Artículo de método

Modelos de cultivo celular tridimensional para investigar la barrera epitelial en la esofagitis eosinofílica

1.8K vistas

⸱

DOI:

10.3791/66503

⸱

10 de mayo de 2024

 , 
1Department of Biomedicine, University of Basel, 2Department of Gastroenterology and Hepatology, University Digestive Healthcare Center, Clarunis

En este artículo

Resumen

Aquí, se proporciona un protocolo para el cultivo de organoides esofágicos humanos y el cultivo de interfaz aire-líquido. El cultivo de la interfaz aire-líquido de los organoides esofágicos se puede utilizar para estudiar el impacto de las citocinas en la barrera epitelial esofágica.

Resumen

El epitelio escamoso del esófago está expuesto directamente al medio ambiente, enfrentándose continuamente a antígenos extraños, incluidos antígenos alimentarios y microbios. Mantener la integridad de la barrera epitelial es fundamental para prevenir infecciones y evitar la inflamación causada por antígenos inofensivos derivados de los alimentos. Este artículo proporciona protocolos simplificados para generar organoides esofágicos humanos y cultivos de interfaz aire-líquido a partir de biopsias de pacientes para estudiar el compartimento epitelial del esófago en el contexto de la homeostasis tisular y la enfermedad. Estos protocolos han sido hitos científicos importantes en la última década, ya que describen estructuras tridimensionales similares a órganos a partir de células primarias derivadas de pacientes, organoides y cultivos de interfaz aire-líquido. Ofrecen la posibilidad de investigar la función de citocinas específicas, factores de crecimiento y vías de señalización en el epitelio esofágico dentro de un marco tridimensional, manteniendo las propiedades fenotípicas y genéticas del donante. Los organoides proporcionan información sobre la microarquitectura de los tejidos mediante la evaluación del transcriptoma y el proteoma después de la estimulación de citocinas. Por el contrario, los cultivos de interfaz aire-líquido permiten evaluar la integridad de la barrera epitelial a través de la resistencia transepitelial (TEER) o mediciones de flujo de macromoléculas. La combinación de estos organoides y los cultivos de interfaz aire-líquido es una herramienta poderosa para avanzar en la investigación en condiciones de barrera epitelial esofágica deteriorada.

Introducción

La inflamación esofágica compromete la integridad de la barrera epitelial 1,2,3,4,5, como se observa en la esofagitis eosinofílica (EoE), una enfermedad inflamatoria crónica del esófago dominada por Th26. La EoE se describió por primera vez en la década de 1990 7,8 y es inducida predominantemente por antígenos alimentarios 9,10,11,12,13. Los síntomas más frecuentes de la EoE en la población adulta son la disfagia y la impactación alimentaria14. En los niños, la EoE se manifiesta típicamente con retraso del crecimiento, rechazo de alimentos, vómitos y dolor abdominal15. Los estudios de asociación del genoma completo (GWAS, por sus siglas en inglés) han identificado genes de riesgo de EoE involucrados en la integridad de la barrera epitelial, lo que ha llevado al epitelio al foco de la investigación de EoE 16,17,18. La transcriptómica de EoE reveló además que un proceso de diferenciación alterado y una hiperplasia reactiva de la zona basal causan el compromiso de la función barrera del epitelio esofágico 3,5,19,20,21,22. La comprensión temprana de que la EoE esuna enfermedad mediada por Th2 6 condujo al descubrimiento de la IL-13 como mediador impulsor al perturbar la integridad epitelial 3,4,21,23. Los sistemas experimentales que permiten la disección de los efectos mediados por citocinas sobre la integridad epitelial a partir del deterioro de la barrera intrínseca a través de la predisposición genética brindan la posibilidad de estudiar la compleja interacción entre las células inmunitarias y el epitelio en EoE. Los organoides esofágicos humanos y los cultivos de interfaz aire-líquido (ALI) han sido propuestos como herramientas valiosas para analizar las consecuencias de la estimulación de citocinas sobre la integridad epitelial5.

El primer protocolo para generar organoides esofágicos derivados de células madre específicas de tejido adulto (ASC) se estableció cinco años después de los primeros informes publicados de organoides intestinales en 2009 utilizando ASC intestinales Lgr5+ que recapitulan el compartimento epitelial del intestino delgado24. DeWard et al. fueron pioneros en la generación de organoides a partir de células epiteliales esofágicas murinas25. En 2018, Kasagi et al. generaron organoides esofágicos humanos a partir de la línea celular inmortalizada de epitelio escamoso esofágico humano EPC2-hTERT y células primarias derivadas de pacientes26. En el mismo año, Zhang et al. generaron con éxito organoides esofágicos derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Delinearon la importancia de la inhibición de TGFβ y de la proteína morfogenética ósea (BMP) para el desarrollo de células progenitoras esofágicas (EPC) y el papel crucial de la señalización de Notch en la diferenciación del epitelio escamoso estratificado26,27. Trisno y sus colegas complementaron estos hallazgos identificando a Sox2 como un inhibidor de Wnt que dirige el destino del desarrollo hacia la diferenciación esofágica28. Los posteriores refinamientos de los protocolos, la composición del medio y las condiciones de cultivo aumentaron la tasa de formación de organoides e hicieron posible el subcultivo y la recuperación de organoides después de la criopreservación 26,29,30,31,32. Aunque estos organoides son herramientas poderosas para estudiar la arquitectura de los tejidos y la expresión de posibles genes diana después de la estimulación con citocinas, los organoides esofágicos no ofrecerán la posibilidad de medir la resistencia transepitelial (TEER) o el flujo de macromoléculas como medidas directas para la integridad de la barrera. Como se describió previamente por Sherrill y colaboradores22, los cultivos ALI que modelan la diferenciación epitelial4 permiten evaluaciones directas de la integridad epitelial. La combinación de organoides derivados de pacientes y cultivos de ALI es una herramienta poderosa para investigar la arquitectura de los tejidos y la integridad de la barrera epitelial en la EoE.

A continuación, se presentan procedimientos con instrucciones para aislar células viables de biopsias esofágicas y establecer cultivos de organoides esofágicos y ALI que se pueden utilizar para estudiar los efectos de las citocinas en la integridad de la barrera.

Protocolo

Los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética de Suiza Noroeste y Central (EKNZ; ID del proyecto: 2019-00273). Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para el uso experimental de biopsias antes del examen endoscópico. Los reactivos y equipos utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Aislamiento celular de organoides esofágicos derivados de pacientes

NOTA: En la Tabla 1 se proporciona una lista de los constituyentes del medio para el cultivo de organoides esofágicos humanos.

  1. Obtener las biopsias.
    NOTA: En el presente estudio, se obtienen dos biopsias de un segmento de esófago durante la esofagogastroduodenoscopia con pinzas de biopsia utilizando un gastroscopio con un canal de trabajo de 2,8 mm.
  2. Transfiera las biopsias a un medio libre de suero de queratinocitos disponible comercialmente (KSFM; Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL de FEAG, 50 μg/mL de BPE).
    NOTA: Las biopsias se pueden almacenar en hielo durante varias horas hasta su uso.
  3. Sustituya el medio KSFM por 1 mL de dispasa I (10 U/mL) e incube las biopsias durante 10 min a temperatura ambiente.
  4. Centrifugar las biopsias a temperatura ambiente a 300 x g durante 2 min.
  5. Aspire la dispasa con una pipeta de 1000 μL sin tocar las biopsias ni la pastilla de restos celulares.
  6. Enjuague las biopsias con 1 mL de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco.
  7. Centrifugar las biopsias a temperatura ambiente a 300 x g durante 2 min.
  8. Aspire el sobrenadante con una pipeta de 1000 μL.
  9. Incubar las biopsias con 500 μL de tripsina-EDTA (0,05%) a 37 °C durante 10 min mientras se agita a 800 rpm.
  10. Realice la interrupción mecánica mediante el pipeteo repetido hacia arriba y hacia abajo hasta obtener una suspensión de una sola celda.
  11. Filtre las células a través de un filtro de células de 70 μm utilizando el cabezal de émbolo de goma de una jeringa de tuberculina.
  12. Lavar el colador con 2-4 mL de inhibidor de tripsina de soja (250 μg/mL).
  13. Filtre las células a través de un colador de células de 35 μm con un tapón a presión en un tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml.
  14. Transfiera la solución unicelular a un tubo cónico de 15 mL.
  15. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
  16. Aspire el sobrenadante con una pipeta de 1000 μL.
  17. Vuelva a suspender las células en 100 μL de medio KSFM.
  18. Mezclar 10 μL de azul de tripano con 10 μL de suspensión celular.
  19. Cuente las celdas usando un contador de celdas automatizado.

2. Cultivo de organoides derivado del paciente

  1. Agregue 1-2 mL de KSFM a la suspensión celular después de contar.
  2. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C.
  3. Aspire el sobrenadante con una pipeta de 1000 μL sin alterar el gránulo de celdas.
  4. Resuspender el pellet celular en la matriz de hidrogel de extracto de membrana basal (BME) (40 μL de BME por cada 20.000 células).
    NOTA: Después de agregar el BME, mantenga las células en hielo para evitar la solidificación prematura del BME.
  5. Corte una punta de pipeta de 200 μL para aspirar la mezcla viscosa de suspensión BME-cell.
  6. Forma gotas de 40 μL en una placa de cultivo celular en suspensión precalentada (37 °C).
  7. Incubar la placa sin medio durante 20-30 min a 37 °C para asegurar la solidificación de las gotas de BME.
  8. Añadir medio KSFM-C precalentado suplementado con 10 μM de Y27632 (inhibidor de ROCK) durante los dos primeros días de cultivo.
  9. Reemplace el medio con un nuevo medio KSFM-C (sin Y27632 y +/- citocina de interés) cada dos días.
  10. Aspire el medio y rasque las gotas con la punta de la pipeta mientras agrega continuamente 1 mL de Dispasa II (1.5 U/mL) al pocillo.
  11. Transfiera la mezcla de BME y dispasa a un tubo de centrífuga de 15 mL e incube durante 20 min a 37 °C en un baño de agua agitable para digerir el BME.
  12. Centrifugar a 250 x g durante 3 min a 4 °C y aspirar la Dispasa II.
  13. Proceda de acuerdo con el protocolo de la lectura de interés (p. ej., aislamiento de ARN, aislamiento de proteínas o fijación con PFA al 4% para histología).

3. Aislamiento celular para cultivos de interfaz aire-líquido (ALI) derivados del paciente

  1. Obtener las biopsias. Durante la esofagogastroduodenoscopia con un gastroscopio con un canal de trabajo de 2,8 mm, se toman dos biopsias de un segmento de esófago con pinzas de biopsia.
  2. Colocar las biopsias en un medio libre de suero de queratinocitos disponible comercialmente (KSFM; Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) y almacenar en hielo durante varias horas hasta su uso.
  3. Intercambie KSFM con 1 mL de dispasa (10 U/mL). Después, incubar las biopsias durante 10 minutos a temperatura ambiente.
  4. Centrifugar las biopsias a temperatura ambiente a 300 x g durante 2 min.
  5. Retire la dispasa con una pipeta de 1000 μL sin tocar las biopsias ni la pastilla de restos celulares.
  6. Lave las biopsias con 1 mL de DPBS.
  7. A temperatura ambiente, centrifugar las biopsias a 300 x g durante 2 minutos.
  8. Aspire el sobrenadante con una pipeta de 1000 μL.
  9. Incubar las biopsias en 500 μL de tripsina-EDTA (0,05%) a 37 °C durante 10 min y mezclar continuamente a 800 rpm durante la incubación.
  10. Interrumpa las biopsias mecánicamente con pipeteo repetido hacia arriba y hacia abajo hasta obtener una suspensión de una sola célula.
  11. Pase las células disociadas a través de un filtro de células de 70 μm con una cabeza de émbolo de goma de una jeringa de tuberculina y recoja las células en un tubo cónico de 50 mL.
  12. Lave el colador con 2-4 mL de inhibidor de tripsina de soja (250 μg/mL) para eliminar las células restantes del colador.
  13. Filtre las células con un tapón de filtro de células de 35 μm en un tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml.
  14. Transfiera las células a un tubo cónico de 15 mL.
  15. Centrifugar a 300 x g a 4 °C durante 5 min.
  16. Retire el sobrenadante con una pipeta de 1.000 μL.
  17. Vuelva a suspender el pellet celular en 4 mL de medio KSFM (Ca2+ 0,09 mM), incluyendo 10 μM Y27632.
  18. Transfiera las células a un matraz de cultivo celular T25.
  19. Para expandir los queratinocitos primarios, cultive las células hasta una confluencia del 60%-80% durante aproximadamente 1 semana.
    NOTA: El pasaje (P)0 forma conglomerados celulares en forma de islotes y no es una monocapa. Los queratinocitos primarios forman monocapas a partir de P1.
  20. Paso a 60%-80% de confluencia y resiembra de P1 en 2-3 matraces de cultivo celular T25 o 1-2 T75.
  21. Vuelve a pasar P1 cuando los queratinocitos forman una monocapa con una confluencia del 60%-80%.

4. Cultivo de interfaz aire-líquido (ALI) derivado del paciente

  1. Siembre queratinocitos primarios P2 en insertos transwell para el cultivo de ALI.
    NOTA: Siembra 400.000 células en 12 pocillos (200.000 queratinocitos por 0,6cm2) en 500 μL de KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL de EGF, 50 μg/mL de BPE).
    1. Siembra 150.000 células en 24 pocillos (155.000 queratinocitos por 0,5cm2) en 100 μL de KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE).
    2. Alternativamente, congele en el medio KSFM (Ca2 + 0,09 mM + 10% DMSO) a -80 °C durante 24 h y luego transfiera las células congeladas a nitrógeno líquido para su uso posterior.
      NOTA: Cuando utilice viales congelados, vuelva a pasar después de descongelar antes de utilizar las células para el cultivo de ALI.
  2. Agregue medio al pocillo inferior debajo del inserto de la placa de cultivo transwell.
    NOTA: Para placas de 12 pocillos: 1,5 mL de KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL de EGF, 50 μg/mL de BPE). Para 24 placas de pocillos: 600 μL de KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL de EGF, 50 μg/mL de BPE).
  3. Reemplace el KSFM de calcio medio a alto (Ca2+ 1.8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) después de 2 días.
  4. Cambie el medio KSFM con alto contenido de calcio cada dos días hasta el día 7.
  5. Realice el transporte aéreo el día 7 aspirando el medio desde la cámara superior y reemplazando el medio en la cámara inferior con KSFM con alto contenido de calcio (Ca2+ 1,8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) que contiene 10 ng/mL KGF (=FGF7), 75 μg/mL de ácido ascórbico (AA).
    1. Opcional: Añada al medio la citocina de interés a la concentración deseada.
  6. Cambie el medio cada dos días hasta el día 14.

5. Medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER)

  1. Esterilice el electrodo del medidor TEER sumergiéndolo en un pocillo de una placa de 24 pocillos con hipoclorito de sodio al 5% durante 10-15 min.
  2. Lave el hipoclorito de sodio al 5% sumergiendo el electrodo en 4 pocillos secuenciales con ddH2O estéril y dejando que el electrodo se seque al aire.
  3. Fije el blanco colocando un electrodo en el pocillo y el segundo electrodo en el inserto transpocillo, llenándolo con PBS y midiendo el TEER.
    NOTA: Volúmenes recomendados para las mediciones de TEER: Para placa de 12 pocillos (1900 μL en el pocillo y 900 μL en el inserto). Para placa de 24 pocillos (750-1000 μL en el pocillo y 250 μL en el inserto).
  4. Reemplace el medio de los cultivos ALI con PBS estéril a temperatura ambiente.
    NOTA: Retire el medio del pocillo inferior y, en un segundo paso, del inserto transpocillo. Del mismo modo, agregue PBS primero al inserto y luego al pocillo inferior para evitar el desprendimiento del cultivo de ALI de la membrana transpocillo.
  5. Coloque los electrodos del medidor de TEER en los pozos experimentales con cultivos de ALI y realice la medición de TEER1.
    NOTA: Realice mediciones de TEER cada dos días antes de cambiar el medio.

6. Flujo macromolecular

  1. Diluir la solución madre de FITC-Dextrano (3-5 kDa) hasta una concentración de trabajo de 1 mg/mL.
    NOTA: Proteja siempre el FITC-Dextrano de la exposición a la luz.
  2. Prepare una fila de dilución con una concentración decreciente de FITC (1000 μg/mL a 0,25 μg/mL) como estándar para la lectura.
  3. Añada 500 μL de solución de FITC-dextrano (1 mg/mL) a la cámara superior del transpocillo y 1,5 mL de medio (+/- citocina de interés) en el compartimento inferior y coloque la placa en la incubadora.
  4. Recoja 120 μL de medio del compartimento inferior en los puntos de tiempo respectivos (por ejemplo, 0 min, 15 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min y 180 min).
  5. Pipetea duplicados (50 μL/pocillo) de cada punto de tiempo en una placa negra de fondo plano transparente de 96 pocillos.
  6. Excite el FITC-dextrano a 490 nm y lea la emisión a una longitud de onda de 520 nm utilizando un lector de placas.
  7. Calcule la cantidad de flujo macromolecular de acuerdo con el estándar.

Resultados

Los organoides esofágicos crecerán a partir de células primarias extraídas de biopsias de pacientes de acuerdo con las instrucciones del protocolo proporcionado, según lo documentado con un microscopio de campo claro invertido (Figura 1). Las ASC epiteliales comienzan a formar grupos de células de manera autoorganizada dentro de los primeros dos días de cultivo después de sembrar las células aisladas en el extracto de membrana basal, que sirve como andamio. El tamaño y el número de grupos de células, perceptibles con un microscopio de campo claro invertido, aumentan continuamente durante la primera semana (Figura 2). Sin embargo, en este punto, los grupos de células carecen de la estructura similar a una cebolla característica del epitelio escamoso de múltiples capas de un organoide esofágico derivado de ASC. En el día 9 de cultivo, la estructura multicapa similar a una cebolla y un núcleo queratinizado en crecimiento en el centro del organoide se hacen evidentes (Figura 2A). El cultivo de organoides puede sostenerse hasta 21 días26. Sin embargo, se ha demostrado que los organoides alcanzan la maduración completa y el tamaño máximo entre el día 11 y el día 14. A partir del día 11, el proceso de cultivo se caracteriza predominantemente por el avance de la queratinización y la reducción de las células viables metabólicamente activas 5,26. Por lo tanto, el tiempo óptimo para recuperar organoides para la experimentación depende de la etapa de diferenciación deseada y se encuentra entre 5 y 11 días.

Son posibles hasta 3 pasos antes de que los organoides dejen de crecer porque el aumento del núcleo de queratina reduce el número de células viables. Los organoides se pueden recolectar para el aislamiento de ARN o proteínas en los días deseados para analizar la expresión de genes/proteínas o para histología y biobancos.

Los pasos iniciales de aislamiento celular para el cultivo de ALI y organoides son idénticos. Antes de que se pueda establecer el cultivo de ALI, las células primarias recién aisladas deben expandirse en contraste con el protocolo de organoides. Después del segundo paso, los queratinocitos primarios se siembran en insertos transpocillos y se cultivan en un medio con baja concentración de calcio para inducir la formación de monocapas y evitar la diferenciación prematura de los queratinocitos primarios aislados. A las 48 h, cuando se forma una monocapa confluente, la concentración de calcio del medio se eleva a 1,8 mM, induciendo la diferenciación y estratificación de la capa epitelial. Después de 7 días, el puente aéreo expone el lado apical del epitelio multicapa al aire para causar queratinización. Por lo general, los cultivos de ALI se pueden mantener hasta por 14 días (Figura 2B). Las mediciones de TEER y los experimentos de flujo macromolecular monitorearán la funcionalidad del epitelio. Aquí, las mediciones de TEER se realizaron en cultivos de ALI de queratinocitos esofágicos primarios, en cultivos de queratinocitos primarios de ALI con una capa de alimentación de fibroblastos NIH/3T3 en el fondo de cada pocillo, y en cultivos de ALI de queratinocitos primarios con una capa de alimentación de fibroblastos NIH/3T3 en cada inserto (Figura 2C).

figure-results-1
Figura 1: Proceso de cultivo de organoides esofágicos derivados del paciente. Un diagrama que ilustra el procedimiento de recolección de muestras, el aislamiento celular, el cultivo de organoides y las posibles aplicaciones experimentales de los organoides esofágicos derivados del paciente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Formación y diferenciación de organoides esofágicos derivados del paciente. (A) Imágenes representativas de campo claro de organoides esofágicos cultivados a partir de células primarias derivadas de la biopsia del paciente. (B) Imágenes representativas de campo claro de cultivos esofágicos de ALI cultivados a partir de células primarias derivadas de biopsias en el día 14. Barras de escala: 50μM. (C) Mediciones de resistencia eléctrica transepitelial (TEER) en días indicados en cultivos de interfaz aire-líquido (ALI) de queratinocitos esofágicos primarios, ALI cultivados a partir de queratinocitos primarios con una capa de alimentación de fibroblastos NIH/3T3 en el fondo de cada pocillo, y ALI cultivados a partir de queratinocitos primarios con una capa de alimentación de fibroblastos NIH/3T3 en cada inserto debajo de la capa de queratinocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

MedioKSFMKSFM-C
Medio baseQueratinocitos-SFMQueratinocitos-SFM
SuplementosPenicilina/Estreptomicina1%1%
Extracto de hipófisis bovina (BPE)50 μg/mL50 μg/mL
Factor de crecimiento epidérmico (EGF)1 ng/mL1 ng/mL
Cloruro de calcio (CaCl2)0,09 mM0,6 mM
Y-27632 (inhibidor de rocas)-10 μM

Tabla 1: Medios organoides esofágicos primarios derivados de células. Lista de los constituyentes del medio para el cultivo de organoides esofágicos humanos. SFM: Medio sin suero.

Discusión

Los procedimientos proporcionados permiten el cultivo de organoides derivados de pacientes y cultivos de ALI con altas perspectivas de éxito. El protocolo de organoides ha sido adaptado del primer protocolo publicado que informa de la generación de organoides esofágicos humanos26 y de un protocolo recientemente publicado32. Sherill y sus colegas han descrito el modelo ALI22. Los organoides y los modelos de cultivo de ALI se ayudan mutuamente en el estudio del impacto de las citocinas y otros mediadores sobre la barrera epitelial esofágica en contextos de enfermedades esofágicas, como la EoE 5,26.

Una ventaja del protocolo de organoides es su simplicidad en el proceso de cultivo y la composición del medio de cultivo celular. A diferencia de otros protocolos basados en ASC y PSC, que en su mayoría requieren la adición de múltiples suplementos costosos y factores de crecimiento 24,25,27,28,33, el medio KSFM es relativamente económico. Solo requiere la adición de factor de crecimiento epitelial recombinante humano (hEGF) y extracto de hipófisis bovina (BPE). KSFM es un medio base optimizado para el cultivo de queratinocitos y elimina la necesidad de una capa34 alimentadora de fibroblastos. Es necesario valorar la concentración de Ca2+ de la KSFM de 0,09 mM a 0,6 mM utilizando CaCl2 para obtener el medio KSFM-C utilizado para el cultivo de organoides. Los cultivos de ALI requieren una mayor concentración de Ca2+ de 1,8 mM que el modelo de organoide. La alta concentración de Ca2+ es esencial para iniciar la diferenciación de los queratinocitos, facilitando posteriormente la formación de la configuración típica de epitelio escamoso multicapa presente en los organoides esofágicos 26,34,35 y la estratificación epitelial en los cultivos de ALI22.

La prevención de la diferenciación prematura de queratinocitos, la generación de organoides y cultivos de ALI requiere evitar concentraciones altas de Ca2+ durante el aislamiento celular. La diferenciación temprana disminuye la formación de colonias e impide la formación autoorganizada de organoides y la formación de una monocapa confluente de queratinocitos indiferenciados como base de los cultivos de ALI. El uso de medios que contienen suero para detener la actividad enzimática de la tripsina durante el aislamiento celular perjudica la generación exitosa de organoides al desencadenar una diferenciación prematura, similar al uso de un medio enriquecido con Ca2+ durante el aislamiento celular36. En su lugar, se recomienda un inhibidor de la tripsina de la soja o cualquier otro inhibidor de la tripsina sin suero para detener la reacción enzimática después de la digestión de la biopsia con tripsina. El medio de cultivo se complementa con el inhibidor de la rho-quinasa (ROCK) Y27632 durante los dos primeros días de cultivo para mejorar la tasa de formación de colonias. La inhibición de ROCK tiene efectos antiapoptóticos, previene la senescencia de los queratinocitos y, por lo tanto, mejora la tasa de formación de organoides37,38.

Se recomienda sembrar aproximadamente 20.000 células en una gota de 40 μL de BME para garantizar un cultivo de organoides próspero y de 150.000 a 400.000 células para el cultivo de ALI. Un recuento adecuado de células de siembra garantizará material suficiente para la transcriptómica, la proteómica y la histología posteriores. Cuando se utilizan líneas celulares como la línea celular epitelial esofágica humana EPC2-hTERT, el recuento de células de siembra puede disminuir debido a la mayor tasa de formación de organoides exhibida por esta línea celular26. Este fenómeno se atribuye probablemente a la homogeneidad y a la mayor sincronicidad del ciclo celular demostrada por las líneas celulares en comparación con las células primarias derivadas de la biopsia. La línea celular inmortalizada EPC2-hTERT también conserva su capacidad proliferativa, lo que permite el paso infinito de organoides.

Por el contrario, los organoides humanos derivados de biopsias esofágicas no pueden mantenerse para el cultivo a largo plazo26,28. La disminución de las células viables en división dentro de los organoides esofágicos completamente desarrollados y una tasa decreciente de formación de organoides con cada paso26 indica que la pérdida de capacidad proliferativa en los organoides primarios derivados de células se debe a la diferenciación terminal y queratinización de las células progenitoras. Los intentos previos de mantener la capacidad proliferativa mediante la suplementación del medio de cultivo con Noggin, Wnt3a o A83-01 fueron infructuosos 26,28,32. Por lo tanto, el biobanco a largo plazo de organoides esofágicos derivados de pacientes sigue siendo un desafío que debe abordarse en estudios futuros.

El advenimiento del cultivo de organoides ha traído nuevas posibilidades experimentales que han permitido en gran medida el descubrimiento de mediadores inflamatorios clave y factores ambientales responsables de las alteraciones epiteliales en la EoE 5,39,40,41,42. No obstante, es esencial tener en cuenta que los organoides esofágicos derivados de ASC y PSC tienen limitaciones, ya que no recapitulan perfectamente todos los compartimentos celulares del esófago. Los organoides derivados de ASC recapitulan el compartimento epitelial 24,26,27,33, mientras que los organoides derivados de PSC recapitulan los compartimentos epitelial, endotelial y mesenquimal 28,43,44. Sin embargo, todos los modelos de organoides actuales carecen del microambiente inmunológico. En un estudio reciente, se han estimulado organoides esofágicos humanos y cultivos de ALI con citocinas de la familia de las citocinas IL-20 para descifrar un nuevo aspecto de la disfunción de la barrera epitelial en EoE5. La combinación de ambos modelos de cultivo tridimensional evaluó medidas directas e indirectas de la integridad de la barrera epitelial. Es probable que más publicaciones utilicen organoides esofágicos en combinación con cultivos de ALI para dilucidar los efectos de citocinas definidas en el epitelio. Si bien este enfoque reduce la complejidad de la comunicación cruzada entre el sistema inmunitario y el epitelio para revelar la función de mediadores específicos en el epitelio, descuida muchos otros factores potencialmente involucrados. La combinación de la tecnología de organoides y órganos en un chip puede proporcionar una solución a esta limitación. La tecnología de órgano en un chip basada en la microfluídica puede replicar el microambiente luminal y basolateral de los órganos tubulares, lo que hace posible la entrada y salida de células inmunitarias y otros componentes circulatorios y luminales. Esto permite investigar las interacciones entre el epitelio y las células inmunitarias en la homeostasis y la enfermedad45,46. El cultivo exitoso de organoides de túbulos renales fisiológicamente polarizados que exhiben una barrera epitelial intacta y un transporte de iones transepiteliales funcionales en una plataforma de órgano en un chip47 respalda el uso ampliado de la tecnología de organoides en un chip derivada del paciente. Además, otro progreso de la utilización de la tecnología de organoide en un chip se demuestra a través del cultivo extendido de organoides originarios de células primarias mediante la implementación de un flujo luminal a través de los canales microfluídicos en el lado apical de los organoides tubulares para eliminar las células epiteliales que se desprenden46. Estos avances ponen de manifiesto el potencial de esta tecnología para replicar in vivo entornos in vitro.

La capacidad de cultivar organoides 3D que se asemejan a todo, desde el compartimento epitelial hasta un miniórgano casi completo con la mayoría de los tipos de células, insta a posibles aplicaciones clínicas 5,26,46. Si bien se han realizado progresos considerables en los últimos años, es necesario superar obstáculos adicionales antes de que los organoides puedan utilizarse en la práctica clínica. Un obstáculo importante para la implementación clínica de organoides es la presencia de proteínas de origen animal en el medio de cultivo y en los productos de ECM de andamiaje. Si bien ya se dispone de medios libres de proteína animal para el cultivo de queratinocitos y recientemente han surgido variantes de KSFM sin BPE, la producción de alternativas de MEC sin proteína animal con propiedades y resultados de cultivo similares a los productos de MEC tradicionales parece más desafiante. Recientemente, se ha reportado una alternativa potencialmente prometedora totalmente sintetizada químicamente48. Sin embargo, en la actualidad, no existe ningún producto de MEC libre de origen animal accesible comercialmente.

Los organoides esofágicos y los cultivos de ALI son instrumentos vitales para el estudio de la EoE. El cultivo de organoides y los cultivos de ALI con los protocolos aquí proporcionados sirvieron de base para nuevas revelaciones sobre la implicación del compartimento epitelial en la esofagitis eosinofílica 5,26,39,41,42,49,50. La simple implementación de estos protocolos y el avance continuo de las tecnologías de cultivo celular tridimensional facilita la aproximación experimental al entorno in vivo, lo que resulta en una mayor traducibilidad de los descubrimientos y, posiblemente, en una reducción gradual de la experimentación animal.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

La subvención 310030_219210 de la SNSF a J.H.N. apoyó la publicación de este manuscrito sin restricciones. La figura 1 se ha creado con la ayuda de BioRender.com.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1250 y micro; L Griptip - FiltroIntegra4445
300 µ L Griptip - FiltroIntegra4435
70 µ M filtro de célulasSarstedt83.3945.070
Ácido ascórbicoSigma-Aldrich (Merck)A4544
Extracto de hipófisis bovinaGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
Cloruro de calcioSigma-Aldrich (Merck)21115
Placas multipocillos para cultivo celular CELLSTAR para cultivos en suspensiónGreiner Bio-One7.657 185
Extracto de Membrana Basal (BME) de Cultrex, Tipo 2, PathclearR& D Systems (Bio-Techne)3532-010-02
Dimetilsulfóxido (DMSO), >99,5% Grado BioScienceCarl RothA994
Dispasa ICorning354235
Dispasa IISigma-Aldrich (Merck)D4693
Dulbeccos Solución salina tamponada con fosfato  (DPBS)Sigma-Aldrich (Merck)D8537
EVE Contador de células automatizadoNanoEntekEVE-MC
EVE Portaobjetos de recuento de célulasNanoEntekEVS-050
Falcon 5 mL Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo, con filtro de células Tapón a presiónFalcon352235
Isotiocianato de fluorescina (FITC)-dextranoSigma-Aldrich (Merck)FD4peso molar promedio 3000-5000
Heraeus - Megafuge  40R Thermo Fisher Scientific75004518
Factor de crecimiento epidérmico recombinante humanoGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
Queratinocitos-SFMGibco (Thermo Fischer Scientific)17005042
Penicilina-EstreptomicinaGibco (Thermo Fischer Scientific)15140122
Proteína recombinante humana KGF/FGF-7 R& D Systems (Bio-Techne)251-KG-010/CF
Tubo con tapón de rosca, 15 mLSarstedt62.554.502
Monocanal EVOLVE 100-1000 µ L Integra3018
Monocanal EVOLVE 20-200 µ L Integra3016
Jeringa 1 mL1134950
ThermoMixer CEppendorf5382000015
Inhibidor de tripsina de Glycine max (soja)Sigma-Aldrich (Merck)T9128
Tripsina-EDTASAFC Biosciences (Merck)59418C
Y27632 diclorhidratoTocris (Bio-Techne)1254

Referencias

  1. Wu, L., et al. Filaggrin and tight junction proteins are crucial for IL-13-mediated esophageal barrier dysfunction. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 315 (3), G341-G350 (2018).
  2. Davis, B. P., et al. Eosinophilic esophagitis-linked calpain 14 is an IL-13-induced protease that mediates esophageal epithelial barrier impairment. JCI Insight. 1 (4), e86355(2016).
  3. Blanchard, C., et al. Coordinate interaction between IL-13 and epithelial differentiation cluster genes in eosinophilic esophagitis. J Immunol. 184 (7), 4033-4041 (2010).
  4. Kc, K., Rothenberg, M. E., Sherrill, J. D. In vitro model for studying esophageal epithelial differentiation and allergic inflammatory responses identifies keratin involvement in eosinophilic esophagitis. PLoS One. 10 (6), e0127755(2015).
  5. Kaymak, T., et al. IL-20 subfamily cytokines impair the oesophageal epithelial barrier by diminishing filaggrin in eosinophilic oesophagitis. Gut. 72 (5), 821-833 (2023).
  6. Straumann, A., Bauer, M., Fischer, B., Blaser, K., Simon, H. U. Idiopathic eosinophilic esophagitis is associated with a T(H)2-type allergic inflammatory response. J Allergy Clin Immunol. 108 (6), 954-961 (2001).
  7. Straumann, A., Spichtin, H. P., Bernoulli, R., Loosli, J., Vogtlin, J. Idiopathic eosinophilic esophagitis: a frequently overlooked disease with typical clinical aspects and discrete endoscopic findings. Schweiz Med Wochenschr. 124 (33), 1419-1429 (1994).
  8. Attwood, S. E., Smyrk, T. C., Demeester, T. R., Jones, J. B. Esophageal eosinophilia with dysphagia. A distinct clinicopathologic syndrome. Dig Dis Sci. 38 (1), 109-116 (1993).
  9. Kelly, K. J., et al. Eosinophilic esophagitis attributed to gastroesophageal reflux: improvement with an amino acid-based formula. Gastroenterology. 109 (5), 1503-1512 (1995).
  10. Fogg, M. I., Ruchelli, E., Spergel, J. M. Pollen and eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 112 (4), 796-797 (2003).
  11. Wolf, W. A., Jerath, M. R., Dellon, E. S. De-novo onset of eosinophilic esophagitis after large volume allergen exposures. J Gastrointestin Liver Dis. 22 (2), 205-208 (2013).
  12. Moawad, F. J., et al. Correlation between eosinophilic oesophagitis and aeroallergens. Aliment Pharmacol Ther. 31 (4), 509-515 (2010).
  13. Woo, W., Aceves, S. S. The role of the allergist in the management of eosinophilic esophagitis. Curr Opin Gastroenterol. 37 (4), 390-396 (2021).
  14. Dellon, E. S., et al. Updated International Consensus diagnostic criteria for eosinophilic esophagitis: Proceedings of the AGREE conference. Gastroenterology. 155 (4), e1010 1022-1033 (2018).
  15. Liacouras, C. A., Spergel, J., Gober, L. M. Eosinophilic esophagitis: Clinical presentation in children. Gastroenterol Clin North Am. 43 (2), 219-229 (2014).
  16. Sleiman, P. M., et al. GWAS identifies four novel eosinophilic esophagitis loci. Nat Commun. 5, 5593(2014).
  17. Kottyan, L. C., et al. Genome-wide association analysis of eosinophilic esophagitis provides insight into the tissue specificity of this allergic disease. Nat Genet. 46 (8), 895-900 (2014).
  18. Kottyan, L. C., et al. Replication and meta-analyses nominate numerous eosinophilic esophagitis risk genes. J Allergy Clin Immunol. 147 (1), 255-266 (2021).
  19. Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes Immun. 15 (6), 361-369 (2014).
  20. Collins, M. H., et al. Newly developed and validated eosinophilic esophagitis histology scoring system and evidence that it outperforms peak eosinophil count for disease diagnosis and monitoring. Dis Esophagus. 30 (3), 1-8 (2017).
  21. Rochman, M., et al. Profound loss of esophageal tissue differentiation in patients with eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 140 (3), 738-749 (2017).
  22. Sherrill, J. D., et al. Desmoglein-1 regulates esophageal epithelial barrier function and immune responses in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunol. 7 (3), 718-729 (2014).
  23. Blanchard, C., et al. IL-13 involvement in eosinophilic esophagitis: transcriptome analysis and reversibility with glucocorticoids. J Allergy Clin Immunol. 120 (6), 1292-1300 (2007).
  24. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  25. DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Rep. 9 (2), 701-711 (2014).
  26. Kasagi, Y., et al. The esophageal organoid system reveals functional interplay between Notch and cytokines in reactive epithelial changes. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (3), 333-352 (2018).
  27. Zhang, Y., et al. 3D modeling of esophageal development using human PSC-derived basal progenitors reveals a critical role for notch signaling. Cell Stem Cell. 23 (4), e515 516-529 (2018).
  28. Trisno, S. L., et al. Esophageal organoids from human pluripotent stem cells delineate sox2 functions during esophageal specification. Cell Stem Cell. 23 (4), e507 501-515 (2018).
  29. Kijima, T., et al. Three-dimensional organoids reveal therapy resistance of esophageal and oropharyngeal squamous cell carcinoma cells. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 73-91 (2019).
  30. Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 53 (1), e109(2020).
  31. Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440(2021).
  32. Nakagawa, H., et al. Modeling epithelial homeostasis and reactive epithelial changes in human and murine three-dimensional esophageal organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 52 (1), e106(2020).
  33. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  34. Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81, 1 Suppl 33-40 (1983).
  35. Bertolero, F., Kaighn, M. E., Gonda, M. A., Saffiotti, U. Mouse epidermal keratinocytes. Clonal proliferation and response to hormones and growth factors in serum-free medium. Exp Cell Res. 155 (1), 64-80 (1984).
  36. Bertolero, F., Kaighn, M. E., Camalier, R. F., Saffiotti, U. Effects of serum and serum-derived factors on growth and differentiation of mouse keratinocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 22 (7), 423-428 (1986).
  37. Witkowski, T. A., et al. Y-27632 acts beyond ROCK inhibition to maintain epidermal stem-like cells in culture. J Cell Sci. 136 (17), jcs.260990 (2023).
  38. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
  39. Sasaki, M., et al. Lysyl oxidase regulates epithelial differentiation and barrier integrity in eosinophilic esophagitis. bioRxiv. , (2023).
  40. Doyle, A. D., et al. Detergent exposure induces epithelial barrier dysfunction and eosinophilic inflammation in the esophagus. Allergy. 78 (1), 192-201 (2023).
  41. Hara, T., et al. CD73(+) epithelial progenitor cells that contribute to homeostasis and renewal are depleted in eosinophilic esophagitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1449-1467 (2022).
  42. Kasagi, Y., et al. Fibrostenotic eosinophilic esophagitis might reflect epithelial lysyl oxidase induction by fibroblast-derived TNF-alpha. J Allergy Clin Immunol. 144 (1), 171-182 (2019).
  43. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  44. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  45. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
  46. Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
  47. Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nat Biotechnol. 37 (3), 303-313 (2019).
  48. Sorrentino, G., et al. Mechano-modulatory synthetic niches for liver organoid derivation. Nat Commun. 11 (1), 3416(2020).
  49. Azouz, N. P., et al. The antiprotease SPINK7 serves as an inhibitory checkpoint for esophageal epithelial inflammatory responses. Sci Transl Med. 10 (444), 9736(2018).
  50. Azouz, N. P., et al. Functional role of kallikrein 5 and proteinase-activated receptor 2 in eosinophilic esophagitis. Sci Transl Med. 12 (545), 7773(2020).

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Organoides esof gicosinterfaz aire l quidodiferenciaci n epitelialcultivo de queratinocitosresistencia transepitelialestimulaci n con citocinasv a de la MAP quinasa
Modelos de cultivo celular tridimensional para investigar la barrera epitelial en la esofagitis eosinofílica
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.