Aquí, se proporciona un protocolo para el cultivo de organoides esofágicos humanos y el cultivo de interfaz aire-líquido. El cultivo de la interfaz aire-líquido de los organoides esofágicos se puede utilizar para estudiar el impacto de las citocinas en la barrera epitelial esofágica.
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Artículo de método
Modelos de cultivo celular tridimensional para investigar la barrera epitelial en la esofagitis eosinofílica
En este artículo
Resumen
Resumen
El epitelio escamoso del esófago está expuesto directamente al medio ambiente, enfrentándose continuamente a antígenos extraños, incluidos antígenos alimentarios y microbios. Mantener la integridad de la barrera epitelial es fundamental para prevenir infecciones y evitar la inflamación causada por antígenos inofensivos derivados de los alimentos. Este artículo proporciona protocolos simplificados para generar organoides esofágicos humanos y cultivos de interfaz aire-líquido a partir de biopsias de pacientes para estudiar el compartimento epitelial del esófago en el contexto de la homeostasis tisular y la enfermedad. Estos protocolos han sido hitos científicos importantes en la última década, ya que describen estructuras tridimensionales similares a órganos a partir de células primarias derivadas de pacientes, organoides y cultivos de interfaz aire-líquido. Ofrecen la posibilidad de investigar la función de citocinas específicas, factores de crecimiento y vías de señalización en el epitelio esofágico dentro de un marco tridimensional, manteniendo las propiedades fenotípicas y genéticas del donante. Los organoides proporcionan información sobre la microarquitectura de los tejidos mediante la evaluación del transcriptoma y el proteoma después de la estimulación de citocinas. Por el contrario, los cultivos de interfaz aire-líquido permiten evaluar la integridad de la barrera epitelial a través de la resistencia transepitelial (TEER) o mediciones de flujo de macromoléculas. La combinación de estos organoides y los cultivos de interfaz aire-líquido es una herramienta poderosa para avanzar en la investigación en condiciones de barrera epitelial esofágica deteriorada.
Introducción
La inflamación esofágica compromete la integridad de la barrera epitelial 1,2,3,4,5, como se observa en la esofagitis eosinofílica (EoE), una enfermedad inflamatoria crónica del esófago dominada por Th26. La EoE se describió por primera vez en la década de 1990 7,8 y es inducida predominantemente por antígenos alimentarios 9,10,11,12,13
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Protocolo
Los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética de Suiza Noroeste y Central (EKNZ; ID del proyecto: 2019-00273). Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para el uso experimental de biopsias antes del examen endoscópico. Los reactivos y equipos utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Aislamiento celular de organoides esofágicos derivados de pacientes
NOTA: En la Tabla 1 se proporciona una lista de los constituyentes del medio para el cultivo de organoides esofágicos humanos.
- Obtener las bio....
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Resultados
Los organoides esofágicos crecerán a partir de células primarias extraídas de biopsias de pacientes de acuerdo con las instrucciones del protocolo proporcionado, según lo documentado con un microscopio de campo claro invertido (Figura 1). Las ASC epiteliales comienzan a formar grupos de células de manera autoorganizada dentro de los primeros dos días de cultivo después de sembrar las células aisladas en el extracto de membrana basal, que sirve como andamio. El tamaño y el número de grupos de.......
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Discusión
Los procedimientos proporcionados permiten el cultivo de organoides derivados de pacientes y cultivos de ALI con altas perspectivas de éxito. El protocolo de organoides ha sido adaptado del primer protocolo publicado que informa de la generación de organoides esofágicos humanos26 y de un protocolo recientemente publicado32. Sherill y sus colegas han descrito el modelo ALI22. Los organoides y los modelos de cultivo de ALI se ayudan mutuamente en el es.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
La subvención 310030_219210 de la SNSF a J.H.N. apoyó la publicación de este manuscrito sin restricciones. La figura 1 se ha creado con la ayuda de BioRender.com.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1250 y micro; L Griptip - Filtro | Integra | 4445 | |
| 300 µ L Griptip - Filtro | Integra | 4435 | |
| 70 µ M filtro de células | Sarstedt | 83.3945.070 | |
| Ácido ascórbico | Sigma-Aldrich (Merck) | A4544 | |
| Extracto de hipófisis bovina | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
| Cloruro de calcio | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | |
| Placas multipocillos para cultivo celular CELLSTAR para cultivos en suspensión | Greiner Bio-One | 7.657 185 | |
| Extracto de Membrana Basal (BME) de Cultrex, Tipo 2, Pathclear | R& D Systems (Bio-Techne) | 3532-010-02 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO), >99,5% Grado BioScience | Carl Roth | A994 | |
| Dispasa I | Corning | 354235 | |
| Dispasa II | Sigma-Aldrich (Merck) | D4693 | |
| Dulbeccos Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) | Sigma-Aldrich (Merck) | D8537 | |
| EVE Contador de células automatizado | NanoEntek | EVE-MC | |
| EVE Portaobjetos de recuento de células | NanoEntek | EVS-050 | |
| Falcon 5 mL Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo, con filtro de células Tapón a presión | Falcon | 352235 | |
| Isotiocianato de fluorescina (FITC)-dextrano | Sigma-Aldrich (Merck) | FD4 | peso molar promedio 3000-5000 |
| Heraeus - Megafuge 40R | Thermo Fisher Scientific | 75004518 | |
| Factor de crecimiento epidérmico recombinante humano | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
| Queratinocitos-SFM | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 17005042 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 15140122 | |
| Proteína recombinante humana KGF/FGF-7 R | & D Systems (Bio-Techne) | 251-KG-010/CF | |
| Tubo con tapón de rosca, 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Monocanal EVOLVE 100-1000 µ L | Integra | 3018 | |
| Monocanal EVOLVE 20-200 µ L | Integra | 3016 | |
| Jeringa 1 mL | 1134950 | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
| Inhibidor de tripsina de Glycine max (soja) | Sigma-Aldrich (Merck) | T9128 | |
| Tripsina-EDTA | SAFC Biosciences (Merck) | 59418C | |
| Y27632 diclorhidrato | Tocris (Bio-Techne) | 1254 |
Referencias
- Wu, L., et al. Filaggrin and tight junction proteins are crucial for IL-13-mediated esophageal barrier dysfunction. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 315 (3), G341-G350 (2018).
- Davis, B. P., et al.
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Reimpresiones y permisos
