Artículo de método

Puntuaciones Z para la evaluación de la reserva ovárica en pacientes jóvenes sometidas a preservación de la fertilidad

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DOI:

10.3791/66504

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25 de octubre de 2024

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1Division of Obstetrics and Gynecology, Department of Clinical Science, Intervention and Technology, Karolinska Institutet, 2Department of Gynecology and Reproductive Medicine, Karolinska University Hospital, 3Applied Tumor Genomics Research Program, Faculty of Medicine, University of Helsinki, 4Department of Medical and Clinical Genetics, Medicum, Faculty of Medicine, University of Helsinki, 5Children's Hospital, Pediatric Research Centre, University of Helsinki and Helsinki University Hospital, 6NORDFERTIL Research Lab Stockholm, Department of Women's, and Children's Health, Karolinska Institutet, and Karolinska University Hospital, 7Department of Obstetrics and Gynecology, Helsinki University Hospital, University of Helsinki, 8Department of Cell and Molecular Biology, Uppsala University, 9Department of Women's and Children's Health, Uppsala University

En este artículo

Resumen

El presente protocolo describe un método para evaluar la reserva ovárica en pacientes menores de 25 años que requieren preservación de la fertilidad mediante criopreservación de tejido ovárico. Este método implica: (1) la evaluación histológica de la reserva ovárica en muestras corticales, (2) la comparación con un conjunto de datos de referencia y (3) el cálculo de las puntuaciones Z.

Resumen

Las mujeres nacen con un grupo no renovable de folículos ováricos, lo que se conoce como reserva ovárica. Esta reserva está formada por folículos primordiales de los ovarios y puede verse afectada por muchos factores, como trastornos genéticos y endocrinos, intervenciones médicas y disruptores endocrinos. Se recomienda la preservación de la fertilidad cuando son necesarios tratamientos gonadotóxicos. Las opciones preferidas para las mujeres son la criopreservación de ovocitos y embriones. Sin embargo, en pacientes muy jóvenes y sexualmente inmaduras, la criopreservación de tejido ovárico es la única opción. Conocer la densidad folicular de las muestras de tejido criopreservado es esencial en el asesoramiento sobre fertilidad de pacientes jóvenes. Este protocolo demuestra el uso de puntuaciones Z para la densidad del folículo cortical como herramienta para evaluar la calidad del tejido ovárico en niñas y mujeres jóvenes de 25 años o menos que están en proceso de preservación de la fertilidad. La densidad de folículos en muestras de pacientes se compara con los estándares de referencia normalizados por edad, desarrollados por Hassan et al. para estimar las posibles desviaciones del estándar. La densidad del folículo se mide a través de la cuantificación histológica. Para ello, se fija un pequeño trozo de tejido cortical ovárico (~2 mm x 2 mm x 2 mm) en solución de Bouin o de formaldehído, se incrusta en parafina, se secciona a 4 μm de grosor, se tiñe con hematoxilina y eosina y se digitaliza con un escáner de portaobjetos. Las etapas foliculares presentes en la corteza van desde los folículos primordiales hasta los primarios. El área cortical estaba a 1 mm del epitelio superficial en los cortes histológicos. La densidad de folículos se calcula utilizando una fórmula modificada presentada por Schmidt et al., y la puntuación Z se determina utilizando la media de referencia y la desviación estándar. La puntuación Z indica cuánto se desvía el valor medido de la media de referencia, determinando la reserva ovárica reducida (<-1,7 puntuación Z). Con este método, las densidades de los folículos se pueden utilizar como una medida valiosa de la reserva ovárica para pacientes jóvenes que requieren preservación de la fertilidad.

Introducción

El ovario es un órgano dinámico, endocrinológicamente activo, formado por una corteza externa y una médula interna. Dentro de los ovarios se distribuyen heterogéneamente los folículos, que contienen el ovocito gonadal rodeado de células estromales de la granulosa1. Todos los folículos ya se forman durante el desarrollo fetal, alcanzando su punto máximo alrededor de las 20 semanas de edad gestacional, seguido de una disminución exponencial. Al nacer, 1-2 millones de folículos primordiales permanecen dentro de la corteza, y solo unos pocos cientos de miles de folículos sobreviven hasta la pubertad2. El acervo de folículos que no crece, también conocido como reserva ovárica, influye en la fertilidad de la mujer, entre otros factores. La reserva ovárica reside dentro de la corteza y se mueve hacia la médula a medida que los folículos crecen y maduran. Algunos investigadores reconocen que la reserva ovárica está compuesta únicamente por folículos primordiales, mientras que otros incluyen todos los folículos unilaminares (es decir, primordial, intermediario y primario)3,4,5,6. Durante la vida de una mujer, solo 300-400 folículos maduran y sobreviven para finalmente sufrir la ovulación. La menopausia comienza cuando el número de folículos desciende a alrededor de mil, lo que generalmente ocurre alrededor de los 50 años de edad 2,7. Actualmente existe un debate en curso sobre la presencia de células madre oogoniales (OSC) en ovarios humanos adultos que pueden formar ovocitos después de un xenotrasplante. Algunos estudios sugieren aislar células que expresan un perfil genético de células germinales primitivas y se diferencian en ovocitos 8,9, mientras que otros indican que las supuestas OSC son células perivasculares de los vasos sanguíneos 10,11,12.

La insuficiencia ovárica prematura (IOP) se define por la interrupción del ciclo menstrual con niveles elevados de FSH antes de los 40 años13. Las causas de la IOP son multifactoriales y pueden ocurrir de forma idiopática; sin embargo, a menudo surge como resultado de condiciones médicas14. Por ejemplo, ciertas condiciones genéticas congénitas se asocian con POI debido a una reserva ovárica reducida ya en el nacimiento, como el síndrome de Turner15. La POI también puede ocurrir como un efecto secundario de los tratamientos gonadotóxicos, lo cual es particularmente problemático en pacientes muy jóvenes, ya que puede conducir a una incapacidad para experimentar una pubertad normal y afectar drásticamente la reserva ovárica. Dependiendo del riesgo de IOP y de la edad de la paciente, existen varias opciones de preservación de la fertilidad, como la criopreservación de ovocitos maduros, la criopreservación de embriones después de la fertilización in vitro y la criopreservación de tejido ovárico (OTC). Para los pacientes prepúberes, la OTC es la única opción factible debido a su inmadurez sexual 16,17. En los Estados Unidos, la preservación de la fertilidad a través de OTC ha sido considerada recientemente como una rutina clínica aceptable18. Sin embargo, la OTC todavía se considera experimental en muchos países europeos, y se requiere aprobación ética, particularmente para el autotrasplante19,20. Por lo tanto, los criterios de inclusión para los protocolos de venta libre deben considerarse cuidadosamente y se debe realizar un análisis de riesgo-beneficio para cada paciente. No todos los niños que reciben terapias gonadotóxicas son elegibles para la preservación de la fertilidad. En Suecia, solo se recomienda que los pacientes con riesgo alto o muy alto se sometan a la preservación de la fertilidad de acuerdo con las directrices sobre la preservación de la fertilidad de la Sociedad Nórdica de Hematología y Oncología Pediátrica21. Este grupo incluye (1) niños prepúberes y pospúberes que requieren trasplante de células madre o que reciben radioterapia con el ovario en el campo de rango, y (2) niños pospúberes con dosis acumulativas altas de quimioterapia alquilante. Para las niñas antes de la menarquia, los criterios de inclusión para el riesgo muy alto de infertilidad incluyen aquellas tratadas con cualquiera de los siguientes tratamientos: dosis de radiación >10 Gy al ovario, o terapia alogénica o autóloga con células madre hematopoyéticas (TCMH). Los criterios de exclusión incluyen a aquellos que necesitan productos sanguíneos adicionales para otras preparaciones anticoagulantes antes de la cirugía o que tienen un recuento de neutrófilos <1. Para las niñas/mujeres después de la menarquia, los criterios de inclusión para riesgo alto o muy alto de infertilidad incluyen aquellas tratadas con cualquiera de los siguientes tratamientos: dosis de radiación >10 Gy al ovario, o TCMH alogénico, ciclofosfamida >9 g/m², ifosfamida >60 g/m², procarbazina o compuestos de nitrosourea (BCNU/CCNU) >360 mg/m². Los criterios de exclusión incluyen aquellos con un mayor riesgo de sangrado, mayor riesgo de infección, mayor riesgo de complicaciones quirúrgicas o mayor riesgo de problemas de dolor según lo evaluado por el médico a cargo.

En el caso de la venta libre, el tejido ovárico se recolecta durante las cirugías abdominales mediante laparotomía o laparoscopia mediante ooforectomía unilateral o biopsia. La médula se extrae del tejido ovárico recolectado y la corteza restante se secciona en fragmentos más pequeños para la criopreservación mediante congelación o vitrificación a tasa controlada para su uso posterior en la restauración de la fertilidad22. Luego, las muestras se almacenan en nitrógeno líquido hasta que la paciente se recupera de su tratamiento y desea formar una familia. Dependiendo del tipo de cáncer y en ausencia de contraindicaciones para el trasplante de tejido ovárico, el tejido se descongela y se autoinjerta para restaurar la función hormonal y ovárica. La OTC ha demostrado ser exitosa, con una tasa de embarazo del 50% y más de 200 nacidos vivos reportados después del injerto de tejido ovárico criopreservado recolectado durante la edad adulta 23,24,25. Los nacidos vivos reportados después del autotrasplante de tejido ovárico recolectado durante la infancia son pocos, y ninguno ha sido reportado después del autotrasplante de tejido ovárico indudablemente prepuberal 26,27,28,29,30. La calidad de los tejidos es un requisito previo para el éxito de la restauración de la fertilidad31. Por lo tanto, es fundamental estudiar la calidad de las muestras de tejido recolectadas.

En la actualidad, una forma de estimar la calidad del tejido ovárico es a través de cortes histológicos y recuento manual de los folículos. Sin embargo, es difícil evaluar la normalidad de la densidad folicular debido a la disminución natural de la reserva con el aumento de la edad y a la distribución heterogénea de los folículos. Además, la comparación con los valores de referencia es un desafío, ya que no están estandarizados para el tamaño y la edad de la biopsia. Otras opciones de evaluación, como los niveles séricos de AMH o la tinción del tejido digerido con calceína o rojo neutro, no están bien establecidas o tienen sus propias limitaciones. Wallace y Kelsey publicaron previamente un modelo de reserva ovárica normal a lo largo de la edad mediante la recopilación de datos sobre el número de folículos de ovarios enteros de pacientes sin patologías ováricas conocidas2. Además, dado que las biopsias no son representativas de todo el ovario, Schmidt et al. desarrollaron un método para estimar el número total de folículos basado en biopsias corticales32. Utilizando una versión modificada de este método y el modelo de reserva ovárica normal, se estableció un conjunto de datos de referencia para la densidad de folículos de mujeres de 0 a 25 años33.

Este artículo describe la estrategia para evaluar la normalidad de la densidad de folículos basada en muestras ováricas pequeñas mediante (1) la cuantificación directa de los folículos mediante histología y (2) la comparación de los resultados con referencias estándar normalizadas por edad a través de puntuaciones Z. El uso de puntuaciones Z describe la relación de la densidad de folículos de una biopsia ovárica con una media de grupo de referencia estandarizada por edad y tamaño. Esto será de gran valor para los médicos a la hora de aconsejar a sus pacientes para el autotrasplante y el tratamiento posterior después de la preservación de la fertilidad.

Protocolo

Todos los procedimientos realizados fueron aprobados por la Autoridad Sueca de Revisión Ética (pacientes de Sveafertil, Dnr: 2019-03802) y por el Comité de Ética del Hospital Universitario de Helsinki (pacientes con HCH, Dnr 340/13/03/03/2015). Las enfermeras investigadoras proporcionaron información escrita y oral sobre el estudio y se obtuvo el consentimiento informado de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Para los pacientes menores de 18 años, se obtuvo el consentimiento informado de los tutores legales. Todas las muestras fueron seudonimizadas y procesadas de acuerdo con el Reglamento General de Protección de Datos (RGPD) europeo. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Recolección y procesamiento de tejido ovárico

NOTA: Identifique a todos los pacientes elegibles para la preservación de la fertilidad cuando exista una indicación de un riesgo alto o muy alto de infertilidad siguiendo las pautas locales (p. ej., pautas específicas nórdicas, europeas o internacionales). En Europa, reclutar pacientes menores de edad solo como parte de los programas de investigación de preservación de la fertilidad. Determine el riesgo de infertilidad utilizando las directrices de su país para la preservación de la fertilidad.

  1. Realizar el procedimiento quirúrgico bajo anestesia general. Administrar propofol (2 mg/kg) por vía intravenosa, sufentanilo (0,5 microgramos/kg) y bromuro de rocuronio (0,6 mg/kg) para la inducción de la anestesia.
    1. Intubar y ventilar al paciente con un volumen corriente de 6-8 mL/kg y una presión espiratoria positiva de 6-8 cm deH2O. Administrar sevoflurano al 1% a 2% a través del tubo endotraqueal para mantener la anestesia inhalatoria.
    2. Mantener el bloqueo neuromuscular con bromuro de rocuronio (0,15 mg/kg) durante el procedimiento quirúrgico para proporcionar una adecuada relajación muscular y permitir la laparoscopia a presiones de insuflación intraabdominal más bajas.
    3. Utilice el índice biespectral para guiar la profundidad anestésica y facilitar el despertar rápido con una dosis de anestésico reducida. Antagonizar el bloqueo neuromuscular residual con sugammadex (2-4 mg/kg).
  2. Utilizando una técnica de tres puertos, se inserta un trócar de 10 mm en la cavidad peritoneal en el ombligo para introducir una lente óptica con una cámara acoplada, y dos trócares de 5 mm en las regiones ilíacas izquierda y derecha (2 cm por encima y 2 cm medial a la respectiva columna ilíaca anterosuperior) bajo visión directa para la instrumentación quirúrgica y la extracción de tejido. Inspeccionar los órganos pélvicos, incluidos ambos ovarios, para confirmar la normalidad.
    1. Identifique el ovario al que es más fácil acceder y luego agárrelo. Corte un volumen que sea aproximadamente un tercio del ovario (o como se indique en su permiso ético), luego use diatermia, si es necesario, para asegurar la hemostasia.
      NOTA: Realice la biopsia solo si no existen contraindicaciones, como factores de riesgo de hemorragia excesiva intra o postoperatoria o mayor riesgo de infección. Especificar claramente y seguir los criterios de inclusión y exclusión del país. Se puede extraer todo el ovario si el riesgo de infertilidad es muy alto y/o si el riesgo de cortarse solo una parte se considera demasiado alto (por ejemplo, debido a un sangrado). Evite el uso de diatermia antes de recolectar la muestra porque puede dañar el tejido.
  3. Durante el quirófano, coloque el tejido en un tubo que contenga 5 mL de solución salina tampón de fosfato (PBS) 1x Dulbecco con CaCl2, MgCl2, 1 g/L de D-glucosa, 36 mg/L de piruvato, ya sea calentado a 37 °C si la muestra se procesa inmediatamente en el laboratorio (dentro de los 30 min) o mantenido a 4 °C durante transportes más largos (hasta 24 h).
    NOTA: Las soluciones de transporte incluyen una variedad de soluciones de transporte/perfusión de órganos disponibles en el mercado, así como tampones simples como PBS y MEM34.
  4. Corta un pequeño trozo de tejido ovárico (2 mm x 2 mm x 2 mm) de la superficie del ovario. Esta pieza contiene la corteza, que es la porción externa del ovario donde se encuentran los folículos ováricos35.
    PRECAUCIÓN: Manipule tejidos humanos, como el ovario, utilizando prácticas y procedimientos de Bioseguridad de Nivel 2.
    NOTA: Una unidad especializada en medicina reproductiva criopreserva clínicamente el resto del tejido ovárico para su posible uso futuro en la restauración de la fertilidad de las pacientes.
  5. Coloque el tejido en 350 μL de solución de Bouin a temperatura ambiente durante 2 h o en 350 μL de formaldehído al 4% a 4 °C durante la noche, asegurándose de que el tejido esté completamente sumergido. Después de la incubación, lavar el tejido con etanol al 70% tres veces.
    1. Para la solución de Bouin, lave hasta que el color amarillo desaparezca. Incruste el tejido en cera de parafina36. Corte un mínimo de 30 secciones de tejido en serie con un grosor de 4 μm y colóquelas en portaobjetos de vidrio.
      PRECAUCIÓN: Manipule la solución de Bouin y el formaldehído dentro de una cubierta química y con el equipo de protección adecuado.
      NOTA: El formaldehído puede provocar artefactos relacionados con la contracción en el tejido. Por lo tanto, la solución de Bouin es la opción preferida para preservar la histología. Sin embargo, la solución de Bouin conlleva riesgos adicionales, lo que lleva a varias instituciones a preferir el uso de formaldehído37.

2. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E)

  1. Pesa 5 g de polvo de eosina Y en un frasco de vidrio esterilizado en autoclave de 100 ml. Agregue 800 mL de etanol al 95% y 200 mL de agua desionizada para hacer una solución madre de eosina al 0,5%. Prepare una solución de trabajo de eosina al 0,25% diluyendo 200 ml de la solución madre de eosina al 0,5% con 160 ml de etanol al 100%, 1 ml de ácido acético y 40 ml de agua desionizada.
    NOTA: Es posible que el polvo no se disuelva por completo. Filtre la solución antes de usar para reducir el precipitado.
  2. Coloque los portaobjetos en estantes. Sumerja la rejilla con correderas en los recipientes correspondientes en el siguiente orden: 15 min en xileno, 5 min en etanol al 100%, sumérjalo 10 veces en etanol al 70%, sumérjalo 10 veces en etanol al 50% y luego sumérjalo 10 veces en agua desionizada.
    1. Sumerja la rejilla con portaobjetos en solución de hematoxilina durante 3 minutos, luego transfiera la rejilla con portaobjetos a un recipiente con agua destilada del grifo durante 30 s para lavar el exceso de mancha de hematoxilina.
    2. Coloque la rejilla con portaobjetos en un recipiente con solución de diferenciación (1 mL de HCl al 37% añadido a 100 mL de etanol al 70%) durante 1 min, luego transfiera la rejilla con portaobjetos a un recipiente con agua destilada del grifo durante 30 s.
      NOTA: Asegúrese de que las secciones de tejido estén sumergidas en el líquido. Agregue más reactivo al recipiente si es necesario. Cambie el xileno después de cada 5 usos cuando tiña grandes cantidades. Prepare etanol al 50% diluyendo etanol al 70% (por ejemplo, agregue 35 mL de etanol al 70% a 15 mL de DPBS para hacer 50 mL de etanol al 50%).
      PRECAUCIÓN: Manipule el xileno dentro de una capucha y con el equipo de protección adecuado.
  3. Coloque la rejilla con portaobjetos en el agua del grifo de Scott (también conocida como solución azulada) durante 30-60 s, luego transfiera la rejilla con portaobjetos a un recipiente con agua del grifo destilada durante 30 s. Sumerja la rejilla con portaobjetos en la solución de trabajo de eosina durante 1 min.
    1. Deshidratar los portaobjetos colocándolos en los siguientes reactivos: etanol al 100% durante 30 s, un segundo recipiente con etanol al 100% durante 30 s y luego sumergir dos veces en xileno. Después de retirar la rejilla de la solución de xileno, déjela secar en un recipiente de vidrio para evitar que el xileno gotee dentro de la campana.
    2. Monte la corredera con 2 gotas de solución de montaje. Coloque con cuidado las correderas de la cubierta para evitar burbujas y deje que la solución de montaje se seque.
      PRECAUCIÓN: Manipule el xileno dentro de una capucha y con el equipo de protección adecuado.
  4. Digitalice las diapositivas escaneándolas con escáneres de diapositivas si es posible. Si esta opción no está disponible, utilice un microscopio invertido normal con un aumento de 20-40x para contar directamente los folículos. Asegúrese de tomar una imagen de toda la biopsia para facilitar la medición del área en el software de análisis de imágenes.

3. Recuento de folículos

  1. Si las diapositivas se digitalizaron, abra los archivos con el software adecuado (por ejemplo, el software de código abierto QuPath38). En caso de no estar digitalizado, realizar el análisis directamente utilizando un microscopio invertido y su respectivo software.
    1. Arrastre el archivo a la ventana principal de QuPath. Establezca el tipo de imagen en Brightfield H&E (consulte la Figura 1A). Defina 1 mm del epitelio de la superficie (una sola capa de células cuboidales que recubren la superficie) utilizando la barra de escala. Haga clic en la herramienta elipse y anote los folículos (consulte la Figura 1B).
    2. Cuente el número de folículos dentro de esta área de 1 mm, desde la etapa primordial hasta la primaria. Identifique la etapa de cada folículo (primordial: una capa de células granulosas aplanadas que rodea al ovocito; etapa intermedia: una mezcla de células granulosas aplanadas y cuboidales; primaria: una capa completa de células granulosas cuboidales que rodean el ovocito).
    3. Ingrese el ID de la muestra, la edad, el número de folículos para cada portaobjetos, el grosor de la sección y la nésima sección contada en la hoja denominada Folículo enmm 3 en el archivo de Excel de la calculadora de puntuación Z del folículo (consulte el Archivo complementario 1 y la Figura 2A).
      NOTA: Debido al diámetro de los folículos (folículos más pequeños >35 μm), el mismo folículo puede aparecer en secciones consecutivas. Tenga mucho cuidado al contar secciones en las que la distancia entre secciones sea menor que el diámetro del folículo. Preferiblemente, cuente los folículos de cada10 secciones ( por ejemplo, sección # 10, # 20, # 30). El epitelio de la superficie puede desprenderse durante el procesamiento del tejido y puede estar solo parcialmente presente en los portaobjetos. Cuente solo los folículos con citoplasma visible. Para el control de calidad, haga que dos personas cuenten los folículos de forma independiente y determinen qué tan bien se alinean sus recuentos. Calcule la concordancia entre observadores utilizando una función de correlación simple entre los recuentos de folículos de cada observador para la misma muestra.
  2. Identifique el 10% más grande de los folículos en cada sección contada mediante la observación ocular. Mida el diámetro medio de estos ovocitos haciendo clic en la herramienta de línea , dibujando dos líneas perpendiculares a través de la membrana del ovocito y seleccionando Medir, luego Mostrar medidas de anotación (ver Figura 1C).
    1. Registre las mediciones en la columna Longitud μm (consulte la figura 1D). Introduzca el diámetro medio de todos los ovocitos en el campo Diámetro medio del ovocito (μm) para cada portaobjetos en el archivo de Excel de la calculadora de puntuación Z del folículo (Folículo en mm3, ver Archivo complementario 1 y Figura 2A).
  3. Coloque la imagen en el centro de la pantalla en QuPath, luego haga clic en el icono ImageJ . Seleccione Enviar instantánea a ImageJ (consulte la figura 3A). En ImageJ, demarque 1 mm del borde con la herramienta de pincel . Haga clic en la imagen, luego en Tipo y seleccione 8 bits (consulte la Figura 3B).
    1. Haga clic en la herramienta de línea , dibuje una línea en la barra de escala en la parte inferior izquierda de la pantalla (consulte la Figura 3C). Haga clic en Analizar, luego en Establecer escala, ingrese la longitud indicada en la barra de escala en el campo Distancia conocida y haga clic en Aceptar (consulte la Figura 3C). Haga clic en Imagen, luego en Ajustar, Brillo/Contraste y seleccione Automático (consulte la Figura 3D).
    2. Haga clic en Imagen, luego en Ajustar, Umbral y seleccione Automático (consulte la Figura 3E). Haga clic en la herramienta de varita , seleccione el área, luego presione Ctrl + M (consulte la Figura 3F). Introduzca el valor del área en el archivo de Excel de la calculadora de puntuación Z del folículo (folículo en mm3, véase el archivo complementario 1 y la figura 2A).

4. Cálculos de densidad de folículos, volumen cortical y puntuación Z

  1. Utilice el archivo de Excel de la calculadora de puntuación Z del folículo que se proporciona para realizar automáticamente los cálculos que se describen a continuación. Los resultados aparecerán en la hoja "Z-score (folículo por mm³)" de la calculadora Excel (ver Fichero Complementario 1), siempre que los datos indicados en el apartado 3 se introduzcan en la hoja "folículos en mm³".
  2. Para calcular las densidades de folículos en estas secciones, se utiliza la fórmula modificada presentada por Schmidt et al.32. En primer lugar, aplique el factor de corrección α para tener en cuenta el doble recuento del mismo folículo. La fórmula modificada es la siguiente:
    figure-protocol-1
    figure-protocol-2
    NOTA: En esta fórmula, t es el grosor de la sección, d es el diámetro del ovocito y q es el cociente del diámetro del folículo dividido por el grosor de la sección.
  3. Extrapola el número total de folículos (n folículos) en la corteza a partir del recuento de folículos en la sección usando la siguiente fórmula33:
    figure-protocol-3
    NOTA: Esta fórmula también tiene en cuenta todas las secciones no calculadas. Aquí γ representa el número de secciones que no se calculan (por ejemplo, γ = 10 si se cuenta cada 10secciones ), α es el factor de corrección calculado en 4.1, N es el número de secciones contadas y n i es el número total de folículos en las secciones contadas.
    1. Extrapola todo el volumen cortical (V) de las áreas contadas usando la siguiente fórmula33:
      figure-protocol-4
      NOTA: Aquí, Ai es el área de la sección, y ti es el grosor del tejido. Consulte el paso 4.2 para ver γ y N.
    2. Utilice la siguiente fórmula33 para calcular la densidad del folículo:
      figure-protocol-5
  4. Determine si hay una reserva ovárica reducida (<-1,7 Z) calculando la puntuación Z utilizando la fórmula33:
    figure-protocol-6
    NOTA: La puntuación Z se calcula automáticamente en la hoja "Puntuación Z (folículo por mm³)" en la calculadora de Excel (ver Archivo Complementario 1) en función de la información proporcionada en la Sección 3 (Recuento de folículos) (Figura 2B). En esta fórmula, Z representa la puntuación Z, x es la densidad de folículos calculada (folículos/cm3) de la muestra de estudio (paso 4.4), M es la densidad media de folículos del grupo de edad respectivo y SD es la desviación estándar del grupo de edad respectivo. Los valores de referencia para las mujeres de 0 a 25 años se han establecido en Hassan et al.33. Las medias y desviaciones estándar de las densidades de folículos de los respectivos grupos de edad se pueden encontrar en el archivo de Excel de la calculadora de puntuación Z de folículos (Archivo complementario 1) y se utilizan para los cálculos de la puntuación Z.

Resultados

Los folículos ováricos se cuantifican después de una sección, tinción y escaneo exitosos de los portaobjetos. Se distinguen y analizan las diferentes etapas y la salud de los folículos. En la Figura 4A, se muestra una sección transversal teñida con HE de un ovario fijado a Bouin de un adulto, con ejemplos de tejido cortical y medular. La figura 4B muestra una imagen representativa del ovario de un niño con un ejemplo de epitelio superficial. La reserva ovárica (es decir, el grupo de folículos que no crece) y los pequeños folículos en crecimiento residen en la corteza. Usando un microscopio virtual, los folículos se amplían y clasifican para garantizar la inclusión de la reserva ovárica únicamente. La Figura 5 representa las etapas de los folículos encontrados y contados en los tejidos corticales ováricos de Bouin (Figura 5A) y fijados en formaldehído (Figura 5B): (1) folículos primordiales (alrededor de 40 μm de diámetro), (2) intermedios y (3) primarios. Los folículos 4-6 son ejemplos de folículos que deben excluirse del recuento debido a la incapacidad de asignarles correctamente una etapa de maduración. La Figura 6 muestra imágenes representativas de tejidos corticales ováricos con ausencia o un número bajo de folículos (Figura 6A) y tejidos ováricos con un número medio a alto de folículos (Figura 6B). La Figura 7 muestra imágenes representativas de las secciones de tejido que se excluirán debido a la presencia de solo tejido medular (Figura 7A) o a la mala calidad del tejido (Figura 7B). En la figura 2 se muestran capturas de pantalla del archivo de Excel de la calculadora de puntuación Z del folículo. Los números calculados y las puntuaciones Z asociadas se calculan automáticamente a partir de los datos introducidos. Una puntuación Z <1,7 indica una reserva ovárica reducida en función del área bajo la curva de características operativas de la curva-receptor (AUC-ROC) de las pacientes con síndrome de Turner16.

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Figura 1: Capturas de pantalla del uso del software QuPath. (A) Mostrar el proceso de abrir un archivo de imagen en QuPath y establecer el tipo de imagen. (B) Anotación de folículos utilizando la herramienta de elipse dentro del software. (C,D) Medición del diámetro medio de los ovocitos en las imágenes anotadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Capturas de pantalla del archivo de Excel de la calculadora de puntuación Z del folículo. (A) La hoja "Folículos en mm³" muestra los campos donde se ingresarán los datos (celdas verdes) para la identificación de la muestra, la edad, laenésima sección, el recuento final de folículos, el área, el diámetro medio del ovocito, el grosor de la sección y cada enésima sección contada. La densidad de folículos (folículos/mm³) se calcula automáticamente cuando se introducen todos los datos necesarios; Permanece en blanco si algún dato está incompleto. (B) La hoja "Puntuación Z (folículos por mm³)" vincula los datos de identificación, edad y folículo/mm³ de la hoja "Folículos en mm³" y calcula automáticamente la puntuación Z para la muestra. Los valores de referencia correspondientes aparecen en la tabla de la derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Capturas de pantalla del uso del software ImageJ. (A) Transferencia de una imagen de QuPath a ImageJ. (B) Establecer el tipo de imagen dentro de ImageJ. C) Establecer el baremo de medición. (D,E) Ajuste automático del brillo/contraste y el umbral de la imagen. (F) Medición del área dentro de la imagen ajustada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Imágenes representativas del tejido ovárico. (A) Una imagen de un ovario de un adulto sometido a una cirugía de reasignación de género. La corteza, que tiene una mayor densidad de células somáticas y contiene la reserva ovárica, es visible junto con el tejido medular, que se caracteriza por una menor densidad y células somáticas más grandes y, a menudo, contiene más vasos. (B) Una imagen de un ovario de un niño en proceso de preservación de la fertilidad. La corteza se determina midiendo 1 mm desde el epitelio superficial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Imágenes representativas de folículos en el ovario fijados con diferentes soluciones. (A) Folículos fijados con solución de Bouin y (B) con formaldehído al 4% en varias etapas: (1) folículo en etapa primordial, (2) folículo en etapa intermedia, (3) folículo en etapa primaria. Se excluyen los folículos (4) a (6) debido a la ausencia de citoplasma visible. Los artefactos comunes en la fijación de formaldehído incluyen la separación de la membrana basal del tejido (indicada por flechas verdes) y las células picnóticas de la granulosa (indicadas por puntos amarillos). Las barras de escala representan 50 μm. Esta figura es una adaptación de Björvang et al.39. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Imágenes representativas de biopsias corticales de un ovario infantil. (A) Una biopsia que muestre un número de folículos nulo o bajo y (B) una biopsia que muestre un recuento de folículos de medio a alto. Los folículos están marcados con un asterisco (*). La línea discontinua azul indica 1 mm del epitelio de la superficie, mientras que la línea negra marca el epitelio de la superficie. Las barras de escala representan 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: Imagen representativa de las secciones de tejido a excluir. (A) Un pedazo de ovario donde se tomó la médula, en lugar de la corteza. Esta sección se caracteriza por la presencia de epitelio superficial y la baja densidad de células. (B) Una sección de tejido de mala calidad, identificada por abrasiones en el tejido. Las barras de escala representan 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Ficha complementaria 1: Calculadora de puntuación Z del folículo. Este archivo facilita el cálculo de las puntuaciones Z de los folículos. Es necesario introducir los datos (ID de la muestra, edad, número de folículos por portaobjetos, grosor de la sección,N-ésima sección contada y área) en la hoja "Folículos en mm³". A continuación, la puntuación Z se calcula automáticamente y se resume en la hoja "Puntuación Z (folículos por mm³)". Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Las mujeres nacen con un grupo finito de ovocitos, que no se pueden reponer. La reserva ovárica es un determinante clave del potencial reproductivo de una mujer. En este artículo se describe un método para la cuantificación histológica de la densidad folicular y su comparación con los estándares de referencia utilizando puntuaciones Z de las densidades de folículos corticales ováricos en pacientes jóvenes y mujeres de hasta 25 años de edad.

En este protocolo, el tejido ovárico se obtiene de niñas y mujeres con riesgo alto o muy alto de infertilidad que se someten a OTC para preservar la fertilidad, o de pacientes que se someten a una cirugía de reasignación de género. Se utiliza una pequeña pieza de tejido ovárico para evaluar el material criopreservado. Dado que la reserva ovárica varía con la edad, la conversión de las densidades foliculares a puntuaciones Z permite la comparación con los valores de referencia normalizados por edad desde el nacimiento hasta la madurez sexual (Hassan et al.33). El uso de las puntuaciones Z proporciona un método estandarizado por edad e independiente de la cohorte para estimar la normalidad de una muestra de reserva ovárica. Se establece una media del grupo de referencia basada en la edad, que luego se utiliza para el cálculo de la puntuación Z de una muestra individual. Este enfoque permite evaluar la normalidad independientemente de la distribución por edades dentro de la población estudiada. La evaluación estandarizada por edad de la reserva ovárica permite la combinación de datos de pacientes con antecedentes genéticos similares o exposiciones a quimioterapia en diferentes poblaciones de estudio, lo que facilita los metanálisis a gran escala.

Este método tiene limitaciones. Los recuentos de folículos en los tejidos ováricos de pacientes sin patología ovárica conocida son limitados. Los estándares de referencia establecidos se basan en un pequeño número de muestras, especialmente cuando se consideran diferentes grupos de edad, y solo son aplicables a mujeres de hasta 25 años de edad en tratamiento con OTC. En consecuencia, esta herramienta no es aplicable a mujeres mayores de 25 años. Además, es posible que una pequeña pieza de tejido cortical no contenga folículos, incluso en mujeres en edad reproductiva, debido a la distribución desigual de los folículos a lo largo de la corteza32. Además, la orientación del tejido durante el proceso de inclusión podría oscurecer la correcta identificación de la corteza. Las biopsias suelen ser muy pequeñas y el método de recolección de biopsias no está estandarizado, lo que lleva a la posibilidad de recibir tejido ovárico que es principalmente medular, lo que lo haría inadecuado para la evaluación de la puntuación Z.

Además, los estudios aún no han confirmado el uso de la biopsia ovárica para el diagnóstico de la fertilidad remanente40. Es importante tener en cuenta que este método sólo tiene en cuenta la densidad de los folículos, no la salud de los folículos. El uso de tejido fijado con formaldehído, conocido por causar artefactos tisulares (como se muestra en la Figura 5B), complica la determinación de si la morfología anormal es el resultado de la atresia folicular o del procedimiento de fijación. Este problema podría abordarse en el futuro utilizando técnicas de imagen de alta resolución sin etiquetas, como la microscopía de fase cuantitativa41 o fijadores alternativos37. Además, todo el proceso, desde la recolección de la biopsia hasta el recuento manual de folículos, es invasivo, requiere mucho tiempo y mano de obra, lo que hace que la evaluación de la densidad de folículos a través de la histología sea poco práctica para algunos grupos de pacientes.

Además, sigue sin estar claro qué folículos están destinados a la maduración y cómo la quimioterapia afecta el tamaño y la funcionalidad de la reserva ovárica. Se necesitan más estudios que utilicen este método a mayor escala y durante un período más largo antes de que se pueda establecer una correlación con el éxito del trasplante de tejido ovárico.

Sin embargo, este método tiene un valor significativo tanto en la investigación de la biología ovárica como en el asesoramiento clínico sobre fertilidad. El uso de las puntuaciones Z mejora la interpretación de la reserva ovárica de una persona al compararla con un estándar de referencia. Esto facilita un examen exhaustivo del tamaño y la normalidad de la reserva ovárica en diferentes grupos de pacientes y poblaciones de estudio. Por ejemplo, este método puede emplearse para evaluar las asociaciones entre la reserva ovárica y diversas exposiciones, como los productos químicos ambientales o los tratamientos gonadotóxicos39. Varias clínicas obtienen rutinariamente biopsias pequeñas para la evaluación histológica durante la preparación del tejido para la criopreservación. En estos casos, este método podría resultar útil para determinar la normalidad de la reserva ovárica antes de la criopreservación. En resumen, las densidades de los folículos pueden utilizarse para estimar el tamaño de la reserva ovárica a nivel poblacional39, lo que convierte a este método en una herramienta valiosa para los estudios epidemiológicos, así como para el asesoramiento sobre la fertilidad.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a los profesionales de la salud que nos ayudaron con el reclutamiento de participantes y la recolección de tejidos y a todas las pacientes que donaron su tejido ovárico. También reconocemos al Fondo de Cáncer Infantil (PR2020-0096) y al Instituto Karolinska PhD que financia KID, cuya financiación hizo posible este trabajo. También nos gustaría agradecer al servicio de Análisis de Fenotipos Morfológicos por la preparación de las láminas histológicas. Agradecemos a Nicola Byers por la edición lingüística de este manuscrito.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1x Solución salina tamponada con fosfato de DulbeccoThermo Fisher14190144
1x solución salina tamponada con fosfato con CaCl2, MgCl2, 1 g/L de D-glucosa, 36 mg/L de piruvato Thermo Fisher14287-080
Ácido clorhídrico al 37%Sigma-Aldrich1.09057.1000
70% etanolHistolabs01370.01L
1057214395%Etanol científico de Fisher
Histolabs01399.01L
Solución de BouinSigma-AldrichHT10132-1L
Eosina Y Ácido libreSigma-AldrichE4009-5G 
FormaldehídoThermo Fisher28908
Solución de hematoxilina según DelafieldSigma-Aldrich03971-250ML
ImageJ
Microsoft Excel
Microtomo 
Solución de montaje de Pertex Histolabs00840-05
PropofolBaxter Holding B.V.N01AX10código ATC proporcionado en lugar del número de catálogo
QuPathhttps://qupath.github.io/
bromuro de rocuronio B. Braun Melsungen AG M03AC09código ATC en lugar del número de catálogo
Concentrado sustituto de agua del grifo Scott'sSigma-AldrichS5134-6x100ml
SevofluranoBaxter Medical AB N01AB08se proporciona un código ATC en lugar del número de catálogo Escáner de
diapositivas 
SufentanilHameln Pharma gmbhN01AH03código ATC en lugar del número de catálogo
SugammadexBaxter Holding B.V.V03AB35código ATC proporcionado en lugar del número de catálogo
SuperFrost más blanco Histolabs  06400 
Portaobjetos de microscopio SuperFrost Plus WhiteHistolabs  06400 
XilenoSaveen Werner131769.1611
Etanol al

Referencias

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