Artículo de método

Caracterización de moduladores de receptores activados por proteasas con un ensayo de movilización de calcio mediante un lector de placas

DOI:

10.3791/66507

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24 de mayo de 2024

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1Function Therapeutics, 2Department of Chemistry, Marquette University, 3School of Medicine, Washington University

En este artículo

Resumen

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Se ha desarrollado un protocolo mejorado para un ensayo de movilización de calcio con células endoteliales, utilizado para identificar ligandos de receptores activados por proteasas (PAR). El nuevo protocolo reduce el tiempo total de ensayo entre 90 y 120 minutos y produce curvas de concentración-respuesta reproducibles.

Resumen

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Los cambios en la concentración de calcio en las células se monitorean rápidamente de una manera de alto rendimiento con el uso de tintes intracelulares, fluorescentes que se unen al calcio e instrumentos de imagen que pueden medir las emisiones fluorescentes de hasta 1.536 pocillos simultáneamente. Sin embargo, estos instrumentos son mucho más caros y pueden ser difíciles de mantener en comparación con los lectores de placas ampliamente disponibles que escanean los pocillos individualmente. Aquí se describe un ensayo de lector de placas optimizado para su uso con una línea celular endotelial (EA.hy926) para medir la activación impulsada por el receptor activado por proteasa (PAR) de la señalización Gαq y la posterior movilización de calcio utilizando el colorante de unión al calcio Fluo-4. Este ensayo se ha utilizado para caracterizar una variedad de ligandos PAR, incluidos los ligandos antiinflamatorios "parmodulina" alostéricos dirigidos a PAR1 identificados en el laboratorio de Dockendorff. Este protocolo evita la necesidad de un manipulador de líquidos automatizado y permite el cribado de ligandos PAR en placas de 96 pocillos y debería ser aplicable al estudio de otros receptores que inician la movilización del calcio.

Introducción

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Los receptores activados por proteasas (PAR)1,2,3 son una subfamilia de receptores acoplados a proteínas G (GPCR) de clase A que se expresan en una variedad de tipos de células, incluidas las plaquetas y las células endoteliales 4,5,6,7. A diferencia de la mayoría de los GPCR, los PAR tienen un modo de activación intramolecular único. La mayoría de los GPCR son activados por ligandos solubles que interactúan con un bolsillo de unión distinto, pero los PAR son activados por la escisión proteolítica del N-terminal, lo que da como resultado un nuevo ligando atado que puede interactuar con el dominio del bucle extracelular 2 en la superficie de una célula 6,8,9. Esta interacción activa el receptor y puede iniciar varias vías de señalización, promoviendo efectos como la inflamación y la activación plaquetaria 4,10,11,12. Diferentes proteasas pueden activar PARs a través de la escisión en sitios únicos en el extremo N-terminal, revelando diferentes ligandos atados (TL) que estabilizan las conformaciones de los receptores, que inician diferentes vías de señalización 9,13,14,15. Por ejemplo, en el miembro más estudiado de la subfamilia, PAR1, la escisión por trombina se utiliza para apoyar numerosos procesos biológicos, incluida la activación plaquetaria y el reclutamiento de leucocitos al endotelio, pero puede provocar efectos deletéreos cuando el receptor se sobreexpresa o se sobreactiva 4,16,17,18,19,20,21 . Por el contrario, la escisión por la proteína C activada (aPC) puede promover efectos antiinflamatorios y mantenimiento de las barreras endoteliales 15,22,23,24,25,26,27,28,29. Los PARs también pueden ser activados por análogos peptídicos de los TLs de forma intermolecular 13,30,31. Estos péptidos se utilizan de forma rutinaria para medir la inhibición (modulación) de PAR en lugar de las proteasas dirigidas a PAR, y se utilizan en este protocolo.

Numerosos trastornos se asocian con la señalización patológica de PAR1, incluyendo sepsis22,32, enfermedad cardiovascular 33,34,35,36,37,38, enfermedad renal 39,40,41,42, enfermedad de células falciformes43, fibrosis44, osteoporosis y osteoartritis45,46, neurodegeneración 47,48,49,50,51 y cáncer 52,53,54,55,56,57,58,59. Los antagonistas de PAR1 se han estudiado desde la década de 1990 como agentes antiplaquetarios para las enfermedades cardiovasculares, y la creciente lista de enfermedades asociadas con el receptor requiere la identificación de nuevos ligandos para su uso como sondas biológicas (compuestos herramienta) o como posibles terapias. Actualmente, solo existe un antagonista de PAR1 aprobado por la FDA, vorapaxar, que se usa para tratar la enfermedad de las arterias coronarias en pacientes de alto riesgo 34,36,37,60. Un antagonista alternativo de PAR1, la pepducina PZ-128, completó con éxito un estudio de fase II para prevenir la trombosis en pacientes con cateterismo cardíaco38. El grupo de Dockendorff se ha centrado en la química medicinal y la farmacología de una clase separada de moléculas pequeñas, los ligandos PAR1 conocidos como parmodulinas 61,62. A diferencia de los antagonistas de PAR1 reportados, como el vorapaxar, las parmodulinas son moduladores alostéricos y sesgados de PAR1 que bloquean selectivamente la vía Gαq mientras promueven efectos citoprotectores similares a los de aPC. A diferencia de los potentes antagonistas ortostéricos de PAR1 como el vorapaxar, las parmodulinas publicadas también son reversibles 63,64,65.

Inicialmente, las parmodulinas fueron identificadas por Flaumenhaft y colaboradores por su capacidad para inhibir la expresión de P-selectina o la secreción de gránulos en plaquetas61,66. Sin embargo, se requería un método alternativo para estudiar los efectos de las parmodulinas en las células endoteliales. Un método común para monitorear la señalización relacionada con GPCR es medir la movilización intracelular de Ca2+, un mensajero secundario importante que se puede medir utilizando un colorante intracelular adecuado que se une al calcio67,68. Se han proporcionado pruebas sustanciales que demuestran que la movilización de calcio inducida por PAR1 se produce a través de la activación de Gαq 69,70. Una vez activado por su ligando anclado (o un ligando exógeno adecuado), PAR1 sufre un cambio conformacional que hace que el difosfato de guanosina (GDP) unido a la subunidadG αq sea reemplazado por trifosfato de guanosina (GTP)68. A continuación, la subunidadG αq activa la fosfolipasa Cβ (PLC-β), que cataliza la hidrólisis del fosfatidilinositol 4,5 bisfosfato (PIP2), formando trifosfato de 1,4,5-inositol (IP3) y diacilglicerol (DAG). Finalmente, IP3 se une a los canales de Ca2+ sensibles a IP3 en la membrana del retículo endoplásmico, lo que permite que el Ca2+ se libere en el citoplasma, donde puede unirse a colorantes fluorescentes dependientes de Ca2+, como Fluo-4, que se agregan a las células71. Este proceso ocurre en segundos y puede aumentar la concentración de Ca2+ 100 veces, lo que lleva a un cambio drástico en la cantidad de tinte unido al calcio y una señal de fluorescencia robusta.

En 2018, el grupo de Dockendorff reveló un ensayo de movilización de Ca2+ de rendimiento medio que podría usarse para identificar antagonistas de la vía Gαq de PAR172. El ensayo utilizó EA.hy92673, una línea celular endotelial humana híbrida, que se puede usar para múltiples pasajes sin un cambio notable en la expresión de PAR1, y se establece para mediciones in vitro de efectos citoprotectores.

El protocolo original utilizó células EA.hy926 en placas de 96 pocillos y cargadas con colorante Fluo-4/AM, que se eligió debido a su intensa fluorescencia a 488 nm y su alta permeabilidad celular. Una vez que el tinte se cargaba en las celdas, se realizaban largos pasos de lavado con un manipulador de líquidos automatizado de 8 canales (los métodos más rápidos de manejo de líquidos, como una lavadora de 96 canales, eran inaccesibles). La reproducibilidad de este ensayo fue superior a la que se produjo sin los cambios cuidadosos y automatizados de medios robóticos. A continuación, se incubaron antagonistas con las células, PAR1 se activó mediante la adición secuencial de un agonista selectivo (16 pocillos a la vez) y se midieron los cambios en la fluorescencia resultantes de la movilización del calcio y la unión del colorante para determinar la actividad.

Si bien este protocolo permite la medición de la movilización de calcio mediada por PAR1, está limitado por el tiempo requerido para analizar cada placa de 96 pocillos. Los largos tiempos de experimentación son problemáticos no solo porque el número de compuestos que se pueden analizar cada día es limitado, sino también porque el flujo de colorante se produce con el tiempo, lo que reduce la ventana de ensayo al aumentar la fluorescencia basal. Un factor que contribuye al largo tiempo del experimento es el uso de un manipulador de líquidos de 8 canales para el lavado de placas, que agrega más de 30 minutos a cada experimento. Las propinas requeridas también se volvieron difíciles de obtener debido a problemas en la cadena de suministro. Aquí se informa de un protocolo actualizado para el ensayo de movilización de calcio mediado por PAR que no requiere un manipulador de líquidos y, por lo tanto, puede ejecutarse con un mayor rendimiento. Este protocolo también debería ser adecuado para medir la señalización con otros GPCR que conducen a la movilización de calcio intracelular. Este protocolo de lector de placas actualizado es ideal para laboratorios académicos y pequeños laboratorios industriales que no tienen los recursos para costosos instrumentos de imágenes celulares, pero tienen la necesidad de analizar rápidamente numerosos compuestos. Para un ejemplo de un ensayo de movilización de calcio utilizando un generador de imágenes en placas, véase Caers et al.74.

Protocolo

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Todos los intercambios/adiciones de medios realizados en los pasos 1 y 2 del siguiente protocolo se realizan en una campana estéril. A menos que se indique lo contrario, todos los utensilios de plástico utilizados en la campana estéril deben comprarse esterilizados y sellados o esterilizarse adecuadamente a través de un autoclave.

1. Inicio de la línea celular EA.hy926

  1. Adquiera las celdas EA.hy926.
  2. Almacene los viales de celdas en la fase de vapor de un tanque de nitrógeno líquido.
  3. Prepare el medio completo DMEM calentando primero DMEM, FBS y pluma/estreptococo (consulte la Tabla de materiales para obtener detalles específicos) en un baño de agua a 37 °C durante 15-30 min. Agregue 50 mL de FBS y 1 mL de pluma/estreptococo a 500 mL de DMEM. Mezcle suavemente la solución por inversión.
    NOTA: Mezclar demasiado vigorosamente causa cantidades excesivas de burbujas.
  4. Retire un vial de células de nitrógeno líquido y caliéntelo en un baño de agua a 37 °C durante 5 min.
  5. Esterilice el vial de células y el frasco de medio completo DMEM rociándolo con alcohol, luego muévalo a la campana estéril.
  6. Utilice una pipeta de 1.000 μL para transferir cuidadosamente las células a un tubo de centrífuga estéril de 15 mL. Agregue 1 mL de DMEM al vial para enjuagar y agregue al tubo de centrífuga.
  7. Haga una bolita de células con una centrífuga (150 × g, 5 min, 22 °C). Retire el medio del tubo de centrífuga por aspiración; Tenga cuidado de no perturbar la pellet de la celda.
  8. Añada 3 mL de medio completo DMEM al tubo de centrífuga y separe suavemente el pellet mezclando la suspensión de la célula con una pipeta de 1.000 μL.
    NOTA: Se debe evitar causar burbujas al mezclar demasiado vigorosamente, ya que esto podría activar o dañar las células.
  9. Mezcle 10 μL de la suspensión celular con 10 μL de azul de tripano en un tubo de microcentrífuga utilizando una pipeta con puntas de 20 μL o 200 μL. Agregue 10 μL de la mezcla de suspensión celular / azul de tripano a un hemocitómetro y cuente las células.
    NOTA: El uso de puntas de pipeta de 0,1-10 μL puede cizallar las células. Las puntas de este tamaño no deben usarse mientras se manipula la suspensión de celdas.
  10. Añada el medio completo DMEM a la suspensión celular para obtener una densidad de 66.000 células/ml utilizando una pipeta serológica de 10 o 25 mL. Pipetear 15 mL de la suspensión celular en matraz de cultivo T-75. Asegure la dispersión uniforme de la suspensión de la celda moviendo el matraz de norte a sur y de este a oeste.
  11. Incubar las células hasta que alcancen la confluencia (generalmente después de 4-6 días), según lo estimado por un examen bajo un microscopio. En este punto, use las celdas en el experimento (comenzando con la sección 2) o siembrójelas en nuevos matraces para expandirlos y preparar existencias congeladas (a una densidad de siembra recomendada de 1,000,000 de celdas en 15 mL de medio completo por matraz T-75).
    NOTA: Las células se pueden cultivar en los matraces de cultivo durante un máximo de 3 semanas sin que se note una diferencia en la forma, la salud o el rendimiento del ensayo. El medio completo debe cambiarse cada 3-4 días.

2. Adición de celdas EA.hy926 a placas de 96 pocillos

NOTA: Las células de un matraz de cultivo T-75 confluente pueden utilizarse para preparar dos o tres placas de ensayo o, opcionalmente, ampliarse hasta en un máximo de 15 matraces T-75 frescos. Se pueden analizar al menos cinco placas de ensayo utilizando el protocolo de las secciones 4 y 5 en una jornada laboral normal. Las siguientes instrucciones describen la preparación y prueba de una placa de ensayo, pero se pueden preparar placas adicionales repitiendo los pasos 2.2, 2.7, 2.12 y 3.2 para preparar el número deseado de placas de ensayo. Lo más habitual es que se preparen cuatro placas de ensayo al día para medir las respuestas a la concentración con hasta 16 compuestos, lo que requiere dos matraces T-75 con células confluentes.

  1. Calentar el medio completo DMEM en un baño de agua a 37 °C durante 15-30 min. Esterilice el frasco de DMEM complete medium rociándolo con alcohol, luego muévalo a la campana estéril.
  2. Agregue 100 μL de una solución de gelatina esterilizada al 0,4% a todos los pocillos de una placa de fondo transparente de 96 pocillos de paredes negras con tapa. Incubar la placa con la solución de gelatina en una incubadora (37 °C, 5% CO2) durante 30 min.
  3. Confirme que las células de un matraz de cultivo T-75 son 80-100% confluentes utilizando un microscopio invertido. Retire el medio completo DMEM del matraz T-75 por aspiración.
  4. Lave las células del matraz con 10 ml de PBS y mueva suavemente el matraz de norte a sur y de este a oeste. Retire el PBS del matraz por aspiración.
  5. Añada 5 mL de solución de disociación celular al matraz e incube el matraz en una incubadora (37 °C, 5% CO2) durante ~12 min. Golpee el matraz después de 6 minutos para ayudar a facilitar la disociación.
    NOTA: La incubación de células durante más de 15 minutos con el agente de disociación celular referenciado hace que las células comiencen a agruparse, lo que dificulta la obtención de un recuento celular preciso y puede interferir con el ensayo.
  6. Añada 5 mL del medio completo DMEM precalentado al matraz y mezcle suavemente con la solución de disociación celular/suspensión celular. Con una pipeta serológica de 10 mL, agregue la suspensión celular en un tubo de centrífuga estéril de 50 mL. Haga un pellet de células con una centrífuga (150 × g, 5 min, 22 °C).
  7. Mientras se forma el pellet, retire la solución de gelatina de la placa de 96 pocillos por aspiración con una pipeta Pasteur conectada a una aspiradora. Retire la tapa de la placa desde el momento de la extracción de la gelatina hasta que la solución esté lista para ser emplatada.
    NOTA: Opcionalmente se puede utilizar una pipeta multicanal o un colector estéril conectado a una aspiradora.
  8. Extraer el medio del tubo de centrífuga por aspiración utilizando una pipeta Pasteur conectada a una aspiradora o una pipeta serológica; Tenga cuidado de no perturbar la pellet de la celda.
  9. Añada medio completo DMEM fresco al tubo de centrífuga con una pipeta serológica de 5 o 10 ml. Rompa suavemente el gránulo celular mezclando el medio completo DMEM con una pipeta de 1.000 μL o una pipeta serológica de 5 mL.
    NOTA: Por lo general, se usan ocho mililitros de DMEM, pero se pueden agregar volúmenes más altos para facilitar el recuento de células.
  10. Mezcle 10 μL de la suspensión celular con 10 μL de azul de tripano en un tubo de microcentrífuga utilizando una pipeta con puntas de 20 μL o 200 μL. Agregue 10 μL de la mezcla de suspensión celular / azul de tripano a un hemocitómetro y cuente las células.
  11. Añada medios completos DMEM a la suspensión celular para obtener una densidad de 600.000 células/mL utilizando una pipeta serológica de 10 o 25 mL. Esto dará una densidad final de 60.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos (determinada como la densidad óptima por experimentación).
    NOTA: Un cultivo celular normal exitoso producirá entre 12.000.000 y 15.000.000 de células, que pueden sembrar de dos a tres placas de 96 pocillos.
  12. Mezcle la suspensión celular invirtiendo suavemente el tubo de centrífuga y añádalo a un depósito de pipeta multicanal de 50 mL. Mezclando la suspensión en el depósito cada 30 s meciendo suavemente el depósito de lado a lado, agregue 100 μL de la suspensión celular a cada pocillo usando una pipeta multicanal. Vuelva a colocar la cubierta transparente de la placa y agite suavemente la placa deslizándola sobre la superficie de la campana estéril de norte a sur y de este a oeste para garantizar una distribución uniforme de las células. Incubar la placa en la incubadora (37 °C, 5% CO2) durante 16-24 h.
    NOTA: Se puede usar una suspensión de celda adicional para preparar placas adicionales, o se pueden repetir los pasos 1.10-1.11 para continuar con la línea de celda.

3. Preparación del ensayo de movilización de calcio

  1. Prepare los reactivos de ensayo.
    1. Prepare la solución de probenecid (250 mM, acuosa) añadiendo 36 mg de probenecid a un tubo de microcentrífuga y disolviéndolo en NaOH 0,6 M (500 μL). Vortex, la solución.
      NOTA: El probenecid mejora la retención de colorante en la célula al inhibir los transportadores de iones orgánicos 75,76,77.
    2. Para producir tampón de ensayo HBSS-HEPES, añada HEPES (1,19 g) a un frasco de 500 ml de HBSS sin rojo de Ca/Mg/fenol (haciendo una solución de 10 mM de HEPES). Complemente el tampón con MgCl2 (solución acuosa 1 M, 500 μL) y CaCl2 (solución acuosa 1 M, 500 μL). Mezcle la solución y guárdela en el frigorífico a 5 °C cuando no esté en uso.
      1. Para cada placa de 96 pocillos, agregue 50 mL del tampón de ensayo HBSS-HEPES a un tubo de centrífuga de 50 mL, complemente con 500 μL de la solución de probenecid y mezcle bien. Caliente el tampón a temperatura ambiente antes de usarlo.
    3. Prepare una solución de Pluronic F-127 al 10% en DMSO añadiendo Pluronic F-127 (20 mg) a un tubo de microcentrífuga o vial de HPLC y disolviéndolo con 200 μL de DMSO.
      NOTA: Esta solución se puede almacenar a temperatura ambiente y es suficiente para unos 30 platos. Pluronic F-127 se disuelve muy lentamente a temperatura ambiente y debe calentarse suavemente para facilitar la disolución.
    4. Prepare el tampón de carga de colorante agregando primero 24 μL de DMSO a un vial de Fluo-4/AM (50 μg) para disolver el tinte. En un tubo de centrífuga de 15 ml envuelto en papel de aluminio, agregue 6 ml de tampón de ensayo HBSS-HEPES y complemente con 6 μl de F-127 plurónico al 10 % y 6 μl de solución Fluo-4/AM. Agite brevemente la solución y déjela reposar a temperatura ambiente, fuera de la luz, durante 10 minutos.
      NOTA: Para evitar el fotoblanqueo de Fluo-4, mantenga el tinte alejado de la luz envolviendo papel de aluminio alrededor del tubo de centrífuga que contiene la solución de tinte y la tapa de la placa de ensayo.
  2. Prepare las placas de ensayo.
    1. Retire la placa de ensayo de la incubadora y confirme la confluencia con un microscopio invertido. Retire manualmente el medio completo DMEM deslizándolo hacia un fregadero y secando la parte superior del plato con una toalla de papel.
      NOTA: El medio se elimina lo suficiente sosteniendo la placa horizontalmente y moviéndola, seguida de girar la placa 180 ° y repitiendo.
    2. Añada tampón de ensayo HBSS-HEPES más solución de probenecid a un depósito de disolvente de pipeta multicanal de 50 mL.
      NOTA: Esta solución se utilizará para los pasos de lavado posteriores y debe dejarse a un lado y cubrirse con papel de aluminio hasta que se necesite.
    3. Añada 100 μl del tampón de ensayo HBSS-HEPES más la solución de probenecid a cada pocillo con una pipeta multicanal y deje que las células se asienten en presencia de probenecid durante 5 min. Retire el tampón de ensayo HBSS-HEPES deslizándolo hacia el sumidero de la misma manera que en el paso 3.2.1.
    4. Añada el tampón de carga de colorante a un depósito de disolvente de pipeta multicanal de 50 ml independiente. Añada 50 μl del tampón de carga de colorante a cada pocillo de la placa de ensayo mediante una pipeta multicanal. Incubar la placa durante 45 min (37 °C, 5% CO2).
    5. Mientras la placa está en la incubadora, prepare las soluciones de agonistas/antagonistas.
      1. Las soluciones antagonistas se almacenan como soluciones de 31,6 mM en DMSO. En un tubo de PCR, diluir 2 μL de la solución madre con 38 μL de 0,1% BSA/agua para obtener una solución de 1,58 mM. 2 μL de esta solución darán una concentración final de 31,6 μM en la placa de ensayo. Diluir 4 μL de la solución antagonista de 1,58 mM con 36 μL de DMSO al 5%/agua (sin adición de BSA), y preparar las concentraciones restantes mediante diluciones en serie.
      2. Prepare una solución de 108,3 μM (16,7x) de TFLLRN-NH2 en tampón de ensayo HBSS-HEPES, que dará una concentración final de 6,5 μM cuando se añadan 6 μL a cada pocillo de la placa de ensayo. Por ejemplo, disuelva una alícuota de 2 mg de TFLLRN-NH2 con 5,244 mL de tampón de ensayo HBSS-HEPES para obtener una solución madre de 0,5 mM. Mezcle 1,083 mL de esta solución con 3,917 mL de tampón de ensayo HBSS-HEPES para obtener una solución de 108,3 μM.
        NOTA: LAS SOLUCIONES TFLLRN-NH2 deben almacenarse en un congelador de -20 °C cuando no estén en uso.
    6. Retire la placa de la incubadora y asegure la absorción del tinte mediante el uso de un microscopio de fluorescencia en un ajuste adecuado (por lo general, para la proteína fluorescente verde, consulte la Figura 1 para ver un ejemplo de Fluo-4 cargado con éxito en las células). Retire el tampón de carga de tinte moviendo la placa de la misma manera que en el paso 3.2.1.
    7. Lave las células 2 veces con 50 μL de tampón de ensayo HBSS-HEPES más solución de probenecid (a partir del paso 3.2.3) en cada pocillo (retírelo moviendo el medio en el fregadero).
    8. Añada 92 μl de tampón de ensayo HBSS-HEPES a cada pocillo y vuelva a observar las células con un microscopio de fluorescencia para asegurarse de que el exceso de colorante se ha eliminado por completo y que las células siguen adheridas.
    9. Utilice una pipeta multicanal para añadir 2 μL de las soluciones antagonistas y el vehículo a los pocillos apropiados (consulte la Tabla 1 para obtener un mapa de placas representativo).

4. Realización del ensayo de movilización de calcio

  1. Ajuste el lector de placas de la siguiente manera: temperatura: 37 °C; longitud de onda de excitación: 485 nm; longitud de onda de emisión: 525 nm; altura de medición: 7,8 mm (optimizada); número de destellos: 100; Número de repeticiones: 20.
  2. Incubar la placa durante 15 min en el lector de placas a 37 °C. Mida la fluorescencia de fondo en las columnas 1 y 2 (cinco escaneos por pocillo).
  3. Expulse la placa del lector de placas y añada rápidamente 6 μL de solución agonista a cada pocillo de las columnas 1 y 2 desde una tira de PCR de 8 tubos utilizando una pipeta multicanal.
    NOTA: Para este paso, utilizamos una pipeta electrónica de 8 canales con puntas de pipeta de 0,1-10 μL.
  4. Mide el cambio en la fluorescencia a medida que se produce la movilización de calcio en las células. Realice 20 escaneos de cada pocillo de acuerdo con la configuración anterior.
    NOTA: El escaneo de cada pocillo en dos columnas de 20x cada una toma aproximadamente 5 minutos (es decir, ~ 15 s entre escaneos de cada pozo).
  5. Repita los pasos 4.2 a 4.4 para las columnas 3 a 12 en incrementos de dos columnas.

5. Análisis de datos

  1. Exporte los datos del ensayo como hojas de cálculo separadas para cada grupo de dos columnas.
  2. Encuentre el promedio de las lecturas de fluorescencia basal utilizando la función AVG (primer escaneo: último escaneo). Haga esto para cada pozo en ambas columnas.
  3. Encuentre la fluorescencia máxima después de la adición de un agonista utilizando la función MÁX (primer escaneo: último escaneo).
  4. Calcule el cambio en la fluorescencia restando la fluorescencia basal de la fluorescencia máxima.
  5. Reste el cambio en fluorescencia calculado para el control negativo (adición de vehículo sin agonista) de cada pocillo en la misma columna.
  6. Encuentre el cambio relativo (normalizado) en la fluorescencia dividiendo el cambio en la fluorescencia en cada pocillo por el cambio en la fluorescencia en el vehículo (0,1% DMSO/agua) + 6,5 μM TFLLRN-NH2 pocillo.
  7. Copie los valores no controlados, como porcentajes, en un programa de software de estadísticas y gráficos. Si utiliza el software al que se hace referencia, elija la opción de tabla XY, con los Números elegidos como eje X y replique los valores en subcolumnas una al lado de la otra como eje Y.
  8. Utilice el programa para trazar curvas de concentración-respuesta (CRC) a partir de los datos. Si utiliza el software al que se hace referencia, elija la opción log(inhibidor) vs. respuesta - Pendiente variable (cuatro parámetros ).

Resultados

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El propósito de este ensayo es generalmente producir curvas de concentración-respuesta (CRC) para tres o cuatro nuevas parmodulinas. En cada placa de ensayo, a menudo se genera un CRC adicional para un compuesto conocido, como NRD-21, que actúa como un control de calidad para el experimento debido a su conocido IC50. Para generar CRC, se debe planificar un mapa de placas como el que se muestra en la Tabla 1 . Si, en cambio, se desean respuestas de concentración de un solo punto, se deben agregar compuestos a concentraciones finales de 10 μM (u otras concentraciones preferidas) a al menos tres pocillos.

Al realizar el ensayo, debe haber un aumento rápido en la fluorescencia (el aumento debe comenzar dentro de las primeras 3-4 exploraciones) mostrado por el lector de placas (consulte la Figura 2A para ver un ejemplo de salida en comparación con la salida fallida en la Figura 2B). Es importante tener en cuenta que el agonista debe agregarse rápidamente (dentro de los 15 segundos) para que el lector de placas pueda capturar con precisión el aumento de la fluorescencia. En un experimento de trabajo, la señal de fluorescencia para el pocillo del vehículo debe permanecer plana, mientras que la señal de fluorescencia en los pocillos de control positivo (vehículo + 6,5 μM TFLLRN-NH2) debe comenzar a aumentar después de tres o cuatro escaneos. Una vez que se alcanza el valor máximo (después de ~ 10 escaneos), la señal de fluorescencia debería comenzar a disminuir lentamente. En experimentos con antagonistas altamente eficaces, los pocillos con las concentraciones más altas de antagonistas deben tener una señal que permanezca relativamente plana, similar al control negativo. También debería haber poca diferencia entre la señal de los pozos de control positivo y aquellos con bajas concentraciones del antagonista (Figura 2C). Si las concentraciones más bajas de antagonistas siguen inhibiendo la movilización de calcio, las concentraciones examinadas deben ajustarse para incluir concentraciones más bajas. Los CRC generados deben tener al menos un punto de datos ~100% para mostrar completamente la naturaleza sigmoidal de la curva.

La señal más común de que un experimento no funcionó es si el pozo de control positivo (vehículo + 6,5 μM TFLLRN-NH2) no muestra un gran aumento en la fluorescencia (Figura 2B). Esto podría suceder por una variedad de razones: el recuento de células podría ser bajo (si no se confirmó la confluencia), la solución agonista podría estar comprometida o las células podrían haber absorbido cantidades inadecuadas de tinte. También es posible erróneamente no agregar agonista a ciertos pocillos.

Con un método programado, los datos se generan como seis hojas de cálculo separadas, cada una de las cuales contiene datos para dos columnas. Las cinco exploraciones de la fluorescencia basal están en su propia fila, y las 20 exploraciones tomadas después de la adición del agonista se encuentran en la fila inmediatamente inferior (véase la Figura 3 para obtener resultados representativos). Para un ejemplo de cálculo, se utilizará una columna de un experimento utilizando NRD-21. En el archivo exportado (Figura 3), la fluorescencia basal de cada pocillo se envía a las columnas C a G, y los datos posteriores a la adición del agonista (las siguientes 20 exploraciones) se envían a las columnas C a V en la fila siguiente. Las filas 14 a 17 del archivo contienen el control positivo de dos columnas separadas. El promedio de la fila basal para uno de los pozos de control positivo se calculó utilizando el comando "=PROMEDIO(C16:G16)", que dio un valor de 1,039.8. Este comando se repitió para las mediciones basales adicionales en cada pozo. El máximo de los escaneos experimentales se calculó utilizando el comando "=MAX(C16:V16)", que dio un valor de 2.629. Una vez más, la orden se repitió para todos los pozos. A continuación, se restó la fluorescencia basal de cada pocillo del valor máximo. En este experimento, los datos se normalizaron restando el cambio en la fluorescencia en el control negativo de cada pocillo (que fue 142,6 en la columna del ejemplo). Estos valores se dividieron por el valor calculado de manera similar del control positivo. En esta columna, el valor máximo fue 2.629, la medición basal promedio fue 1.039,8 y el valor restado para el blanco fue 142,6. Por lo tanto, el valor de control positivo ajustado es de 1.446,6 (calculado a partir de la ecuación). Esta ecuación se repite para cada pozo de la columna y los valores calculados se dividen por 1.446,6 para dar su cambio relativo en la fluorescencia. A continuación, las proporciones se convertían en porcentajes y se copiaban en el software analítico. Este proceso se repitió para las otras 11 columnas.

Para procesar los datos utilizando el software de referencia, se debe seleccionar una tabla XY con la opción de tener tres mediciones repetidas en columnas una al lado de la otra. Los valores -log de cada concentración deben introducirse en los valores x y los porcentajes calculados deben añadirse a los valores y. Se debe realizar un análisis de regresión no lineal sobre los datos, lo que hace que se produzcan cuatro curvas de concentración-respuesta. El programa también genera valores IC50 , estadísticas de error cuantificadas y estadísticas de bondad de ajuste.

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Figura 1: Fluo-4/AM cargado en las celdas EA.hy926. Fluo-4 cargado selectivamente en las células EA.hy926, después de las etapas de incubación y lavado del tinte. Toda la fluorescencia se encuentra dentro de las células, sin fugas de colorante. Imagen obtenida utilizando la configuración GTP en un generador de imágenes celular EVOS y aumento de 20x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Salida potencial del ensayo. (A) Salida representativa del lector de placas de un ensayo en funcionamiento. La fila A es el control negativo y no tiene cambios en la fluorescencia. La fila B es el control positivo y muestra un rápido aumento de la fluorescencia. Las filas C-H son los pozos experimentales, con las concentraciones más altas de parmodulina más bajas en la placa. (B) Ejemplo de salida de un experimento fallido. No se observa un aumento de la fluorescencia en la fila B, que es el control positivo. (C) Cambio en la fluorescencia a lo largo del tiempo inducido por el agonista PAR1 TFLLRN-NH2. El escaneo de dos columnas de una placa de 96 pocillos utilizando la configuración proporcionada tarda ~5 min. en el lector de placas PerkinElmer EnSpire (es decir, ~15 s entre escaneos de cada pocillo). Las diferentes soluciones de NRD-21 son como se indica, "Agonista" es 6,5 μM TFLLRN-NH2, n = 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Ejemplo de salida de Excel para un ensayo de trabajo. La fluorescencia basal se emite en filas pares a partir de la fila 10, y el resultado de las primeras 10 exploraciones después de la adición de agonistas se muestra en las filas impares siguientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Manejo robótico de líquidos frente a "flicking". El recubrimiento previo de las placas de ensayo con gelatina y la realización manual de intercambios de medios moviendo la placa y secándola produce curvas de concentración-respuesta con menor variabilidad. (A) Curvas de concentración-respuesta de las parmodulinas ML161 y NRD-21 y 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (manipulación automatizada de líquidos). (B) Curvas de concentración-respuesta de las parmodulinas ML161 y NRD-21 y 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (placas recubiertas de gelatina, agitadas). Los datos son medios ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Estudios de temperatura. Realizar el ensayo a 37 °C genera datos más reproducibles que a temperatura ambiente. (A) Curvas de concentración-respuesta de ML161 y 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (temperatura ambiente). (B) Curvas de concentración-respuesta de ML161 y 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (37 °C). Los datos son medios ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Estudios de densidad celular. La densidad celular óptima es de 60.000 células/pocillo cuando se siembra 16-24 h antes de comenzar un ensayo. (A) Curvas de concentración-respuesta de TFLLRN-NH2 a diferentes densidades celulares, n = 3. (B) Curva de concentración-respuesta de TFLLRN-NH2 a la densidad óptima de células de 60.000 células/pocillo. Los datos son medios ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: Volumen del ensayo. El uso de un volumen de ensayo de 100 μL genera curvas de concentración-respuesta más reproducibles que los ensayos que utilizan un volumen final de 200 μL. (A) Curvas de concentración-respuesta de ML161 y 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (volumen final de 200 μL). (B) Curvas de concentración-respuesta de ML161 y 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (volumen final de 100 μL). Los datos son medios ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 8: Generación de factores Z' para determinar la capacidad del ensayo para detectar un compuesto golpeado. Respuestas de movilización de calcio con 6,5 μM TFLLRN-NH2 (columna B) más antagonistas PAR1 opcionales, 10 μM NRD-21 (columna C) o 0,316 μM vorapaxar (columna D). (A) Ensayo completado 16 h después de la siembra de la célula. (B) Ensayo completado 24 h después de la siembra de la célula. (C) Tabla de factores Z' calculados utilizando la siguiente ecuación: figure-results-9, dondeσ p es la desviación estándar del control positivo, σn es la desviación estándar para el control o muestra negativos, μp es la media del control positivo y μn es la media del control negativo o muestra. Cada valor se calcula designando el vehículo + 6,5 μM TFLLRN-NH2 como control positivo y comparándolo con la condición indicada como control negativo (vehículo) o muestra (NRD-21 y vorapaxar). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 9: Movilización de calcio a partir de un agonista PAR2. Cambio en la fluorescencia a lo largo del tiempo inducido por 10 μM SLIGKV-NH2, n = 4. Los datos son medios ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Ejemplo de mapa de placas de 96 pocillos para el cribado de compuestos. Cada concentración se mide por triplicado. La fila A contiene controles negativos (sin antagonista; sin agonista) y la fila B contiene controles positivos (sin antagonista; agonista). Las columnas 1 a 3 contienen seis concentraciones semilogarítmicas de parmodulina NRD-21 que pueden utilizarse opcionalmente para el control de calidad. PM-A, PM-B, PM-C son parmodulinas sin nombre. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Comparación del protocolo publicado anteriormente y el nuevo protocolo optimizado. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

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Si bien el protocolo72 reportado anteriormente fue generalmente confiable y nos permitió identificar una nueva parmodulina principal, NRD-21,62, se deseaba un protocolo más eficiente. El ensayo se vio aún más comprometido durante la escasez de suministro causada por la pandemia de COVID-19. La adquisición de puntas para el manipulador automático de líquidos se volvió difícil, y el intento de lavar, esterilizar y reutilizar las puntas produjo CRC con una variación significativa. Esto facilitó una serie urgente de experimentos diseñados para simplificar un ensayo mejorado de movilización de calcio impulsado por PAR.

La identificación de una alternativa válida al uso del manipulador de líquidos automatizado para las etapas de lavado fue la principal prioridad en este estudio. Durante el desarrollo de ensayos anteriores, el uso del manipulador de líquidos robótico redujo los errores causados por los intercambios manuales de medios. Sin embargo, esto añadió un tiempo significativo al ensayo, ya que los intercambios de medios con el manipulador de líquidos de 8 canales aumentaron el tiempo total de cada placa de ensayo en 30-45 min. Aunque anteriormente se había probado un método de intercambio de medios, estos experimentos se realizaron sin recubrir las placas de ensayo con gelatina antes de la siembra de células. Al pretratar las placas con gelatina, se aseguró que las células permanecieran en su lugar independientemente de la fuerza utilizada para eliminar manualmente los medios. Los CRC generados en un ensayo utilizando placas recubiertas de gelatina tuvieron mejores puntuaciones de bondad de ajuste y barras de error más pequeñas en múltiples puntos de datos que las curvas en las que se utilizó el manipulador de líquidos automatizado (Figura 4). Los valores de error cuadrático medio (RMSE) para la placa que utilizó el manipulador de líquidos automatizado fueron de 9,687 para la curva ML161 y de 10,690 para la curva NRD-21, mientras que los valores de RMSE para la placa que utilizó gelatina y un intercambio manual de medios fueron de 7,658 para la curva ML161 y 6,408 para la curva NRD-21. Los valores RMSE más bajos indican una curva que se ajusta mejor a los datos dados. Este cambio también reduce en gran medida el tiempo total de ensayo. Alternativamente, se puede utilizar un lavador de placas automatizado multicanal.

El método de adición de agonistas fue un factor adicional que se estudió. Esto se hizo para determinar si se podía agregar un agonista a todos los pocillos de la placa simultáneamente, seguido de un escaneo de toda la placa a la vez; Esto eliminaría la necesidad de que los investigadores permanezcan cerca del lector de placas durante la duración del ensayo sensible al tiempo para numerosas adiciones de agonistas separadas, lo que podría aumentar el rendimiento significativamente. Desafortunadamente, agregar agonista a todos los pocillos y escanear toda la placa fue problemático, porque la respuesta es demasiado rápida para medir de manera confiable la concentración máxima transitoria de calcio en cada pocillo, lo que da CRC muy variables. Reducir el número de columnas escaneadas de 12 a 6 mejoró ligeramente los resultados, pero los mejores resultados se generaron al escanear solo dos columnas (16 pocillos) a la vez. Se podría plantear la hipótesis de que la reducción de la temperatura del ensayo de 37 °C a temperatura ambiente podría ralentizar el cambio en la concentración de calcio lo suficiente como para permitir mediciones fiables. A pesar de que se han validado múltiples protocolos de movilización de calcio con diferentes colorantes o líneas celulares a temperatura ambiente78,79, en este ensayo específico se observan mejores resultados a 37 °C. Las curvas de concentración-respuesta del antagonista medidas a temperatura ambiente (~23 °C) no fueron tan uniformes como a 37 °C (Figura 5A vs. Figura 5B). Debido a estos resultados, se determinó que el escaneo de dos columnas a la vez a 37 °C es óptimo.

Otra variable que se analizó para reducir el tiempo de ensayo fue el tiempo de incubación de los antagonistas. En el protocolo anterior, los antagonistas se incubaron durante 40 min antes de la adición de agonistas, pero aquí se determinó que 15 min es tiempo suficiente para que las parmodulinas interactúen con PAR1. Esto se probó agregando soluciones de parmodulina a varias columnas al mismo tiempo, seguido de la adición de agonista en diferentes puntos de tiempo (el agonista se agregó a t = 15 min, 30 min y 45 min). La actividad de las parmodulinas se mantuvo, pero no mejoró, al incubar los antagonistas durante más tiempo. Como resultado de este hallazgo, en el nuevo protocolo, se agregan soluciones antagonistas a toda la placa a la vez, y se agregan soluciones agonistas a las primeras columnas después de una incubación de 15 min. Este cambio reduce aún más el tiempo total del experimento en 30 minutos. Cabe señalar que los antagonistas con cinética de unión lenta, como el vorapaxar, pueden requerir tiempos de incubación más largos80,81.

Si bien la reducción del tiempo de ensayo y la eliminación de la dependencia del manipulador de líquidos fueron los principales factores que requirieron una actualización del protocolo de ensayo, también se probó un método alternativo de cultivo de células. Anteriormente, las placas se sembraban con células directamente de existencias congeladas y se dejaban crecer en las placas durante 40-48 h después de la siembra. Sin embargo, el tiempo prolongado entre las placas de siembra y la realización de los ensayos limitó el número de experimentos que se podían realizar cada semana. El uso de células cultivadas en matraces de cultivo reduce drásticamente este tiempo. Las células se cultivaron en matraces T-75 tratados con cultivo de tejidos y se extrajeron de la superficie del matraz mediante el uso de un agente de disociación celular no enzimático. Esto puede ser importante para evitar dañar ciertos receptores de la superficie celular, en particular PAR2, con tripsina. Una vez añadidas a la placa de ensayo, las células necesitan tiempo suficiente para asentarse y adherirse a la gelatina. Debido a que el método de movimiento de los medios también puede desplazar las células, se necesita suficiente tiempo para permitir que las células se incrusten en la gelatina. Un experimento que permitió que las células se asentaran durante dos horas causó una pérdida significativa de células, lo que resultó en un ensayo inutilizable (datos no mostrados). Los tiempos de sedimentación entre 2 h y 12 h limitan el número de placas que se pueden analizar en un solo día, por lo que se prefiere una incubación nocturna más larga. Se descubrió que la incubación de las células recién cultivadas entre 16 y 24 horas permitió que las células se adhirieran completamente a la gelatina, y se pueden obtener datos reproducibles.

El cambio de células congeladas a células cultivadas en matraces de cultivo también cambió la densidad óptima de siembra de células. Como era de esperar, la siembra de pocillos a la densidad de 25.000 células/pocillo que era estándar en el protocolo anterior no permitió que las células alcanzaran la confluencia con un tiempo de incubación más corto. Se generaron CCR agonistas con ocho densidades celulares separadas para determinar las condiciones óptimas (Figura 6). Anteriormente, TFLLRN-NH2 se utilizaba como agonista de PAR1 a 5 μM, ya que esto permitía un antagonismo razonable con parmodulinas de menor solubilidad. No hay una diferencia significativa en la señal de fondo o máxima cuando se siembra con 45.000-65.000 células/pocillo, pero hay una disminución en la variabilidad con 5 μM TFLLRN-NH2 cuando se añaden 60.000 células/pocillo. Curiosamente, no hay un aumento significativo en la fluorescencia máxima con un mayor número de células, por lo que se eligió 60.000 células/pocillo como la densidad óptima debido a la disminución de la variabilidad. Los CCR agonistas también produjeron una EC50 de 6,5 μM para TFLLRN-NH2, por lo que se eligió como la nueva concentración de agonistas estándar.

Otro factor que se analizó fueron los volúmenes utilizados en el ensayo. En el protocolo anterior, se añadían 2 μL de agonista a cada pocillo para dar un volumen final de ensayo de 200 μL. Se planteó la hipótesis de que agregar volúmenes más altos de solución agonista, pero manteniendo constante la concentración final, podría ayudar en la mezcla, causando una señal más rápida y confiable. Para probar esta hipótesis, se comparó la adición de 2 μL, 6 μL y 10 μL DE TFLLRN-NH2 en 100 μL o 200 μL de HEPES-HBSS en una placa de ensayo que contenía diferentes concentraciones de NRD-21. Se generaron CCR de NRD-21 de cada condición para determinar qué combinación de volumen de agonista y volumen de ensayo final proporcionó los datos más consistentes. Si bien las adiciones de 2 μL y 6 μL dieron lugar a CCR generados con poca variabilidad, no se pudo decir lo mismo de las curvas producidas a partir de la adición de 10 μL TFLLRN-NH2 (datos no mostrados); los aumentos en la fluorescencia no fueron consistentes en estos pozos ni en magnitud ni en tiempo, lo que produce CRC que deberían ser idénticos, pero en cambio son drásticamente diferentes. Aunque las adiciones de 2 μL y 6 μL produjeron resultados similares, el cambio en la fluorescencia ocurrió mucho más rápido con la adición de 6 μL de TFLLRN-NH2, lo que permitió que el número total de exploraciones en cada pocillo se redujera a la mitad, de 40 exploraciones a 20 exploraciones. También se determinó que el uso de un volumen final de 100 μL produce CRC más uniformes en comparación con los generados con un volumen final de 200 μL (Figura 7).

Para determinar si el nuevo protocolo es adecuado para ensayos de mayor rendimiento, se calcularon los factores Z' para el ensayo (Figura 8). Un factor Z' es un método estadístico que mide la calidad de un ensayo de cribado y determina si un ensayo diferenciará de forma fiable los compuestos activos e inactivos82. Se calcularon los factores Z' para los ensayos realizados entre 16 y 24 h después de la siembra de las placas, y en diferentes pasajes celulares. En todos los casos, tanto para el modo agonista solo como para el agonista más antagonista, los factores Z' calculados fueron superiores a 0,5, lo que indica un ensayo excelente82. Los factores Z' calculados también fueron similares a los calculados para el ensayo anterior, lo que indica que los cambios realizados en el protocolo para producir un ensayo más rápido no afectaron negativamente la calidad.

El protocolo para la movilización de calcio impulsada por PAR se actualizó a través de experimentos que generaron valores de IC50 a partir de CCR, pero el ensayo también se puede utilizar para medir la eficacia de los antagonistas de PAR1 en concentraciones individuales. El ensayo también se puede utilizar para medir la actividad de los ligandos PAR2; por ejemplo, el agonista de PAR2 SLIGKV-NH2 puede reemplazar a TFLLRN-NH2 en el protocolo actualizado (Figura 9); el protocolo anterior también se utilizó con agonistas y antagonistas de PAR283. Aunque no se ha probado explícitamente aquí, este protocolo también debería ser aplicable a las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), que se utilizaron con el protocolo anterior, y potencialmente a otras líneas celulares adherentes. Una limitación para el uso de un lector de placas de barrido con protocolos como este es que no son adecuados para estudiar respuestas rápidas (sub-segundo), al menos no en paralelo como es posible con un lector de imágenes de placas.

En conclusión, aquí se presenta un protocolo más rápido y sencillo para el ensayo de movilización de calcio impulsado por PAR endotelial utilizando un lector de placas. Al eliminar la necesidad de un manipulador de líquidos automatizado, reducir el tiempo de incubación del antagonista y disminuir el número de exploraciones para cada pocillo, el tiempo total del ensayo se redujo en al menos 90-120 min, y los costos del ensayo se redujeron (para una comparación entre los protocolos informados anteriormente y los actuales, consulte la Tabla 2). Esto no solo permitirá el cribado de más compuestos cada día, sino que también elimina el riesgo de una disminución de la ventana de ensayo por el flujo de colorantes, lo que podría dar lugar a resultados poco fiables. El ensayo recientemente optimizado permite un cribado más rápido en las células endoteliales de los ligandos PAR1 o PAR2, o potencialmente de otros ligandos GPCR que activan la movilización del calcio intracelular, en laboratorios limitados al uso de lectores de placas.

Divulgaciones

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C.D. es el inventor de las patentes relacionadas con las parmodulinas y es el fundador y accionista de Function Therapeutics, Inc., que está desarrollando parmodulinas para uso clínico.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Irene Hernández, Trudy Holyst, al Dr. Hartmut Weiler (Instituto de Investigación de la Sangre Versiti) y al Dr. Leggy Arnold (Universidad de Wisconsin-Milwaukee) por proporcionar espacio y apoyo indirecto a este proyecto, y al Dr. John McCorvy (Colegio Médico de Wisconsin) por los consejos pertinentes. Agradecemos al Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (R15HL127636), al Departamento de Defensa de los Estados Unidos (W81XWH22101) y a la Fundación Nacional de Ciencias (2223225) por el apoyo de las subvenciones.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
cultivo celular fuertes
adherentes EA.hy926 célulasATCCCRL-2922
Reactivo de disociación celular CellStripperCorning25-056-CILa tripsina se puede usar opcionalmente, pero definitivamente debe evitarse con los ensayos PAR2.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con rojo fenolCorning10-013-CV
Suero fetal bovino (FBS)Avantor97068-091
Gelatina de piel porcinaMilliporeSigmaG2500Úselo para hacer una solución acuosa al 0,4% (p/v) con agua desionizada. Autoclave antes de usar para esterilizar.
Pluma/Estreptococo (100X)Corning30-002-CI
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Corning21-040-CV
Azul de tripán (0,4% c/v)Corning25-900-CI
fuerte>Reactivos de movilización de calcio
4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanoácido sulfónico (HEPES)Thermo172571000
Albúmina sérica bovina (BSA)Avantor97061-420
Cloruro de calcio dihidratadoThermo42352-0250
DimetilsulfóxidoThermo J66650-AD
Fluo-4/AMInvitrogenF14201
Solución salina equilibrada de Hank's (Ca/Mg/libre de rojo fenol)Corning21-022-CV
Cloruro de magnesio hexahidratadoMilliporeSigmaM2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)Spectrum ChemicalP1166
ProbenecidTCI AmericaP1975
Hidróxido de sodioVWR InternationalBDH9292
TFLLRN-NH2 (Sal TFA)Preparado por Trudy Holyst en Versiti Blood Instituto
de InvestigaciónMaterials
96-pocillos, tratado con cultivo, pared negra, fondo transparenteCorning3603con tapas transparentes
Tubo de centrífuga, 15 mLAvantor89039-664
Tubo de centrífuga, 50 mLMatraz de cultivo Avantor89039-656
T-75Corning353136tratamiento con cultivo de tejidos
Depósito de reactivo desechable, 50 mLCorningRES-V-50-S
Lector de placas EnspirePerkin ElmerDescatalogado
Tubo de microcentrífuga, 1,5 mLPipeta Pasteur Avantor20170-038
Fisher13-678-6Bdebe esterilizarse
Tira de tubo de PCR con plano separado tiras de tapónAvantor76318-802
Puntas de pipeta, 20 µ LBiotix63300042estériles, puntas filtradas
Puntas de pipeta, 200 µ LBiotix63300044estériles puntas filtradas
Puntas de pipeta, 1250 y micro; LBiotix63300047estériles, puntas filtradas
PrismGraphPadvolumen 6 usado
Pipeta serológica, 5 mLTradewinds Direct  07-5005
Pipeta serológica, 10 mLTradewinds Direct  07-5010
Pipeta serológica, 25 mLTradewinds Direct  07-5025
< placa de ensayo , , 9"

Referencias

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