Aquí, presentamos un protocolo para generar organoides derivados de pacientes con melanoma mediante el cultivo de suspensiones celulares disociadas de tejidos frescos de melanoma. Estos organoides recapitulan fielmente los tumores específicos del paciente in vitro, lo que ofrece un enfoque innovador para explorar los mecanismos inmunosupresores de tumores, la detección de fármacos, los mecanismos de resistencia a los medicamentos y los enfoques de vigilancia del cáncer.
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Artículo de método
Presentación de oportunidades terapéuticas con modelos de organoides derivados de pacientes con melanoma
En este artículo
Resumen
Resumen
Con el desarrollo de la inmunoterapia, existe una necesidad continua de desarrollar modelos que puedan recapitular el microambiente tumoral de los tumores nativos. Si bien los modelos bidimensionales y tridimensionales tradicionales pueden ofrecer información sobre el desarrollo y la progresión del cáncer, carecen de aspectos cruciales que dificulten una imitación fiel de los tumores nativos. Un modelo alternativo que ha ganado mucha atención es el organoide derivado del paciente. El desarrollo de estos organoides recapitula la compleja comunicación intercelular, el microambiente tumoral y la histoarquitectura de los tumores. En este artículo se describe el protocolo para establecer modelos de organoides derivados de pacientes con melanoma (MPDO). Para validar estos modelos, evaluamos la composición de las células inmunitarias, incluidos los niveles de expresión de los marcadores de activación de las células T, para confirmar la heterogeneidad celular de los organoides. Además, para describir la utilidad potencial de los MPDOs en terapias celulares, evaluamos las capacidades citotóxicas del tratamiento de los organoides con linfocitos T γδ. En conclusión, los modelos MPDO ofrecen vías prometedoras para comprender la complejidad tumoral, validar estrategias terapéuticas y, potencialmente, avanzar en el tratamiento personalizado.
Introducción
Los modelos convencionales de cultivo celular en 2D son herramientas esenciales en la investigación del cáncer para estudiar la progresión y el tratamiento del cáncer1. Estos modelos no solo permiten condiciones experimentales controladas para investigar los mecanismos moleculares y celulares que subyacen al desarrollo y la progresión del cáncer, sino que también proporcionan resultados experimentales rentables y relativamente rápidos. Su uso, sin embargo, está restringido debido a la limitada diversidad celular en el microambiente tumoral (TME), que no puede recapitularse en la naturaleza coplanar de los model....
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Protocolo
Los tejidos de melanoma humano se obtuvieron de pacientes que recibían tratamiento en la Universidad de Pensilvania utilizando el protocolo de recolección de tejidos (UPCC08607) aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Pensilvania. Todos los pacientes han firmado el consentimiento informado. Después de la resección de los tejidos de melanoma humano, el tejido tumoral se coloca en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y se mantiene a 4 °C hasta el procesamiento (dentro de las 6 h). Los organoides derivados del paciente con melanoma (MPDO) se derivaron de un tumor reciente, como se ilustra en la
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Resultados
La forma y el tamaño de los MPDOs fueron monitoreados a lo largo del tiempo para estudiar su dinámica de crecimiento. Como se observa en la Figura 2, durante el período de crecimiento inicial, el tamaño del organoide aumentó sustancialmente a lo largo de los 7 días representados. Tras la observación de la dinámica de crecimiento de la MPDO, la atención se centró en la evaluación de la composición de las células inmunitarias para verificar la fiel recapitulación de los organoides a los tumore.......
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Discusión
La aparición de las PDOs ha abordado las múltiples limitaciones planteadas por otros métodos de investigación del cáncer previamente establecidos, al tiempo que ha introducido aplicaciones potenciales transformadoras en el campo. Esta tecnología de organoides fue propuesta inicialmente en 2009 por Hans Clevers y sus colegas, quienes pudieron establecer con éxito un sistema de cultivo de organoides intestinales mediante el cultivo de células madre Lgr5+ derivadas del intestino .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Este estudio fue financiado en parte por subvenciones de R01(CA258113), SPORE (CA261608) y P01 (CA114046). La Figura 1 se preparó en BioRender.com.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2 mL Tapa Roja Polipropileno Roscado Interno Vial Criogénico | Corning | 431420 | |
| 50 mL Tubo Cónico de Polipropileno | Corning | 352070 | |
| 100 mm Placa de Cultivo Celular con Tratado TC | Corning 353003 | ||
| 105 mm Pinzas de Poliestireno | Caplugs Estériles Evergreen | 222-1121-B1I | |
| 150 cm2 Cell Culture Maternal | CLS430825 | ||
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 (1x) Medio de Suero Reducido (1:1) | Gibco | 12634-010 | |
| B-27 Suplemento (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| Brilliant Violet 510 anti-humano Anticuerpo | PerforinaBioLegend | 308120 | |
| Violeta Brillante 605 antihumano Anticuerpo Ki-67 | BioLegend | 350522 | |
| Violeta Brillante 650 antihumano Anticuerpo CD366 (Tim-3) | BioLegend | 345028 | |
| Violeta Brillante 711 antihumano Anticuerpo CD45 BioLegend | 304050 | ||
| Insertos de cultivo celular 0.4 y micro; m, 30 mm de diámetro | Millipore Sigma | PIHP03050 | |
| Tampón de tinción celular | BioLegend | 420201 | |
| Cell Strainer 40 µ m Cornejado de nylon | 352340 | ||
| Filtro de celdas 70 y micro; m Cornejado de nylon | 352350 | ||
| Colagenasa, Tipo IV, polvo | Gibco | 17104019 | |
| Cultrex Rata Colágeno I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| Placa de cultivo, PS, 48 pocillos, TC tratado con tapa, estéril | Max Scientific | 07-6048 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM - alto contenido de glucosa 4,5 mg/mL | Corning | MT10-0130CV | |
| Dnase I - Grado II | Millipore Sigma | 10104159001 | |
| DPBS, 1% | Corning | 21-031-CV | |
| Suero fetal bovino, FBS | Corning | MT35-010-CV | |
| FITC Kit de detección de apoptosis de anexina V | BD Biosciences | ||
| Forskolin | Tocris | 1099 | |
| Antibiótico Selectivo Genético (Sulfato G418) (50 mg/mL) | ThermoFisher | 10131035 | |
| GlutaMAX Suplemento | ThermoFisher | 35050061 | |
| Ham F12 Mezcla de Nutrientes ThermoFisher | 11765054 | ||
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| Higromicina B (50 mg/mL) | ThermoFisher | 10687010 | |
| L-Glutamina 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Célula L-WRN ATCC | CRL-3276 | ||
| Matrigel Sin Fenol & Dato de crecimiento. Filtro de | jeringa Corning | 356231 | |
| Millex PVDF reducido, 0,22 μ M | Millipore Sigma | SLGVR33RB | |
| N-acetilcisteína | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotinamida | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Nunc TripleFlask Matraz de cultivo celular tratado | ThermoFisher | 132867 | |
| PE/Cyanine5 antihumano Anticuerpo CD8a | BioLegend | 301010 | |
| PE-Cy 7 Ratón anti-humano CD279 (PD-1) | BD Biociencias | ||
| Pluma Estreptococo | Gibco | 15140-122 | |
| EGF humano recombinante | Peprotech | AF-100-15-1MG | |
| FGF humano recombinante-ácido | Peprotech | 100-17A | |
| Solución de bicarbonato de sodio (NaHCO3) (7.5%) | Calidad Biológico | 118-085-721 | |
| Cuchillas quirúrgicas de acero inoxidable n.º 22 | Integra | 4-322 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 |
Referencias
- Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. Cancer Cell Lines Are Useful Model Systems for Medical Research. Cancers (Basel). 11 (8), 1098(2019).
- Shannon, A. E., Boos, C. E., Hummon, A. B. Co-culturing multicellular tumor models: Modeling the tumor ....
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Reimpresiones y permisos
