Aquí, presentamos un protocolo para generar organoides derivados de pacientes con melanoma mediante el cultivo de suspensiones celulares disociadas de tejidos frescos de melanoma. Estos organoides recapitulan fielmente los tumores específicos del paciente in vitro, lo que ofrece un enfoque innovador para explorar los mecanismos inmunosupresores de tumores, la detección de fármacos, los mecanismos de resistencia a los medicamentos y los enfoques de vigilancia del cáncer.
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Artículo de método
Presentación de oportunidades terapéuticas con modelos de organoides derivados de pacientes con melanoma
En este artículo
Resumen
Resumen
Con el desarrollo de la inmunoterapia, existe una necesidad continua de desarrollar modelos que puedan recapitular el microambiente tumoral de los tumores nativos. Si bien los modelos bidimensionales y tridimensionales tradicionales pueden ofrecer información sobre el desarrollo y la progresión del cáncer, carecen de aspectos cruciales que dificulten una imitación fiel de los tumores nativos. Un modelo alternativo que ha ganado mucha atención es el organoide derivado del paciente. El desarrollo de estos organoides recapitula la compleja comunicación intercelular, el microambiente tumoral y la histoarquitectura de los tumores. En este artículo se describe el protocolo para establecer modelos de organoides derivados de pacientes con melanoma (MPDO). Para validar estos modelos, evaluamos la composición de las células inmunitarias, incluidos los niveles de expresión de los marcadores de activación de las células T, para confirmar la heterogeneidad celular de los organoides. Además, para describir la utilidad potencial de los MPDOs en terapias celulares, evaluamos las capacidades citotóxicas del tratamiento de los organoides con linfocitos T γδ. En conclusión, los modelos MPDO ofrecen vías prometedoras para comprender la complejidad tumoral, validar estrategias terapéuticas y, potencialmente, avanzar en el tratamiento personalizado.
Introducción
Los modelos convencionales de cultivo celular en 2D son herramientas esenciales en la investigación del cáncer para estudiar la progresión y el tratamiento del cáncer1. Estos modelos no solo permiten condiciones experimentales controladas para investigar los mecanismos moleculares y celulares que subyacen al desarrollo y la progresión del cáncer, sino que también proporcionan resultados experimentales rentables y relativamente rápidos. Su uso, sin embargo, está restringido debido a la limitada diversidad celular en el microambiente tumoral (TME), que no puede recapitularse en la naturaleza coplanar de los modelos de monocultivo2. Además, los modelos de cultivo celular ofrecen un entorno demasiado simplificado en comparación con el cuerpo humano3. Por lo tanto, para comprender mejor la progresión del cáncer y desarrollar tratamientos efectivos, los investigadores han recurrido a modelos innovadores que tienen como objetivo recapitular la EMT en la naturaleza de cerca. En consecuencia, mantener la fidelidad a los tumores nativos es primordial en estos modelos. Dada la naturaleza compleja del cáncer, cualquier desviación significativa del tumor original podría introducir variables imprevistas que podrían confundir conclusiones significativas sobre el comportamiento del tumor.
Si bien los xenoinjertos derivados del paciente (PDX) han surgido como un sistema modelo que permite el seguimiento de la progresión tumoral in vivo, algunas limitaciones cuestionan qué tan bien el tumor desarrollado recapitula la biología del cáncer humano4. Por ejemplo, el melanoma TME contiene células inmunitarias infiltrantes de tumores y células estromales. Cuando se pasa como un xenoinjerto, las células no cancerosas del paciente se perderán gradualmente, lo que puede seleccionar adaptaciones que difieren de las de los tumores del paciente. Si bien estas limitaciones pueden mitigarse mediante la realización de pasajes limitados de la PDX in vivo, las diferencias entre las especies aún pueden representar un riesgo de cambios genéticos en la PDX que se desvían de la del tumor nativo5. Además, los modelos PDX se establecen normalmente en ratones inmunocomprometidos para evitar el rechazo de tejidos humanos. Esto limita la capacidad de estudiar el papel del sistema inmune del huésped en el cáncer, especialmente en los estudios inmunoterapéuticos6. Nosotros y otros hemos injertado PDX en ratones "humanizados" 7,8. Sin embargo, el establecimiento de modelos PDX en ratones humanizados requiere mucho tiempo y es costoso. El desarrollo de un único modelo de PDX a partir de la muestra tumoral de un paciente puede llevar varios meses o años, lo que limita la velocidad y la escala de la investigación. A pesar de estas limitaciones, los modelos PDX han demostrado representar con precisión la biología del TME, por lo que han sido ampliamente utilizados para el desarrollo de terapias contra el cáncer, medicina personalizada e inmunoterapia, entre otros9.
Una técnica alternativa de cultivo 3D que ha surgido es el organoide derivado del paciente (PDO), en el que se cultiva un tumor del paciente recién resecado para crear modelos que mantengan la heterogeneidad fenotípica, la histoarquitectura y las comunicaciones intercelulares10. Su capacidad para parecerse mucho a los tumores nativos ha sido demostrada previamente donde los organoides cultivados de cáncer de vejiga no músculo-invasivo (NMIBC) y músculo-invasivo (MIBC) recapitularon con éxito aspectos clave de los tumores parentales11. Debido a su potencial y ventajas sobre otros modelos, las PDOs ofrecen una amplia variedad de aplicaciones personalizadas de las que carecen otros modelos, incluidos, entre otros, el estudio y desarrollo de inhibidores de puntos de control inmunitarios junto con terapias celulares y dirigidas. Por ejemplo, hemos utilizado previamente organoides derivados de pacientes con melanoma (MPDO) para estudiar la capacidad de los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) para expandirse mediante IL-2 y anticuerpos anti-PD1 (αPD-1). Los resultados mostraron que los TILs expandidos por IL-2 y αPD-1 no solo tenían un número mayor, sino que también podían infiltrar con éxito MPDOs y matar las células de melanoma con mayor eficiencia que los TILs expandidos usando otros métodos12. Otros grupos han mostrado resultados similares en los que el uso de anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 conduce a que los TIL permanezcan funcionales en las PDO, lo que posteriormente conduce a la muerte tumoral13. Además, nuestro grupo también ha utilizado MPDOs para evaluar la infiltración y la capacidad de destrucción de las células T γδ14. La aplicabilidad de las PDOs abarca una amplia gama de áreas, incluida la expansión de TIL, los estudios de citotoxicidad y el cribado de moléculas pequeñas. Todas estas aplicaciones ponen de manifiesto el potencial y la usabilidad que confiere este modelo. Como tal, describimos el protocolo detallado para el cultivo de MPDOs.
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Protocolo
Los tejidos de melanoma humano se obtuvieron de pacientes que recibían tratamiento en la Universidad de Pensilvania utilizando el protocolo de recolección de tejidos (UPCC08607) aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Pensilvania. Todos los pacientes han firmado el consentimiento informado. Después de la resección de los tejidos de melanoma humano, el tejido tumoral se coloca en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y se mantiene a 4 °C hasta el procesamiento (dentro de las 6 h). Los organoides derivados del paciente con melanoma (MPDO) se derivaron de un tumor reciente, como se ilustra en la Figura 1.
1. Aislamiento de células de tejido de melanoma humano
- Preparativos antes del inicio del procedimiento
NOTA: Se pueden utilizar dos métodos de cultivo (Matrigel y gel de colágeno) para cultivar tejido de melanoma disociado:- Para el método Matrigel: Prepare una solución de recubrimiento de la matriz de membrana basal con factor de crecimiento reducido (GFR) diluyendo la matriz de membrana basal GFR con medio de cultivo de organoides (ver Tabla 1) en una proporción de 1:2. Agregue aproximadamente 115 μL de la solución descongelada a cada uno de los varios pocillos de una placa de 48 pocillos y déjela solidificar durante 30 minutos a 37 °C en una incubadora humidificada.
- Para el método del gel de colágeno: Añadir 1 mL de gel de colágeno (ver Tabla 1) a un inserto de membrana interna de 30 mm. Deje que el gel se solidifique durante 30 minutos a 37 °C en una incubadora humidificada.
- Prepare el medio acondicionado L-WRN15. El medio acondicionado L-WRN se produce a partir de una línea celular L-WRN diseñada para secretar Wnt3a, R-espondina 3 y Noggin en un solo medio acondicionado que se usa ampliamente para el cultivo celular.
- Descongele un tubo criogénico de células L-WRN en el baño de agua a 37 °C. Añadir 5 mL de medio de célula L (ver Tabla 1) y la suspensión de célula L-WRN a un tubo cónico de 15 mL, y centrifugar a 120 × g durante 5 min a 4 °C. Aspire el sobrenadante, asegurándose de que queden ~500 μL en el fondo para resuspender la pelletización de las células.
- Transfiera el gránulo de células en el sobrenadante a 30 mL de medio de células L en hielo y agregue 150 μL de higromicina (500 μg/mL) y 300 μL de G418 (500 μg/mL). Siembre las células a una densidad de 3 × 106 en un matraz T-150 e incube a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2 hasta ~90% confluente.
- Una vez que las células estén ~90% confluentes, divida las células en cinco matraces T-150 lavándolas con 20 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS), aspirando y digiriendo con 3 mL de sustituto de tripsina. Después de 5 minutos, neutralizar con 9 mL de medio de celda L seguido de centrifugación durante 5 min a 120 × g a 4 °C. Cuando ~100% confluente, divida los cinco matraces T-150 en 10 matraces T-175 de 3 capas.
- Una vez confluentes, lavar las celdas con 2 x 50 mL de PBS y luego con 25 mL de medio de lavado (ver Tabla 1).
- Añadir 75 mL de medio de cultivo primario a cada matraz T-175 de 3 capas e incubar durante 3 días a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2 (ver Tabla 1).
- Después de 3 días, coseche el medio acondicionado en un cónico de 50 mL y centrifugue a 1.100 × g durante 5 min a 4 °C. Recoja el sobrenadante (medio acondicionado), asegurándose de que queden 5 mL.
- Agregue 75 mL frescos de medio de cultivo celular primario a cada matraz T-175 de 3 capas e incube durante 3 días adicionales para recolectar medio acondicionado adicional.
- Al medio acondicionado recogido, añada un volumen igual de medio de cultivo celular primario (50% de volumen) y filtre al vacío el contenido con un filtro de 0,22 μm. Almacene las alícuotas en tubos de 50 ml y almacene a -20 °C para uso prolongado o a 4 °C durante un máximo de 2-3 semanas. Utilice este medio para complementar el medio de cultivo de organoides (ver Tabla 1).
NOTA: Descongele las alícuotas a 4 °C durante la noche antes de usarlas.
- Recolección de la mezcla celular a partir de tejido fresco de melanoma
- Lave el tejido de melanoma recién resecado en una placa de Petri de 10 ml que contenga medio de lavado. Después del primer enjuague, use pinzas estériles para transferir el tumor a una segunda placa de Petri para un lavado adicional y repita este proceso 3 veces en hielo para preservar la integridad y viabilidad del tumor. A lo largo de estos ciclos de enjuague, use tijeras estériles y una cuchilla para eliminar el exceso de tejido conectivo, grasa y sangre residual. Después de los tres lavados, coloque el tumor en una placa de Petri vacía y use cuchillas estériles para picarlo finamente.
NOTA: Después de picar, el tumor debe exhibir una consistencia gelatinosa. Cuanto más fino sea el picado del tumor, mayor será el rendimiento celular. Esto se debe a que los grupos más grandes del tumor serán más difíciles de digerir y es posible que no pasen a través del filtro de células de nailon de 70 μm en el paso siguiente. - Una vez que el tejido tumoral se haya lavado y picado completamente, se transfiera a un tubo cónico de 50 mL que contenga 10 mL del medio de digestión preparado (ver Tabla 1). Coloque la cónica en un baño de agua a 37 °C, asegurándose de que el contenido se agite en vórtice cada 5 minutos.
- Después de 25 minutos, agregue 30 ml del medio ADMEM/F12 que contiene 10% de FBS para detener la digestión.
NOTA: Estas cantidades especificadas están destinadas a tumores que no pesen más de 0,2 g. - Filtre la suspensión celular digerida a través de un colador de células de nailon de 70 μm, luego enjuague el filtro con ADMEM/F12 (1x) Medio de suero reducido (1:1) que contiene 10% de FBS. Después del paso de lavado, utilice una pipeta para recuperar los medios restantes en la parte inferior del filtro para asegurarse de que se recupera el mayor número posible de células. A continuación, centrifugar a 300 × g durante 7 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en medio de cultivo de organoides (ver Tabla 1).
- Cultivo de la suspensión unicelular de melanoma en sistemas de cultivo Matrigel o colágeno:
- Matrigel: Cuente la suspensión unicelular para asegurarse de que aproximadamente 2 × 105 células se siembran en los pocillos precalentados recubiertos de Matrigel suplementados con 200 μL de medio de cultivo de organoides.
NOTA: Los organoides a base de Matrigel se utilizan para estudiar la fisiopatología, evaluar la eficacia de los medicamentos y probar la toxicidad de los medicamentos16. - Gel de colágeno: Cuente la suspensión unicelular para asegurarse de que se mezclen aproximadamente 10a 6 células con 1 ml de gel de colágeno. Agregue la mezcla a los insertos de membrana de gel de colágeno presolidificado y colóquelos en un plato de 6 pocillos. Agregue suficiente medio de cultivo de organoides para sumergir los insertos que contienen las células y el gel de colágeno.
NOTA: Los organoides de gel de colágeno se utilizan para medir la migración de células T y estudiarel desarrollo de los tejidos.
- Matrigel: Cuente la suspensión unicelular para asegurarse de que aproximadamente 2 × 105 células se siembran en los pocillos precalentados recubiertos de Matrigel suplementados con 200 μL de medio de cultivo de organoides.
- Deje que los organoides crezcan mientras se asegura de agregar medio fresco cada 3 días.
- Pase los organoides una vez que alcancen un tamaño de 150-200 μm o criopreservalos hasta su uso posterior.
- Para el paso de organoides, transfiera los organoides a una cónica de 15 mL y lávelos con 1x DPSB. Centrifugar la mezcla a 300 × g durante 7 min a 4 °C. Retirar el sobrenadante y añadir sustituto de tripsina (50-100 μL por organoide) durante 10 min en un baño de agua a 37 °C, asegurándose de que el contenido se agite en vórtice cada 3 min.
- Detenga la digestión utilizando ADMEM/F12 (1x) Reduced Serum Medium (1:1) medio que contenga un 10% de FBS. Centrifugar la mezcla a 300 × g durante 7 min y volver a suspender en medio de cultivo de organoides.
- Siembre la suspensión unicelular en un nuevo pocillo recubierto de Matrigel/colágeno con la misma densidad de siembra inicial (2 × 105 células en 200 μL de medio de cultivo de organoides para pocillos recubiertos de Matrigel en una placa de 48 pocillos o 106 células en 1 mL de medio de cultivo de organoides para un inserto de membrana interna de 30 mm recubierto de colágeno).
- Para la criopreservación, digiera los MPDOs utilizando el sustituto de tripsina en suspensiones unicelulares seguidas de la resuspensión de 10a 6 células en 1 mL de medio de congelación (ver Tabla 1).
- Lave el tejido de melanoma recién resecado en una placa de Petri de 10 ml que contenga medio de lavado. Después del primer enjuague, use pinzas estériles para transferir el tumor a una segunda placa de Petri para un lavado adicional y repita este proceso 3 veces en hielo para preservar la integridad y viabilidad del tumor. A lo largo de estos ciclos de enjuague, use tijeras estériles y una cuchilla para eliminar el exceso de tejido conectivo, grasa y sangre residual. Después de los tres lavados, coloque el tumor en una placa de Petri vacía y use cuchillas estériles para picarlo finamente.
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Resultados
La forma y el tamaño de los MPDOs fueron monitoreados a lo largo del tiempo para estudiar su dinámica de crecimiento. Como se observa en la Figura 2, durante el período de crecimiento inicial, el tamaño del organoide aumentó sustancialmente a lo largo de los 7 días representados. Tras la observación de la dinámica de crecimiento de la MPDO, la atención se centró en la evaluación de la composición de las células inmunitarias para verificar la fiel recapitulación de los organoides a los tumore...
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Discusión
La aparición de las PDOs ha abordado las múltiples limitaciones planteadas por otros métodos de investigación del cáncer previamente establecidos, al tiempo que ha introducido aplicaciones potenciales transformadoras en el campo. Esta tecnología de organoides fue propuesta inicialmente en 2009 por Hans Clevers y sus colegas, quienes pudieron establecer con éxito un sistema de cultivo de organoides intestinales mediante el cultivo de células madre Lgr5+ derivadas del intestino ...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Este estudio fue financiado en parte por subvenciones de R01(CA258113), SPORE (CA261608) y P01 (CA114046). La Figura 1 se preparó en BioRender.com.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2 mL Tapa Roja Polipropileno Roscado Interno Vial Criogénico | Corning | 431420 | |
| 50 mL Tubo Cónico de Polipropileno | Corning | 352070 | |
| 100 mm Placa de Cultivo Celular con Tratado TC | Corning 353003 | ||
| 105 mm Pinzas de Poliestireno | Caplugs Estériles Evergreen | 222-1121-B1I | |
| 150 cm2 Cell Culture Maternal | CLS430825 | ||
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 (1x) Medio de Suero Reducido (1:1) | Gibco | 12634-010 | |
| B-27 Suplemento (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| Brilliant Violet 510 anti-humano Anticuerpo | PerforinaBioLegend | 308120 | |
| Violeta Brillante 605 antihumano Anticuerpo Ki-67 | BioLegend | 350522 | |
| Violeta Brillante 650 antihumano Anticuerpo CD366 (Tim-3) | BioLegend | 345028 | |
| Violeta Brillante 711 antihumano Anticuerpo CD45 BioLegend | 304050 | ||
| Insertos de cultivo celular 0.4 y micro; m, 30 mm de diámetro | Millipore Sigma | PIHP03050 | |
| Tampón de tinción celular | BioLegend | 420201 | |
| Cell Strainer 40 µ m Cornejado de nylon | 352340 | ||
| Filtro de celdas 70 y micro; m Cornejado de nylon | 352350 | ||
| Colagenasa, Tipo IV, polvo | Gibco | 17104019 | |
| Cultrex Rata Colágeno I | Trevigen | 3440-100-01 | |
| Placa de cultivo, PS, 48 pocillos, TC tratado con tapa, estéril | Max Scientific | 07-6048 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM - alto contenido de glucosa 4,5 mg/mL | Corning | MT10-0130CV | |
| Dnase I - Grado II | Millipore Sigma | 10104159001 | |
| DPBS, 1% | Corning | 21-031-CV | |
| Suero fetal bovino, FBS | Corning | MT35-010-CV | |
| FITC Kit de detección de apoptosis de anexina V | BD Biosciences | ||
| Forskolin | Tocris | 1099 | |
| Antibiótico Selectivo Genético (Sulfato G418) (50 mg/mL) | ThermoFisher | 10131035 | |
| GlutaMAX Suplemento | ThermoFisher | 35050061 | |
| Ham F12 Mezcla de Nutrientes ThermoFisher | 11765054 | ||
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| Higromicina B (50 mg/mL) | ThermoFisher | 10687010 | |
| L-Glutamina 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Célula L-WRN ATCC | CRL-3276 | ||
| Matrigel Sin Fenol & Dato de crecimiento. Filtro de | jeringa Corning | 356231 | |
| Millex PVDF reducido, 0,22 μ M | Millipore Sigma | SLGVR33RB | |
| N-acetilcisteína | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotinamida | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Nunc TripleFlask Matraz de cultivo celular tratado | ThermoFisher | 132867 | |
| PE/Cyanine5 antihumano Anticuerpo CD8a | BioLegend | 301010 | |
| PE-Cy 7 Ratón anti-humano CD279 (PD-1) | BD Biociencias | ||
| Pluma Estreptococo | Gibco | 15140-122 | |
| EGF humano recombinante | Peprotech | AF-100-15-1MG | |
| FGF humano recombinante-ácido | Peprotech | 100-17A | |
| Solución de bicarbonato de sodio (NaHCO3) (7.5%) | Calidad Biológico | 118-085-721 | |
| Cuchillas quirúrgicas de acero inoxidable n.º 22 | Integra | 4-322 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 |
Referencias
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