Ensayo de complementación basado en Escherichia coli para estudiar la función chaperona de la proteína de choque térmico 70

Summary

Este protocolo demuestra la actividad chaperona de la proteína de choque térmico 70 (Hsp70). Las células de E. coli dnaK756 sirven como modelo para el ensayo, ya que albergan una Hsp70 nativa y funcionalmente deteriorada, lo que las hace susceptibles al estrés térmico. La introducción heteróloga de Hsp70 funcional rescata la deficiencia de crecimiento de las células.

Abstract

La proteína de choque térmico 70 (Hsp70) es una proteína conservada que facilita el plegamiento de otras proteínas dentro de la célula, lo que la convierte en una chaperona molecular. Si bien Hsp70 no es esencial para las células de E. coli que crecen en condiciones normales, esta chaperona se vuelve indispensable para el crecimiento a temperaturas elevadas. Dado que Hsp70 está altamente conservado, una forma de estudiar la función chaperona de los genes Hsp70 de varias especies es expresarlos heterólogamente en cepas de E. coli que son deficientes en Hsp70 o expresan una Hsp70 nativa que está funcionalmente comprometida. Las células de E. coli dnaK756 son incapaces de soportar el ADN del bacteriófago λ. Además, su Hsp70 nativo (DnaK) exhibe una elevada actividad de ATPasa al tiempo que demuestra una afinidad reducida por GrpE (factor de intercambio de nucleótidos Hsp70). Como resultado, las células de E. coli dnaK756 crecen adecuadamente a temperaturas que oscilan entre 30 °C y 37 °C, pero mueren a temperaturas elevadas (>40 °C). Por esta razón, estas células sirven como modelo para estudiar la actividad chaperona de Hsp70. Aquí, describimos un protocolo detallado para la aplicación de estas células para realizar un ensayo de complementación, lo que permite el estudio de la función chaperona in cellulo de Hsp70.

Introduction

Las proteínas de choque térmico desempeñan un papel importante como chaperonas moleculares al facilitar el plegamiento de proteínas, prevenir la agregación de proteínas y revertir el mal plegamiento de proteínas ^1,2. La proteína de choque térmico 70 (Hsp70) es una de las chaperonas moleculares más prominentes, desempeñando un papel central en la homeostasis de las proteínas ^3,4. DnaK es el homólogo de E. coli Hsp70⁵.

Se han desarrollado varios ensayos biofísicos, bioquímicos y celulares para explorar la actividad de la chaperona de Hsp70 y para detectar inhibidores dirigidos a esta chaperona ^6,7,8. Hsp70 es una proteína altamente conservada. Por esta razón, se ha reportado que varias Hsp70 de organismos eucariotas, como Plasmodium falciparum (el principal agente de la malaria), sustituyen la función de DnaK en E. coli ^6,9. De esta manera, se ha desarrollado un ensayo de complementación basado en E. coli que involucra la expresión heteróloga de Hsp70s en E. coli para explorar su función citoprotectora. Por lo general, este ensayo implica la utilización de células de E. coli que son deficientes para DnaK o que expresan un DnaK nativo que está funcionalmente comprometido. Si bien el DnaK no es esencial para el crecimiento de E. coli en condiciones normales, se vuelve esencial cuando las células se cultivan en condiciones estresantes, como temperaturas elevadas u otras formas de estrés^10,11.

Las cepas de E. coli que se han desarrollado para estudiar la función de Hsp70 mediante un ensayo de complementación incluyen E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) y E. coli dnaK756. Las células de E. coli dnaK103 producen un DnaK truncado que no es funcional y, como tal, las células crecen adecuadamente a 30 °C, mientras que la cepa es sensible al estrés por frío y calor^12,13. Del mismo modo, la cepa E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) no crece por encima de 40 °C^14,15. La cepa de E. coli dnaK756 expresa un DnaK nativo mutante (DnaK756) caracterizado por tres sustituciones de glicina a aspartato en las posiciones 32, 455 y 468, lo que da lugar a resultados proteostáticos comprometidos. En consecuencia, esta cepa es resistente al bacteriófago λ ADN¹⁴. Además, E. coli dnaK756 exhibe una elevada actividad de ATPasa, mientras que su afinidad por el factor de intercambio de nucleótidos, GrpE, se reduce¹⁶. E. coli Las cepas mutantes DnaK sirven como modelos ideales para investigar la actividad chaperona de Hsp70 a través de un enfoque de complementación. Dado que el DnaK solo es esencial en condiciones de estrés, el ensayo de complementación se realiza normalmente a temperaturas elevadas (Figura 1). Algunas ventajas del uso de E. coli para este estudio incluyen su genoma bien caracterizado, su rápido crecimiento y el bajo costo de cultivo y mantenimiento¹⁷.

En este artículo, describimos en detalle un protocolo que involucra el uso de células de E. coli dnaK756 para estudiar la función de Hsp70. Las Hsp70 que empleamos en el ensayo son DnaK de tipo salvaje y su derivado quimérico, KPf (formado por el dominio ATPasa de DnaK fusionado con el dominio de unión al sustrato C-terminal de Plasmodium falciparum Hsp70-1 ^6,18). KPf-V436F se expresó heterólogamente como un control negativo, ya que la mutación esencialmente lo bloquea de unirse a los sustratos, anulando así su actividad chaperona⁹.

Protocol

1. Transformación

NOTA: Utilice cristalería estéril para el cultivo, puntas de pipeta y medios recién preparados y esterilizados en autoclave. Preparar cultivos de las células de E. coli en 2x triptona de levadura (YT) [triptona al 1,6% (p/v), extracto de levadura al 1% (p/v), NaCl al 0,5% (p/v), agar agar al 1,5% (p/v)]. Los reactivos generales utilizados en el protocolo y sus fuentes se proporcionan en la Tabla de Materiales.

1. Etiquete los tubos de microcentrífuga de 2,0 ml y una alícuota de 50 μl de células competentes de E. coli dnaK756, manteniendo las células en hielo.
2. A los tubos de microcentrífuga de 2,0 ml con células competentes, alicuar 10-50 ng de ADN plásmido pQE60/DnaK, pQE60/KPf y pQE60/KPf-V436F⁹ en tubos separados.
3. Mantenga los tubos de microcentrífuga de 2,0 ml que contienen las células competentes y el ADN plasmídico en hielo durante 30 minutos.
4. Realice un choque térmico de la mezcla de células competentes y ADN durante 60 s a 42 °C y vuelva a colocar los tubos de microcentrífuga en hielo durante 10 minutos.
5. Añadir 950 μL de caldo fresco 2x YT (preincubado a 37 °C) e incubar a 37 °C agitando a 150 revoluciones/min durante 1 h. Deja que las células crezcan durante mucho más tiempo para favorecer su recuperación si es necesario.
   NOTA: Evite agitar las células vigorosamente.
6. Pipetear 100 μL de las células y extenderlas en 2 placas de agar YT que contengan 50 μg/mL de kanamicina, 10 μg/mL de tetraciclina para la cepa respectiva y 100 μg/mL de ampicilina (ver Tabla de materiales) para la selección de plásmidos.
7. Centrifugar el resto de las células (cuyo volumen es ahora de aproximadamente 900 μL) durante 1 min a 5000 x g (a 4 °C) utilizando una microcentrífuga de sobremesa.
8. Decantar unos 800 μL del caldo y utilizar el medio restante para resuspender las células peletizadas.
9. Coloque las células recuperadas en la placa de agar 2x YT.
10. Incubar ambas placas de agar durante la noche (o aproximadamente 17 h) a 37 °C.
    NOTA: Estas células crecen muy lentamente y es posible que deban incubarse durante mucho más tiempo. Tenga cuidado de detectar las colonias que pueden comenzar siendo muy pequeñas. La placa que contiene las células resuspendidas después de la centrifugación (paso 1.7) sirve como respaldo en caso de que la eficiencia de transformación de las células sea deficiente, en cuyo caso las células peletizadas pueden mejorar la recuperación de cualquier célula transformada. Sin embargo, si la eficiencia de transformación es excelente, la placa de agar en la que se sembraron las células concentradas puede caracterizarse por un cultivo demasiado crecido en el momento de la incubación, lo que dificulta la identificación de colonias individuales. En ese caso, la otra placa de agar puede ser aquella en la que crecen colonias bien espaciadas.

2. Recubrimiento celular

1. Recoger una sola colonia de los transformantes e inocularla en 10 ml de caldo 2x YT suplementado con 50 μg/ml de kanamicina, 10 μg/ml de tetraciclina para la selección de las células de E. coli dnaK756 y 100 μg/ml de ampicilina para la selección de plásmidos.
   NOTA: Utilice matraces (≥50 mL) para asegurar la aireación al agitar el cultivo. Incubar el inóculo durante la noche (17 h) a 37 °C agitando a 150 rotaciones/min.
2. Tome una lectura de absorbancia en OD₆₀₀ a la mañana siguiente.
3. Limpie la superficie del banco de trabajo con etanol al 75% para frotar la superficie en preparación para la detección de células.
4. Usando un tubo de microcentrífuga de 2 ml, estandarice el cultivo a una lectura de OD₆₀₀ de 2.0 usando caldo YT 2x.
   NOTA: Asegúrese de que las lecturas de OD se tomen correctamente, ya que este paso es importante para estandarizar la densidad celular en las distintas muestras.
5. Usando tubos de microcentrífuga de 2 mL, prepare diluciones seriadas de las células de 10⁰ a ^10-5.
6. Incubar las placas de agar que se utilizarán para localizar las células en un horno a 40 °C para permitir que las placas se sequen con las tapas parcialmente abiertas para garantizar la salida del vapor de agua.
   NOTA: Para asegurarse de que las celdas se detectan a distancias uniformemente separadas, dibuje líneas en una hoja de papel en la que se imprima una plantilla de sitios de detección.
7. Colocar 2 μL de las células diluidas en serie en las placas de agar suplementadas con 50 μg/mL de kanamicina, 10 μg/mL de tetraciclina, 100 μg/mL de ampicilina y 0,5 mM de IPTG (para la inducción de la expresión de las proteínas recombinantes) (ver Tabla de Materiales).
8. Coloque cada muestra en dos placas separadas (una para incubar a 37 °C y la otra a 43,5 °C).
   NOTA: Evite perforar la placa de agar.
9. Coloque las muestras de control en la misma placa que las muestras experimentales para minimizar los efectos ambientales.
10. Realice el manchado rápidamente para asegurarse de que el proceso se complete antes de que las células comiencen a crecer, ya que esto puede generar patrones de crecimiento sesgados.
    NOTA: Es importante evitar los aerosoles al manchar, ya que estos contaminarían las placas. También es importante mantener las placas cerradas entre las manchas para evitar la contaminación.
11. Incubar una placa a 37 °C (temperatura de crecimiento permisiva) y la otra a la temperatura de crecimiento no permisiva de 43,5 °C.
    NOTA: Incube las placas boca abajo para evitar que el vapor se acumule en la tapa, ya que el agua condensada arrastraría las colonias manchadas de sus posiciones.
12. Coloque todas las placas en las incubadoras al mismo tiempo y evite abrir la incubadora hasta la mañana siguiente.
    NOTA: Se desaconseja abrir la puerta de la incubadora varias veces durante la incubación de las placas. Esto se debe a que el acceso de aire a la incubadora puede provocar fluctuaciones de temperatura que afectan negativamente al crecimiento celular.

3. Confirmación de la expresión de proteínas recombinantes

1. Usando un asa estéril, recoja parte de las células restantes de la misma colonia de células transformadas de E. coli dnaK756.
2. Inocular las células en 10 ml de caldo YT suplementado con 50 μg/ml de kanamicina, 10 μg/ml de tetraciclina y 100 μg/ml de ampicilina. Incubar durante la noche (17 h) a 37 °C agitando a 150 revoluciones/min.
3. Transfiera el cultivo a 90 ml de caldo estéril 2x YT que contenga los antibióticos necesarios como se menciona en el paso 3.2. Deje que las células crezcan hasta la fase logarítmica media (OD₆₀₀ = 0,4-0,6).
4. Tomar 2 ml del cultivo de la muestra antes de la inducción (muestra de inducción de 0 h).
5. Añadir IPTG a una concentración final de 1 mM para inducir la producción de proteínas y volver a incubar las células a 37 °C.
6. Tome una segunda muestra de 2 ml 6 h después de la inducción.
7. Cosechar las células centrifugando a 5000 x g durante 10 min. Mantenga la temperatura de la centrífuga a 4 °C.
8. Deseche el sobrenadante.
9. Resuspender el gránulo en tampón PBS (137 mM NaCl, 27 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄, 1,4 mM KH₂PO₄) y almacenar a -20 °C.

4. Análisis SDS-PAGE y Western blot

1. Prepare 2 geles de SDS al 10% como se describió anteriormente¹⁹.
2. Guarde uno de los geles SDS-PAGE para la tinción posterior con tinción de Coomassie para ver las bandas de proteínas. Utilice el segundo gel SDS-PAGE para realizar el análisis de Western blot.
3. Alícuota 80 μL de las muestras resuspendidas y mezclarlo con 20 μL de tampón de carga 4x Laemmli SDS.
4. Hervir la suspensión a 100 °C durante 10 min. A continuación, cargue 10 μL de cada muestra en el gel SDS prefabricado (consulte la Tabla de materiales).
5. Realice la electroforesis a temperatura ambiente durante 1 h utilizando una tensión de 120 V en una solución 1x de tampón de funcionamiento SDS (25 mm de Tris, 250 mm de glicina, 0,1 % (p/v) de SDS).
6. Tiñir el gel con la tinción de Coomassie (ver Tabla de Materiales) durante 1 h, seguido de decoloración con tampón decolorante (metanol al 50% (v/v), ácido acético al 10% (v/v) en agua destilada) durante 2 h.
7. Visualice las bandas de proteínas presentes en el gel utilizando un sistema de imágenes de gel (consulte la Tabla de materiales). Vuelva a ejecutar otro gel SDS-PAGE con las mismas muestras siguiendo el protocolo mencionado anteriormente.
8. Cuando finalice la ejecución electroforética, tome los geles SDS-PAGE para realizar el análisis de Western blot como se describió anteriormente¹⁹.
9. Lave la membrana de nitrocelulosa a la que se transfirieron las proteínas tres veces en tampón de lavado (TBS-Tween, pH 7,4 [50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% (v/v) Tween]).
10. Utilice α-DnaK (consulte la Tabla de materiales) para detectar DnaK y α-PfHsp70-1⁷ para detectar KPf y su mutante, KPf-V436F), respectivamente.
11. Utilizar los anticuerpos en una dilución de 1:2000 en leche descremada al 5%. Incubar a 4 °C agitando a 60 revoluciones/min durante 1 h.
12. Eliminar el anticuerpo no unido específicamente lavando la membrana de nitrocelulosa en TBS-Tween 3 veces en 15 min.
13. Incubar la membrana en el anticuerpo secundario (α-conejo, ver Tabla de Materiales) en las mismas condiciones que en el paso anterior. A esto le sigue el lavado posterior en las mismas condiciones que el anticuerpo primario.
14. Resuelva las bandas utilizando el reactivo de detección de quimioluminiscencia mejorada (ECL).
15. Visualice las bandas con un generador de imágenes de gel.

Results

La Figura 2 presenta una imagen del agar escaneado que contiene células que fueron detectadas y cultivadas a la temperatura de crecimiento permisiva de 37 °C y 43,5 °C, respectivamente. En el lado derecho de la Figura 2, los componentes de Western blot extirpados representan la expresión de DnaK, KPf y KPf-V436F en células dnaK756 de E. coli. Como era de esperar, todas las células de E. coli dnaK756 cultivadas a la temperatura de crecimiento permisiva de 37 °C lograron crecer. Sin embargo, bajo las condiciones de crecimiento no permisivo de 43,5 °C, solo las células que expresan heterología DnaK y KPf lograron crecer, como se informó previamente ^6,9,20 (Figura 2). Por otro lado, las células que expresan KPf-V436F solo crecieron a 37 °C, pero no crecieron a 43,5 °C. Esto demuestra que DnaK y KPf fueron capaces de restaurar el defecto de crecimiento de las células de E. coli dnaK756 en condiciones de estrés térmico. El fracaso de las células que expresan heterólogamente KPf-V436F para apoyar el crecimiento de las células a 43,5 °C demuestra la falta de función chaperona de esta proteína. En este sentido, KPf-V436F sirve como una proteína ideal de control negativo.

Figura 1: Principio del ensayo de complementación utilizando células de E. coli dnaK756 para estudiar la función chaperona de proteínas expresadas heterólogamente. E. coli dnaK756 expresa una proteína nativa DnaK756 que es incapaz de proteger las células contra el estrés térmico. La introducción de Hsp70 heteróloga funcional rescata a las células de la muerte tras la exposición al estrés térmico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Ensayo en placa de complementación que demuestra las capacidades de DnaK y KPf para proteger las células de E. coli dnaK756 contra el estrés térmico. Las células transformadas se cultivaron a 37 °C (temperatura de crecimiento permisiva) y 43,5 °C (temperatura de crecimiento no permisiva). Las células se estandarizaron y se sembraron como diluciones seriadas. La 'N' simboliza 'Limpio', representando la primera mancha compuesta de células sin diluir. En el extremo derecho se encuentran las escisiónes de Western blot que representan la expresión de las tres proteínas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El protocolo demuestra la utilidad de las células dnaK756 de E. colien la exploración de la función chaperona de la Hsp70 expresada heterólogamente. Este ensayo podría adoptarse para detectar inhibidores dirigidos a la función de Hsp70 en el celullo. Sin embargo, una limitación de este método es que las Hsp70 incapaces de sustituir al DnaK en E. coli no son compatibles con este ensayo. La falta de modificación postraduccional²¹ de algunas Hsp70 no nativas puede explicar su falta de función dentro del sistema de E. coli . Un ensayo de complementación basado en levaduras²² puede abordar algunas de las deficiencias del ensayo basado en E. coli.

Varios pasos clave son cruciales para garantizar resultados reproducibles. Entre ellas, garantizar que solo se utilicen durante la siembra las células transformadas por la construcción plásmida respectiva. Además, es importante evitar la contaminación del cultivo a lo largo de los pasos. Además, dado que las células DnaK de E. coli estresadas son susceptibles a una filamentación excesiva¹⁰, es importante evitar la agitación vigorosa durante el cultivo, ya que esta tensión física promueve una filamentación extensa. Las células excesivamente filamentadas dan lecturas de crecimiento aparente falsas más altas a DO₆₀₀, lo que lleva a una sobreestimación del crecimiento del cultivo y afecta negativamente a la estandarización celular antes de la siembra. Aunque la Hsp70 no es esencial para el crecimiento de E. coli en condiciones normales, las células que carecen de esta proteína son susceptibles al estrés¹⁰. Por esta razón, las células de E. coli dnaK756 crecen mucho más lentamente después de ser transformadas o durante su recuperación de las reservas de glicerol. Además, son extremadamente sensibles a las fluctuaciones de temperatura. Por lo tanto, es importante evitar abrir la puerta de la incubadora una vez colocadas las placas de agar plateadas en el interior hasta que llegue el momento de ver las placas.

Los datos de Western blot son importantes para confirmar la expresión de las respectivas proteínas Hsp70 recombinantes en células de E. coli dnaK756. La falta de expresión de la proteína respectiva conduce a un resultado falso negativo para las células que crecen a una temperatura de crecimiento no permisiva.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-β-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	8,05,740	Constituyente para el colorante de carga de muestras
Ácido acético	Labchem		101005125 Constituyente del decolorante
Acrilamida	Sigma-Aldrich	8008300100	Componente del agar SDS
Merck		HG000BX1.500	Constituyente del ensayo de crecimiento medio y líquido
Agarosa	Clever Scientific	14131031	Biología molecular certificada agarosa
Persulfato de amonio	Sigma-Aldrich	101875295	Constituyente para el gel SDS-PAGE
Ampicilina	VWR International	0339—EU— 25G	Antibiótico selectivo
Bis	Sigma-aldrich		1015460100 Componente de SDS
Bromofenol	Sigma-Aldrich	0449-25G	Constituyente para colorante de carga de muestras
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4	Para la preparación
Coomassie azul brillante	VWR International	443293X	SDS-PAGE colorante
Fosfato sódico dibásico	Sigma-Aldrich	RB10368	Constituyente del tampón
PBS ECL	Thermofischer Scientific	32109	Reactivo de detección de Western blot
Bromuro de etidio	Thermofischer Scientific	17898	Colorante intercalante de ADN
Glicerol	Merck		SAAR2676520L Constituyente para el colorante de carga de muestras
Glicina	VWR International	10119CU	Componente de SDS
IPTG	Glentham life sciences	162IL	inductor
Kanamycin	Melford	K0126	Antibiótico selectivo
Cloruro de magnesio	Merck	SAAR4123000EM	Constituyente del ensayo de crecimiento medio y líquido
Metanol	Labchem	113140129	Constituyente del destainer
Fosfato de potasio monobásico	Merck	1,04,87,30,250	Constituyente del tampón PBS
Peptona Merck		HG000BX4.250	Constituyente del ensayo de crecimiento medio y líquido
Cloruro de potasio	Merck	SAAR5042020EM	Constituyente del tampón PBS
Membrana de PVDF	Thermofischer scientific	PB7320	Membrana Western blot
Cloruro de sodio	Merck	SAAR5822320EM	Constituyente del ensayo de crecimiento medio y líquido
Dodecil sulfato de sodio	VWR International 108073		Para resolver las proteínas expresadas
Spectramax iD3	Separaciones	373705019	Lector automático de placas
TEMED	VWR International	ACRO420580500	Componente del gel SDS
Tetraciclina	Duchefa Biochemies	T0150.0025	Antibiótico selectivo
Tris	VWR International	19A094101	Componente del gel SDS
Tween20	Merck	SAAR3164500XF	Constituyente para tampón de lavado occidental
Cámara de transferencia occidental	Thermofisher Scientific	PB0112	Transferencia de proteína a membrana de nitrocelulosa
Extracto de levadura	Merck	HG000BX6.500	Constituyente del ensayo de crecimiento medio y líquido
&alfa;-DnaK	anticuerpo Inqaba	BK CAC09317	Anticuerpo primario
&alfa;-anticuerpo de conejo	Thermofischer scientific	31460	Anticuerpo secundario