Ensayo de complementación basado en Escherichia coli para estudiar la función chaperona de la proteína de choque térmico 70

Resumen

Este protocolo demuestra la actividad chaperona de la proteína de choque térmico 70 (Hsp70). Las células de E. coli dnaK756 sirven como modelo para el ensayo, ya que albergan una Hsp70 nativa y funcionalmente deteriorada, lo que las hace susceptibles al estrés térmico. La introducción heteróloga de Hsp70 funcional rescata la deficiencia de crecimiento de las células.

Resumen

La proteína de choque térmico 70 (Hsp70) es una proteína conservada que facilita el plegamiento de otras proteínas dentro de la célula, lo que la convierte en una chaperona molecular. Si bien Hsp70 no es esencial para las células de E. coli que crecen en condiciones normales, esta chaperona se vuelve indispensable para el crecimiento a temperaturas elevadas. Dado que Hsp70 está altamente conservado, una forma de estudiar la función chaperona de los genes Hsp70 de varias especies es expresarlos heterólogamente en cepas de E. coli que son deficientes en Hsp70 o expresan una Hsp70 nativa que está funcionalmente comprometida. Las células de E. coli dnaK756 son incapaces de soportar el ADN del bacteriófago λ. Además, su Hsp70 nativo (DnaK) exhibe una elevada actividad de ATPasa al tiempo que demuestra una afinidad reducida por GrpE (factor de intercambio de nucleótidos Hsp70). Como resultado, las células de E. coli dnaK756 crecen adecuadamente a temperaturas que oscilan entre 30 °C y 37 °C, pero mueren a temperaturas elevadas (>40 °C). Por esta razón, estas células sirven como modelo para estudiar la actividad chaperona de Hsp70. Aquí, describimos un protocolo detallado para la aplicación de estas células para realizar un ensayo de complementación, lo que permite el estudio de la función chaperona in cellulo de Hsp70.

Introducción

Las proteínas de choque térmico desempeñan un papel importante como chaperonas moleculares al facilitar el plegamiento de proteínas, prevenir la agregación de proteínas y revertir el mal plegamiento de proteínas ^1,2. La proteína de choque térmico 70 (Hsp70) es una de las chaperonas moleculares más prominentes, desempeñando un papel central en la homeostasis de las proteínas ^3,4. DnaK es el homólogo de E. coli Hsp70⁵.

Se han desarrollado varios ensayos biofísicos, bioquímicos y celulares para ....

Protocolo

1. Transformación

NOTA: Utilice cristalería estéril para el cultivo, puntas de pipeta y medios recién preparados y esterilizados en autoclave. Preparar cultivos de las células de E. coli en 2x triptona de levadura (YT) [triptona al 1,6% (p/v), extracto de levadura al 1% (p/v), NaCl al 0,5% (p/v), agar agar al 1,5% (p/v)]. Los reactivos generales utilizados en el protocolo y sus fuentes se proporcionan en la Tabla de Materiales.

1. Etiquete los tubos de microcentrífuga de 2,0 ml y una alícuota de 50 μl de células competentes de E. coli dnaK756, manteniendo las células en hielo.
....

Resultados

La Figura 2 presenta una imagen del agar escaneado que contiene células que fueron detectadas y cultivadas a la temperatura de crecimiento permisiva de 37 °C y 43,5 °C, respectivamente. En el lado derecho de la Figura 2, los componentes de Western blot extirpados representan la expresión de DnaK, KPf y KPf-V436F en células dnaK756 de E. coli. Como era de esperar, todas las células de E. coli dnaK756 cultivadas a la temperatura de crecimiento pe.......

Discusión

El protocolo demuestra la utilidad de las células dnaK756 de E. colien la exploración de la función chaperona de la Hsp70 expresada heterólogamente. Este ensayo podría adoptarse para detectar inhibidores dirigidos a la función de Hsp70 en el celullo. Sin embargo, una limitación de este método es que las Hsp70 incapaces de sustituir al DnaK en E. coli no son compatibles con este ensayo. La falta de modificación postraduccional²¹ de algunas Hsp70 no nativas puede explicar .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-β-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	8,05,740	Constituyente para el colorante de carga de muestras
Ácido acético	Labchem		101005125 Constituyente del decolorante
Acrilamida	Sigma-Aldrich	8008300100	Componente del agar SDS
Merck		HG000BX1.500	Constituyente del ensayo de crecimiento medio y líquido
Agarosa	Clever Scientific	14131031	Biología molecular certificada agarosa
Persulfato de amonio	Sigma-Aldrich	101875295	Constituyente para el gel SDS-PAGE
Ampicilina	VWR International	0339—EU— 25G	Antibiótico selectivo
Bis	Sigma-aldrich		1015460100 Componente de SDS
Bromofenol	Sigma-Aldrich	0449-25G	Constituyente para colorante de carga de muestras
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4	Para la preparación
Coomassie azul brillante	VWR International	443293X	SDS-PAGE colorante
Fosfato sódico dibásico	Sigma-Aldrich	RB10368	Constituyente del tampón
PBS ECL	Thermofischer Scientific	32109	Reactivo de detección de Western blot
Bromuro de etidio	Thermofischer Scientific	17898	Colorante intercalante de ADN
Glicerol	Merck		SAAR2676520L Constituyente para el colorante de carga de muestras
Glicina	VWR International	10119CU	Componente de SDS
IPTG	Glentham life sciences	162IL	inductor
Kanamycin	Melford	K0126	Antibiótico selectivo
Cloruro de magnesio	Merck	SAAR4123000EM	Constituyente del ensayo de crecimiento medio y líquido
Metanol	Labchem	113140129	Constituyente del destainer
Fosfato de potasio monobásico	Merck	1,04,87,30,250	Constituyente del tampón PBS
Peptona Merck		HG000BX4.250	Constituyente del ensayo de crecimiento medio y líquido
Cloruro de potasio	Merck	SAAR5042020EM	Constituyente del tampón PBS
Membrana de PVDF	Thermofischer scientific	PB7320	Membrana Western blot
Cloruro de sodio	Merck	SAAR5822320EM	Constituyente del ensayo de crecimiento medio y líquido
Dodecil sulfato de sodio	VWR International 108073		Para resolver las proteínas expresadas
Spectramax iD3	Separaciones	373705019	Lector automático de placas
TEMED	VWR International	ACRO420580500	Componente del gel SDS
Tetraciclina	Duchefa Biochemies	T0150.0025	Antibiótico selectivo
Tris	VWR International	19A094101	Componente del gel SDS
Tween20	Merck	SAAR3164500XF	Constituyente para tampón de lavado occidental
Cámara de transferencia occidental	Thermofisher Scientific	PB0112	Transferencia de proteína a membrana de nitrocelulosa
Extracto de levadura	Merck	HG000BX6.500	Constituyente del ensayo de crecimiento medio y líquido
&alfa;-DnaK	anticuerpo Inqaba	BK CAC09317	Anticuerpo primario
&alfa;-anticuerpo de conejo	Thermofischer scientific	31460	Anticuerpo secundario

competente de células