Fabricación de matriz de bazo descelularizada derivada de ratas

Resumen

La matriz de bazo descelularizada (DSM) tiene aplicaciones prometedoras en el campo de la ingeniería de tejidos hepáticos. Este protocolo describe el procedimiento para preparar el DSM de rata, que incluye la recolección de bazo de rata, la descelularización de los mismos mediante perfusión y la evaluación del DSM resultante para confirmar sus características.

Resumen

El trasplante de hígado es el tratamiento primario para la enfermedad hepática en etapa terminal. Sin embargo, la escasez y la calidad inadecuada de los órganos de los donantes hacen necesario el desarrollo de terapias alternativas. Los hígados bioartificiales (BAL) que utilizan matriz hepática descelularizada (DLM) han surgido como soluciones prometedoras. Sin embargo, el abastecimiento de DLM adecuados sigue siendo un reto. Se ha explorado el uso de una matriz de bazo descelularizada (DSM) como base para las LBA, ofreciendo una alternativa fácilmente disponible. En este estudio, se recolectaron bazos de rata y se descelularizaron utilizando una combinación de ciclos de congelación-descongelación y perfusión con reactivos de descelularización. El protocolo preservó las microestructuras y componentes de la matriz extracelular (MEC) dentro del DSM. El proceso completo de descelularización duró aproximadamente 11 h, lo que dio como resultado un ECM intacto dentro del DSM. El análisis histológico confirmó la eliminación de componentes celulares conservando la estructura y composición de la MEC. El protocolo presentado proporciona un método integral para la obtención de DSM, ofreciendo aplicaciones potenciales en ingeniería de tejido hepático y terapia celular. Estos hallazgos contribuyen al desarrollo de enfoques alternativos para el tratamiento de la enfermedad hepática en etapa terminal.

Introducción

El trasplante hepático sigue siendo el único tratamiento definitivo para la enfermedad hepática terminal ^1,2,3. Sin embargo, la escasez crítica y la disminución de la calidad de los órganos de los donantes han aumentado la necesidad de tratamientos alternativos⁴. En el ámbito de la medicina regenerativa, los hígados bioartificiales (BAL) que utilizan matriz hepática descelularizada (DLM) han surgido como soluciones prometedoras ^5,6,7. El DLM conserva la estructura hepática original, incluida su intrincada red microvascular y los componentes de la MEC, lo que ofrece un andamio para crear BAL trasplantables que podrían aliviar las enfermedades hepáticas.

A pesar de la promesa, la adopción de esta tecnología se enfrenta a desafíos, especialmente en el abastecimiento de DLM adecuados. Los DLM derivados del ser humano son escasos, mientras que los de origen animal conllevan riesgos de transmisión de enfermedades y rechazo inmunológico. En un enfoque innovador, nuestra investigación ha explorado el uso de una matriz de bazo descelularizada (DSM) como base para las LBA 8,9,10,11. El bazo está más disponible en diversas situaciones médicas, como la hipertensión portal, la ruptura traumática, la púrpura trombocitopénica idiopática y la donación después de la muerte cardíaca. Por lo tanto, el bazo está más ampliamente disponible que el hígado para fines de investigación. Los pacientes que se han sometido a esplenectomías no sufren afecciones graves, lo que confirma aún más la prescindibilidad del bazo. El microambiente del bazo, particularmente la matriz extracelular y los sinusoides, es similar al del hígado. Esto hace que el bazo sea un órgano adecuado para la adhesión y proliferación celular en la investigación del trasplante de hepatocitos. Sobre la base de estos hallazgos, nuestras investigaciones anteriores han demostrado que los DSM comparten microestructuras y componentes comparables con los DLM y pueden apoyar la supervivencia y la función de los hepatocitos, incluida la producción de albúmina y urea. Además, se ha demostrado que los DSM mejoran la diferenciación hepática de las células madre mesenquimales de la médula ósea, lo que conduce a una funcionalidad mejorada y consistente.

Mediante el empleo de DSMs tratados con heparina, hemos diseñado BALs funcionales capaces de demostrar una anticoagulación efectiva a corto plazo y una compensación parcial de la función hepática¹¹. En consecuencia, este DSM tridimensional es muy prometedor para el avance de la ingeniería de tejidos hepáticos y la terapia celular. En este trabajo, presentamos los métodos detallados de recolección de bazo de rata y preparación de DSM que preservan las microestructuras y componentes de la MEC.

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de los Experimentos con Animales de la Universidad de Xi'an Jiaotong y se llevó a cabo de acuerdo con las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

1. Recolección de bazo

1. Utilice ratas Sprague Dawley macho que pesen entre 250 y 280 g. Aloje a las ratas en habitaciones con temperatura y humedad controladas, y bríndeles comida y agua ad libitum, excepto en ayunas antes de la cirugía.
2. Inyectar buprenorfina por vía subcutánea (0,05 mL/kg) como analgésico 1 h antes de la operación. Anestesiar a la rata por inhalación de isoflurano. Utilice un caudal de 1,5 L/min de isoflurano al 5% para la anestesia de inducción en una caja de plexiglás y mantenga la anestesia con un caudal de 0,6-0,8 L/min de isoflurano al 2% a través de una mascarilla. Confirme la profundidad de la anestesia pellizcando los dedos de los pies.
3. Usa una afeitadora eléctrica para afeitar la piel de todo el abdomen. Asegure la rata en posición supina sobre la mesa quirúrgica. Inyectar 2 mL de solución salina heparinizada (1.000 U de heparina) a través de la vena dorsal del pene para lograr la anticoagulación sistémica. Desinfecte la piel afeitada con una solución de povidona yodada y cúbrala con un paño estéril.
4. Haga una incisión cruciforme con tijeras quirúrgicas en el abdomen, exponga la cavidad abdominal estirándola con las pinzas hemostáticas y voltee el hígado hacia el diafragma. Exteriorizar el tracto gastrointestinal hacia el lado derecho del abdomen y cubrirlo con una gasa húmeda.
5. Separe y corte cuidadosamente el ligamento esplenogástrico para exponer el hilio esplénico.
   NOTA: En el abdomen izquierdo se puede identificar el bazo, que aparece como una estructura alargada de color rojizo, de aproximadamente 3,0 cm x 0,6 cm x 0,6 cm.
6. Separe y exponga gradualmente la arteria hepática común, la arteria gastroduodenal y la arteria esplénica mediante disección a lo largo del hilio esplénico. Ligar y cortar la arteria gastroduodenal y la arteria hepática común mientras disocia progresivamente el tejido circundante.
7. Voltea el bazo hacia el lado derecho para exponer la aorta abdominal. Realice suavemente una disección roma y exponga la aorta abdominal y el tronco celíaco con hisopos de algodón. Colocar una sutura de seda 3-0, de aproximadamente 3 cm de longitud, por encima y por debajo de las ramas del tronco celíaco, y colocar una sutura de seda 6-0, de aproximadamente 10 cm de longitud, en la rama del tronco celíaco.
8. Ligadura de la aorta abdominal por debajo y por encima de las ramas del tronco celíaco. Haga una pequeña incisión en la rama arterial. Levante suavemente la sutura de seda 6-0, inserte un catéter venoso de 24 G en la arteria esplénica a lo largo del tronco celíaco, y látelo y asegúrelo.
9. Utilizando una bomba de jeringa a una velocidad de 4 mL/min, infunda solución salina normal heparinizada (25 U/mL) a un volumen de 50 mL. Al mismo tiempo, corte la vena porta como un canal de salida para permitir que el líquido infundido fluya fuera del bazo. El animal es sacrificado por exanguinación.
10. Diseccionar cuidadosamente el tejido circundante del bazo, evitando dañar el páncreas, al tiempo que se conservan los principales vasos accesorios.
11. Verifique si hay fugas alrededor del bazo, luego retire el bazo y el páncreas y enjuáguelos con solución salina normal.
    NOTA: El bazo y el páncreas de las ratas están estrechamente conectados, con el páncreas envolviendo la arteria esplénica. Si el bazo se extirpa por separado, puede ser difícil ligar numerosos vasos sanguíneos pequeños. En este procedimiento, se extirpa el bazo junto con el páncreas. Después de la descelularización, el bazo y el páncreas se vuelven transparentes y la microvasculatura es visible, lo que facilita la preservación del bazo con vasos sanguíneos intactos.
12. Transfiera el bazo a un tubo de centrífuga de 50 ml lleno de solución salina normal y guárdelo en un congelador a -80 °C.
    NOTA: El bazo y el catéter venoso insertados en la arteria esplénica se criopreservarán juntos para una conexión conveniente durante los experimentos de perfusión.

2. Descelularización del bazo

1. Repita el ciclo de congelación-descongelación 3 veces en un recipiente estéril para lisar las células del bazo.
   NOTA: El ciclo de congelación-descongelación es un método físico utilizado para la descelularización del andamio. El tejido del bazo se coloca en un congelador a -80 °C durante la noche para su congelación, luego se retira del ambiente a baja temperatura y se coloca en un baño de agua a temperatura ambiente o 37 °C para descongelar. Este proceso de congelación y descongelación se repite de 3 a 6 veces, lo que altera las membranas celulares y conduce a la lisis celular.
2. Configure un sistema de perfusión dentro de un banco limpio compuesto por una bomba peristáltica, un depósito de 2 L, un tubo de silicona con un diámetro interior de 2,4 mm y una trampa de burbujas (Figura 1).
3. Llene el sistema de perfusión con agua desionizada (ddH₂O) y manténgalo en funcionamiento durante 10 min.
4. Transfiera con cuidado el bazo extraído al recipiente lleno de ddH₂O.
5. Conecte el tubo de silicona al catéter venoso que se ha insertado en la arteria esplénica.
6. Iniciar la perfusión con ddH₂O a una velocidad de 2 mL/min durante 30 min.
7. Continuar la perfusión con ddH₂O a una velocidad de 4 mL/min durante 30 min.
8. Perfundir con una solución SDS al 0,1% (p/v) durante 4 h.
9. Perfundir con una solución Triton X-100 al 1% (v/v) durante 2 h.
10. Perfundir con PBS a una velocidad de 4 mL/min durante 4 h para lavar el DSM.
    NOTA: Uso de la bomba peristáltica para la perfusión unidireccional de todos los líquidos.
11. Una vez completada la perfusión, ligar y seccionar las ramas vasculares entre el páncreas y el bazo, y luego extirpar el páncreas. Guarde el DSM en un tubo de centrífuga limpio y sellado de 50 mL, empapado en PBS que contenga un 10% de penicilina-estreptomicina a -20 °C, hasta que esté listo para su uso en futuros experimentos.

Resultados

Este protocolo utilizó una combinación de ciclos repetidos de congelación-descongelación y perfusión con reactivos de descelularización para la descelularización del bazo de rata. La descelularización completa del bazo se logró en aproximadamente 11 h (Figura 2A). A lo largo del proceso de descelularización, el color del bazo pasó gradualmente de un rojo intenso a un rojo claro moteado y, finalmente, a una apariencia blanca translúcida (Figura 2B). La morfología...

Discusión

Los LBA representan un enfoque eficaz para el tratamiento de la enfermedad hepática terminal, especialmente en los casos en que el trasplante hepático se ve obstaculizado por la escasez actual de órganos de donantes⁶. Una opción prometedora para la creación de BAL es la utilización de DLM, que preserva la MEC natural y la estructura vascular del hígado nativo. Sin embargo, la escasez de DLM humana y los riesgos potenciales de infección e inmunogenicidad asociados con la DLM animal plantean limitac...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Máquina de anestesia	Harvard Apparatus trampa	anestesia animal	mesa
	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd.	diámetro de los poros: 5 μ m	prevenir las burbujas de aire
Buprenorfina	TIPR Pharmaceutical Responsible Co., Ltd		un analgésico
Pinzas hemostáticas	Shanghai Medical Instruments  Co., Ltd	J31020	herramienta quirúrgica
solución salina heparinizada	SPH No.1 Bioquímica & Farmacéutica Co., LTD		prevenir la formación de trombosis
Isoflurano	RWD Ciencias de la Vida Co.		anestésico: para la inducción y el mantenimiento de la anestesia
Penicilina-Estreptomicina	Beyotime Biotechnology Co., Ltd.	C0222	antibióticos in vitro para prevenir la contaminación microbiana
Bomba peristáltica	Baoding Bomba de precisión más larga Co., Ltd.	BT100-1L
solución salina tamponada con fosfato	Shanghai Titan Scientific Co., Ltd.	4481228	solución salina tampón de ácido fosfórico
Tubo de silicona	Baoding Bomba de precisión más larga Co., Ltd.	2.4 veces;
	Yangzhou Jinhuan Fábrica de instrumentos médicos	6-0 y 3-0	ligar vasos sanguíneos
Sulfato de dodecilo de sodio	Shanghai Titan Scientific Co., Ltd.	151-21-3	detergente iónico, disuelve tanto la célula como las membranas nucleares
Bomba de jeringa	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd	BeneFusion SP5	infusión intravenosa
Triton X-100	Shanghai Titan Scientific Co., Ltd.	9002-93-1	detergente no iónico, interrumpe las interacciones lípido-lípido, lípido-proteína y ADN-proteína
Catéter venoso	B. Braun Company	24G	insertando la arteria del bazo

de burbujas de de Sutura de seda de 0,8 mm