Artículo de método

Medición del estrés del retículo endoplásmico y respuesta proteica desplegada en células T infectadas por VIH-1 y análisis de su papel en la replicación del VIH-1

3.1K vistas

⸱

DOI:

10.3791/66522

⸱

14 de junio de 2024

 ,  , 
1National Centre for Cell Science, SP Pune University Campus

En este artículo

Resumen

Aquí, describimos algunos métodos establecidos para determinar el estrés del retículo endoplásmico (RE) y la activación de la respuesta proteica desplegada (UPR), con especial énfasis en la infección por VIH-1. Este artículo también describe un conjunto de protocolos para investigar el efecto del estrés del RE/UPR en la replicación del VIH-1 y la infectividad del virión.

Resumen

Las infecciones virales pueden causar estrés en el retículo endoplásmico (RE) debido a la acumulación anormal de proteínas, lo que conduce a la respuesta de proteínas desplegadas (UPR). Los virus han desarrollado estrategias para manipular la UPR del huésped, pero en la literatura hay una falta de comprensión detallada de la modulación de la UPR y su importancia funcional durante la infección por VIH-1. En este contexto, el presente artículo describe los protocolos utilizados en nuestro laboratorio para medir los niveles de estrés del RE y la UPR durante la infección por VIH-1 en células T y el efecto de la UPR sobre la replicación viral y la infectividad.

La tinción con tioflavina T (ThT) es un método relativamente nuevo que se utiliza para detectar el estrés del RE en las células mediante la detección de agregados de proteínas. Aquí, hemos ilustrado el protocolo para la tinción de ThT en células infectadas por VIH-1 para detectar y cuantificar el estrés del RE. Además, el estrés del RE también se detectó indirectamente mediante la medición de los niveles de marcadores UPR como BiP, IRE1, PERK y eIF2α fosforilados, el empalme de XBP1, la escisión de ATF6, ATF4, CHOP y GADD34 en células infectadas por VIH-1, utilizando inmunotransferencia convencional y reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (RT-PCR). Hemos encontrado que la fluorescencia de ThT se correlaciona con los indicadores de activación de UPR. Este artículo también muestra los protocolos para analizar el impacto del estrés del RE y la modulación de UPR en la replicación del VIH-1 mediante experimentos de derribo, así como el uso de moléculas farmacológicas. El efecto de la UPR sobre la expresión/replicación del gen VIH-1 y la producción del virus se analizó mediante ensayos de luciferasa y ELISA de captura de antígeno p24, respectivamente, mientras que el efecto sobre la infectividad del virión se analizó mediante la tinción de células reporteras infectadas. En conjunto, este conjunto de métodos proporciona una comprensión completa de las vías de respuesta de proteínas desplegadas durante la infección por VIH-1, revelando su intrincada dinámica.

Introducción

El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) se caracteriza por una reducción gradual del número de linfocitos T CD4+, lo que conduce al fracaso progresivo de la respuesta inmunitaria. El virus de inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1) es el agente causal del SIDA. Es un virus de ARN monocatenario con envoltura, de sentido positivo, con dos copias de ARN por virión y pertenece a la familia retroviridae. La producción de altas concentraciones de proteínas virales dentro de la célula huésped ejerce una presión excesiva sobre la maquinaria de plegamiento de proteínas de la célula1. El RE es el primer compartimento de la vía secretora de las células eucariotas. Se encarga de producir, alterar y entregar proteínas a la vía secretora y a los sitios diana del espacio extracelular. Las proteínas experimentan numerosos cambios postraduccionales y se pliegan en su conformación natural en el RE, incluida la glicosilación ligada a la asparagina y la creación de enlaces disulfuro intra e intermoleculares2. Por lo tanto, hay altas concentraciones de proteínas en el lumen del RE y estas son muy propensas a la agregación y al plegamiento incorrecto. Diversas condiciones fisiológicas, como el choque térmico, las infecciones microbianas o virales, que exigen una mayor síntesis de proteínas o una mutación de proteínas, conducen al estrés del RE debido al aumento de la acumulación de proteínas en el RE, lo que altera la homeostasis del lúmene del RE. El estrés del RE activa una red de vías de transducción de señales adaptativas altamente conservadas, la Respuesta de Proteína Desplegada (UPR)3. La UPR se emplea para restablecer la condición fisiológica normal del RE mediante la alineación de su carga proteica desplegada y su capacidad de plegamiento. Esto se produce al aumentar el tamaño del RE y las chaperonas y pletasas moleculares residentes en el RE, lo que resulta en una elevación de la capacidad de plegamiento del RE. La UPR también disminuye la carga proteica del RE a través de la atenuación global de la síntesis de proteínas a nivel traslacional y aumenta la eliminación de proteínas desplegadas del RE mediante la regulación positiva de la degradación asociada al RE (ERAD)4,5.

El estrés del RE es detectado por tres proteínas transmembrana residentes en el RE: la proteína quinasa del retículo endoplásmico similar a la R (PKR) (PERK), el factor de transcripción activador 6 (ATF6) y la enzima requirente de inositol tipo 1 (IRE1). Todos estos efectores se mantienen inactivos al unirse al miembro 5 (HSPA5) de la familia de proteínas de choque térmico chaperona A (Hsp70), también conocida como proteína de unión (BiP)/proteína regulada por glucosa de 78 kDa (GRP78). Tras el estrés del RE y la acumulación de proteínas desplegadas/mal plegadas, HSPA5 se disocia y conduce a la activación de estos efectores, que a su vez activan una serie de objetivos posteriores que ayudan a resolver el estrés del RE y, en condiciones extremas, promueven la muerte celular6. Al disociarse de HSPA5, PERK se autofosforila y se activa su actividadquinasa 7. Su actividad quinasa fosforila eIF2α, lo que conduce a la atenuación traduccional, disminuyendo la carga proteica del RE8. Sin embargo, en presencia del factor de iniciación fosfoeucariota 2α (eIF2α), los marcos de lectura abiertos no traducidos en ARNm específicos se traducen preferentemente, como ATF4, regulando los genes inducidos por el estrés. ATF4 y la proteína homóloga C/EBP (CHOP) son factores de transcripción que regulan los genes inducidos por el estrés y regulan las vías de apoptosis y muerte celular 9,10. Uno de los objetivos de ATF4 y CHOP es la proteína inducible por el daño del ADN y la detención del crecimiento (GADD34), que, junto con la proteína fosfatasa 1 desfosforila peIF2α y actúa como un regulador de retroalimentación para la atenuación traduccional11. Bajo estrés ER, ATF6 se disocia de HSPA5 y su señal de localización de Golgi queda expuesta, lo que lleva a su translocación al aparato de Golgi. En el aparato de Golgi, ATF6 es escindido por la proteasa del sitio-1 (S1P) y la proteasa del sitio-2 (S2P) para liberar la forma escindida de ATF6 (ATF6 P50). A continuación, ATF6 p50 se transloca al núcleo, donde induce la expresión de genes implicados en el plegamiento, maduración y secreción de proteínas, así como en la degradación de proteínas12,13. Durante el estrés del RE, IRE1 se disocia de HSPA5, se multimeriza y se autofosforila14. La fosforilación de IRE1 activa su dominio RNasa, mediando específicamente el splicing de 26 nucleótidos de la parte central del ARNm de la proteína de unión a X-box 1 (XBP1)15,16. Esto genera un nuevo C-terminal que confiere una función de transactivación, generando la proteína funcional XBP1s, un potente factor de transcripción que controla varios genes inducidos por el estrés del RE17,18. La actividad combinada de estos factores de transcripción activa programas genéticos destinados a restaurar la homeostasis del RE.

Existen varios métodos para detectar el estrés del RE y la UPR. Estos incluyen los métodos convencionales de análisis de los marcadores UPR 19,20. Varios métodos no convencionales incluyen la medición del estado redox de la UPR y la distribución de calcio en el lumen del RE, así como la evaluación de la estructura del RE. La microscopía electrónica se puede utilizar para ver cuánto se agranda el lumen del RE en respuesta al estrés del RE en las células y los tejidos. Sin embargo, este método requiere mucho tiempo y depende de la disponibilidad de un microscopio electrónico, que puede no estar disponible para todos los grupos de investigación. Además, la medición del flujo de calcio y el estado redox del RE es un desafío debido a la disponibilidad de reactivos. Además, la lectura de estos experimentos es muy sensible y podría verse afectada por otros factores del metabolismo celular.

Una técnica potente y sencilla para monitorizar las salidas del UPR es medir la activación de las diferentes vías de señalización del UPR y se ha utilizado durante décadas en diversos escenarios de estrés. Estos métodos convencionales para medir la activación de UPR son económicos, factibles y proporcionan la información en menos tiempo en comparación con otros métodos conocidos. Estos incluyen inmunotransferencia para medir la expresión de marcadores UPR a nivel de proteína, como la fosforilación de IRE1, PERK y eIF2α y la escisión de ATF6 midiendo la forma P50 de ATF6 y la expresión de proteínas de otros marcadores como HSPA5, XBP1 empalmado, ATF4, CHOP y GADD34, así como RT-PCR para determinar los niveles de ARNm, así como el empalme de ARNm de XBP1.

Este artículo describe un conjunto validado y fiable de protocolos para monitorizar el estrés del RE y la activación de la UPR en células infectadas por el VIH-1 y para determinar la relevancia funcional de la UPR en la replicación e infectividad del VIH-1. Los protocolos utilizan reactivos fácilmente disponibles y económicos y proporcionan información convincente sobre las salidas de la UPR. El estrés del RE es el resultado de la acumulación de proteínas desplegadas/mal plegadas, que son propensas a formar agregados proteicos21. Describimos un método para detectar estos agregados proteicos en células infectadas por VIH-1. La tinción con tioflavina T es un método relativamente nuevo que se utiliza para detectar y cuantificar estos agregados de proteínas22. Beriault y Werstuck describieron esta técnica para detectar y cuantificar los agregados de proteínas y, por lo tanto, los niveles de estrés del RE en células vivas. Se ha demostrado que la pequeña molécula fluorescente tioflavina T (ThT) se une selectivamente a los agregados de proteínas, especialmente a las fibrillas amiloides.

En este artículo, describimos el uso de ThT para detectar y cuantificar el estrés del RE en células infectadas por VIH-1 y correlacionarlo con el método convencional de monitorización de la UPR mediante la medición de la activación de diferentes vías de señalización de la UPR.

Dado que también hay una falta de información completa sobre el papel de la UPR durante la infección por VIH-1, proporcionamos un conjunto de protocolos para comprender el papel de la UPR en la replicación del VIH-1 y la infectividad del virión. Estos protocolos incluyen la eliminación mediada por lentivirus de los marcadores UPR, así como el tratamiento con inductores farmacológicos del estrés del RE. Este artículo también muestra los tipos de lectura que se pueden utilizar para medir la expresión génica del VIH-1, la producción viral y la infectividad de los viriones producidos, como el ensayo de luciferasa basado en repetición terminal larga (LTR), el ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) p24 y el ensayo de tinción β-gal reportero, respectivamente.

Utilizando la mayoría de estos protocolos, recientemente hemos reportado la implicación funcional de la infección por VIH-1 en UPR en células T23, y los resultados de ese artículo sugieren la confiabilidad de los métodos aquí descritos. Por lo tanto, este artículo proporciona un conjunto de métodos para obtener información completa sobre la interacción del VIH-1 con el estrés del RE y la activación de la UPR.

Protocolo

NOTA: Las líneas celulares utilizadas aquí son HEK-293T y Jurkat J6 (una línea celular CD4 + T), que se obtuvieron del Repositorio de Células, NCCS, Pune, India; TZM-bl, una línea celular derivada de HeLa que ha integrado copias de los genes de β-galactosidasa y luciferasa bajo el promotor de repetición terminal larga (LTR) del VIH-124 y CEM-GFP (otra línea de células T reporteras CD4+)25 se obtuvieron del Repositorio de SIDA de los NIH, EE. UU.

1. Preparación y almacenamiento de las existencias del virus VIH-1

  1. Preparación del stock del virus VIH-1
    NOTA: Se recomienda poner en práctica las directrices internacionales relacionadas con la bioseguridad disponibles en el manual de la Organización Mundial de la Salud (OMS) o de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) en todos los experimentos que involucren el VIH-1. La manipulación del virus y cualquier experimento con el virus vivo solo debe realizarse en un gabinete de bioseguridad adecuado ubicado en un laboratorio de contención de nivel BSL2 como mínimo. En este segmento del protocolo se describe la producción de partículas infecciosas del VIH-1 utilizando un kit de transfección de fosfato de calcio en mamíferos.
    1. Siembre las células HEK-293T en placas de 90 mm con 10 mL de DMEM (medio Eagle modificado de Dulbecco) completo (suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina-estreptomicina) en una cabina de bioseguridad de clase II tipo A2 y manténgalo durante aproximadamente 12 h en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C para que la confluencia de las células esté entre el 50% y el 60%.
    2. Al día siguiente, prepare la mezcla de transfección: Prepare la solución A que contiene 25 μg de ADN plasmídico pNL4.3 (un clon molecular del VIH-1) en tampón estéril, 86,8 μL de 2 M de CaCl2 y el agua estéril restante para hacer el volumen final de 700 μL para cada placa. Prepare la solución B que contiene 700 μL de 2x solución salina tamponada con HEPES (HBS) para 1 placa. A continuación, ajuste el cálculo para el número total de placas.
    3. Ahora agregue la Solución B a la Solución A gota a gota mientras vórtice continuamente la Solución A. El volumen total de la mezcla de transfección ahora es de 1,4 mL para una placa.
      NOTA: La adición precisa gota a gota de la solución B a la solución A mientras el vórtice continuo conduce a la formación de complejos de transfección perfectos.
    4. Incubar esta mezcla a temperatura ambiente (RT) durante unos 20 min. A continuación, agregue lentamente la mezcla gota a gota a cada placa que contenga 9 ml de DMEM fresco y transfiera las placas a la incubadora de CO2 . Después de 8-10 h, cambie el medio existente con 10 mL nuevos de DMEM completo.
    5. Después de 24 horas después del cambio de medio, recoja el sobrenadante (que contiene las partículas del virus) de todas las placas en tubos cónicos. Centrifugar a 600 x g durante 5 min utilizando una centrífuga de mesa de baja velocidad (Tabla de Materiales) para eliminar los restos de celda.
    6. Transfiera el sobrenadante a tubos de ultracentrífuga de polialómero y colóquelos en el rotor oscilante de una ultracentrífuga (Tabla de materiales). Verifique el equilibrio de los pesos de los soportes de los tubos y ajústelos con un medio estéril si es necesario.
    7. Ultracentrífuga a 1,41.000 x g durante 2,5 h a 4 °C. Después de esto, saque con cuidado los tubos y decante el sobrenadante lentamente dentro del gabinete de bioseguridad.
    8. Al pellet (que ahora es el virus concentrado) en cada tubo, agregue 1 mL de medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 incompleto y realice un pipeteo vigoroso para desalojar el pellet.
      NOTA: El pellet después de la ultracentrífuga es casi invisible a simple vista. Por lo tanto, debe asegurarse de agregar RPMI 1640 en el medio del tubo para que el pellet se desaloje correctamente.
    9. A continuación, añada 25 μL de 1 M HEPES pH 7,4 a 1 mL de suspensión de virus. Alicube 50 μL de la suspensión a tubos de centrífuga de 1,5 mL y almacene inmediatamente en un congelador a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo.
  2. Cuantificación de la concentración del virus y de la infectividad del virión
    NOTA: Para calcular la infectividad del virus, primero es esencial cuantificar su concentración, lo que se hace mediante ELISA de captura de antígeno p24 (de acuerdo con las instrucciones del fabricante y, por lo tanto, no se describe aquí; consulte la tabla de materiales). Este proceso da la concentración del virus en nanogramos por microlitro (ng/μL) de la cepa, que luego se utiliza para identificar el número de virión infeccioso en la cepa a través del siguiente experimento en células reporteras TZM-bl26.
    1. Cuente y siembre 0,1 x 106 células TZM-bl en una placa de 24 pocillos utilizando 500 μL de DMEM completo para cada pocillo y manténgalo en una incubadora de cultivo celular durante 10-12 h.
    2. Asegúrese de que las células estén confluentes entre un 50% y un 60% antes de comenzar con la infección para la cuantificación del virus. Cambie el medio existente con 250 μL de DMEM completo fresco en cada pocillo.
      NOTA: Mantenga un pozo de control positivo para descartar cualquier falla experimental.
    3. Calcule la cantidad de virus de stock necesaria para infecciones de 1 ng, 0,1 ng y 0,01 ng en duplicados. Agregue la cantidad adecuada de virus a los pocillos y mantenga la placa en la incubadora a 37 °C durante 4 h.
    4. Lave las células dos veces con 500 μL de DMEM incompleto y luego agregue 500 μL de DMEM completo.
    5. Continúe con el procedimiento de tinción de β galones después de 36 h de cambio de medio.
      1. Deseche el medio existente y lave las células dos veces con 1 ml de PBS. Fije las células añadiendo 500 μL de la solución de fijación (0,25% de glutaraldehído en PBS) a cada pocillo e incube en RT dentro de la cabina de bioseguridad durante 5-7 min.
      2. Prepare la solución de tinción como se indica en la Tabla 1. Manténgalo alejado de la luz ya que X-gal es sensible a la luz.
      3. Lave las células una vez con 1 mL de PBS. Recubrir las células con 500 μL de solución de tinción recién preparada e incubar a 37 °C en la oscuridad durante 2-18 h.
      4. Para detener la reacción posterior, enjuague las células con 500 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) al 3% en PBS dos veces y luego mantenga las células en 500 μL de PBS fresco.
      5. Cuente las células azules infectadas (como se muestra en la Figura 1A) bajo el microscopio con un aumento de 10x para 5 campos aleatorios. Toma un conteo promedio de los 5 campos y multiplícalo por el factor de campo y el factor de dilución. Esto cuantifica las partículas de virión infeccioso en el stock de virus.
        NOTA: Para una placa de 24 pocillos, el factor de campo es 75.
ComponentesPreparaciónVolumen requerido
PBSPrepare 1x PBS a partir de un stock de 10x PBS14 mL
Ferri-ferrocianuro de potasioDisuelva 0,82 g de ferricianuro de potasio y 1,06 g de ferrocianuro de potasio en 25 ml de 1x PBS0,75 ml
Cloruro de magnesio1 M en 1 mL de 1x PBS15 μL
X-galDisolver 30 mg en 0,6 mL de N,N-dimetil formamida (en oscuro)0,3 mL
Total = 15 mL

Tabla 1: Lista de componentes necesarios para la tinción de β-gal en células TZM-bl.

2. Infección por VIH-1 de líneas de células T

  1. Descongelar y cultivar una línea de células T inmortalizadas. En este estudio se utilizó una línea celular CEM-GFP cultivada en medio RPMI 1640 completo suplementado con suero fetal bovino al 10%, penicilina-estreptomicina al 1% y 500 μg/mL G418.
  2. Cuente y tome 2 millones de células para cada punto de tiempo (no infectadas, 24 h, 48 h, 72 h y 96 h). Recoja las células no infectadas inmediatamente centrifugando a 100 x g durante 5 min y agregue tampón de lisis celular (50 mM de Tris-HCl pH 7.4, 0.12 M NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% NP40, 0.5 mM NaF, 1 mM DTT), suplementado con cóctel de inhibidores de la proteasa, 0.5 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) y 1x inhibidor de la fosfatasa (50 μL para 1-3 millones de células) o lisado en el reactivo Trizol (1 mL para 1-3 millones de células) para el aislamiento de ARN (ver Tabla de Materiales).
  3. Lave las células una vez con 1 mL de medio RPMI 1640 completo que contenga polibreno (5 μg/mL) a 100 x g durante 5 min en RT. Resuspenda las células en 1 mL de medio completo.
    NOTA: El policereno es un polímero catiónico que se utiliza para mejorar la infección retroviral en células de mamíferos.
  4. Vuelva a suspender los 8 millones de células en 1 ml de medio completo que contenga policeno. Ahora calcule el volumen de stock viral requerido para 4 millones de partículas de virión, agregue el stock de virus y compense el volumen total a 2 mL agregando medios completos. Esto hace que sea un MOI de 0,5.
  5. Mantenga las células dentro de la incubadora de CO2 a 37 °C durante 4 h, con golpeteo intermitente cada 30-45 min.
  6. Después de 4 h, centrifugar las células y desechar el sobrenadante con cuidado dentro de la cabina de bioseguridad con los métodos de eliminación adecuados.
    NOTA: A partir de este paso, centrifugar las células a 100 x g durante 5 min a RT.
  7. Lavar las células dos veces con 1 mL de medio incompleto. Resuspender las células en 8 mL de medio completo, lo que hace que sea 1 millón de células/mL.
  8. En una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos, siembre un número igual de células en el número requerido de pocillos y mantenga la placa en una incubadora de CO2 mantenida a 37 °C.
  9. Durante los próximos 4 días, recoja las células cada 24 h añadiendo tampón de lisis celular. Además, recoja el sobrenadante y transfiéralo inmediatamente al congelador a -80 °C.
  10. Para comprobar si se ha producido una infección, proceda a realizar el ELISA de captura de antígeno p24 para todos los puntos temporales. Realice diluciones adecuadas para los puntos de tiempo, es decir, una dilución más baja para los puntos de tiempo iniciales y más alta para los posteriores que van de 1:50 a 1:500. Represente las lecturas en un gráfico que represente la progresión de la infección (Figura 1B).

3. Tinción de tioflavina T para determinar el estrés del RE

  1. Fijar 1 millón de células CEM-GFP no infectadas e infectadas con 0,5 MOI (tomadas 72 h de células infectadas) con 200 μL de paraformaldehído al 4% en PBS durante 20 min en RT.
  2. Pulverizar las células a 100 x g durante 5 min y tratar con 500 μL de glicina 0,1 M durante 5 min, seguido de un lavado con 500 μL de PBS dos veces. Resuspender las células en 100 μL de PBS.
  3. Ensamble los portaobjetos de vidrio, las tarjetas de filtro y las cámaras de muestras. Agregue los 100 μL de células resuspendidas a las cámaras de muestra y haga girar las células a 1000 x g durante 4 min para que las células se adhieran a los portaobjetos en una citocentrífuga (Tabla de Materiales).
    NOTA: No habría suficientes células inmovilizadas en el portaobjetos después de la centrifugación por citocentrífuga si la suspensión celular está demasiado diluida. Es probable que las células se agrupen y se distribuyan mal después de la citocentrífuga, si la suspensión celular está muy concentrada.
  4. Permeabilizar las células durante 10 minutos utilizando gotas de Triton-X-100 al 0,1% en PBS (suficiente para cubrir la zona donde se han adherido las células) y lavar las células dos veces colocando PBS gota a gota y limpiando el PBS con un pañuelo de papel inclinando el portaobjetos.
  5. Incubar las células con 10 μL de 5 μM de tioflavina T durante 30 min.
    NOTA: No lavar después de la incubación con ThT.
  6. Monte los portaobjetos con 5 μL de medio de montaje (80% de glicerol v/v, 20% PBS v/v y 8 mg/mL de 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano [DABCO]), coloque el cubreobjetos y selle el cubreobjetos con esmalte de uñas. Deja que los portaobjetos se sequen.
    NOTA: En todos estos pasos, asegúrese de que las células no se sequen.
  7. Tome las imágenes confocales de las células fijas con una lente de inmersión en glicerol de 63x en un microscopio confocal (consulte la tabla de materiales). Ajuste los siguientes ajustes de excitación y emisión: GFP (Ej. 494 nm, Em. 519 nm) y ThT (Ej. 458 nm, Em. 480-520 nm).
    NOTA: Cada canal fluorescente debe ser visualizado secuencialmente, en lugar de simultáneamente, para evitar la superposición de canales. La GFP se tomó como indicación de infección por VIH-1, ya que las células CEM-GFP tienen GFP bajo la regulación del promotor LTR, que se dispara tras la infección por VIH-125.
  8. Convierta las imágenes fluorescentes a 8 bits antes de cuantificarlas mediante análisis de umbral. Cuantifique la intensidad de cada célula manualmente utilizando un software como Image J (~50 celdas)27. Represente el gráfico con la intensidad de cada celda como puntos en el eje Y con respecto a los criterios infectados y no infectados.
  9. Para demostrar la efectividad de este protocolo, se debe realizar un control positivo, por ejemplo, el tratamiento con Thapsigargin (conocido inductor de estrés en el RE) en este caso28. Tratar 1 millón de células CEM-GFP, cada una con 1 μL de DMSO (control de vehículos) y 100 nM de Thapsigargin durante 12 h.
  10. Recoja las células y procese la tinción de ThT como se mencionó para las muestras infectadas (pasos 3.1-3.8).
    NOTA: Para estas muestras, no se requiere fluorescencia GFP. Por lo tanto, solo la fluorescencia ThT se captura en la microscopía confocal.

4. Determinación de la activación y expresión de varios marcadores UPR

NOTA: Para determinar la expresión de los marcadores UPR se utilizan dos métodos: Immunoblotting y RT-PCR. Para la inmunotransferencia, recoja las células CEM-GFP infectadas con VIH-1 0,5 MOI en varios puntos después de la infección (24 h, 48 h, 72 h y 96 h post-infección) y vuelva a suspender la célula en el tampón de lisis (como se menciona en el paso 2.2). Alternativamente, para RT-PCR, los gránulos celulares se lisan en el reactivo Trizol (1 mL para 1-3 millones de células) (Ver Tabla de Materiales). Las células resuspendidas en tampón de lisis y reactivo de Trizol pueden almacenarse a -80 °C hasta su uso posterior.

  1. Immunoblotting para el análisis de marcadores UPR.
    1. Mantenga las células resuspendidas en el tampón de lisis en hielo durante 45 minutos con mezcla intermitente mediante un vórtice.
    2. Granule las celdas a 18000 x g durante 15 min utilizando una centrífuga de alta velocidad de sobremesa (consulte la tabla de materiales). Recoja el sobrenadante en un tubo nuevo.
    3. Cuantifique la concentración de proteínas en cada muestra utilizando Bradford o un reactivo similar.
    4. Tome una concentración igual de proteína para cada muestra y prepare las muestras de proteína en tampón Laemmli (tampón 6x: 250 mM Tris-Cl pH 6.8, 10% SDS, 30% glicerol y 0.02% azul de bromofenol; 5% β-Mercaptoetanol).
      NOTA: Para la inmunotransferencia de cada marcador UPR, se utilizó un mínimo de 60-80 μg de proteína.
    5. Hervir las muestras de proteína a 96 °C durante 5 min y girar brevemente.
    6. Resuelva las muestras de proteínas en un gel SDS-PAGE al 10%-12% y transfiera las proteínas a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (consulte la tabla de materiales).
    7. Bloquear con leche en polvo descremada al 5% o albúmina sérica bovina (BSA) durante 1-2 h, lavar dos veces con TBST (20 mM Tris pH7.4 y 0.137 M NaCl; 0.1% Tween 20), y sondear con anticuerpos primarios específicos de proteínas contra marcadores UPR (ver Tabla de Materiales) en un balancín, durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, después de lavar las manchas dos veces con TBST, sondear con los anticuerpos secundarios respectivos durante 1,5 h.
    8. Lave las manchas de nuevo con TBST y visualice las bandas de proteínas utilizando un sustrato que detecta la quimioluminiscencia (consulte la Tabla de materiales) en un instrumento de adquisición de imágenes Western blot.
  2. RT PCR
    1. Aísle el ARN total de las células utilizando el reactivo Trizol (consulte la tabla de materiales).
    2. Prepare el ADNc a partir de una concentración igual de ARN utilizando la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV-RT) (consulte la tabla de materiales).
    3. Analizar la modulación de la expresión de ARNm de HSPA5, XBP1 empalmado, ATF4, CHOP y GADD34 mediante qRT-PCR con cebadores específicos de genes (Tabla 2). Brevemente, prepare mezclas de reacción de 10 μL que contengan una plantilla de ADNc (100 ng), 5 μL de colorante verde SYBR (consulte la tabla de materiales) y 10 pmol de cada par de cebadores de oligonucleótidos específicos del gen. Ajuste el volumen con H2O estéril.
    4. Ejecute las mezclas en una máquina de PCR en tiempo real utilizando el siguiente programa: desnaturalización inicial a 95 °C durante 3 min y 40 ciclos de 95 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s seguido del análisis de la curva de fusión. Calcule el cambio de pliegue en la expresión génica objetivo en relación con el gen de mantenimiento (por ejemplo, β-actina) como:
      Cambio de pliegue = 2-Δ(ΔCT)
      Donde ΔCT = CT (diana) − CT (gen de mantenimiento)
      y Δ(ΔCT) = ΔCT (tratado) -ΔCT (control)
    5. Para confirmar aún más el empalme de XBP1, realice una RT-PCR semicuantitativa con muestras no infectadas y 72 h infectadas.
      NOTA: El empalme del ARNm de XBP-1 se estudia mediante RT-PCR en el sitio de empalme.
    6. Amplificar el ADNc con cebadores XBP1 (Tabla 2) utilizando una mezcla maestra de PCR de alta fidelidad (ver Tabla de Materiales) en las siguientes condiciones: 1 ciclo de 98 °C durante 30 s, seguido de 5 ciclos de 98 °C durante 15 s, 65*Δ-5 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s, seguidos de 30 ciclos de 98 °C durante 15 s, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s, seguido de una extensión final de 72 °C durante 10 min y mantener a 4 °C.
    7. Separe los amplicones en un gel de agarosa al 2,5% que contenga 50 ng de bromuro de etidio/mL y visualice en un instrumento de gel doc. La banda XBP1 empalmada es más pequeña en 26 nucleótidos.

5. Eliminación de marcadores UPR y análisis de la expresión génica impulsada por LTR y la producción de virus por VIH-1

  1. Preparación de construcciones de shRNA para la eliminación de marcadores UPR
    1. Cree construcciones de shRNA utilizando la columna vertebral del vector pLKO.1-TRC (vector de clonación lentiviral)29.
    2. Construya dos construcciones de shRNA para cada gen (IRE1, PERK, ATF6 y HSPA5). Los oligonucleótidos sentido y antisentido dirigidos al ARNm del gen respectivo son diseñados por el Consorcio ARNi (https://www.broadinstitute.org/rnai-consortium/rnai-consortium-shrna-library) (Tabla 3).
      NOTA: De manera similar, se pueden hacer construcciones de shRNA para otros marcadores UPR.
    3. Recocer los cebadores (100 nM de avance y retroceso) a 95 °C seguido de un enfriamiento gradual a RT.
    4. A continuación, ligarlo en los sitios Age1 y EcoRI del vector pLKO.1 utilizando una ligasa de ADN T4 (ver Tabla de Materiales). Confirme la secuencia mediante secuenciación de ADN.
      NOTA: Una construcción de shRNA dirigida al gen LacZ se utiliza como control no dirigido.
  2. Eliminación de PERK, ATF6, IRE1 y HSPA5 en células HEK-293T, ensayo de luciferasa y ELISA p24
    1. Prepare una mezcla de construcción de shRNA (0,9 μg) y un reactivo de transfección como la polietilenimina (PEI) (3 μL de PEI por 1 μg de ADN) (ver Tabla de Materiales) en 50 μL de medios libres de suero mediante vórtice e incube durante 20 min.
    2. A partir de un matraz HEK-293T confluente que contiene un matraz, tripsiniza y siembra ~0,25 x 106 células junto con la mezcla de transfección en una placa de 24 pocillos, haciendo el volumen total de 125 μL e incuba durante 6 h a 37 °C en una incubadora de CO2 . Este método se denomina transfección inversa, en la que las células se siembran junto con la mezcla de transfección.
    3. Después de 6 h, agregue 125 μL de medio completo a los pocillos y vuelva a suspender las celdas para una siembra uniforme.
      NOTA: Para los experimentos de derribo, la transfección inversa (pasos 5.2.1-5.2.3) proporciona una mejor eficiencia tanto con shRNAs como con siRNAs.
    4. Pasadas 24 h, realizar una segunda transfección. Prepare una mezcla de construcciones de pNL4-3 (100 ng), pLTR-Luc (100 ng) y pEGFP-N1 (50 ng) (pNL4-3:pLTR-Luc:pEGFPN1-1:1:0.5) con PEI (3 μL de PEI por 1 μg de ADN) en 50 μL de medios incompletos por vórtice. Incubar la mezcla durante 20 min en RT. Cambie el medio existente con 250 μL de medio fresco incompleto y agregue la mezcla a las celdas.
      NOTA: Un vector reportero para el VIH-1 LTR se desarrolló mediante la subclonación de LTR de pU3RIII30,31 en pGL3basic en el laboratorio anteriormente32. Se utilizó la expresión de GFP utilizando pEGFP-N1 para normalizar la eficiencia de la transfección32.
    5. Cambie el medio después de 6 h después de la transfección con 500 μL de DMEM completo. Recolectar las células después de 36 h para inmunotransferencia y ensayo de luciferasa.
    6. Para el ensayo de luciferasa, granule las células y vuelva a suspenderlas en un sustrato de luciferasa obtenido comercialmente (50 μL) (consulte la tabla de materiales). Agregue el lisado celular resuspendido a una placa opaca de 96 pocillos e incube durante 10-15 minutos. Obtenga la lectura de luciferasa en un luminómetro. Mida también la fluorescencia de GFP en las mismas muestras para normalizar la lectura de luciferasa en un lector de placas micromodo de microplaca (Ex: 494 nm, Em: 519 nm).
    7. Traza el gráfico como la unidad de luciferasa/GFP en el eje Y.
      NOTA: Se debe comprobar la eliminación de los respectivos marcadores UPR, y se puede realizar mediante inmunotransferencia o qRT-PCR utilizando anticuerpos específicos de genes o cebadores, respectivamente.
    8. Recoja los sobrenadantes para procesar el ELISA p24 como se mencionó anteriormente.
  3. Creación de células estables con knockdown de marcadores UPR e infección por VIH-1.
    1. Prepare las partículas de lentivirus mediante la transfección de células HEK-293T sembradas en una placa de 6 pocillos, con las respectivas construcciones de shRNA (1 μg) junto con pMD2.G (vector de envoltura VSV-G) (0,75 μg) y psPAX2 (plásmido de empaquetamiento lentiviral) (0,25 μg) (ver Tabla de Materiales) utilizando PEI en la proporción 1 μg de ADN: 3 μL de PEI. Prepare la mezcla en 100 μL de DMEM incompleto e incube durante 20 min en RT. Agregue la mezcla a 1,8 mL de medio completo en las células HEK-293T sembradas.
      NOTA: Siembre las células HEK-293T en una placa de 6 pocillos al menos 12 h antes de la transfección hasta que adquieran morfología y sean aproximadamente 60-70% confluentes.
    2. Después de 24 h de transfección, añadir 1 mL de DMEM completo a cada pocillo.
    3. Recoja los sobrenadantes después de 48 h, almacene a -80 °C en el congelador y realice el ELISA p24 para confirmar la presencia del virus en estos sobrenadantes. Utilice este sobrenadante lentiviral crudo para transducir células J6.
    4. Incubar 2 millones de células en una placa de 6 pocillos con un volumen igual de sobrenadante lentiviral (500 μL) para cada lentivirus de control y de eliminación específico del gen y agregar un medio RPMI 1640 completo y fresco en presencia de polibreno (5 μg/mL) para compensar el volumen a 2 mL.
    5. Después de 24 h, agregue Puromicina (1 μg/mL) a cada pocillo para seleccionar células estables. Después de agregar Puromicina, granule las células cada 24 h y agregue 2 mL de medio fresco con Puromicina.
    6. Haga esto hasta que no haya muerte celular (~ 1 semana). Las células supervivientes son las células estables con la eliminación genética deseada.
      NOTA: La eliminación de los genes respectivos se puede verificar a intervalos regulares y, finalmente, cuando solo las células sobrevivientes son visibles en medios que contienen puromicina mediante el uso de inmunotransferencia o qRT-PCR.
    7. Infectar las células LacZ y las células knockdown específicas del gen con 0,5 MOI de VIH-1 como se describe en la sección 2 y recolectar las células 48 h después de la infección.
    8. Recoja el sobrenadante de cada muestra y procese el ELISA p24 como se describió anteriormente y procese las células para verificar el nivel de knockdown mediante inmunotransferencia.

6. Tratamiento con inductor de estrés del RE y análisis de su efecto sobre la replicación del VIH-1

NOTA: Para determinar el efecto de la sobreestimulación de UPR durante la replicación del VIH-1, se puede utilizar la molécula inductora farmacológica, Thapsigargin.

  1. Determinación del porcentaje de viabilidad celular tras el tratamiento con Thapsigargin.
    NOTA: La citotoxicidad de la Thapsigargin se determina mediante el reactivo MTT (ver Tabla de Materiales).
    1. Siembre 25.000-30.000 células CEM-GFP por pocillo en una placa de 96 pocillos que contiene 100 μL de RPMI 1640 completo. Añada 100 nM de Thapsigargin al medio e incube a 37 °C en una incubadora.
      NOTA: Las células tratadas con 1 μL de DMSO se tomaron como vehículo de control.
    2. Después de 48 h, añadir 10 μL de MTT (5 mg/mL) en cada pocillo e incubar en la oscuridad durante 4 h para la formación de cristales de formazano a 37 °C con 5% de CO2.
    3. Después de 4 h, disuelva los cristales usando 100 μL de isopropanol para formar un color púrpura y mida la absorbancia a 570 nm usando un espectrofotómetro.
    4. Calcule el porcentaje de viabilidad de la celda en función de la ecuación que se muestra a continuación
      % de viabilidad celular = (ControlOD570 - TratamientoOD570)/ ControlOD570 x 100
  2. Pretratamiento de Thapsigargin y análisis de la progresión de la infección por VIH-1 mediante ELISA p24.
    1. Siembre 1 millón de células CEM-GFP en una placa de 12 pocillos que contenga 1 mL de RPMI 1640 completo y trate las células con 100 nM de Thapsigargin o 1 μL de DMSO (control de vehículos) durante 12 h en una incubadora de CO2 mantenida a 37 °C. Después de 12 h, lavar las células con RPMI 1640 completo e infectar con 0,5 MOI de VIH-1 como se describió anteriormente.
    2. Recoja las células en diferentes puntos temporales, como 24 h, 48 h y 72 h después de la infección, para la inmunotransferencia.
    3. Recoja los sobrenadantes de cada muestra y realice el ELISA p24 como se describió anteriormente.
    4. Traza el gráfico con la concentración de p24 en la muestra como eje Y y los puntos de tiempo respectivos como eje X.
    5. Mediante el uso de inmunotransferencia, analice la inducción de estrés del RE debido al tratamiento con Thapsigargin midiendo el nivel de cualquier marcador UPR. En este estudio se utilizó HSPA5 como marcador.

7. Ensayo de infectividad TZM-bl β-gal para determinar el efecto de UPR sobre la infectividad del virión

NOTA: Para comprender el papel de la UPR en la infectividad del virión, el sobrenadante del knockdown, así como el tratamiento con Thapsigargin, se puede utilizar para el ensayo de infectividad de TZM-bl β-gal como se describe en la sección 1.2, basado en la concentración de p24 determinada por p24 ELISA.

  1. Infecte las células TZM-bl con una concentración igual de p24 de cada muestra y realice la tinción de β galones. Cuente las células azules infectadas bajo el microscopio con un aumento de 10x para 5 campos aleatorios.
  2. Tome un promedio del recuento de los 5 campos para cada muestra de los pasos anteriores.
  3. Calcule el cambio de pliegue como se menciona a continuación:
    Cambio de pliegue = Número medio de células azules en las muestras de prueba/Número medio de células azules en la muestra de control.

Resultados

En este trabajo hemos descrito un protocolo detallado para estudiar in vitro el estrés del RE y la activación de la UPR ante la infección por VIH-1 en células T (Figura 2). Este estudio también describe métodos para analizar la relevancia funcional de la UPR en la replicación del VIH-1 y la infectividad del virión (Figura 3).

Para ello, analizamos el estrés del RE causado por la infección por VIH-1 mediante la observación de los agregados proteicos en el interior de la célula mediante tinción con tioflavina T. Como se muestra en la Figura 4A, la intensidad de ThT representa los agregados de proteínas en las células infectadas y no infectadas. Del mismo modo, como control positivo, la Figura 4B representa la tinción de ThT en las células tratadas con Thapsigargin. El aumento de la intensidad de ThT sugiere la presencia de más agregados de proteínas, lo que se correlaciona con un mayor estrés del RE.

Además, para validar esta observación, se utilizó un método más convencional, que involucró el análisis de marcadores UPR. La activación de la UPR se analizó inicialmente mediante la activación de los efectores primarios -IRE1, ATF6 y PERK. La activación de IRE1 se midió mediante el análisis de los niveles de fosfo-IRE1 mediante inmunotransferencia de los lisados de células no infectadas e infectadas recolectadas en diferentes puntos de tiempo después de la infección, como se representa en la Figura 5A. El aumento en los niveles de pIRE1/IRE1 total sugiere la activación de IRE1. De manera similar, la activación de PERK se midió por los niveles de fosfo-PERK en células infectadas y no infectadas (Figura 5B). La activación de ATF6 se cuantificó mediante el nivel de expresión de la forma ATF6 P50 mediante inmunotransferencia (Figura 5C). Otro marcador importante de UPR es el regulador maestro y un acompañante del RE, HSPA5. El nivel de HSPA5 también se analizó mediante inmunotransferencia, como se muestra en la Figura 5D. Se siguió un protocolo similar para otros marcadores UPR, como sXBP1, peIF2α, ATF4, CHOP y GADD34, utilizando sus anticuerpos específicos (Figura suplementaria 1). El empalme del ARNm de XBP1 puede analizarse tanto mediante RT-PCR cuantitativa (Fig. 5E) como RT-PCR semicuantitativa. Dado que la RT-PCR cuantitativa no pudo identificar específicamente el empalme, se combinó con el ensayo de empalme, en el que se utilizó una RT-PCR semicuantitativa (Figura 5F). Con el protocolo mencionado anteriormente, observamos que los datos de qRT-PCR coinciden con los datos de semi-qRT-PCR. De forma similar a la qRT-PCR realizada para sXBP1, el protocolo se utilizó para el análisis de otros marcadores de UPR, como HSPA5, ATF4, CHOP y GADD34 a nivel de ARNm (Figura suplementaria 2)

A continuación, para investigar el papel de la UPR en la replicación del VIH-1 y la infectividad del virión, realizamos un derribo de ciertos marcadores de la UPR: PERK y HSPA5. Utilizando los protocolos mencionados, logramos la eliminación de estos marcadores a un nivel significativo tanto en las células HEK-293T (Figura 6A) como en las células J6 (Figura 6B). Utilizando estas células knockdown, investigamos el efecto de la knockdown de la actividad génica impulsada por el VIH-1 LTR (Figura 6A), que se representa como la relación de expresión Luc/GFP en las muestras respectivas. La producción del virus se midió mediante ELISA p24 del sobrenadante, como se representa en la Figura 6B. La infectividad de los viriones producidos también se puede analizar utilizando el protocolo de tinción de β-gal de la misma manera que se muestra en la Figura 1A.

Además, utilizando un inductor químico del estrés del RE, la Thapsigargina, se puede estudiar el efecto de la sobreestimulación de la UPR sobre la replicación del VIH-1, la producción del virus y la infectividad del virión. La citotoxicidad de Thapsigargin a la concentración dada se analizó utilizando un ensayo MTT (Figura 7A), que muestra que la citotoxicidad a la concentración deseada no es significativa. El inmunoblot para HSPA5 se realizó para analizar el efecto del fármaco sobre el estrés del RE (Figura 7B). Los resultados muestran que 12 h de pretratamiento con 100 nM de Thapsigargin indujo la expresión de HSPA5 en todos los momentos. El ELISA p24 muestra el efecto sobre la producción del virus y la infectividad de los viriones producidos, que se puede analizar como se describió anteriormente.

figure-results-1
Figura 1: Cuantificación de la infectividad del virión y análisis de la progresión de la infección. (A) Cuantificación de la infectividad del virión mediante un ensayo de β galones basado en TZM-bl. La infectividad del virus se determinó añadiendo 1 ng, 0,1 ng y 0,01 ng del virus a las células TZM-bl, seguidas de una tinción de β galones y el recuento del número de glóbulos azules. Aumento: 10x. (B) Análisis de la progresión de la infección en células CEM-GFP infectadas por VIH-1 con 0,5 MOI basado en ELISA de captura de antígeno p24 de los sobrenadantes de cultivo. Las células CEM-GFP se infectaron con 0,5 MOI de VIH-1 y los sobrenadantes se procesaron para p24 ELISA. Las barras de error se muestran como valores medios ± S.E. Los asteriscos indican el nivel de significación, que se indica en las figuras como ns = p ≥ 0,05, * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001 y ****=p ≤ 0,0001 según lo analizado por la prueba t de Student. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Presentación esquemática de los pasos a seguir para analizar el efecto de la infección por VIH-1 sobre el estrés de la RE y la UPR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: Diagrama de flujo de los pasos a seguir para analizar el efecto de la UPR en la replicación del VIH-1, la producción del virus y la infectividad del virión.

figure-results-4
Figura 4: Análisis del nivel de estrés del RE en las células T debido a la infección por VIH-1 mediante tinción ThT. (A) Las células CEM-GFP se infectaron con 0,5 MOI de VIH-1 y se cosecharon 72 h después de la infección. Las células se fijaron y se tiñeron con tioflavina T. La expresión de GFP indica células CEM-GFP infectadas. El gráfico muestra la intensidad de tioflavina T en el caso de células no infectadas e infectadas por el VIH-1. En el gráfico se presentan datos de ~50 células de n = 3 réplicas biológicas. (B) Las células CEM-GFP se trataron con DMSO y TG durante 12 h. Las células se fijaron y se tiñeron con tioflavina T. El gráfico muestra la intensidad de tioflavina T en el caso de las células tratadas con DMSO y TG. En el gráfico se presentan datos de ~50 células de n = 3 réplicas biológicas. Las barras de error se muestran como valores medios ± S.E. Los asteriscos indican el nivel de significación, que se indica en las figuras como ns = p ≥ 0,05, * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001 y **** = p ≤ 0,0001 según lo analizado por la prueba t de Student. ONU: No infectados; IN: Infectados; TG: Thapsigargin. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-5
Figura 5: Análisis de la expresión de diferentes marcadores UPR en linfocitos T infectados por VIH-1. Las células CEM-GFP infectadas con VIH-1 (A-E) (0,5 MOI) se recolectaron hasta el día 4 cada 24 h y se procesaron para diversos análisis como se describe a continuación. (A) La activación de IRE1 se analizó mediante inmunotransferencia de pIRE1. (B) La activación de PERK se analizó mediante inmunotransferencia de pPERK. (C) La activación de ATF6 se analizó mediante inmunotransferencia de la forma ATF6 P50. (D) La expresión de la chaperona del RE HSPA5 se analizó mediante inmunotransferencia HSPA5. (E) El empalme de XBP1 se analizó mediante qRT-PCR de sXBP1 utilizando cebadores específicos en tiempo real. (F) Para analizar el empalme de XBP1 por semi-qRT-PCR, el ARNm de XBP-1 se amplificó mediante RT-PCR a través del sitio de empalme y se visualizaron las bandas. Las barras de error se muestran como valores medios ± S.E. ONU: No infectados. EN: Infectado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-6
Figura 6: Análisis del papel de la UPR en la replicación del VIH-1 y la producción del virus. (A) PERK (panel izquierdo) y HSPA5 (panel derecho) se desmontaron en células HEK-293T, y se realizó un ensayo de luciferasa para analizar la actividad génica impulsada por el VIH-1 LTR. Los inmunoblots muestran los niveles de knockdown de las proteínas respectivas. (B) PERK (panel izquierdo) y HSPA5 (panel derecho) se desmontaron en células J6, y se realizó ELISA p24 con el sobrenadante recolectado para analizar la producción del virus. Los inmunoblots muestran los niveles de knockdown de las proteínas respectivas. Las barras de error se muestran como valores medios ± S.E. Los asteriscos indican el nivel de significación, que se indica en las figuras como ns = p ≥ 0,05, * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001 y ****=p ≤ 0,0001 según lo analizado por la prueba t de Student. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-7
Figura 7: Análisis del efecto del inductor químico del estrés del RE, Thapsigargin, en la progresión de la infección por VIH-1. (A) Viabilidad celular de las células CEM-GFP tras el tratamiento con Thapsigargina 100 nM. La viabilidad celular se analiza mediante el ensayo MTT. (B) Las células CEM-GFP pretratadas con 100 nM de TG durante 12 h se infectaron con 0,5 MOI de VIH-1 y se recolectaron a las 24 h, 48 h y 72 h después de la infección. El inmunoblot muestra el efecto de TG en la expresión de HSPA5, mientras que el gráfico muestra la producción del virus analizada por p24 ELISA. Las barras de error se muestran como valores medios ± S.E. Los asteriscos indican el nivel de significación, que se indica en las figuras como ns = p ≥ 0,05, * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001 y ****= p ≤ 0,0001 según lo analizado por la prueba t de Student. TG: Thapsigargin. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Análisis de la expresión de varios marcadores posteriores de la UPR. Expresión de (A) sXBP1, (B) fosforilación de eIF2α, (C) ATF4, (D) CHOP y (E) GADD34 analizada por inmunotransferencia. (A-E) Las células CEM-GFP infectadas con 0,5 MOI del VIH-1 se recolectaron a las 24 h, 48 h, 72 h y 96 h después de la infección y se utilizaron para la inmunotransferencia. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Análisis de diferentes marcadores UPR a nivel de ARNm mediante qRT-PCR. (A-D) Las células CEM-GFP infectadas con 0,5 MOI del VIH-1 se recolectaron cada 24 h hasta el día 4 y se utilizaron para qRT-PCR de (A) HSPA5, (B) ATF4, (C) CHOP y (D) GADD34. Las barras de error se muestran como valores medios ± S.E. Los asteriscos indican el nivel de significación, que se indica en las figuras como ns = p ≥ 0,05, * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001 y **** = p ≤ 0,0001 según lo analizado por la prueba t de Student. Haga clic aquí para descargar este archivo.

ConstruirSecuencia de cebadores de 5' a 3'
ENSAYO DE EMPALME XBP1 FTTACGAGAGAAAACTCATGGCC
ENSAYO DE EMPALME XBP1 RGGGTCCAAGTTGTCCAGAATGC
EMPALMADO XBP1 FCTGAGTCCGAATCAGGTGCAG
EMPALMADO XBP1 RATCCATGGGGAGATGTTCTGG
HSPA5 FCACAGTGGTGCCTACCAAGA
HSPA5 RTGATTGTCTTTTGTCAGGGGT
ATF4 FAGTCCCTCCAACAACAGCAA
ATF4 RGAAGGTCATCTGGCATGGTT
CORTE FCAGTGTCCCGAAGGAGAAAG
CHOP RCAGAGCTGGAACCTGAGGAG
GADD34 FATGGACAGTGACCTTCTCGG
GADD34 RCTGGGCTCCTCCTAGGCT
ACTINA FAGAAAATCTGGCACCACACC
ACTINA RGGGGTGTTGAAGGTCTCAAA

Tabla 2: Lista de cebadores utilizados para el análisis RT-PCR. F: Adelante; R: Reversa

Construcción de shRNASecuencia de cebadores de 5' a 3'
VENTAJA SH1 FCCGGCGGCAGGTCATTAGTAATTATCGAGATAATTACTAATGACCTGCCGTTTTTG
VENTAJA SH1 RAATTCAAAAACGGCAGGTCATTAGTAATTATCGAGATAATTACTAATGACCTGCCG
VENTAJA SH2 FCCGGGCCACTTTGAACTTCGGTATACTCGAGTATACCGAAGTTCAAAGTGGCTTTTTG
VENTAJA SH2 RAATTCAAAAAGCCACTTTGAACTTCGGTATACTCGAGTATACCGAAGTTCAAAGTGGC
ATF6 SH1 FCCGGCCCAGAAGTTATCAAGACTTTCTCGAGAAAGTCTTGATAACTTCTGGGTTTTTG
ATF6 SH1 RAATTCAAAAACCCAAGTTATCAAGACTTTCTCTCGAGAAAGTCTTGATAACTTCTGGG
ATF6 SH2 FCCGGCCTAGTCCAAAGCGAAGAGTTCGAGAACTCTTCGCTTTGGACTAGGTTTTTG
ATF6 SH2 RAATTCAAAAACCTAGTCCAAAGCGAAGAGTTCGAGAACTCTCTCTCTTTGGACTAGG
IRE1 SH1 FCCGGCCTGCTTAATGTCAGTCTACACTCGAGTGTAGACTGACATTAAGCAGGTTTTTG
IRE1 SH1 RAATTCAAAAACCTGCTTAATGTCAGTCTACACTCGAGTGTAGACTGACATTAAGCAGG
IRE1 SH2 FCCGGCCCATCAACCTCTCTTCTCTCTACTCGAGTACAGAAGAGAGGTTGATGGGTTTTTG
IRE1 SH2 RAATTCAAAAACCCATCAACCTCTCTTCTGTACTCGAGTACAGAAGAGAGGTTGATGGG
HSPA5 SH1 FCCGGGAGCGCATTGATACTAGAAATCTCGAGATTTCTAGTATCAATGGGCTCTTTTTG
HSPA5 SH1 RAATTCAAAAAGAGCGCATTGATACTAGAAATCTCGAGATTTCTAGTATCAATGCGCTC
HSPA5 SH2 FCCGGGTGAGTGATCACTGGTATTAACTCGAGTTAATACCAGTGATCACTCACTTTTTG
HSPA5 SH2 RAATTCAAAAAGTGAGTGATCACTGGTATTAACTCGAGTTAATACCAGTGATCACTCAC
LacZ FCCGGTCGTATTACAACGTCGTGACTCTCGAGAGTCACGACGTTGTAATACGATTTTTG
LacZ RAATTCAAAAATCGTATTACAACGTCGTGACTCTCGAGAGTCACGACGTTGTAATACGA

Tabla 3: Lista de cebadores utilizados para generar construcciones de shRNA. F: Adelante; R: Reversa

Discusión

El alcance del presente protocolo incluye (i) el manejo de las reservas del virus VIH-1 y la medición de la concentración del virus y la infectividad del virión, (ii) la infección de las células T con el VIH-1 y la evaluación de su efecto sobre el estrés del RE y diferentes marcadores de UPR, (iii) el efecto de la eliminación de los marcadores de UPR y su efecto sobre la actividad génica impulsada por el VIH-1 LTR, producción del virus y la infectividad del virión y (iv) Sobreestimulación de la UPR utilizando moléculas farmacológicas y analizando su efecto sobre la replicación del VIH-1. Utilizando el actual conjunto de protocolos, se puede obtener información completa sobre la interacción del VIH-1 y el EPU. Los protocolos enumerados en este estudio son fáciles de realizar, rentables y altamente confiables.

Dado que la UPR es una vía de señalización sensible al estrés, trabajar en ella implica pasos bastante delicados. Para todos los experimentos, recomendamos evitar las celdas de paso largo para obtener consistencia en los resultados. También es importante mantener condiciones de esterilidad en todas las técnicas de cultivo celular para evitar contaminaciones bacterianas y de levaduras, ya que pueden dificultar los experimentos y los resultados correspondientes. Además, al manipular las células durante los experimentos, incluido su cultivo posterior, evite las alteraciones bruscas o prolongadas de la temperatura y asegúrese de que las células estén sanas y sin estrés desde el principio. De lo contrario, los cambios podrían causar estrés adicional a las células, lo que puede alterar los resultados. Trate de mantener los puntos de tiempo lo más fijos posible, ya que la UPR es una vía de señalización sensible, y un ligero cambio en los puntos de tiempo puede variar los resultados.

El método de tinción de ThT que detecta agregados de proteínas y se utiliza para determinar el estrés del RE.22, muestra muy claramente los niveles de estrés del RE en las células infectadas por el VIH-1. La tinción con ThT se basa en la detección de agregados proteicos, que se correlacionan con el estrés del RE. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la activación de la UPR no siempre se puede correlacionar con los agregados de proteínas, ya que las vías de señalización de la UPR individuales pueden activarse directamente sin la participación de los agregados de proteínas. Por lo tanto, aunque este método de tinción de ThT da una idea de los niveles de estrés del RE, para un análisis en profundidad de la activación de la UPR, siempre debe validarse con un análisis más detallado de los marcadores de la UPR. Además, para definir mejor la localización subcelular de la tinción de ThT, se pueden utilizar marcadores como KDEL en el caso de marcar el RE. Además, en muchos casos, el estrés del RE da lugar a un cambio en el tamaño y la forma de las células, por lo que también se puede tener en cuenta el área de las células al cuantificar la intensidad de la ThT. La disponibilidad de anticuerpos comerciales específicos de genes altamente sensibles, fiables y rentables ha revolucionado muchos aspectos del campo de las ciencias de la vida, permitiendo un análisis más fácil de los niveles de proteínas en las células. Además, hoy en día, se dispone de equipos altamente sensibles para visualizar las bandas de proteínas en las manchas y hacer que la cuantificación sea rápida y sencilla. Por lo tanto, la activación de los marcadores UPR se puede analizar fácilmente mediante inmunotransferencia. Sin embargo, como la expresión de las proteínas marcadoras UPR es relativamente baja, es necesario utilizar una concentración significativa de proteínas para analizar su expresión. Además, la dilución de los anticuerpos primarios debe optimizarse adecuadamente en función de la expresión de proteínas en las células utilizadas para evitar la unión inespecífica y el ruido de fondo en las manchas. Además, como se muestra en Figura 4C, el anticuerpo ATF6 es policlonal y proporciona una serie de bandas inespecíficas. Es necesaria una optimización adecuada del lavado y de la concentración de anticuerpos para reducir hasta cierto punto estas bandas inespecíficas. Las transferencias deben lavarse adecuadamente después de la incubación en solución bloqueante, anticuerpo primario y anticuerpo secundario para reducir las bandas de fondo e inespecíficas. Durante el desarrollo de los blots, se debe evitar la sobresaturación de las bandas para obtener una visualización adecuada del patrón en los resultados obtenidos. Al observar el enfoque general de este artículo sobre métodos, no nos hemos centrado en los métodos detallados y la solución de problemas para las técnicas generales de inmunotransferencia; sin embargo, uno puede referirse a los artículos de método de Mahmood y Yang33 así como Ghosh et al.34 para lo mismo. Dado que, hoy en día, la RT-PCR es un método muy utilizado, los cebadores y las máquinas de RT-PCR fácilmente disponibles proporcionan datos para analizar ciertos marcadores UPR. Sin embargo, se deben tomar precauciones al preparar el ARN y el ADNc para la RT-PCR, ya que es un método muy sensible y las ligeras variaciones en la calidad de las muestras y el pipeteo pueden provocar grandes variaciones en la lectura. Cualquier contaminación de ADN o proteínas debe eliminarse de las muestras de ARN. Además, tome siempre las muestras por triplicado para qRT-PCR para que se pueda reducir el error de pipeteo. La concentración del ADN utilizada para la qRT-PCR debe optimizarse de modo que el valor de CT de cada muestra sea inferior a 30, ya que cualquier valor superior a 30 no se considera ideal. Siempre se debe mantener un control negativo para qRT-PCR para evitar cualquier lectura de falsos positivos. El empalme de XBP1 se puede analizar tanto por qRT-PCR como por semi-qRT-PCR. Dado que la qRT-PCR no mostraría con precisión el empalme, siempre se debe realizar una semi-qRT-PCR aparte de la qRT-PCR para validar los datos y determinar la relación relativa entre XBP1 y XBP1 no empalmada. Dado que la diferencia entre el tamaño de XBP1 empalmado y no empalmado es de solo 26 nt, se debe usar un mayor porcentaje de gel de agarosa para resolver el gel. Además, las bandas deben resolverse en baja tensión y mayor duración para una mejor separación. Otro método que es más popular hoy en día para observar el empalme de XBP1, es el ensayo de empalme que utiliza el Pst1 digestión enzimática de restricción del ADNc y proporciona una mejor visualización del empalme XBP135. Este método también se puede utilizar para visualizar el empalme de XBP1 en muestras infectadas por VIH-1. Los resultados obtenidos de la inmunotransferencia y la RT-PCR se pueden utilizar para validar los resultados de la tinción de ThT.

Los resultados representativos mostrados en la Figura 5 sugieren que la activación de la UPR tras la infección por VIH-1 se correlaciona con la tinción ThT mejorada que se muestra en la Figura 4. Sin embargo, las limitaciones del uso de la inmunotransferencia y la RT-PCR para analizar la UPR son que son rigurosas y hay que monitorizar múltiples productos genéticos, ya que los genes individuales de la UPR pueden ser modificados de forma independiente por factores de estrés ajenos al RE. Además, estos métodos miden indirectamente el estrés del RE observando los diferentes marcadores UPR. Es por ello que la tinción de ThT y el análisis de marcadores UPR por inmunotransferencia y RT-PCR pueden utilizarse conjuntamente para analizar el efecto de la infección por VIH-1 sobre el estrés del RE y la activación de UPR en células T.

La segunda parte de este artículo trata de los protocolos involucrados en la comprensión del impacto de la UPR en la replicación del VIH-1. Se encontró que el método de transfección inversa utilizado para la eliminación de los marcadores UPR descrito en este artículo produce una reducción significativa en la expresión de los marcadores UPR. Como se mencionó en el protocolo, la fluorescencia GFP se utilizó para normalizar la lectura de luciferasa para el ensayo de luciferasa. Sin embargo, en muchos casos, la lectura de GFP también puede verse afectada debido a la transfección genética específica36, por lo que en ese caso, se pueden utilizar otros marcadores fluorescentes como RFP, YFP o la concentración total de proteínas para normalizar la lectura de luciferasa. Además, en algunos casos en los que las células son difíciles de lisar, como las células TZM-bl, se puede agregar un reactivo de lisis adicional antes de agregar el sustrato de luciferasa. Como se representa en los resultados, los resultados de la luciferasa (Figura 6A Panel izquierdo) coinciden con los resultados de ELISA p24 en el caso de PERK (Figura 6B Panel izquierdo), donde la eliminación de PERK reduce significativamente la actividad del gen VIH-1 y la producción del virus. Mientras que en el caso de HSPA5, la eliminación de HSPA5 no afecta a la actividad génica impulsada por LTR (Figura 6A Panel derecho) según los resultados del ensayo de luciferasa, mientras que afecta la producción del virus según el ELISA p24 (Figura 6B Panel derecho). De esta manera, estos resultados sugieren que diferentes marcadores UPR pueden tener diferentes efectos sobre la actividad génica impulsada por el VIH-1 LTR y la producción del virus. El antígeno p24 medido en el sobrenadante por ELISA es principalmente indicativo de la concentración de partículas virales liberadas en el sobrenadante del cultivo. Por lo tanto, de forma rutinaria, los investigadores han utilizado los resultados del ELISA de captura de antígeno p24 como una indicación indirecta de la producción del virus en el sobrenadante celular37. Por lo tanto, el ensayo de luciferasa en células y el ELISA p24 del sobrenadante se pueden usar juntos para determinar el efecto sobre la actividad génica impulsada por el VIH-1 LTR y la producción del virus. Además, este protocolo se puede utilizar para analizar el efecto de otros marcadores UPR en la actividad génica impulsada por LTR del VIH-1 y la producción del virus mediante el uso de shRNAs específicos de genes. Para todos aquellos experimentos que involucran lecturas de ELISA p24 y ensayo de luciferasa, es importante asegurarse de que se mantengan las diluciones y el tiempo de incubación adecuados y que no se deben considerar los valores que entran en la categoría de valores atípicos. Por ejemplo, al hacer p24 ELISA, un OD450 un valor entre 0,1 y 2 se considera ideal. El segundo enfoque para investigar el papel de la UPR en la replicación del VIH-1 es el uso de moléculas farmacológicas como la Thapsigargina, un inductor del estrés del RE, o el TUDCA, un inhibidor del estrés del RE. Estos fármacos se utilizan con mucha frecuencia para estudiar la UPR en diversos contextos38,39,40,41. En este artículo, hemos demostrado el protocolo para el tratamiento con Thapsigargin y analizado su efecto sobre la progresión de la infección por VIH-1 en células T. Antes de utilizar el fármaco para cualquier experimento, se recomienda encarecidamente probar la viabilidad celular para un rango de dosis del fármaco en la línea celular que se va a utilizar. Debe evitarse la concentración que proporcione menos de ~ 80% de viabilidad celular en la línea celular dada. Además, para los ensayos de viabilidad celular, siempre se deben tomar células sanas, ya que las células que ya están estresadas no mostrarán la lectura adecuada, y los restos celulares pueden crear turbidez y dar lecturas falsas. El protocolo mencionado en este estudio muestra el efecto de Thapsigargin sobre la replicación viral durante 72 h después de la infección, lo que proporciona una mejor comprensión del efecto del fármaco sobre la replicación viral a lo largo del tiempo. También se pueden tomar intervalos de tiempo más cortos, como 12 h, 24 h, 36 h, 48 h, 60 h y 72 h después de la infección para analizar más a fondo el punto de tiempo más temprano en el que el medicamento comienza a mostrar su efecto sobre la replicación viral.

Dado que la UPR también está involucrada en la degradación de proteínas y la dinámica de membranas42,43, es posible que la UPR pueda tener un papel en la infectividad de los viriones. La infectividad de los viriones producidos por las células también se puede analizar utilizando el protocolo dado. Los protocolos mencionados anteriormente también se pueden utilizar para determinar el efecto de la infección por VIH-1 sobre el estrés del RE y la UPR y su relevancia funcional en PBMC humanos para estudios más relevantes desde el punto de vista biológico. La comprensión de la función de la RE-UPR en la infección por VIH-1 es esencial debido a la creciente concienciación sobre su implicación en el desarrollo de numerosas enfermedades graves. La información obtenida utilizando este conjunto de métodos se sumará a este campo inexplorado al ofrecer una comprensión importante de la interacción entre el VIH-1 y la UPR.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Damos las gracias al Centro Nacional de Ciencia Celular del Departamento de Biotecnología del Gobierno de la India por su apoyo interno. AT y AD están agradecidos por el apoyo a la investigación de doctorado recibido del Centro Nacional de Ciencia Celular, Departamento de Biotecnología, Gobierno de la India. DM agradece la beca nacional JC Bose de SERB, Gobierno de la India.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AcrilamamidaBiorad, EE. UU.1610107
AgarosaG-Biosciences, EE. UU.RC1013
Persulfato de amonioSigma-Aldrich, EE. UU. Tecnología deA3678
EE. UU.11815Dilución de detección de Western blot-1:1000
anticuerpo anti-ATF6Abcam, Reino Unidoab122897Detección de Western blot Dilución-1:1000
anticuerpo anti-CHOPTecnología de señalización celular, EE. UU2897Detección de Western blot Dilución-1:1000
anti-eIF2 y alfa; anticuerpoSanta Cruz Biotechnology, EE. UUsc-11386 Detección deWestern blot Dilución-1:2000 
anticuerpo anti-GADD34Abcam, Reino Unidoab236516Detección de Western blot Dilución-1:1000
anticuerpo anti-GAPDHSanta Cruz Biotechnology, EE. UU.sc-32233Detección de Western blot Dilución-1:3000 
anticuerpo anti-HSPA5Tecnología de señalización celular, EE. UU.3177Detección de Western blot Dilución-1:1000
anticuerpo anti-IRE1Tecnología de señalización celular, EE. UU3294Detección de Western blot Dilución-1:2000
Anticuerpo conjugado anti-ratón HRP Biorad, EE. UU.1706516Detección de Western blot Dilución: anticuerpo
anti-peIF2 y alfaInvitrogen, EE. UU.44-728G Detección deWestern blot Dilución-1:1000
anticuerpo anti-PERKTecnología de señalización celular, EE. UU.5683Dilución de detección de Western blot-1:2000
anti-pIRE1Abcam, Reino Unidoab243665Detección de Western blot Dilución-1:1000
Anticuerpo anti-pPERKInvitrogen, EE. UU.PA5-40294 Detección deWestern blot Dilución-1:2000
Anticuerpo conjugado anti-conejo HRPBiorad, EE. UU.1706515Detección de Western blot Dilución:
anticuerpo anti-XBP1Abcam, Reino Unidoab37152Detección de Western blot Dilución-1:1000
Centrífuga de sobremesa de alta velocidadEppendorf, EE. UU.5804RRotor- F-45-30-11
Centrífuga de baja velocidad de sobremesaEppendorf, EE. UU.5702RRotor- A-4-38
Bis-AcrilamidaBiorad, EE. UU.1610201
Albúmina sérica bovina (BSA)MP biomedicals, EE. UU.160069
reactivo BradfordBiorad, EE. UU.5000006
CalPhos mamífero Kit de transfecciónClontech, Takara Bio, EE. UU.631312Stock de virus
preparación CEM-GFPNIH, Repositorio de AIDS, EE. UU3655
Sustrato Clarity ECLBiorad, EE. UU.1705061sustrato de detección de quimioluminiscencia
Clarity max ECLsustrato Biorad, EE. UU.sustratode detección de quimioluminiscencia
Microscopio de barrido láser confocalOlympus, JapónModelo:FV3000
Centrífuga CytospinThermo Fisher Scientific, EE. UU.ASHA78300003
DMEM Invitrogen, EE. UU.11995073
DMSOSigma-Aldrich, EE. UU.D2650
dNTPsPromega, EE. UU.U1515
DTTInvitrogen, EE. UUR0861
EDTAInvitrogen, EE. UU12635
EtBrInvitrogen, EE. UU. Suero
Invitrogen, EE. UU16000044
G418Invitrogen, EE. UU.
Glutaraldehído 25%Sigma-Aldrich, EE. UU.G6257Ensayo de infectividad
Thermo Fisher Scientific, EE. UU.Q24755
HEK-293TNCCS, India
VIH-1 infeccioso Clon molecular pNL4-3NIH, Repositorio de SIDA, EE. UU114
Microscopio invertidoNikon, JapónModelo: Eclipse Ti2
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad, EE. UU.1715124
Jurkat J6NCCS, India
Cloruro de magnesioSigma-Aldrich, EE. UUM8266Infectividad ensayo
MMLV-RT Invitrogen, EE. UU.28025013
reactivo MTTSigma-Aldrich, EE. UU.M5655Ensayo de viabilidad celular
N,N-dimetil formamidaFluka Chemika40255Ensayo de infectividad
NaClThermo Fisher Scientific, EE. UU.Q27605
NaFSigma-Aldrich, EE. UU201154
NP40Invitrogen, EE. UU85124
Kit ELISA de captura de antígeno P24ABL, EE. UU.5421
PageRuler escalera de proteínas preteñidaSci-fi Biologicals, IndiaPGPMT078
ParaformaldehídoSigma-Aldrich, EE. UU.P6148
pEGFP-N1Clontech, EE. UU632515
Penicilina/EstreptomicinaInvitrogen, EE. UU151140122
Inhibidor de la fosfatasaSigma-Aldrich, EE. UU.4906837001
Phusion Mezcla maestra de PCR de alta fidelidad con tampón GCNEB, EE. UU.M05532
pLKO.1-TRCAddgene, EE. UU10878Vector de clonación lentiviral
pMD2.GAddgene, EE. UU12259Vector de envoltura VSV-G
PMSFSigma-Aldrich, EE. UUP7626
Polietilenimina (PEI) Polysciences, Inc., EE. UU.23966
Ferricianuro de potasioSigma-Aldrich, EE. UU244023 Ensayo de infectividad
Ferrocianuro de potasioSigma-Aldrich, EE. UUP3289Ensayo de infectividad
Inhibidor de la proteasaSigma-Aldrich, EE. UU.  
psPAX2Addgene, EE. UU.12260Plásmido de empaquetamiento lentiviral
PuromycinSigma-Aldrich, EE. UU.P8833Selección de células estables
Membrana de PVDFBiorad, EE. UU.1620177
Imprimadores aleatoriosInvitrogen, EE. UU.48190011
RPMI 1640Invitrogen, EE. UU22400105
SDSSigma-Aldrich, EE. UU.L3771
Sustrato Steady-GloPromega, EE. UU.E2510Ensayo de luciferasa
T4 ADN ligasaInvitrogen, EE. UU.15224017
TEMEDInvitrogen, EE. UU.17919
ThapsigarginSigma-Aldrich, EE. UU.T9033
Tioflavina TSigma-Aldrich, EE. UU.596200
TrisThermo Fisher Scientific, EE. UU.Q15965
Triton-X-100Sigma-Aldrich, EE. UU.T8787
TrizolInvitrogen, EE. UU.15596018
Tween 20Sigma-Aldrich, EE. UU.P1379
TZM-blNIH, Repositorio de SIDA, EE. UU.8129
UltracentrífugaBeckman Optima L90K, EE. UU.330049Rotor-SW28Ti
UltraPure X-galInvitrogen, EE. UU15520-018 Ensayo deinfectividad
señalización celular del anticuerpo anti-ATF4 , . . . 1:4000 1:4000 . 1705062. . fetal bovino 15585011 . 11811023 Gglycine. . . . . . . . . . . 5056489001. .

Referencias

  1. Levy, J. A. HIV and the Pathogenesis of AIDS. 3rd. , ASM Press. (2007).
  2. Hebert, D. N., Molinari, M. In and out of the ER: Protein folding, quality control, degradation, and related human diseases. Physiol Rev. 87 (4), 1377-1408 (2007).
  3. Mori, K. The unfolded protein response: The dawn of a new field. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 91 (9), 469-480 (2015).
  4. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
  5. Kaufman, R. J. Orchestrating the unfolded protein response in health and disease. J Clin Invest. 110 (10), 1389-1398 (2002).
  6. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 519-529 (2007).
  7. Marciniak, S. J., Garcia-Bonilla, L., Hu, J., Harding, H. P., Ron, D. Activation-dependent substrate recruitment by the eukaryotic translation initiation factor 2 kinase PERK. J Cell Biol. 172 (2), 201-209 (2006).
  8. Harding, H. P., Zhang, Y., Ron, D. Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature. 397 (6716), 271-274 (1999).
  9. Vattem, K. M., Wek, R. C. Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 mRNA translation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (31), 11269-11274 (2004).
  10. Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Mol Cell. 11 (3), 619-633 (2003).
  11. Novoa, I., Zeng, H., Harding, H. P., Ron, D. Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34-mediated dephosphorylation of eIF2α. J Cell Biol. 153 (5), 1011-1021 (2001).
  12. Haze, K., Yoshida, H., Yanagi, H., Yura, T., Mori, K. Mammalian transcription factor ATF6 is synthesized as a transmembrane protein and activated by proteolysis in response to endoplasmic reticulum stress. Mol Biol Cell. 10 (11), 3787-3799 (1999).
  13. Ye, J., et al. ER stress induces cleavage of membrane-bound ATF6 by the same proteases that process SREBPs. Mol Cell. 6 (6), 1355-1364 (2000).
  14. Tirasophon, W., Welihinda, A. A., Kaufman, R. J. A stress response pathway from the endoplasmic reticulum to the nucleus requires a novel bifunctional protein kinase/endoribonuclease (Ire1p) in mammalian cells. Genes Dev. 12 (12), 1812-1824 (1998).
  15. Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
  16. Calfon, M., et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).
  17. Wu, J., et al. ATF6α optimizes long-term endoplasmic reticulum function to protect cells from chronic stress. Dev Cell. 13 (3), 351-364 (2007).
  18. Shoulders, M. D., et al. Stress-independent activation of XBP1s and/or ATF6 reveals three functionally diverse ER proteostasis environments. Cell Rep. 3 (4), 1279-1292 (2013).
  19. Oslowski, C. M., Urano, F. Measuring ER stress and the unfolded protein response using mammalian tissue culture system. Methods Enzymol. 490, 71-92 (2011).
  20. Gupta, S., Samali, A., Fitzgerald, U., Deegan, S. Methods for monitoring endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response. Int J Cell Biol. 2010, 830307(2010).
  21. Wang, M., Kaufman, R. J. Protein misfolding in the endoplasmic reticulum as a conduit to human disease. Nature. 529 (7586), 326-335 (2016).
  22. Beriault, D. R., Werstuck, G. H. Detection and quantification of endoplasmic reticulum stress in living cells using the fluorescent compound, Thioflavin T. Biochim Biophys Acta. 1833 (10), 2293-2301 (2013).
  23. Tripathi, A., Iyer, K., Mitra, D. HIV-1 replication requires optimal activation of the unfolded protein response. FEBS Lett. 597 (23), 2908-2930 (2023).
  24. Platt, E. J., Wehrly, K., Kuhmann, S. E., Chesebro, B., Kabat, D. Effects of CCR5 and CD4 cell surface concentrations on infections by macrophagetropic isolates of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 72 (4), 2855(1998).
  25. Gervaix, A., West, D., Leoni, L. M., Richman, D. D., Wong-Staal, F., Corbeil, J. A new reporter cell line to monitor HIV infection and drug susceptibility in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4653-4658 (1997).
  26. Augustine, T., et al. Cyclin F/FBXO1 interacts with HIV-1 viral infectivity factor (Vif) and restricts progeny virion infectivity by ubiquitination and proteasomal degradation of vif protein through SCFcyclin F E3 ligase machinery. J Biol Chem. 292 (13), 5349-5363 (2017).
  27. Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 25, 100916(2021).
  28. Treiman, M., Caspersen, C., Christensen, S. B. A tool coming of age: Thapsigargin as an inhibitor of sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPases. Trends Pharmacol Sci. 19 (4), 131-135 (1998).
  29. Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
  30. Sodroski, J., Rosen, C., Goh, W. C., Haseltine, W. A Transcriptional activator protein encoded by the x-lor region of the human T-cell leukemia virus. Science. 228 (4706), 1430-1434 (1985).
  31. Rosen, C. A., Sodroski, J. G., Kettman, R., Haseltine, W. A. Activation of enhancer sequences in type II human T-cell leukemia virus and bovine leukemia virus long terminal repeats by virus-associated trans-acting regulatory factors. J Virol. 57 (3), 738-744 (1986).
  32. Dandekar, D. H., Kumar, M., Ladha, J. S., Ganesh, K. N., Mitra, D. A quantitative method for normalization of transfection efficiency using enhanced green fluorescent protein. Anal Biochem. 342 (2), 341-344 (2005).
  33. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  34. Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
  35. Peña, J., Harris, E. Dengue virus modulates the unfolded protein response in a time-dependent manner. J Biol Chem. 286 (16), 14226-14236 (2011).
  36. Soboleski, M. R., Oaks, J., Halford, W. P. Green fluorescent protein is a quantitative reporter of gene expression in individual eukaryotic cells. FASEB J. 19 (3), 440-442 (2005).
  37. Martinez, Z. S., Castro, E., Seong, C. S., Cerón, M. R., Echegoyen, L., Llano, M. Fullerene derivatives strongly inhibit HIV-1 replication by affecting virus maturation without impairing protease activity. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 5731-5741 (2016).
  38. Askari, S., Javadpour, P., Rashidi, F. S., Dargahi, L., Kashfi, K., Ghasemi, R. Behavioral and molecular effects of Thapsigargin-induced brain ER- stress: Encompassing inflammation, MAPK, and insulin signaling pathway. Life. 12 (9), 1374(2022).
  39. Jaskulska, A., Janecka, A. E., Gach-Janczak, K. Thapsigargin-from traditional medicine to anticancer drug. Int J Mol Sci. 22 (1), 4(2021).
  40. Shaban, M. S., et al. Multi-level inhibition of coronavirus replication by chemical ER stress. Nat Commun. 12 (1), 5536(2021).
  41. Marciniak, S. J., Chambers, J. E., Ron, D. Pharmacological targeting of endoplasmic reticulum stress in disease. Nat Rev Drug Discov. 21 (2), 115-140 (2022).
  42. Sriburi, R., Jackowski, S., Mori, K., Brewer, J. W. XBP1: A link between the unfolded protein response, lipid biosynthesis, and biogenesis of the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 167 (1), 35-41 (2004).
  43. Siwecka, N., Rozpędek-Kamińska, W., Wawrzynkiewicz, A., Pytel, D., Diehl, J. A., Majsterek, I. The structure, activation and signaling of IRE1 and its role in determining cell fate. Biomedicines. 9 (2), 156(2021).

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Infecci n de c lulas Ttinci n con tioflavina Tmarcadores de la RPEinmunotransferenciaRT PCRensayo de gen reportero de luciferasaELISA de P24
Medición del estrés del retículo endoplásmico y respuesta proteica desplegada en células T infectadas por VIH-1 y análisis de su papel en la replicación del VIH-1
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.