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Artículo de método

Producción de lotes de vectores adenoasociados de alto rendimiento utilizando celdas de suspensión HEK293

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DOI:

10.3791/66532

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26 de abril de 2024

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1Laboratory for Regeneration of Sensorimotor Systems, Netherlands Institute for Neuroscience, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW), 2Centre for Neurogenomics and Cognitive Research, Amsterdam Neuroscience, Vrije Universiteit Amsterdam

En este artículo

Resumen

Aquí, se presenta un protocolo de producción de AAV basado en células HEK293 en suspensión, lo que resulta en una reducción del tiempo y la mano de obra necesarios para la producción de vectores utilizando componentes que están disponibles para fines de investigación de proveedores comerciales.

Resumen

Los vectores virales adenoasociados (AAV) son una herramienta notable para investigar el sistema nervioso central (SNC). Cápsidas innovadoras, como AAV. PHP.eB, demuestran una transducción extensa del SNC por inyección intravenosa en ratones. Para lograr una transducción comparable, se necesita un título 100 veces mayor (mínimo 1 x 1011 copias del genoma por ratón) en comparación con la inyección directa en el parénquima del SNC. En nuestro grupo, la producción de AAV, incluido el AAV. PHP.eB se basa en células HEK293T adherentes y en el método de triple transfección. Lograr altos rendimientos de AAV con células adherentes implica un proceso intensivo en mano de obra y materiales. Esta limitación impulsó el desarrollo de un protocolo para el cultivo celular en suspensión en tubos cónicos. Los AAV generados en las células adherentes se compararon con el método de producción en suspensión. Se compararon cultivos en suspensión utilizando reactivos de transfección Polietilenimina o TransIt. Los vectores AAV se purificaron mediante ultracentrifugación en gradiente de yodixanol, seguida de intercambio de tampón y concentración mediante un filtro centrífugo. Con el método adherente, logramos un promedio de 2.6 x10 12 copias del genoma (GC) en total, mientras que el método de suspensión y la polietilenimina produjeron 7.7 x 1012 GC en total, y TransIt produjo 2.4 x 1013 GC en total. No hay diferencia en la eficiencia de transducción in vivo entre los vectores producidos con adherente en comparación con el sistema de celdas de suspensión. En resumen, se introduce un protocolo de producción de AAV basado en células HEK293 en suspensión, lo que da como resultado una menor cantidad de tiempo y mano de obra necesaria para la producción de vectores, al tiempo que se logran rendimientos de 3 a 9 veces mayores utilizando componentes disponibles de proveedores comerciales con fines de investigación.

Introducción

El virus adenoasociado (AAV) fue descubierto en 1965 y desde entonces se ha utilizado en una gran cantidadde aplicaciones. Los AAV se han aplicado en la investigación neurocientífica para estudiar la función génica y neuronal, mapear neurocircuitos o producir modelos animales para enfermedades2. Tradicionalmente, esto se hace inyectando directamente en el sitio de interés, ya que la mayoría de los serotipos naturales no atraviesan la barrera hematoencefálica ni necesitan una dosis alta para hacerlo 1,2,3.

Con el descubrimiento de AAV. PHP.B4 y cápsidas de última generación como AAV. PHP.eB5 y AAV. CAP-B106, es posible dirigirse al sistema nervioso central (SNC) mediante una simple inyección sistémica. El mapeo espacial revela las células a las que se dirige AAV. PHP.eB a nivel celular 6,7. En combinación con promotores/potenciadores específicos, estas cápsidas ofrecen amplias oportunidades para que los neurocientíficos estudien los genes y la función cerebral mediante la administración no invasiva de AAV 4,8.

Mientras que se necesita una dosis más baja para AAV. PHP.eB (típicamente 1 a 5 x 1011 copias del genoma (GC)/ratón) en comparación con AAV9 (4 x 1012 GC/ratón)7, aún se necesita producir más vector en comparación con las estrategias de inyección directa (típicamente inyección de 1 x 109 GC/μL). La mayoría de los serotipos naturales se pueden producir utilizando el sistema clásico de cultivo celular adherente en combinación con la purificación de yodixanol 9,10,11,12. Para AAV. PHP.eB Esto implica un proceso laborioso de cultivo y transfectación de células para obtener suficientes vectores para un experimento8. Por lo tanto, se desarrolló la producción de AAV en cultivo celular en suspensión en tubos cónicos. Los tubos cónicos, con una capacidad de hasta 300 ml, son compactos, lo que ahorra espacio en la incubadora y plásticos. Las células en suspensión son mucho más fáciles de cultivar y manipular en grandes cantidades que las células adherentes en placas de 15 cm. Los componentes de transfección del protocolo siguen siendo los mismos. Por lo tanto, los plásmidos utilizados previamente con el sistema adherente pueden utilizarse fácilmente en este protocolo basado en la producción en células en suspensión. El protocolo se transfirió con éxito a otros investigadores en el laboratorio y se utilizó con éxito para varias cápsidas y construcciones.

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Protocolo

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales de la Real Academia de Ciencias de los Países Bajos (KNAW) y se ajustaron a la Ley holandesa de experimentación animal en el marco del proyecto número AVD8010020199126. En la Figura 1, se proporciona una descripción general esquemática del protocolo completo. Desde la siembra de células hasta la purificación de AAV, el protocolo tarda 6 días en completarse.

1. Preparación de reactivos

  1. Purificación de plásmidos
    1. Realice la extracción de plásmidos como lo describe el fabricante con algunos ajustes para garantizar la esterilidad de los plásmidos.
    2. Prepare etanol al 70% con agua destilada estéril y etanol absoluto.
    3. Después de la etapa de centrifugación de isopropanol, seque los plásmidos en la campana de la cabina de flujo y agregue etanol estéril al 70% a los tubos. Después de la precipitación de etanol, seque los plásmidos en la campana de la cabina de flujo y vuelva a suspender el plásmido en agua destilada estéril. Tenga cuidado de utilizar tubos de microcentrífuga esterilizados.
    4. Tome una alícuota para la cuantificación, el análisis de restricción y, si es necesario, la secuenciación. Se recomienda comprobar la integridad de las repeticiones terminales invertidas (ITR), ya que las mutaciones pueden tener un impacto negativo en el rendimiento. Ajuste la concentración de la muestra a 1 μg/μL.
  2. Preparación de 10x Tampón de lisis Tween
    1. Disuelva 30,3 g de tampón Tris y 2,033 g de MgCl2,6H 2O en 400 ml de agua destilada estéril, ajuste el pH a 8,0 y aumente el volumen total a 450 ml.
    2. Mantenga el Tween 20 estéril, agregue 50 ml de Tween 20 a la solución tampón en la campana y esterilice con un filtro de vacío de 0,2 μM.
  3. Diluciones de yodixanol
    1. La solución de yodixanol se suministra a una concentración del 60%. Utilice la solución inicial para hacer soluciones de 15%, 25% y 40%.
    2. Para una solución al 15 %, diluir 60 ml de solución al 60 % con 48 ml de NaCl 5 M y 48 ml de PBS-MK (5 veces PBS con 5 mM de MgCl2 y 12,5 mM de KCl) y agregar agua destilada hasta 240 ml.
    3. Para una solución al 25%, diluir 67 ml de solución al 60% y 32 ml de PBS-MK. Agregue agua destilada hasta 160 ml. Mezclar bien y añadir 1,6 ml de solución de rojo de fenol.
    4. Para una solución al 40 %, diluya 160 ml de solución al 60 % con 48 ml de PBS-MK y agregue agua destilada hasta 240 ml. Para una solución al 60%, agregue 1 ml de rojo de fenol a 100 ml de solución al 60%.
  4. Solución de sacarosa PBS al 5%
    1. Añadir 25 g de sacarosa a un frasco de 500 ml de DPBS sin calcio ni magnesio. Agitar bien y filtrar con un filtro de vacío de botella de 0,2 μM.
  5. Solución de polietilenglicol (PEG) 8000
    1. Disolver 400 g de PEG 8000 y 24 g de NaCl en agua destilada estéril y ajustar a un volumen final de 1000 mL. Revuelva con fuego hasta que se disuelva por completo. Ajuste el pH a 7.4 usando papel de pH.
    2. Esterilizar con un filtro de vacío de botella de 0,2 μM para obtener una solución PEG 8000 al 40%. Tenga en cuenta que la filtración tardará un tiempo debido a la viscosidad del almacén de solución a 4 °C.

2. Cultivo de células en suspensión HEK293

  1. Use toallitas empapadas en etanol al 70% para la limpieza. Limpie la campana de bioseguridad, prepare y limpie todos los materiales necesarios para el cultivo de células.
  2. Precalentar 30 mL de medio celular de suspensión a 37 °C en un tubo de cultivo cónico de 50 mL. Recuperar células de producción viral a partir de nitrógeno líquido. Descongele rápidamente las células en un baño de agua a 37 °C. Justo antes de que el vial se descongele por completo, límpielo con una toallita empapada en etanol al 70% y transfiera el vial a la campana de bioseguridad.
    NOTA: Los detalles de las células de producción viral utilizadas aquí se proporcionan en la Tabla de Materiales.
  3. Transfiera rápidamente las células al tubo de cultivo cónico precalentado de 50 ml. Cultivo de células en incubadora de agitación a 37 °C, 80% de humedad, 8% de CO2, 200 revoluciones por minuto (RPM) y un diámetro de agitación de 50 mm. Células de paso, una vez que la viabilidad es superior al 90% y la densidad celular es superior a 1-3 x 106 células/mL.
    NOTA: La incubadora utilizada tiene un diámetro de agitación de 50 mm; Las condiciones de cultivo deben ajustarse para un diámetro de agitación diferente.
  4. Pasar las células 3-4 días después de la descongelación. Revise los tubos de cultivo para asegurarse de que no haya signos de contaminación; Por ejemplo, el hongo aparecerá como un anillo descolorido (negro o verde).
  5. Preparar 400 μL de solución de azul de tripano al 0,4% por muestra utilizando una tira de 1 mL.
  6. Recupere rápidamente las células en suspensión de la incubadora. Extraiga inmediatamente 500 μL del tubo con una tira de 1 mL. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo.
  7. Añadir 100 μL de suspensión celular al tubo de azul de tripano preparado. Invierta suavemente el tubo para mezclar; No pipetear para mezclar, ya que esto provocará la muerte celular. Regrese las células a la incubadora.
  8. Tome 50 μL de suspensión celular tratada con azul de tripano y aplíquelo al portaobjetos del hemocitómetro. Cuente el total de células viables y calcule la cantidad de suspensión celular y el medio necesario para el paso o la transfección al día siguiente.
  9. Calentar el medio en la incubadora durante 10-15 min. Agregue la suspensión celular al medio calentado y regrese a la incubadora. Para células de paso durante 3 días (es decir, de lunes a jueves), ajuste a 0,5 x 106 células/ml; para las células de paso durante 4 días (es decir, de jueves a lunes), se establece en 0,3 x 106 células/ml.
    NOTA: Según el fabricante, las células de producción viral se duplican cada 26 h y deben estar entre 3,5 x 106 y 5,5 x 106 antes de pasar al paso. Las celdas se pueden conservar hasta el paso 20.

3. Transfección

  1. Día 1
    1. A las 24 h antes de la transfección, cultivar 1 x 106 células por/mL en 300 mL de medio.
  2. Día 2
    1. Medio caliente, plásmidos y reactivo de transfección a temperatura ambiente. Para conocer las cantidades a preparar, consulte la Tabla 1.
    2. Brevemente plásmidos y reactivos de vórtice. Agregue plásmidos al medio preparado, vórtice. Agregue brevemente el reactivo de transfección y el vórtice. No agite la mezcla después de este paso. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
    3. Mientras tanto, cuente las células preparadas el día 1. Las células deben estar entre 2 y 2,5 x 106 células por ml y > 95% viables.
    4. Después de la incubación, gota a gota, agregue la mezcla de transfección a las células mientras gira suavemente el tubo. Incubar durante 72-96 h.

4. Recolección de las células

  1. Día 5
    1. Añadir 33 mL de tampón de lisis celular 10x (500 mM Tris pH 8, 10% Tween 20, 20 mM MgCl2), mezclar agitando suavemente e incubar a 37 °C durante 1,5 h con agitación.
    2. Centrifugar a 3428 x g a 4 °C durante 60 min. Filtrar a través de un filtro de vacío PES de 0,45 μM para clarificar el lisado celular, dejando el lisado clarificado en el recipiente del filtro.
      NOTA: Opcional después de la filtración: tomar 50 μL de muestra para PCR cuantitativa (Q-PCR).
    3. Añadir 90 ml de solución PEG 8000 al 40% a 360 ml de lisado celular filtrado.
    4. Limpie la barra agitadora con etanol al 70% y agréguela a la muestra. Revuelva en hielo o en la cámara frigorífica a 300 RPM durante 1 h. Incubar a 4 °C sin agitar durante la noche.
      NOTA: Se han probado tiempos de incubación de 1 h a 72 h. Los tiempos de incubación más largos tienen un efecto negativo en la precipitación general de proteínas.

5. Purificación de yodixanol

  1. Día 6
    1. Transfiera toda la muestra de volumen de cultivo precipitado PEG a un tubo cónico grande y limpio y centrífugo a 2820 x g y 4 °C durante 15 min.
    2. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de PEG en 15 mL de DPBS con calcio y magnesio. El gránulo es difícil de resuspender; Tómese el tiempo para hacer esto con cuidado.
    3. Transfiera la pieza resuspendida a un tubo limpio de 50 ml. El PEG permanecerá a los lados del tubo del biorreactor. Agregue 10 ml adicionales, teniendo cuidado de recoger todo el precipitado de PEG. Transfiera todo a un recipiente de 50 ml para obtener un volumen total de 25-30 ml.
    4. Añadir 40 μL de DNasa I (10 U/μL). Colocar en la incubadora durante 1 h 37°C.
      NOTA: Opcional después de la incubación de la DNasa: tomar 50 μL de muestra para Q-PCR.
    5. Limpie bien las barras de agitación que se utilizaron para la precipitación de PEG con una solución de cloruro seguida de etanol al 70%. Deje las barras agitadoras en etanol al 70% para el próximo experimento.
    6. Llene un tubo de polialómero de 25 mm x 89 mm con una pipeta Pasteur de vidrio con 15,5 ml de lisado celular concentrado en cada tubo. Después de añadir el lisado celular, cambie la pipeta Pasteur de vidrio por una nueva.
    7. Añadir soluciones de yodixanol del 15% al 60%: infundir 9 ml de la solución de yodixanol al 15% suavemente debajo del lisado celular. A continuación, agregue 5 ml de las soluciones de yodixanol al 25% y 40% y, por último, agregue 5 ml de la solución de yodixanol al 60%.
    8. Rellene el tubo con una jeringa con DPBS +/+ para eliminar la mayoría de las burbujas de aire, teniendo cuidado de no alterar las capas de yodixanol. Selle el tubo con un adorno de tubo eléctrico.
    9. Centrifugar en un rotor no oscilante durante 1 h 10 min a 490.000 x g a 16 °C en una ultracentrífuga. Retire de la ultracentrífuga, ensamble los tubos en un broche de metal y prepare los tubos de recolección. Abra el rotor en el capó en caso de derrames durante el centrifugado.
    10. Prepare un tubo de 50 ml (para desechar el tubo del rotor), un tubo de 15 ml (para recoger el virus), una jeringa de 5 ml y una aguja de 30 G y 19 G por gradiente.
    11. Perfore un agujero en la parte superior del tubo con una aguja de 30 G. Deje la aguja en su lugar. Coloque una aguja de 19G en la jeringa.
    12. Perfore con cuidado el tubo justo debajo de la interfaz 40%/60%, que se puede ver por el indicador rojo de fenol. Asegúrese de que el bisel de la aguja esté orientado hacia la capa del 40%.
    13. Retire la aguja 30G de la parte superior del tubo con la mano no dominante. Con la aguja biselada, extraiga lentamente el virus/yodixanol. El objetivo es extraer entre 3 mL y 4,5 mL. Aproximadamente a la mitad y bien dentro de la capa de 40%/transparente, gire la aguja para que el bisel quede hacia abajo y continúe extrayendo para evitar la recolección de la capa de proteína.
    14. Prepare el tubo de 50 ml con la mano no dominante, extraiga con cuidado la aguja mientras coloca el tubo en el tubo de 50 ml y deséchelo. Diluya la suspensión de AAV/iodixanol 5 veces en DPBS llenando hasta 15 ml.
    15. Transferir a un tubo de filtro centrífugo y centrifugar a 3428 x g, 4 °C durante 10 min. Deseche el flujo continuo; Retire con cuidado el soporte del filtro y coloque el recipiente inferior en una botella de desecho. Agregue 15 ml de sacarosa PBS-5% para filtrar y vuelva a suspender.
    16. Centrifugar a 3428 x g a 4 °C durante 20 min. Repita el intercambio de búfer al menos 3 veces. Almacenar virus (~150-250 μL) a 4 °C (PHP. B un máximo de 3 meses) o alícuotas en alícuotas de 50 μL y almacenar a -80 °C durante mucho tiempo.
      NOTA: PHP. Las variantes de la cápside B son sensibles a la congelación/descongelación, por lo que esto debe evitarse.
    17. Realice la valoración como se describe en un protocolo anterior10.

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Resultados

La mayoría de los laboratorios académicos utilizan células HEK293T adherentes para la producción de AAV 8,9. Si bien esto funciona relativamente bien cuando se necesitan pequeñas cantidades de AAV para la inyección directa, se necesita un título 100 veces más alto (mínimo 1 x 1011 GC/ratón) para lograr una transducción similar con cápsidas sistémicas como AAV. PHP.eB.

En este protocolo se estableció la producción de AAV util...

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Discusión

La administración sistémica de AAV es una herramienta poderosa para la transferencia de genes al SNC; sin embargo, la producción de AAV es un proceso costoso y laborioso. Mediante el uso de celdas de suspensión, se reduce la mano de obra y los plásticos en comparación con el cultivo adherente de HEK293T en placas de 15cm2 . Además, los tubos cónicos implementados aquí son fáciles de manejar y maximizan el uso del espacio del laboratorio. El protocolo fue establecido por dos investigadores y posteriormente apli...

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Divulgaciones

Mirus proporcionó una muestra gratuita de TransIT para las pruebas iniciales, después de lo cual se compró el reactivo para su uso posterior. Los autores no tienen otros intereses financieros contrapuestos que informar.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de una beca del fondo de investigación de la Real Academia de las Artes y las Ciencias de los Países Bajos (KNAW) y una subvención de Start2Cure (0-TI-01). Agradecemos a Leisha Kopp por sus aportes y consejos en la configuración del protocolo. Las figuras fueron creadas con Biorender.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
39 mL, Tubo de Polipropileno Redondo Quick-Seal, 25 x 89 mm - 50PkBeckman Coulter
600 mL tubos cónicos, para rotor S-4x1000, de 5920701002eppendorf
se adapta a 16 biorreactores de 600 mlInfors HT/ TPP587633
Tapones herméticos a los aerosoles, para cubos redondos de 750 mL5820747005eppendorf
5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4x1000, cubos redondos y adaptador Tubos cónicos de 15 mL/50 mL AguaEppendorf
Gibco
DNasa I recombinante, sin RNasaRoche4716728001
DNasa I recombinante, sin RNasaRoche4716728001
DPBS, calcio, magnesioGibco14040091
DPBS, sin calcio, sin magnesioGibco14190144
Fisherbrand Unidades de filtro PES desechables 0,2Fisher
Fisherbrand Unidades de filtro PES desechables 0,45FisherFB12566505
Soporte para tubos de cultivo de 50 ml también se adapta a Falcon TubeInfors HT/ TPP31362
Soporte para tubo de cultivo celular de 600 mlInfors HT/ TPP66129
Incubadora Minitron 50 mmInfors HT500043
LV-MAX Medio de producciónGibco
N-Tray UniversalInfors HT/ TPP31321
OptiPrep - IodixanolSerumwerk bernburg1893
PEI MAX - Clorhidrato de polietileno lineal de grado de transfección (MW 40,000)Poly-sciences24765-100
Solución de rojo de fenol Sigma-Aldrich72420100
Poli(etilenglicol) 8000Sigma-Aldrich89510
TransIT-VirusGENMirusMir 6706
Solución de Azul de Tripán, 0.4%Gibco5250061
Biorreactores TubeSpin-50mlTTP87050
Biorreactores TubeSpin-600mlTTP87600
Células de producción viralGibcoA35347
Vivaspin 20 MWCO 100 000Cytvia28932363
Adaptador de 342414 La placa adaptadora Centrífuga Destilada 5948000315 15230147FB12566504A3583401

Referencias

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