Evaluación en tiempo real de la contractilidad absoluta, citosólica, libre de Ca2+ y correspondiente en vasos linfáticos aislados y presurizados

Resumen

Este protocolo describe un método para medir simultáneamente el diámetro citosólico, el calcio libre [^Ca2+]_i y los vasos en vasos linfáticos en contracción y luego calcular las concentraciones absolutas de Ca²⁺ , así como los parámetros de contractilidad/ritmicidad. Este protocolo se puede utilizar para estudiar el Ca²⁺ y la dinámica contráctil en una variedad de condiciones experimentales.

Resumen

La vasculatura linfática, ahora a menudo conocida como "la tercera circulación", se encuentra en muchos sistemas de órganos vitales. Una función mecánica principal de la vasculatura linfática es devolver el líquido de los espacios extracelulares a los conductos venosos centrales. El transporte linfático está mediado por contracciones rítmicas espontáneas de los vasos linfáticos (VI). Las contracciones del VI están reguladas en gran medida por el aumento y descenso cíclico del calcio libre citosólico ([Ca²⁺]_i).

En este trabajo se presenta un método para calcular simultáneamente los cambios en las concentraciones absolutas de [Ca²⁺]_i y la contractilidad/ritmicidad de los vasos en tiempo real en VI aislados y presurizados. Utilizando VI mesentéricos aislados de rata, estudiamos los cambios en [Ca²⁺]_i y la contractilidad/ritmicidad en respuesta a la adición de fármacos. Los VI aislados se cargaron con el indicador radiométrico de detección de Ca²⁺ Fura-2AM, y se utilizó microscopía de video junto con software de detección de bordes para capturar mediciones de [Ca²⁺]_i y diámetro de forma continua en tiempo real.

La señal Fura-2AM de cada BT se calibró a la señal mínima y máxima para cada buque y se utilizó para calcular el [Ca²⁺]_i absoluto. Se utilizaron mediciones de diámetro para calcular los parámetros contráctiles (amplitud, diámetro diastólico final, diámetro sistólico final, flujo calculado) y ritmicidad (frecuencia, tiempo de contracción, tiempo de relajación) y se correlacionaron con medidas absolutas [Ca²⁺]_i .

Introducción

La vasculatura linfática se encuentra en muchos sistemas de órganos, incluyendo el cerebro, el corazón, los pulmones, el riñón y el mesenterio 1,2,3,4,5,6, y funciona impulsando líquido (linfa) desde los espacios intersticiales hasta los conductos venosos centrales para mantener la homeostasis del líquido ^7,8,9,10. Comienza con capilares linfáticos ciegos dentro de los lechos capilares vasculares que drenan hacia los vasos linfáticos colectores (VI). Las VI colectoras están formadas por dos capas de células: una capa de células endoteliales englobada por una capa de células del músculo linfático (LMCs)^10,11. El transporte de líquido linfático se logra a través de fuerzas extrínsecas (p. ej., formación de nueva linfa, pulsaciones arteriales, fluctuaciones de la presión venosa central) e intrínsecas¹².

La fuerza intrínseca para el transporte linfático es la contracción rítmica espontánea de los VI, que es el foco de la mayoría de los estudios que investigan la función linfática. Esta bomba linfática intrínseca está regulada principalmente por el ascenso y descenso cíclico del Ca²⁺ libre citosólico ([Ca²⁺]_i). La despolarización espontánea de la membrana plasmática en las LMC activa los canales de Ca²⁺ (Ca_v1.x) "tipo L" dependientes de voltaje, lo que desencadena la entrada de Ca²⁺ y la posterior contracción rítmica del VI ^8,9,10. Este papel se demostró bloqueando el Ca_v1.x con agentes específicos, como la nifedipino, que inhibió las contracciones del VI y provocó la dilatación de los vasos^13,14. El aumento transitorio de [Ca²⁺]_i o "pico de Ca²⁺" en las LMC mediado por los canales de Ca_v1.x también puede movilizar las reservas intracelulares de Ca²⁺ mediante la activación de los receptores de inositol trifosfato (IP₃) y los receptores de rianodina (RyRs) en el retículo sarcoplásmico (SR)15,16,17,18. La evidencia actual sugiere que los receptores IP₃ aportan más^Ca2+ requerido para las contracciones normales del VI en comparación con los RyRs 15,16,19,20,21; sin embargo, los RyR pueden desempeñar un papel durante la patología o en respuesta a la intervención farmacéutica^17,18. Además, la activación de los canales²² de K⁺ activados por Ca²⁺ y los canales de potasio (K ATP) sensibles al_ATP ^23,24 pueden hiperpolarizar la membrana de LMC e inhibir la actividad contráctil espontánea.

Hay muchos otros canales iónicos y proteínas que pueden regular la dinámica del Ca²⁺ en la recolección de VI. La utilización de métodos para estudiar los cambios en el Ca²⁺ y la contractilidad de los vasos en respuesta a agentes farmacológicos en tiempo real es importante para comprender estos posibles reguladores. Se ha descrito un método anterior que utiliza Fura-2 para medir los cambios relativos en el VI [Ca²⁺]_i ²⁵. Debido a que la constante de disociación para Fura-2 y Ca²⁺ se conoce²⁶, es posible calcular las concentraciones reales de Ca²⁺, lo que amplía la aplicación de este método y proporciona información adicional sobre la señalización de Ca²⁺ , la excitabilidad de la membrana y los mecanismos de contractilidad²⁷, además de permitir comparaciones de referencia entre grupos experimentales. Este último abordaje se ha utilizado en cardiomiocitos²⁸ y, por lo tanto, se puede adaptar a los VI. En este trabajo se presenta un método mejorado que combina estos dos enfoques para medir y calcular los cambios en la [Ca²⁺]_i absoluta, así como en la contractilidad/ritmicidad de los vasos, de forma continua y en tiempo real en VI aislados y presurizados. También proporcionamos resultados representativos de los VI tratados con nifedipino.

Protocolo

Se compraron ratas Sprague-Dawley macho de nueve a 13 semanas de edad a un vendedor comercial. Después de su llegada, todas las ratas fueron alojadas y mantenidas en las instalaciones de la División de Medicina de Animales de Laboratorio (DLAM) de la Universidad de Arkansas para Ciencias Médicas (UAMS) con una dieta estándar de laboratorio y expuestas a 12 h de ciclo de luz-oscuridad a 25 ^oC. Todos los procedimientos se llevaron a cabo según el protocolo de uso animal aprobado #4127 por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la UAMS.

1. Disección y canulación de VI mesentéricos

NOTA: Es importante configurar la cámara de perfusión antes del aislamiento de los VI mesentéricos para asegurarse de que no haya interrupciones en el flujo o fugas que puedan interrumpir el experimento.

1. Preparación del baño de perfusión
   1. Compre micropipetas de vidrio de borosilicato (1,2 mm de diámetro exterior, 0,68 mm de diámetro interior y tiradas hasta un diámetro de punta exterior de 75-100 μm) de un proveedor comercial. Corte y pula las micropipetas (también conocidas como cánulas) de aproximadamente 1-2 cm de longitud para montarlas en la cámara de perfusión del recipiente aislado.
   2. Conecte cada cánula de vidrio montada en la cámara de perfusión del recipiente a transductores de presión independientes situados en línea con reguladores de presión independientes alimentados por gravedad utilizando tubos de polietileno.
      NOTA: Esto permite la manipulación independiente de las presiones de entrada y salida según el diseño del estudio. En la figura 1 se muestra esta configuración en detalle.
   3. Rellene la cámara de perfusión (5 mL), las micropipetas de vidrio y el regulador de presión independiente alimentado por gravedad junto con los tubos de polietileno con solución salina fisiológica (PSS; 119 mM NaCl; 24 mM NaHCO₃; 1,17 mM NaH₂PO₄; 4,7 mM KCl; 1,17 mM MgSO₄; 5,5 mM C₆H₁₂O₆ (glucosa); 0,026 mM C₁₀H₁₆N₂O₈ (EDTA); y 1,6 mM CaCl₂) desprovisto de burbujas de aire. Luego, sujete la presión para que las cánulas no estén presurizadas.
      NOTA: El pH de esta solución es de ~7.5. Se mantiene un pH de 7,4 en el baño de perfusión utilizando burbujeo de CO₂ para actuar sobre el sistema de amortiguación de bicarbonato dentro del PSS, como se describe en el paso 1.3.7. El EDTA se utiliza aquí para quelar el exceso de iones Ca²⁺ .
2. Preparación de nudos
   1. Ate nudos dobles por encima de la cabeza bajo el microscopio con hilo de sutura de seda trenzado (tamaño 8-0). Los pasos clave se ilustran en la Figura 2.
      1. Separa un solo filamento.
      2. Use dos pinzas Dumont # 5 con puntas microromas y con una pinza haga un bucle doble alrededor de la punta de las otras pinzas.
      3. Con las pinzas en asa, agarra el extremo suelto de la sutura y pásalo por ambos bucles asegurándote de no cerrar el nudo por completo y dejando una pequeña abertura.
      4. Use las tijeras de resorte Vanna para cortar el exceso de sutura de ambos lados. Utilice estos nudos más tarde para asegurar el VI en las cánulas.
         NOTA: No use las mismas pinzas con las que diseccionará o cánula porque existe más peligro de dañar las puntas de las pinzas durante el atado de nudos.
3. Aislamiento y canulación de VI mesentéricos
   1. Anestesiar profundamente a los animales administrando un isoflurano al 5% con sobredosis de_O2 de 1,5 L/min y desangrar por decapitación.
   2. Aísle mesenterios enteros para la disección de VI mesentéricos haciendo primero un corte longitudinal a lo largo de la línea media de la pared abdominal, exteriorizando el mesenterio y luego cortando la conexión justo debajo del esfínter pilórico y ~ 2-3 cm por encima del ciego, así como la conexión con el recto.
   3. Lave los mesenterios enteros disecados en 200 ml de PSS helado y luego transfiéralos y colóquelos en una placa de Petri (100 mm) revestida de silicona (8-10 mm) que contenga PSS helado.
   4. Diseccione los VI mesentéricos de segundo orden de la grasa circundante y el tejido conectivo utilizando un microscopio estereoscópico, pinzas finas Dumont #5 Inox y tijeras de resorte Vanna. Para ayudar a identificar los extremos de los VI una vez extraídos del tejido, deje un pequeño trozo de grasa en el extremo proximal del VI.
   5. Transfiera los VI disecados a la cámara de perfusión del vaso para la canulación en cánulas de vidrio.
   6. Utilice dos pinzas finas Dumont #5 Inox preafiladas, de punta recta (0,05 x 0,01 mm) para canular los VI con el extremo distal del VI en la cánula P1 (flujo de entrada) y el extremo proximal del vaso en la cánula P2 (flujo de salida) para imitar la dirección del flujo linfático.
      NOTA: Las cánulas P1 y P2 son idénticas y solo difieren en el extremo del VI que está conectado. Es importante utilizar pinzas que se unan perfectamente en la punta y sin daños para facilitar el agarre de la delgada pared del vaso.
      1. Deslice un solo nudo preatado en cada cánula de vidrio para luego asegurar el recipiente en las cánulas.
      2. Usando el pequeño trozo de grasa para ayudar a orientar la dirección del ventrículo izquierdo, primero cánula el extremo distal en P1.
      3. Deslice el nudo por la cánula y apriételo para asegurar el VI. Asegúrese de no apretar demasiado y romper la punta de la cánula.
      4. Presurizar el VI a 4-5 mm Hg en la cámara de perfusión.
         NOTA: Para nuestros propósitos, establecemos la presión P1 y P2 para que sean iguales; Sin embargo, dependiendo de las condiciones experimentales, la presión puede ajustarse en cada cánula para inducir esfuerzo cortante o reflujo.
      5. Repita los pasos 1.3.6.1-1.3.6.4 para canular el extremo proximal del VI en P2.
   7. Coloque la piedra burbujeante con 7% de dióxido de carbono (CO₂) / 93% de oxígeno (_O2) en la cámara de baño para mantener el pH fisiológico.
   8. Conecte la cámara al regulador de temperatura y ajústela a 37 ^oC para que los VI se equilibren y desarrollen contracciones estables y espontáneas (aproximadamente 30 min).
      NOTA: La Figura 1 muestra esta configuración en detalle.

2. Medición de las concentraciones absolutas de [^Ca2+]_i en los VI

1. Tinción con Fura-2AM de VI canulados
   1. Después de que se desarrollen contracciones espontáneas (a partir del paso 1.3.8), incubar los VI con Fura-2-acetoximetílico éster (Fura-2AM; 2 μM o 10 μL/5 mL) y ácido plurónico (PA; 0,02% P/V o 5 μL/5 mL de 20% PA) durante 30 min en la oscuridad.
      NOTA: Después de la adición de Fura-2AM, todos los pasos restantes deben realizarse en la oscuridad.
   2. Después de 30 minutos, cambie la solución en la cámara de perfusión 3 veces vaciando todo el volumen del baño con un vacío de presión negativa, reemplazándolo con PSS sin reactivos a temperatura adaptada (37 ^oC).
      NOTA: Esto debe hacerse rápidamente para minimizar el tiempo que el VI está suspendido en el aire. Utilice ambas manos, por ejemplo, la mano derecha para aspirar y la mano izquierda para reemplazar el nuevo PSS sin reactivos.
   3. Después del lavado, incubar los VI durante 15 minutos en la oscuridad para eliminar el exceso de indicador y permitir la desesterificación.
2. Captura de Ca²⁺ fluorescencia y diámetro de los vasos
   1. Transfiera la cámara a la platina de microscopio fluorescente invertido equipada con una fuente de luz LED, un objetivo S Fluor 20x, un adaptador de encuadre celular y un rápido sistema de cámara de video CMOS, que permite la captura de fluorescencia fotograma a fotograma a 15 Hz.
      NOTA: En la Figura 3 se presenta un esquema de esta configuración de flujo de trabajo. La señal Ca²⁺ se puede capturar con una cámara CCD con al menos 15 fps.
   2. Conecte el microscopio a la computadora equipada con software de imágenes para registrar la fluorescencia y la detección de bordes.
      NOTA: El software al que se hace referencia también permite el registro simultáneo de la presión; sin embargo, eso no está incluido aquí.
   3. Encienda la fuente de luz LED y la interfaz del sistema fluorescente.
      NOTA: Las instrucciones de software descritas aquí son para el software al que se hace referencia, pero se puede utilizar otro software para obtener estos datos.
   4. Software abierto (IonWizard).
   5. En la pestaña Archivo , seleccione Nuevo.
   6. En la pestaña Recopilar , seleccione Experimento.
   7. Cargue la plantilla experimental deseada y haga clic en Aceptar.
      NOTA: Deberá configurar una plantilla experimental con los parámetros que se van a medir. Las instrucciones para la configuración de la plantilla se pueden encontrar en el manual del software²⁹.
   8. Ajuste los trazos en pantalla para ver el diámetro del recipiente, el numerador (señal 340), el denominador (señal 380) y la relación en orden descendente.
   9. Ajuste la escala del eje Y según sea necesario para ayudar a visualizar los seguimientos.
      1. En Seguimientos, seleccione Editar límites de usuarios. Asegúrese de que la opción Límites automáticos esté desactivada.
      2. Seleccione el parámetro que desea ajustar, introduzca los valores mínimo y máximo para el eje y, a continuación, seleccione Aceptar.
   10. Para comenzar el experimento, haga clic en INICIAR (en la parte inferior de la pantalla).
   11. Para medir el diámetro del VI simultáneamente, utilice el software de detección de bordes incorporado en el sistema de imagen, que genera trazas contráctiles de los VI a 3 Hz. Utilice estas mediciones para analizar los parámetros contráctiles y de ritmicidad descritos en la sección 3 y mostrados en la Figura 4.
       1. Asegúrese de ajustar la iluminación para que la pared del VI aparezca como líneas oscuras.
       2. Seleccione una región de interés (ROI) que esté desprovista de grasa y residuos. Una vez que el experimento haya comenzado, no mueva este ROI.
       3. Asegúrese de que el umbral esté configurado de modo que el borde de la pared del recipiente se detecte durante todo el ciclo de contracción.
   12. Para mediciones de fluorescencia, encienda el tubo fotomultiplicador (PMT).
   13. Excite Fura-2, un indicador radiométrico, alternando longitudes de onda de 340 y 380 nm en exposiciones de 50 ms utilizando iluminadores LED, y capture los espectros de emisión a 510 nm a 15 Hz en todo el campo de imagen.
       NOTA: Es importante mantener todos los parámetros ópticos (ajustes de excitación, filtros de emisión, lente del objetivo y espejos dicroicos) iguales durante toda una serie de experimentos para obtener mediciones de Ca²⁺ reproducibles.
   14. Mida la relación señal-fondo obteniendo primero la fluorescencia 340 y 380 con el VI en el centro del campo de visión (señal) y luego, utilizando los manipuladores de etapa para mover el campo de visión al borde del baño sin ningún recipiente (teniendo cuidado de evitar el borde revestido de silicona y/o eliminando cualquier residuo del baño) para capturar el fondo.
       NOTA: Es importante navegar de regreso a la sección original de la embarcación cada vez para las mediciones de Ca²⁺ .
   15. Cambie la solución de baño por PSS sin reactivos a temperatura adaptada para eliminar el indicador de exceso en el baño. Es posible que se necesiten varios intercambios de baño para eliminar el exceso de Fura-2, así que repita este intercambio hasta que la relación señal/fondo sea de aproximadamente 10:1.
   16. Registre la señal de fluorescencia de Fura-2 basal y las contracciones espontáneas durante aproximadamente 30 minutos, seguidas de una respuesta de concentración acumulativa de nifedipino (NIF; 0,1-100 nM), un antagonista de Ca_v1.x dependiente de voltaje. Obtenga mediciones de fondo para cada concentración de fármaco.
   17. Al final de cada experimento, lavar los VI con PSS libre de Ca²⁺ a temperatura ajustada para obtener la señal de fluorescencia mínima de Fura-2 (R_min) y el diámetro máximo de los VI en ausencia de Ca²⁺. Asegúrate de medir el fondo.
       NOTA: El PSS libre de Ca²⁺ tiene la misma composición que el PSS pero sin CaCl₂, y el EDTA se reemplaza por 1 mM EGTA (C₁₄H₂₄N₂O₁₀) (pH ~ 7.5).
   18. Cambie la solución de baño por PSS a temperatura adaptada que contenga 10 mM de Ca²⁺ e ionomicina (10 μM de IONO), un ionóforo de Ca²⁺ , para obtener la señal de fluorescencia máxima de Fura-2 (R_máx) y el diámetro mínimo de los VI en condiciones de saturación de Ca²⁺. Asegúrate de medir el fondo.
3. La fórmula para medir el absoluto [Ca²⁺]_i
   1. Utilice R_min y R_max para calibrar la relación de longitudes de onda de 340 y 380 nm y calcular la concentración absoluta de Ca²⁺ libre citosólico ([Ca²⁺]_i).
   2. Calcule la concentración absoluta de Ca²⁺ libre citosólico ([Ca²⁺]_i) utilizando la ecuación (1)²⁶:
      (1)
      Donde K_d = 225 nM (constante de disociación para Fura-2)²⁶, R = relación 340/380, R_min = relación 340/380 en ausencia de Ca²⁺, R_max = relación 340/380 con condiciones de saturación de Ca²⁺, S_libre = señal de 380 en ausencia de Ca²⁺, S_enlazada = señal de 380 con condiciones de saturación de Ca²⁺
      NOTA: Todas las señales fluorescentes se corrigieron para la fluorescencia de fondo.
   3. La Figura 5 es un ejemplo de seguimiento de Ca²⁺ que detalla qué parámetros se registran. Defina el Ca²⁺ de referencia como el Ca²⁺ en reposo más bajo antes del pico de Ca²⁺ y el pico Ca²⁺ como el Ca²⁺ más alto alcanzado durante el pico de Ca²⁺ . La amplitud es la diferencia entre el pico y la línea de base Ca²⁺. Exporte todos los parámetros directamente desde el software de imagen, excepto la frecuencia del pico de Ca²⁺ , que se calculará fuera de línea como el número de picos de Ca²⁺ /s. A continuación se muestran los pasos clave dentro del software al que se hace referencia para obtener estos parámetros.
      NOTA: Las trazas completas se pueden exportar a un archivo .txt y todos los parámetros se pueden analizar o calcular en el software de su elección.
   4. Para R_min, resalte la sección de la traza del numerador que corresponde al fondo durante el PSS libre de Ca²⁺. Se abrirá un cuadro de diálogo y proporcionará los valores de esta parte del seguimiento.
   5. En Operaciones, seleccione Constantes.
   6. Seleccione Fondo numérico de calcio e ingrese los números de fondo para el numerador y el denominador del paso anterior. Haga clic en Aceptar.
   7. Resalte la sección de la traza de relación que corresponde a la relación más baja durante el PSS libre de Ca²⁺. Esto es R_min. También tome nota del valor del denominador para esta sección; esto es_{S gratis}.
   8. Repita los pasos 2.3.4 a 2.3.7 para R_max y S_enlazados con la sección de la traza que corresponde a un PSS libre de Ca²⁺ alto y una relación más alta.
   9. En Operaciones, seleccione Constantes.
   10. Seleccione Calibración de calcio-calcio e ingrese los valores enumerados en la Ecuación 1. Haga clic en Aceptar.
   11. Ajuste uno de los trazos en pantalla como se describe en el paso 2.2.8 para que pueda ver el calcio numérico restado.
   12. Realice un análisis transitorio monótono para adquirir los parámetros restantes. Las instrucciones para esto se pueden encontrar en el manual del software³⁰.
   13. Como alternativa, en Exportar, seleccione Seguimiento actual.
   14. Seleccione la ubicación a la que desea exportar el archivo .txt y haga clic en Aceptar.
       NOTA: Asegúrese de hacer clic en la traza individual que desea exportar. Puede exportar todo el trazado o las secciones seleccionadas del mismo.

3. Medición de la contractilidad y ritmicidad del VI

1. El software de detección de bordes incorporado en el sistema de imágenes genera trazas contráctiles para las mediciones del diámetro del VI como se ha descrito anteriormente. Utilice estas mediciones para analizar parámetros contráctiles y de ritmicidad. La Figura 4 es un ejemplo de traza contráctil que detalla qué parámetros contráctiles se van a registrar. Exporte todos los parámetros directamente desde el software de imagen utilizando la función de análisis de transitorios monotónicos en la traza de diámetro³⁰, excepto la frecuencia de las contracciones, el flujo calculado y el intervalo, que deben calcularse sin conexión.
   NOTA: Las trazas completas se pueden exportar a un archivo de .txt y todos los parámetros se pueden analizar o calcular en el software de su elección utilizando las ecuaciones a continuación.
2. EDD, ESD, amplitud, frecuencia y mediciones de caudal calculado
   1. Medir los diámetros máximo y mínimo (diámetro diastólico final [EDD] y diámetro sistólico final [ESD], respectivamente) que pueden alcanzar los VI durante sus contracciones rítmicas y espontáneas.
   2. Calcule la amplitud de las contracciones (AMP) como la diferencia entre EDD y ESD.
   3. Calcule la frecuencia como el número de contracciones por período de medición (en s).
   4. Calcule el caudal calculado por μm utilizando la ecuación (2):
      Caudal calculado = π/4(EDD²- ESD²)F (2)
      Donde EDD² = área de la sección transversal del vaso durante el estado relajado, ESD² = medida del área de la sección transversal del vaso durante la constricción, F = frecuencia de contracciones/s
3. Ritmo: tiempo de contracción y relajación:
   1. Otras medidas de la ritmicidad del VI son el tiempo de contracción y el tiempo de relajación.
   2. Defina el tiempo de contracción como el tiempo que tarda el VI en alcanzar la ESD con cada contracción.
   3. Defina el tiempo de relajación como el tiempo que tarda el VI en alcanzar el EDD para cada relajación, lo que dará una indicación general de la ritmicidad correlacionada con [Ca²⁺]_i absoluto dentro de un marco de tiempo específico.
   4. Calcule el tiempo del intervalo (ΔT) a partir de la ecuación (3).
      Δt = t2 _(ESD2)-t1 _(ESD1) (3)

Resultados

Se evaluó la contractilidad de los VI y las alteraciones correspondientes en el Ca²⁺ libre citosólico ([Ca²⁺]_i) en VI mesentéricos aislados de rata tras la exposición a concentraciones variables de nifedipino (NIF; 0,1-100 nM) (Figura 6). Los parámetros, incluida la amplitud del pico de Ca²⁺, el Ca²⁺ basal y el pico de Ca²⁺, mostraron una reducción dependiente de la concentración con la adición incremental de NIF a la cámara de perfusión (Figura 7A). Al mismo tiempo, los parámetros contráctiles, como la amplitud de contracción y el flujo calculado, también mostraron una disminución gradual (Figura 7B). Hubo un pequeño aumento en el diámetro de EDD con NIF (Figura 7B). La frecuencia de pico de Ca²⁺ y la frecuencia de contracción parecen ser una respuesta de todo o nada. Sin embargo, este efecto se produjo a 10 nM para un VI, mientras que todos los VI habían cesado las contracciones a los 100 nM. Por lo tanto, los datos combinados generan gráficos que se asemejan a una respuesta de concentración graduada. Este efecto es consistente con publicaciones previas que utilizaron NIF en VI en otras preparaciones (miografía de alambre y presión^13,14). Los gráficos de Manhattan muestran las respuestas individuales del VI para las medidas de ritmicidad, incluyendo el intervalo, el tiempo de contracción y el tiempo de relajación (Figura 7C). Este tipo de representación de datos permite al investigador desentrañar estas respuestas de todo o nada o la variabilidad en los ritmos de contracción para proporcionar información adicional sobre los mecanismos subyacentes. En última instancia, las disminuciones en la amplitud y frecuencia de la contracción dieron como resultado una reducción en el flujo calculado a través de estos VI aislados, que sirve como un indicador sustituto de la función in vivo. En general, la disminución de la contractilidad del VI se correlacionó con la reducción de [Ca²⁺]_i. Nuestros hallazgos proporcionan evidencia directa de que dentro del rango de 100 nM, NIF detuvo eficazmente las contracciones y las oscilaciones [Ca²⁺]_i en los VI al antagonizar los canales Ca_v1.x presentes en las células musculares linfáticas (LMC).

Figura 1: Imagen de la configuración de la cámara del recipiente aislado. En los estudios de perfusión vascular se utilizó una cámara vasiva aislada equipada con un termorregulador. La gravedad se utilizó para controlar la presión a través de un depósito PSS. La presión se controló mediante transductores conectados a las cánulas de entrada (P1) y de salida (P2). Abreviatura: PSS = solución salina fisiológica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Preparación del nudo de un vistazo. (A) Preparación de doble bucle bajo el microscopio de disección utilizando un solo filamento de hilo de sutura de seda de 3 capas, (B) agarrando el extremo suelto y tirando de él a través de ambos bucles, (C) tirando del nudo de ambos extremos para mantener una pequeña abertura, y (D) cortando el exceso de filamento de cualquier lado y la caja azul que muestra un nudo doble completo listo para usar. Barra de escala = 1,5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Esquema del flujo de trabajo experimental para la adquisición de datos. Una rata sana fue anestesiada con inducción de isoflurano al 5% y se realizó la decapitación para eliminar la sangre del tronco. Se realizó una incisión en la línea media para exponer y aislar el mesenterio. El mesenterio aislado se extendió en una solución helada de PSS y se disecó un VI libre de grasa para su canulación en una cámara de perfusión de vasos aislados. El baño se colocó en la platina del microscopio invertido utilizando una lente de objetivo de 20x. El buque se excitó alternativamente con luz de longitud de onda de 340 y 380 nm y los espectros fluorescentes de emisión se recogieron utilizando una cámara CCD a 510 nm. La computadora conectada al microscopio generó las trazas contráctiles y de Ca²⁺ utilizando software de imágenes de captura de fluorescencia y detección de bordes. Barra de escala = 1 mm. Abreviaturas: PSS = solución salina fisiológica; VI = vaso linfático; CCD = dispositivo de carga acoplada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Traza contráctil representativa del VI. (A) Ejemplo de registro de cambios en el diámetro de VI canulados cargados con el indicador de imagen de Ca²⁺ Fura 2 AM en PSS y (B) una traza ampliada para mostrar todos los parámetros relacionados con la contractilidad del vaso: EDD, ESD, AMP y frecuencia. Estos valores se utilizaron para calcular la ritmicidad y el flujo. Abreviaturas: PSS = solución salina fisiológica; VI = vaso linfático; EDD = diámetro diastólico final; ESD = diámetro telesistólico; AMP = amplitud. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Traza representativa de imágenes de VI Ca²⁺ . (A) Ejemplo de registro de cambios en [Ca²⁺]_i absolutos en VI canulados cargados con Fura-2 en PSS y (B) una traza ampliada para mostrar todos los parámetros (Pico, Amplitud y Línea de base) relacionados con [Ca²⁺]_i (no corregido en segundo plano). Abreviatura: PSS = solución salina fisiológica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Imágenes de contractilidad del ventrículo izquierdo y Ca²⁺ de un vistazo. Trazas representativas correspondientes a (A) diámetro, (B) relación 340/380 y (C) absoluto [Ca²⁺]_i de la línea de base de PSS, nifedipino, un antagonista del canal Ca_v1.x (Ca²⁺), respuesta de concentración, incluyendo R_min y R_max. Abreviaturas: PSS = solución salina fisiológica; VI = vaso linfático; NIF = nifedipina; R_min = señal mínima de fluorescencia Fura-2; R_max = señal máxima de fluorescencia Fura-2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Oscilación de Ca²⁺ y la correspondiente contractilidad bloqueada por nifedipino en VI. (A) Los parámetros contráctiles de Ca²⁺ (n = 3) y (B) (n = 3) disminuyeron de manera dependiente de la concentración con la adición de nifedipino, un antagonista del canal de Ca_v1.x (Ca²⁺) dependiente del voltaje. (C) Los gráficos representativos de Manhattan muestran el intervalo de tiempo medio (Δt) entre las contracciones y los tiempos de contracción y relajación. Los datos se presentan como media ± SEM. Abreviaturas: PSS = solución salina fisiológica; VI = vaso linfático; NIF = nifedipina; EDD = diámetro diastólico final; AMP = amplitud. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Debido a la naturaleza frágil y diminuta de los VI, es imperativo ejercer el máximo cuidado durante los procesos de disección y canulación. Incluso un daño menor en el vaso podría conducir al desarrollo de un VI no viable o dar lugar a anomalías en los transitorios de [Ca²⁺]_i . La consistencia en los ajustes de excitación es igualmente crucial a lo largo de toda la serie experimental para garantizar la comparabilidad en las mediciones de [Ca²⁺]_i entre los grupos de control y tratados. Si no se mantienen ajustes uniformes, se corre el riesgo de sobreestimar o subestimar [Ca²⁺]_i en todos los vasos de una serie experimental. Del mismo modo, es igualmente importante identificar y monitorear con precisión la misma región del vaso a lo largo de cada experimento.

El uso del indicador radiométrico Fura-2AM normaliza las variaciones de fluorescencia causadas por el grosor desigual del tejido, la distribución/fuga de fluoróforos o el fotoblanqueo, problemas comunes con los tintes de una sola longitud de onda. ³¹ Esto permite el monitoreo continuo descrito en este protocolo. Sin embargo, dado que Fura-2 actúa quelando el^Ca-2+, es posible sobrecargar los VI y reducir el [^Ca2+]_i disponible para la contracción o la respuesta al fármaco. En estos casos, aún se pueden observar picos de Ca²⁺ mientras que las contracciones rítmicas están ausentes. La variación de la longitud del VI también puede contribuir a este fenómeno. Si bien es probable que estas mediciones de Ca²⁺ aún sean válidas, puede ser necesario reducir la concentración de Fura-2AM en configuraciones replicadas para lograr con éxito mediciones de Ca²⁺ y diámetro. Nuestros resultados solo incluyen los VI en los que tanto los picos de Ca²⁺ como las contracciones rítmicas estaban presentes al inicio del estudio.

La medición de R_min y R_max son pasos críticos en el cálculo de [Ca²⁺]_i absoluto. Debido a que R_min debe ser la proporción de Fura-2 en ausencia de Ca²⁺, se ha agregado una alta concentración de EGTA al PSS libre de Ca²⁺ para asegurar la quelación de cualquier Ca²⁺ residual. Se realizaron estudios iniciales con EDTA en el PSS libre de Ca²⁺, y esto resultó en contracciones esporádicas de los vasos con los correspondientes picos de Ca²⁺ . Para R_max, se ha añadido una alta concentración de Ca²⁺ al PSS junto con un ionóforo, la ionomicina, para maximizar la señal [Ca²⁺]_i . La solución con alto contenido de Ca²⁺ puede precipitar, lo que puede requerir la eliminación del EDTA del PSS. Es importante destacar que estas mediciones adicionales de R_min y R_max brindan la oportunidad de evaluar cambios fisiológicamente relevantes en [Ca²⁺]_i, lo que puede proporcionar información sobre la excitabilidad de la membrana y los mecanismos de contractilidad²⁷ , así como permitir comparaciones de referencia entre grupos experimentales en comparación con protocolos que solo informan una relación 340/380 para Fura-2. El hecho de que no se alcancen valores adecuados de R_min y R_max impide la capacidad de calcular [Ca²⁺]_{i absoluto.}

Debido a la naturaleza contráctil de los VI, este método solo puede proporcionar una medida de los niveles globales de Ca²⁺ en lugar de los eventos de liberación local de Ca²⁺ que se pueden medir en vasos paralizados³². Sin embargo, este método es ventajoso para correlacionar los cambios en la dinámica absoluta [Ca²⁺]_i con la contractilidad en comparación con los métodos que utilizan vasos paralizados o células individuales^28,32. Para este enfoque, se supone que la mayoría del Ca²⁺ medido se origina en las células linfáticas y musculares. Sin embargo, las células endoteliales, que también están presentes en estos VI aislados, pueden contribuir a la señal total de Ca²⁺ observada³³. Esta contribución podría estimarse utilizando VIs que han sido desprovistos de endotelio³⁴. Las contracciones del VI también pueden hacer que la pared del vaso se desplace ligeramente hacia adentro y hacia afuera durante el ciclo de contracción. Por lo tanto, es importante utilizar segmentos de vasos cortos que se puedan tensar pero sin estirar el vaso.

Más allá de su aplicación en los VI, este método podría utilizarse para estudiar vasos aislados de otros lechos vasculares, incluidas las arteriolas y las venas, y es prometedor para su posible utilización en neurobiología y otras ramas de la biología vascular. Explorar los efectos de varios agonistas o antagonistas dirigidos a diferentes vías de transducción de señales es otra vía para investigar la dinámica subyacente de Ca²⁺ . Además, esta técnica también se puede utilizar para la investigación comparativa que involucra muestras de control y tratadas de animales respectivos. Además, este enfoque es adaptable para su implementación a nivel celular, como en células musculares linfáticas aisladas, lo que requiere ajustes mínimos en la cámara de perfusión y los objetivos del microscopio. En resumen, este método proporciona información fisiológicamente relevante sobre la dinámica global de Ca²⁺ , ya que se correlaciona con la contractilidad y la ritmicidad en los VI y proporciona una evaluación sólida de los posibles reguladores de la dinámica del Ca²⁺ en la recolección de VI.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
20x S Objetivo de flúor	Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, Estados Unidos)	UPlanSApo
Micropipetas de vidrio de borosilicato Living	Systems Instrumentation (Burlington, VT, Estados Unidos)	GCP-75-100
Cloruro de calcio (CaCl2)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Estados Unidos)	BP510-500
Dióxido de carbono (CO2)	nexAir (Memphis, Tennessee, Estados Unidos)	UN3156
Pinzas de disección	Fine Science Tools (Foster City, CA, Estados Unidos)	11254-20
EDTA (C10H16N2O8)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Estados Unidos)	BP118-500
EGTA (C14H24N2O10)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Estados Unidos)	O2783-100
Fura-2AM	Invitrogen (Waltham, MA, Estados Unidos)	F1221
Glucosa (C6H12O6)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Estados Unidos)	D16-500
Regulador de presión alimentado por gravedad	hecho a medida en el laboratorio
Unidad de calefacción	Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, Estados Unidos)	TC-09S
Software de imagen	IonOptix (Westwood, MA, Estados Unidos)
Microscopio fluorescente invertido	Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, Estados Unidos)	IX73
Ionomycin	Invitrogen (Waltham, MA, Estados Unidos)	I24222
IonOptix Cell Framing Adaptor	IonOptix (Westwood, MA, Estados Unidos)	665 DXR
Isoflurano	Piramal Critical Care (Telangana, India)	NDC 66794-017-10
Cámara de perfusión de recipientes aislados	Living Systems Instrumentation (Burlington, VT, Estados Unidos)	CH-1
Pinza de preparación de nudos	Fine Science Tools (Foster City, CA, Estados Unidos)	11253-20
Fuente de luz LED	Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, Estados Unidos)	TL4
Sulfato de magnesio (MgSO4)	Acros Organics (Nueva Jersey, Nueva Jersey, Estados Unidos)	213115000
MyoCam-S3 Sistema de vídeo CMOS rápido	IonOptix (Westwood, MA, Estados Unidos)	MCS300
Nifedipino	Sigma (St. Louis, MO, Estados Unidos)	N7634
Suturas oftálmicas
Oxígeno (O2)	nexAir (Memphis, Tennessee, Estados Unidos)	UN1072
Ácido plurónico	Sigma (St. Louis, MO, Estados Unidos)	P2443
Cloruro de potasio (KCl)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Estados Unidos	BP366-500
Sistema de monitor de presión	Systems Instrumentation (Burlington, VT, Estados Unidos)	PM-4
Transductor de presión	Instrumentación de sistemas vivos (Burlington, VT, Estados Unidos)	PT-F
Placa de Petri revestida de silicona	hecha a medida en el laboratorio
Bicarbonato de sodio (NaHCO3)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Estados Unidos	BP328-500
Cloruro de sodio (NaCl)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Estados Unidos	BP358-212
Fosfato de sodio (NaH2PO4)	Fisher Bioreagents (Waltham, MA, Estados Unidos	BP329-500
Ratas Sprague-Dawley	Envigo RMS (Indianápolis, IN, EE. UU.)	Macho	de 9 a 13 semanas de edad
Microscopio estereoscópico	Leica Microsystems (Wetzlar, Alemania)	Tijeras de resorte S9D
Vannas	Fine Science Tools (Foster City, CA, Estados Unidos)	15000-03