Hibridación óptica fototérmica de fluorescencia infrarroja in situ (OPTIR-FISH)

Summary

Aquí, presentamos un protocolo que utiliza la hibridación óptica fototérmica de fluorescencia infrarroja in situ (OPTIR-FISH), también conocida como FOL fototérmico de infrarrojo medio (MIP-FISH), para identificar células individuales y comprender su metabolismo. Esta metodología se puede aplicar ampliamente para diversas aplicaciones, incluido el mapeo del metabolismo celular con resolución de una sola célula.

Abstract

Comprender las actividades metabólicas de las células individuales dentro de comunidades complejas es fundamental para desentrañar su papel en las enfermedades humanas. Aquí, presentamos un protocolo completo para la identificación celular simultánea y el análisis metabólico con la plataforma OPTIR-FISH mediante la combinación de sondas FISH marcadas con ARNr y sustratos marcados con isótopos. Las imágenes de fluorescencia proporcionan la identificación celular mediante la unión específica de sondas FISH marcadas con ARNr, mientras que las imágenes OPTIR proporcionan actividades metabólicas dentro de células individuales mediante el desplazamiento al rojo inducido por isótopos en los espectros OPTIR. Utilizando bacterias cultivadas con ¹³C-glucosa como banco de pruebas, el protocolo describe el cultivo microbiano con marcaje isotópico, hibridación fluorescente in situ (FISH), preparación de muestras, optimización de la configuración de imágenes OPTIR-FISH y adquisición de datos. También demostramos cómo realizar análisis de imágenes e interpretar datos espectrales a nivel de una sola celda con un alto rendimiento. La naturaleza estandarizada y detallada de este protocolo facilitará en gran medida su adopción por parte de investigadores de diversos orígenes y disciplinas dentro de la amplia comunidad de investigación del metabolismo de una sola célula.

Introduction

El metabolismo celular es un pilar fundamental en la biología celular, ya que dirige muchos procesos que determinan la salud, la función y la interacción de las células con el medio ambiente. El análisis del metabolismo a nivel de célula individual, particularmente dentro de los entornos nativos, proporciona información invaluable para revelar las actividades heterogéneas y complejas en^{los sistemas} biológicos. Esto es especialmente crucial en el estudio de los microorganismos, ya que muchos microbios exhiben requisitos de crecimiento únicos o dependencias ambientales que desafían^{los métodos de} cultivo tradicionales. Por ejemplo, algunas especies pueden requerir composiciones de nutrientes específicas o relaciones simbióticas que no se pueden replicar fácilmente en un entorno de laboratorio, lo que las hace no cultivables por las técnicas estándar³. Además, los largos períodos necesarios para el cultivo de ciertas especies plantean importantes desafíos para la investigación microbiológica, que a menudo se extienden más allá de los plazos prácticos para el estudio y el análisis. Para sortear estas limitaciones, métodos alternativos como la reacción en cadena de la polimerasa y la hibridación fluorescente in situ (FISH) permiten la identificación de especies microbianas sin necesidad de cultivo⁴, lo que puede lograr una visión más precisa y holística de los ecosistemas microbianos. Sin embargo, estas tecnologías analíticas carecen de la capacidad de dilucidar el metabolismo celular. Esta brecha pone de relieve los desafíos actuales en el campo de la microbiología: la tarea concurrente de diferenciar la identidad celular y dilucidar el metabolismo a nivel de una sola célula. Los avances en técnicas como la espectrometría de masas por imágenes (IMS) junto con isótopos estables se han convertido en herramientas poderosas para^{el análisis} metabólico de una sola célula. En estos experimentos, las células se incubaron con sustratos que contenían isótopos como ^{el 13}C o el ¹⁵N. Las biomoléculas recién anabolizadas transportan estos isótopos, lo que las hace distinguibles en los espectros m/z. Sin embargo, IMS adolece de una instrumentación costosa, una preparación de muestras complicada, un rendimiento relativamente bajo y la experiencia necesaria para analizar los espectros m/z. Cuando se combina con imágenes de fluorescencia específicas de marcadores moleculares, se han logrado avances en la elucidación del metabolismo celular con una mayor especificidad⁶. No obstante, persisten los desafíos para tender puentes entre estas dos modalidades. La diferencia de resolución entre las imágenes de IMS y de fluorescencia, combinada con diferentes configuraciones operativas, dificulta la alineación y correlación de los hallazgos⁷.

La integración de imágenes espectroscópicas vibracionales con el marcaje de isótopos estables ofrece una solución novedosa para el estudio del metabolismo de una sola célula. La incorporación de isótopos más pesados ralentiza la vibración de los enlaces químicos, lo que conduce a picos desplazados al rojo en los espectros vibratorios⁸. En particular, las imágenes vibracionales proporcionan una resolución espacial comparable a las imágenes de fluorescencia, y tanto la cuantificación metabólica como la identificación celular se pueden realizar en una sola configuración, lo que simplifica el registro y la correlación de imágenes. Nuestro trabajo reciente ha demostrado la combinación de una plataforma avanzada de imágenes vibracionales: infrarrojo fototérmico óptico (OPTIR) con hibridación fluorescente in situ (FISH) para sondear el metabolismo de la glucosa en comunidades bacterianas⁹ (Figura 1). OPTIR es un sistema de microscopía espectroscópica vibracional que aprovecha el efecto fototérmico de la absorción del infrarrojo medio mediante la detección del cambio de luz visible, lo que proporciona una resolución submicrométrica como en la microscopía óptica, pero con la información espectroscópica vibratoria adicional que se origina en la absorción del infrarrojo medio. La FISH es una técnica comúnmente utilizada para determinar la identidad del microorganismo a nivel de una sola célula. La secuencia de oligonucleótidos podría diseñarse para dirigirse a secuencias específicas de 16S de diferentes taxones, y se podrían unir diferentes fluoróforos. La hibridación específica de las sondas de oligonucleótidos diseñadas con el ARNr objetivo conduce a fuertes señales de fluorescencia de las especies objetivo dentro de las células individuales, y se podrían realizar imágenes de fluorescencia multicanal para identificar múltiples especies dentro de la población. Dado que tanto OPTIR como las imágenes de fluorescencia se basan en la detección óptica, la combinación de la fluorescencia OPTIR y FISH es fácil de implementar. Las dos modalidades comparten la misma resolución óptica para el análisis de una sola celda y se pueden cambiar convenientemente sin necesidad de alineación o registro conjunto adicional.

Este protocolo presenta una guía detallada para aprovechar la plataforma OPTIR-FISH para el análisis avanzado de la estructura y la función de una sola célula. Utilizamos las muestras bacterianas cultivadas en medios que contienen ¹³C-glucosa como banco de pruebas y cuantificamos la síntesis de proteínas de novo a partir de ¹³C-glucosa. Con el fin de demostrar la capacidad de la plataforma para identificar células, utilizamos mezclas bacterianas en las que cada especie se marcó utilizando sondas FISH dirigidas a ARNr. Este enfoque facilitó la identificación precisa de una sola célula de cepas bacterianas específicas, como Escherichia coli (E. coli) y Bacteroides thetaiotaomicron (B. theta), y su metabolismo. Este protocolo ofrece a los investigadores una poderosa herramienta para el perfil metabólico simultáneo y la identificación de especies a nivel de una sola célula, lo que promete avanzar en nuestra comprensión de las interacciones celulares, la fisiología y sus roles en entornos complejos.

Protocol

El uso de muestras bacterianas en este estudio está de acuerdo con las directrices de la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Boston y el Instituto Nacional de Salud.

NOTA: El flujo de trabajo general seguido en este protocolo se resume en la Figura 2.

1. Cultivo bacteriano y marcaje de isótopos (Figura 2A)

NOTA: El ejemplo que se da aquí es para etiquetar un cultivo bacteriano puro. Si se aplica este protocolo a comunidades polimicrobianas, el medio y el tiempo de marcaje deben ajustarse de acuerdo con la comunidad y la fisiología de los organismos de interés.

1. Inocular la cepa bacteriana de interés de una sola colonia y precultivo en un medio rico en nutrientes como caldo de soja tríptico (TSB) o caldo Luria-Bertani (LB) durante 3 h para alcanzar la fase de crecimiento exponencial (log). E. coli BW25113 se utiliza como cepa de ejemplo en este protocolo.
   NOTA: El tiempo para alcanzar la fase de registro variará según la cepa en uso. Este tiempo debe adaptarse a cada cepa.
2. Mida la densidad óptica a 600 nm para estimar la concentración bacteriana.
3. Prepare un medio de crecimiento mínimo complementado con sustratos marcados isotópicamente. Para E. coli BW25113, complemente el medio mínimo M9 con ¹³C-glucosa a una concentración final de 0,2% (p/v).
   NOTA: La ¹³C-glucosa utilizada (D-glucosa ^U-13C₆, 99%) fue universalmente marcada, donde todos los átomos de carbono fueron reemplazados por ^{átomos de 13}C. La elección del medio de crecimiento mínimo dependerá de la cepa bacteriana. La elección del sustrato isotópico dependerá del proceso metabólico específico de interés. El objetivo general es que el sustrato isotópico sirva como la principal fuente de nutrición en comparación con sus contrapartes no etiquetadas.
4. Diluya las bacterias en el medio de crecimiento mínimo que contiene el sustrato marcado isotópicamente hasta una concentración final de 5 × 10⁵ UFC/mL.
   NOTA: Por lo general, se usa una proporción de dilución alta como 1:100, y la nutrición no etiquetada del medio rico se vuelve insignificante. Alternativamente, para garantizar la eliminación completa del medio rico en nutrientes, se podría realizar un lavado con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x mediante centrifugación a 14.000 x g durante 10 min a 4 °C y resuspensión en PBS seguida de una segunda centrifugación y resuspensión final en el medio de crecimiento mínimo.
5. Cultive muestras bacterianas en una incubadora de agitación orbital en condiciones óptimas de crecimiento. En general, ajuste la incubadora de agitación orbital a una velocidad de 220 rpm y una temperatura de 37 °C, y coloque los tubos de cultivo inclinados con una tapa suelta para la incubación aeróbica. En el caso de E. coli, 24 h de incubación aeróbica a 37 °C suelen ser suficientes para alcanzar un marcaje máximo de ¹³C.
   NOTA: El tiempo de incubación depende del proceso metabólico de interés. Un tiempo de incubación más largo generalmente conduce a un marcaje isotópico más alto. Una medición de la curva de crecimiento en la misma condición con un sustrato no etiquetado podría proporcionar información para determinar los puntos de tiempo de recolección adecuados.
6. Recoja las células bacterianas en los puntos de tiempo deseados por centrifugación a 14.000 x g durante 10 min a 4 °C.
7. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender en un volumen igual de 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS. Fije las células en solución de PFA durante 10 min a temperatura ambiente (RT) o 2 h a 4 °C. Para el almacenamiento a largo plazo, lave las celdas dos veces con PBS, vuelva a suspender las celdas en 1 mL de 50% (v/v) de PBS y 96% de etanol, y almacene a -20 °C hasta su uso posterior.

2. Hibridación fluorescente in situ (FISH) (Figura 2B)

1. Hibridar células de E. coli con la sonda de¹⁰ oligonucleótidos Gam42a marcada con un fluoróforo de cianinina5 (Cy5) (Gam42a-Cy5) y células de B. theta con la sonda de oligonucleótidos Bac303¹¹ marcada con un fluoróforo de cianina 3 (Cy3) (Bac303-Cy3), siguiendo un protocolo FISH estándar.
   NOTA: Fundamentos de rRNA-FISH para la identificación: las moléculas de rRNA son objetivos ideales de FISH, ya que se distribuyen de forma ubicua y se amplifican naturalmente dentro de las células microbianas. El ARNr también contiene regiones de secuencia conservadas y variables, por lo que la profundidad filogenética del grupo objetivo podría determinarse mediante el grado de conservación de la sonda de oligonucleótidos. Mediante la unión específica de la sonda diseñada a la secuencia objetivo, el fluoróforo marcado muestra señales fluorescentes para células individuales.
2. Consulte la literatura publicada anteriormente 12,13,14 para obtener el protocolo detallado para la hibridación in situ con fluorescencia. Los pasos a continuación describen brevemente el protocolo estándar para las células microbianas.
   1. Deshidratación:
      1. Centrifugar las celdas fijas (100 μL) a 14.000 x g durante 10 min para pelletizar, resuspender en 100 μL de etanol de grado analítico al 96% e incubar durante 1 min a RT.
      2. Posteriormente, centrifugar las celdas nuevamente a 14,000 x g durante 5 min, retire el etanol y deje que la celda se seque al aire.
   2. Hibridación: Hibridar las células en solución (100 μL) durante 3 h a 46 °C.
      NOTA: El tampón de hibridación consta de 900 mM de NaCl, 20 mM de Tris-(hidroximetil)-amino metano HCl, 1 mM de ácido etilendiaminérgico tetraacético, dodecililsulfato de sodio al 0,01%, 100 ng del respectivo oligonucleótido marcado con fluorescencia y la concentración de formamida necesaria para obtener condiciones estrictas.
   3. Centrífuga: Inmediatamente después de la hibridación, transfiera las muestras a una centrífuga con un rotor precalentado a 46 °C y centrifuga a 14.000 x g durante 15 minutos a la temperatura máxima permitida (generalmente 40 °C).
   4. Lavar y almacenar:
      1. Lavar las muestras en un tampón de rigurosidad adecuada durante 15 min a 48 °C. A continuación, centrifugar las células a 14.000 x g durante 15 min a la temperatura máxima permitida en una centrífuga con un rotor precalentado a 46 °C.
      2. Por último, lave las células con 500 μL de PBS helado, vuelva a suspenderlas en 20 μL de 1x PBS y guárdelas a 4 °C hasta su uso posterior.
         NOTA: La unión específica de la sonda está garantizada por la rigurosidad de hibridación correcta. La alta rigurosidad podría lograrse aumentando la temperatura de hibridación, disminuyendo la concentración de sal o agregando formamida desnaturalizante. La formamida interfiere con los enlaces de hidrógeno que estabilizan los dúplex de ácidos nucleicos. Aquí, la temperatura y la concentración de sal no se modifican en la hibridación mientras se ajusta la concentración de formamida. La concentración óptima de formamida para las sondas de nuevo diseño se determina experimentalmente utilizando curvas de disociación de formamida¹⁰. La concentración de formamida requerida para las sondas publicadas se puede encontrar en probeBase¹⁵ o mediante una búsqueda en la literatura. Alternativamente, las concentraciones predichas de formamida se pueden obtener a partir del análisis in silico utilizando mathFISH¹⁶. En la etapa de lavado, una temperatura ligeramente más alta conduce a una condición un poco más estricta, lo que conduce a una mayor especificidad de unión.

3. Preparación de la muestra (Figura 2C)

1. Limpieza y recubrimiento de portaobjetos:
   1. Utilice portaobjetos CaF₂ estandarizados (10 mm de diámetro y 350 μm de grosor para compatibilidad con el portamuestras del instrumento). Sumerja el CaF₂ en etanol al 70% durante 15 minutos y enjuague dos veces con agua desionizada.
   2. Transfiera los portaobjetos limpios a una solución de poli-L-lisina al 0,1% e incube durante la noche a 4 °C. Enjuague los portaobjetos una vez con agua desionizada y séquelos al aire.
2. Descongele las muestras de células preparadas en RT mientras estén protegidas de la luz.
3. Para evitar el exceso de cristales de sal de PBS durante el secado de la muestra, siga los pasos 3.3.1-3.3.2.
   1. Lave las celdas dos veces con agua desionizada (DI). Centrifugar a 14.000 x g durante 10 min y retirar el sobrenadante.
   2. Vuelva a agregar el volumen original de agua desionizada y el vórtice suavemente. Repita la centrifugación y vuelva a añadir el lavado con agua desionizada.
4. (Opcional) Para muestras de mezcla, transfiera el mismo volumen de cada muestra y mezcle en un tubo de centrífuga.
5. Concentrar las muestras de células bacterianas por centrifugación a 14.000 x g durante 10 min y eliminar el sobrenadante.
6. Agite suavemente la solución restante durante ~30 s y agregue 1-2 μL de solución en el portaobjetos CaF₂ preparado. Seque la muestra al aire durante 30 minutos mientras está protegida de la luz.
   NOTA: Debería aparecer un pequeño punto redondo en el portaobjetos después del secado al aire. Debido al efecto "anillo de café", los bordes del punto tendrían una mayor densidad de células bacterianas. Este paso de centrífuga es para alcanzar una densidad adecuada para la obtención eficiente de imágenes bacterianas de una sola célula. La concentración ideal debe conducir a una capa uniforme y densa de células bacterianas individuales bajo el microscopio. Si hay un gránulo transparente que se puede ver a simple vista después de la centrífuga, retire el sobrenadante para que después del vórtice, la solución se vea casi clara. Se podría realizar una prueba rápida en la muestra de control para estimar el volumen de remoción del sobrenadante. Una matriz de gotas con diferentes cantidades de sobrenadante restante podría depositarse en el portaobjetos de vidrio del microscopio para examinar el volumen de dilución óptimo bajo el microscopio de campo claro. Si no hay gránulos visibles después de la centrifugación, elimine la mayor parte del sobrenadante para concentrar las muestras en la mayor medida posible. El truco consiste en colocar el tubo de centrífuga con la bisagra en el exterior en un rotor de ángulo fijo para que el pellet aparezca en el mismo lado de la bisagra del tubo. Además, reduzca el tamaño de las pipetas (P1000, P200, P10) para una mayor precisión durante la eliminación del sobrenadante y mantener el pellet intacto.
7. Monte el portaobjetos en un portamuestras suministrado y utilice pequeños puntos de cinta de poliéster para asegurar el portaobjetos durante la medición.

4. Imágenes OPTIR-FISH

NOTA: Las imágenes de fluorescencia y las imágenes OPTIR se realizarán en el sistema OPTIR.

1. Geometría del sistema:
   1. Utilice la contrapropagación de la bomba de infrarrojo medio y la sonda visible, la detección hacia atrás (epi) de la luz visible con este protocolo.
   2. Para enfocar la luz visible y recoger la luz visible retroreflejada y dispersa, utilice un objetivo aéreo (50x 0,8NA). Para enfocar la luz del infrarrojo medio, utilice un objetivo Cassegrain (40x 0,78NA).
   3. Asegúrese de que el sistema también esté equipado con un módulo de epifluorescencia de campo amplio con múltiples juegos de filtros de fluorescencia. Para los fluoróforos utilizados en este protocolo, seleccione el conjunto de filtros de proteína fluorescente verde (GFP) para la detección de Cy3 y el conjunto de filtros Alexa Fluor 647 para la detección de Cy5.
2. Prepárese para las mediciones:
   1. Encienda el sistema y abra el software de control de instrumentos. Después de la inicialización, mueva el control deslizante Contrahélice y Fluorescencia a la posición de encendido.
   2. Establezca el objetivo en 50x y, a continuación, realice el fondo automático para adquirir el espectro de potencia IR. Utilice el espectro de potencia para normalizar los espectros de muestra adquiridos o normalizar las imágenes OPTIR a diferentes números de onda. Esto excluirá el efecto de las diferencias de potencia del láser de infrarrojo medio en el análisis y la cuantificación de datos.
      NOTA: La adquisición de espectros de potencia IR para la normalización es imprescindible para el análisis cuantitativo posterior, ya que la intensidad medida está relacionada linealmente con la potencia IR. Después de realizar el fondo automático, el software normalizará los espectros OPTIR y las imágenes OPTIR a los espectros de potencia IR automáticamente para los usuarios. Purgar el sistema con N₂ puede minimizar la influencia del vapor de agua y aumentar la reproducibilidad entre experimentos.
3. Para cargar la muestra, utilice el botón Descargar para mover la etapa de muestra fuera. Utilice un objetivo de aumento bajo, como 10x, para localizar el área de la muestra y navegar hasta la región que tenga la densidad de muestra óptima. Enfoque la muestra ajustando la altura del objetivo en el software de control. Cambia la selección de objetivos a 50x.
4. Adquisición de imágenes
   NOTA: Las muestras utilizadas son: i) E. coli (¹³C-glucosa incubada); ii) E. coli (¹²C-glucosa incubada); iii) B. theta (¹²C-glucosa incubada); iv) mezcla de E. coli (¹³C-glucosa incubada) y B. theta (¹²C-glucosa incubada).
   1. Imágenes de campo claro (Figura 2D): Enfoque la muestra observando las imágenes de campo claro.
   2. Imágenes de fluorescencia (Figura 2E): Cambie el conjunto de filtros haciendo clic en el botón de nombre del filtro (GFP para Cy3 y Alexa Fluor 647 para Cy5) para detectar fluoróforos asociados con las sondas FISH diseñadas y adquirir imágenes de fluorescencia secuencialmente utilizando el módulo de fluorescencia en el software. Ajuste la intensidad de la luz y el tiempo de exposición para obtener un contraste de señal adecuado antes de blanquear los fluoróforos.
      NOTA: Dado que la sonda utilizada en las mediciones de OPTIR puede fotoblanquear fluoróforos, siempre adquiera imágenes de fluorescencia antes que las imágenes de OPTIR. Si tiene alguna inquietud sobre el efecto de los marcadores fluorescentes en la detección de OPTIR, consulte un trabajo publicado anteriormente que demostró que FISH con fluoróforo Cy5 no afecta la siguiente cuantificación basada en imágenes de OPTIR, ya que Cy5 es de tamaño pequeño y baja abundancia en comparación con la proteína bacteriana objetivo⁹.
   3. Imágenes OPTIR (Figura 2F):
      1. Determine el pico normal y la posición del pico desplazado al rojo inducido por isótopos. En el caso de la síntesis de proteínas a partir de ¹³C-glucosa, el pico normal de amida I se detecta alrededor de 1656 cm-1, y el pico desplazado al rojo es alrededor de 1612 ^cm-1 (Figura 3A).
         NOTA: La posición normal del pico depende del componente bioquímico y/o producto metabólico de interés. La posición del pico desplazada también depende del isótopo que se utilice para el etiquetado. Estos dos números de onda también podrían determinarse experimentalmente midiendo los espectros completos de células no marcadas y marcadas al máximo (véase el paso 4.5)
      2. Ajuste la longitud de onda de la bomba IR a 1656 ^cm-1 utilizando el software. Modifique la potencia de la sonda y la ganancia del detector en consecuencia para evitar la saturación de la señal de CC (8 V). Ajuste la altura del objetivo Cassegrain inferior para maximizar la señal de CA.
         NOTA: La potencia IR típica en la muestra es de alrededor de 5 mW, y la potencia de la sonda en la muestra es de alrededor de 3-15 mW, dependiendo de la muestra. Tanto el IR como la potencia de la sonda se pueden ajustar mediante el software de control para optimizar el nivel de potencia y garantizar un alto contraste de imagen y evitar dañar las celdas.
      3. Configure las imágenes OPTIR para que contengan 200 x 200 píxeles y establezca la velocidad de escaneo en 100 μm/s. Establezca el tamaño del paso en las direcciones X e Y en 150 nm para que el tamaño de la imagen sea de aproximadamente 30 x 30 μm².
      4. Adquirir la imagen.
      5. Ajuste la longitud de onda de la bomba IR a 1612 ^cm-1 y adquiera una imagen del mismo campo de visión en este número de onda.
      6. Para cada muestra, obtenga una imagen de al menos tres campos de visión para el análisis estadístico.
5. (Opcional) Medición espectral: Después de la adquisición de la imagen, si se encuentra una característica espacial de interés, realice la medición espectral.
   1. Seleccionar ubicaciones: Elija un solo punto o especifique una matriz de puntos para el análisis en el módulo Espectral del software.
   2. Establezca el parámetro de escaneo espectral. Seleccione el rango de cobertura del número de onda, la velocidad de escaneo y el espaciado de salida de datos según los requisitos.
      NOTA: si la velocidad de escaneo y el espaciado de salida de datos son diferentes en comparación con los utilizados en el paso de adquisición en segundo plano (paso 4.2), se necesita un nuevo fondo basado en los parámetros de escaneo espectral actuales para una normalización correcta.
   3. Establezca el número de co-promedio e inicie la medición espectral. El aumento del co-promedio también aumenta la relación señal-ruido de los espectros, pero requiere tiempos de adquisición más largos.
      NOTA: Si se observa una fluctuación significativa durante el co-promedio, puede indicar inestabilidad de la muestra inducida por el calentamiento con láser. Esto a menudo se puede solucionar disminuyendo la potencia IR y/o disminuyendo la potencia visible de la sonda.

5. Procesamiento y análisis de datos a nivel de célula única

1. Cuantificar la síntesis metabólica a partir de sustratos isotópicos (Figura 2G)
   NOTA: La siguiente cuantificación de la incorporación metabólica a partir de sustratos isotópicos se basa en imágenes OPTIR de dos números de onda correspondientes a los picos normales y desplazados de las macromoléculas objetivo. En comparación con una pila hiperespectral completa, las imágenes de dos números de onda podrían reducir en gran medida el tiempo requerido para cada campo de visión y mejorar el rendimiento, al tiempo que recapturan completamente el efecto isotópico crítico para la cuantificación del metabolismo.
   1. Al restar la imagen OPTIR de pico desplazada de la imagen OPTIR pico normal, se genera un mapa visual de las actividades de síntesis a partir de sustratos isotópicos. Como demostración (Figura 3C), para E. coli cultivada con ¹³C-glucosa, los píxeles positivos en la imagen (1656 cm-1-1612 ^cm-1) indican la incorporación activa de ¹³C en las proteínas, por lo tanto, un mayor nivel de síntesis de proteínas.
      NOTA: La resta se puede realizar utilizando la función ImageJ Image Calculator. Alternativamente, la sustracción podría realizarse fácilmente en cualquier lenguaje de programación preferido para el procesamiento por lotes.
   2. Cuantificación de la actividad metabólica unicelular
      1. Obtenga coeficientes (representados por h en la Figura 2G) de muestras de referencia no etiquetadas y completamente etiquetadas. Dado que el pico de desplazamiento al rojo inducido por isótopos se superpondría parcialmente con el pico normal, tanto las muestras no marcadas como las marcadas (recién sintetizadas a partir del sustrato marcado isotópicamente) contribuirán a las señales de OPTIR en el pico normal y desplazado. Cuantifique estas diferentes contribuciones utilizando la intensidad de la señal OPTIR normalizada en el pico normal y desplazado de muestras de referencia no marcadas y completamente marcadas.
         NOTA: Para las muestras de referencia, las muestras de referencia no marcadas se cultivan (o incuban) sin ningún sustrato marcado isotópicamente. Las muestras de referencia completamente marcadas generalmente se cultivan con la concentración más alta de sustrato marcado isotópicamente con el tiempo de cultivo más largo.
      2. Para el análisis de una sola célula, obtenga máscaras de una sola célula basadas en las imágenes de campo claro.
         NOTA: Aquí se podrían aplicar varias técnicas de procesamiento de imágenes para generar esta máscara, incluida la detección de diferentes partículas, como el análisis de blobs, y los métodos de segmentación de celdas, como la cuenca hidrográfica.
      3. Mida la intensidad de la señal OPTIR de celdas individuales. Aplique la máscara de una sola celda adquirida a las dos imágenes OPTIR (en el pico normal y en el pico desplazado) y, para cada celda individual, promedie los valores de píxel en la región de la máscara de una sola celda. El valor promedio de las celdas individuales se utilizará en la cuantificación.
      4. Para cada celda, calcule la contribución relativa de los componentes biológicos marcados y no marcados en función de los coeficientes del paso 5.1.2.1 y las señales del paso 5.1.2.3.
         NOTA: Una relación de reemplazo isotópico se define como la contribución relativa de los componentes biológicos marcados sobre la suma de los componentes biológicos marcados y no marcados (Figura 2G). Esta relación debe estar en el rango de 0 a 1. La relación de reemplazo isotópico es linealmente proporcional a la relación ¹³C-glucosa a ¹²C-glucosa (con una cantidad fija de glucosa total)⁹. Se ha demostrado una alta sensibilidad de detección del 5% de ¹³C-glucosa para las células de E. coli .
2. Identificación de especies bacterianas a partir de imágenes de fluorescencia multicanal (Figura 2H)
   1. Combine los canales de fluorescencia multicolor para crear una guía visual para diferentes especies bacterianas utilizando ImageJ (Image > Color > Merge Channels).
   2. Para el análisis de una sola célula, para cada canal de fluorescencia, genere un conjunto de regiones de interés (ROI) para células individuales.
      NOTA: Aquí se pueden aplicar varias técnicas de procesamiento de imágenes para generar la máscara, incluidos diferentes métodos de umbral automático y métodos de segmentación de celdas.
3. Correlacionar las identidades de los peces y las actividades metabólicas de OPTIR (Figura 2I)
   1. Vincule las identidades bacterianas a nivel de una sola célula de las imágenes de fluorescencia de FISH directamente con las actividades metabólicas de las imágenes de OPTIR correlacionando las posiciones de los ROI.
   2. Realizar análisis estadísticos para comparar las actividades metabólicas de diferentes especies.
      NOTA: Las máscaras se generan por separado de las imágenes de fluorescencia y las imágenes OPTIR porque las actividades metabólicas podrían analizarse para todas las células a partir de las imágenes OPTIR, mientras que las células desconocidas no aparecerían en ninguno de los canales de fluorescencia. Esto asegura que todas las células puedan ser incluidas en el análisis metabólico. Si hay un gran número de células no identificadas, es posible que sea necesario considerar diferentes sondas FISH dirigidas al ARNr de diferentes taxones de interés.

Results

El flujo de trabajo general para el análisis metabólico microbiano unicelular con identificación genética mediante OPTIR-FISH se resume en Figura 2. Los resultados representativos que demuestran la capacidad de imagen metabólica unicelular de OPTIR se muestran en Figura 3. En este ejemplo se utilizaron células de E. coli incubadas con ¹²C- o bien ¹³C-glucosa durante 24 h. La incorporación de ¹³Se ha demostrado que el C en proteínas causa un desplazamiento al rojo significativo de las amidas de proteínas I y II (Figura 3A)^17,18. Por lo tanto, estos dos números de onda clave que representan el ¹²Proteína C (1656 cm^-1, banda normal de amida I) y ¹³Proteína C (1612 cm^-1, banda I de amida desplazada) y se adquirieron imágenes OPTIR en estos dos números de onda. También se muestran las imágenes de campo claro correspondientes para demostrar la morfología de las células (Figura 3B,E). Las bacterias en forma de bastoncillos pueden resolverse claramente a nivel de una sola célula tanto en imágenes de campo claro como en imágenes OPTIR, lo que confirma la alta resolución espacial de la técnica OPTIR (Figura 3B-G). En el caso de las células incubadas con ¹²C-glucosa (Figura 3B-D), una intensidad mayor a 1656 cm^-1 mientras que una mayor 1612 cm^-1 se observó intensidad en las células incubadas con ¹³C-glucosa (Figura 3E-G). Este cambio máximo indica la incorporación de isótopos de carbono más pesados en la masa proteica¹⁷. La evaluación se amplió para evaluar la capacidad de OPTIR-FISH para discriminar taxones bacterianos y sus actividades metabólicas en muestras de múltiples especies. Mezclamos artificialmente dos especies bacterianas que prevalecen en el microbioma intestinal humano: E. coli y B. thetaiotaomicron (B. theta). E. coli células incubadas con ¹³La C-glucosa se hibridó con una sonda Gam42a-Cy5, dirigida al ARNr 23S de las Gammaproteobacterias¹⁰. B. theta células incubadas con ¹²La C-glucosa se hibridó con la sonda Bac303-Cy3, dirigiéndose al ARNr 16S de la mayoría de las especies de Bacteroidaceae¹¹. Es muy difícil diferenciar las dos especies basándose en las imágenes de campo claro, ya que ambas tienen forma de bastón (Figura 4A). Por lo tanto, las imágenes de fluorescencia multicolor de sondas hibridadas fueron esenciales para asignar una identidad taxonómica a cada célula bacteriana analizada (Figura 4B). Al restar las imágenes OPTIR adquiridas a 1612 cm^-1 de la de 1656 cm^-1, observamos que un segmento de células en esta muestra de biespecie mostró valores de resta positivos (Figura 4C), lo que indica la incorporación de ¹³Isótopos de C. En función de las condiciones de cultivo, asignamos las celdas con valor de sustracción positivo para que sean E. coli, y el valor de resta negativo debe ser B. theta. La asignación de especies bacterianas se confirma mediante los resultados de las imágenes de fluorescencia: las células que producen valores de sustracción positivos producen contraste Cy5, que es específico de E. coli, y las celdas que producen valores de resta negativos producen B. theta-Contrastes específicos de Cy3. A continuación, se calculó la relación de reemplazo isotópico, en este caso, recién sintetizada ¹³Proteína C de ¹³C-glucosa (Figura 4D). Como era de esperar, se observó una diferencia significativa en la relación de reemplazo isotópico entre las dos especies bacterianas (prueba t por pares, p = 9,74 x 10^-33) se observó. Este conjunto de datos subraya la viabilidad de aplicar la plataforma OPTIR-FISH para estudiar el metabolismo en un entorno complejo donde están presentes múltiples especies de muestras.

Figura 1: Esquema de la plataforma OPTIR-FISH para la identificación simultánea de especies y el análisis del metabolismo. Diferentes miembros de la comunidad microbiana pudieron ser identificados por la unión específica de las sondas de ARN ribosómico microbiano a través de la hibridación fluorescente in situ y detectados por imágenes de fluorescencia de los fluoróforos unidos. La actividad metabólica pudo analizarse mediante cultivo con sustratos isotópicos y detectarse mediante imágenes OPTIR. Las imágenes OPTIR detectan el cambio de dispersión inducido por la absorción de IR, y OPTIR es inherentemente compatible con herramientas fluorescentes ampliamente utilizadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Flujo de trabajo general para el análisis de la actividad metabólica de una sola célula con identificación genética por OPTIR-FISH. (A) Las células bacterianas se cultivaron con sustratos marcados isotópicamente. (B) A continuación, se realizó la hibridación fluorescente in situ (FISH). (C) Preparación de la muestra en portaobjetos transparente IR. (D) Las imágenes de campo claro identifican las regiones con una densidad celular óptima. (E, H) Las imágenes de fluorescencia multicolor de diferentes fluoróforos FISH revelan la identidad genética de las células individuales según lo especificado por las sondas FISH o sigue siendo desconocida. (F,G) Las imágenes multiespectrales posteriores de OPTIR en el pico normal y desplazado revelan la incorporación isotópica a la biomasa microbiana. Tomando como referencia los espectros OPTIR para muestras no marcadas y completamente marcadas (coeficiente h), se pudo cuantificar la contribución relativa de los componentes biológicos regulares (c_r) e isotópicos (c_i). La síntesis de proteínas a partir de sustratos metabolizados marcados isotópicamente se cuantificó utilizando la "relación de reemplazo isotópico". (I) Mediante OPTIR-FISH, se puede obtener un análisis de alto rendimiento de la actividad metabólica de las especies microbianas en una población compleja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Espectros representativos de OPTIR y resultados de imagen. (A) Espectros de OPTIR para células de E. coli cultivadas con ¹²C-glucosa (cian) y ¹³C-glucosa (naranja) que cubren la región de amida I y amida II. Se observa un pico claro de amida I desplazado al rojo (1656 ^cm-1 a 1612 ^cm-1) para ¹³células cultivadas con C-glucosa. Imágenes representativas de campo claro y OPTIR de células de E. coli en la banda normal de amida I y amida I desplazada en condiciones de cultivo de (B-D) ¹²C-glucosa y (E-G) ¹³C-glucosa. Barras de escala: 10 μm. Esta figura fue modificada con permiso de Bai et ^al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Imágenes representativas y resultados de cuantificación de mezclas bacterianas. Las células de E. coli se incubaron con ¹³C-glucosa, seguidas de hibridación con la sonda de oligonucleótidos Gam42a-Cy5. Las células B. theta se incubaron con ¹²C-glucosa, seguidas de hibridación con la sonda de oligonucleótidos Bac303-Cy3. (A) La imagen de campo claro muestra la morfología de la mezcla de células. (B) La imagen de fluorescencia a dos colores muestra la distribución de E. coli (rojo) y B. theta (verde). (C) El resultado de la sustracción de OPTIR (1612 cm-1-1656 ^cm-1) muestra el metabolismo proteico de las células bacterianas. (D) Cuantificación de la tasa de reemplazo isotópico que representa la proteína ¹³C recién sintetizada a partir de la ^{glucosa 13}C. (Prueba t por pares: p = 9,74 x ^10-33). Barras de escala: 10 μm. Esta figura fue modificada con permiso de Bai et ^al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Aquí, describimos un protocolo detallado para la aplicación de la plataforma OPTIR-FISH para la identificación simultánea de especies microbianas y la cuantificación de actividades metabólicas a la resolución de una sola célula. Los pasos críticos incluyen el cultivo con marcaje de isótopos estables para estudiar actividades metabólicas específicas y la hibridación fluorescente in situ para identificar especies microbianas objetivo. Las imágenes de fluorescencia multicanal y las imágenes OPTIR en números de onda seleccionados se pueden realizar secuencialmente en el mismo microscopio. Mostramos cómo analizar cuantitativamente estas imágenes para revelar los niveles de actividad metabólica de diferentes especies dentro de la compleja comunidad. El protocolo podría ser especialmente atractivo para el estudio metabólico de diversas especies dentro de la compleja comunidad en su entorno nativo.

Usamos bacterias como ejemplo aquí, pero este protocolo se puede adaptar para otros organismos, como hongos y células de mamíferos. Un punto clave es agregar las sondas vibracionales del proceso metabólico objetivo en el medio de cultivo libre de la contraparte normal. Por ejemplo, si se estudia el metabolismo de los lípidos a partir de ácidos grasos, los ácidos grasos marcados con azido deben complementarse con su medio de cultivo estándar compuesto por suero fetal bovino (FBS) deslipídico, ya que los ácidos grasos provienen originalmente de FBS. Además, el tiempo de incubación también debe coincidir con la tasa de crecimiento de diferentes hongos o células de mamíferos. Esto asegura el crecimiento normal de las células al tiempo que maximiza la eficiencia de etiquetado de las sondas vibratorias en las macromoléculas objetivo.

El protocolo descrito aquí también se puede adaptar para estudiar otros procesos metabólicos más allá de la síntesis de proteínas a partir de la glucosa. Todas las biomoléculas principales, incluidas las proteínas, los lípidos, los ácidos nucleicos y los carbohidratos, pudieron ser fotografiadas por OPTIR^19,20. Además, existe una amplia selección de estrategias de etiquetado, incluido el etiquetado isotópico como ¹³C, ¹⁵N, ¹⁸O y ²H, y la adición de etiquetas vibratorias como C≡C y C≡N a moléculas pequeñas²¹. Debido a los pequeños tamaños de las etiquetas y a su alta biocompatibilidad, es el método preferido para el estudio del metabolismo en comparación con los análogos de fluorescencia. Para estudiar otros procesos metabólicos utilizando diferentes sondas vibracionales, este protocolo puede ser modificado, incluyendo las etapas de cultivo celular y marcaje metabólico, así como la selección del número de onda en base a diferentes sondas y productos metabólicos, que se pueden encontrar en las referencias correspondientes 21,22,23. Algunos de los ejemplos incluyen el mapeo de lípidos recién sintetizados a partir de ácido azida-palmítico en sistemas de cultivo bidimensionales (2D) y tridimensionales (3D) derivados del ser humano²⁴, la obtención de imágenes de proteínas recién sintetizadas a partir de azidohomoalanina en células de macrófagos²³, la obtención de imágenes del metabolismo de la glucosa con deuterio-glucosa en células PC3²⁵, y el análisis de la incorporación de deuterio a partir de agua pesada como marcador de actividad en el microbioma intestinal humano²⁶.

Una posible limitación del protocolo es el límite de detección de ¹³C en comunidades complejas. Hemos demostrado que para el cultivo puro utilizado aquí, el límite de detección es el 5% de ¹³C en el carbono^{total 9}. También demostramos que al mezclar ^{completamente 13}células de E. coli marcadas con C con muestras de microbioma intestinal complejo humano no marcado, podemos diferenciar con confianza la E. coli en función de los perfiles metabólicos a pesar de la posible variación espectral asociada con diferentes composiciones químicas celulares originadas en varias especies de microbioma intestinal no marcadas⁹. Sin embargo, las comunidades microbianas complejas, influenciadas por las fisiologías únicas de las especies microbianas presentes, pueden exhibir tasas de asimilación de ¹³C inconsistentes. En tales casos, vale la pena probar más a fondo la capacidad de diferenciación metabólica de ¹³células marcadas con C y ¹²células marcadas con C de OPTIR-FISH en el contexto de una comunidad compleja. El rendimiento de la plataforma se puede mejorar aún más. Por ejemplo, al combinar la configuración OPTIR de campo amplio, la velocidad de imagen se puede aumentar significativamente²⁷. Se pueden incorporar a la plataforma métodos avanzados de eliminación de ruido basados en el aprendizaje automático para aumentar aún más la velocidad de las imágenes^28,29. Para visualizar mejor la distribución detallada de los metabolitos en las células microbianas, se pueden adoptar las tecnologías de superresolución recientemente desarrolladas^30,31.

Los pasos críticos para este protocolo incluyen la optimización de la eficiencia del etiquetado de FISH para los microbios objetivo, lo que podría lograrse mediante el diseño racional de la sonda de oligonucleótidos, la optimización de la concentración de formamida y el control cuidadoso del entorno de hibridación. La preparación de muestras con una densidad adecuada de una sola célula para el análisis de alto rendimiento es importante para un alto rendimiento en la práctica. También es fundamental optimizar el sistema para obtener la señal adecuada para la cuantificación. Esto se hace automáticamente en el software de control del instrumento durante el paso de fondo automático. Si hay una desviación en la preparación de la muestra, como el uso de un tipo diferente de portaobjetos en lugar del portaobjetos estándar CaF₂ , la optimización manual se puede realizar en el software. Durante el paso de optimización manual, la superposición entre el infrarrojo medio y la luz visible se optimiza mediante el escaneo de una matriz de posiciones de infrarrojo medio. Los principales desafíos incluyen la elección de los sustratos vibracionales más adecuados y los números de onda OPTIR correspondientes para cuantificar las actividades metabólicas de interés.

En conclusión, este estudio demuestra cómo la actividad metabólica y la identificación microbiana podrían lograrse simultáneamente a nivel de una sola célula mediante la plataforma OPTIR-FISH. Creemos que este protocolo detallado proporcionará una guía útil para promover la adopción generalizada de esta nueva plataforma de imágenes vibracionales con alta compatibilidad con herramientas de fluorescencia ampliamente utilizadas, lo que permite aplicaciones en diversos campos de las ciencias de la vida y la medicina y abre oportunidades para nuevos descubrimientos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96% Etanol	ThermoScientific	T032021000
Fluoruro de calcio	Crystran	CAFP10-0.35
D-(+)-Glucosa	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
D-Gluocosa (U-13C6, 99%)	Cambridge Isotopic Laboratories	CLM-1396-1
Ácido etilendiaminotetraacético	Sigma-Aldrich	E9884-100G
formamida	ThermoScientific	17899
Caldo Luria-Bertani	Sigma-Aldrich	L3522-250G
M9 Sales mínimas 5x	SIGMA	M6030-1KG
OPTIR instrumento	Espectroscopia fototérmica Corp.	mIRage
, 4% en solución de	ThermoScientific	J19943-K2
al 0,1% (p/v)	Sigma-Aldrich	P8920-500ML
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	S9888-25G
Dodecil sulfato de sodio	Sigma-Aldrich	L3771-25G
Clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano, 99+%	ThermoScientific	A11379.18
Caldo de soja trípico	Sigma-Aldrich	22092-500G