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Evaluación de las medidas de resultado de la conectividad de la unidad motora del diafragma de rata como biomarcadores cuantitativos de la degeneración y compensación de las neuronas motoras frénicas

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DOI:

10.3791/66568

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19 de abril de 2024

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1NextGen Precision Health, University of Missouri, 2Department of Biomedical Sciences, University of Missouri, 3Department of Physical Medicine and Rehabilitation, University of Missouri, 4Department of Neurology, University of Missouri, 5Department of Medical Pharmacology and Physiology, University of Missouri, 6Dalton Cardiovascular Research Center, University of Missouri

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

En este estudio, presentamos un método in vivo para estimar el número y el tamaño de la unidad motora para cuantificar la conectividad de la unidad motora de diafragma de rata. Se describe un enfoque paso a paso de estas técnicas.

Resumen

La pérdida de la función muscular ventilatoria es una consecuencia de la lesión de la neurona motora y la neurodegeneración (por ejemplo, lesión de la médula espinal cervical y esclerosis lateral amiotrófica, respectivamente). Las neuronas motoras frénicas son el eslabón final entre el sistema nervioso central y el músculo, y sus respectivas unidades motoras (grupos de fibras musculares inervadas por una sola neurona motora) representan la unidad funcional más pequeña del sistema ventilatorio neuromuscular. El potencial de acción muscular compuesto (CMAP), el potencial de unidad motora única (SMUP) y la estimación del número de unidades motoras (MUNE) son enfoques electrofisiológicos establecidos que permiten la evaluación longitudinal de la integridad de la unidad motora en modelos animales a lo largo del tiempo, pero se han aplicado principalmente a los músculos de las extremidades. Por lo tanto, los objetivos de este estudio son describir un enfoque en estudios preclínicos con roedores que se pueda utilizar longitudinalmente para cuantificar el MUNE frénico, el tamaño de la unidad motora (representado como SMUP) y CMAP, y luego demostrar la utilidad de estos enfoques en un modelo de pérdida de neuronas motoras. Los biomarcadores sensibles, objetivos y traslacionalmente relevantes para la lesión, degeneración y regeneración neuronal en lesiones y enfermedades de las neuronas motoras pueden ayudar significativamente y acelerar los descubrimientos de la investigación experimental para las pruebas clínicas.

Introducción

Las neuronas motoras frénicas (MN), que se extienden desde los niveles de miotoma C3 hasta C6, forman el enlace final desde el sistema nervioso central (SNC) hasta el músculo del diafragma1. Las unidades motoras frénicas (UM) están compuestas por una sola MN espinal y sus fibras musculares diafragmáticas inervadas, formando la unidad funcional más pequeña del sistema neuromuscular respiratorio. La función ventilatoria requiere una contracción adecuada del músculo diafragma lograda a través de la activación coordinada de la piscina frénica MU 2,3. Muchas enfermedades neurológicas, incluida la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), provocan una insuficiencia ventilatoria grave, lo que en última instancia contribuye a la causa de la muerte4.

Se pueden emplear varios enfoques electrofisiológicos para evaluar y monitorear la integridad del grupo de la unidad motora (MU) in vivo. El potencial de acción muscular compuesto (CMAP) refleja la despolarización sumada de todas las fibras musculares en un músculo o grupo muscular específico después de la estimulación de los nervios periféricos y es sensible a una variedad de afecciones neuromusculares, incluida la ELA 5,6 y la atrofia muscular espinal (AME)7,8,9. Una limitación de la evaluación de CMAP es que la germinación de colaterales puede conducir a un mantenimiento de la amplitud y el área de CMAP incluso en presencia de pérdida de MU10. Para superar esta limitación, se han realizado modificaciones en la técnica CMAP para evaluar tanto el número de unidades motoras como el tamaño11. Además, un estudio in vivo que investigó la evaluación funcional del CMAP del diafragma mediante un sistema electrofisiológico sugirió que también puede ser factible utilizar la técnica de registro CMAP del diafragma descrita para la estimación del número de unidades motoras12.

La técnica de estimación incremental del número de unidades motoras (MUNE) fue introducida inicialmente a principios de la década de 1970 por McComas et al. para el músculo extensor corto de los dedos en humanos13. El enfoque MUNE incremental fue una modificación de la técnica tradicional de registro CMAP durante la cual se administró una estimulación gradualmente creciente para registrar incrementos submáximos cuánticos, de todo o nada, como índices de respuestas de una sola unidad motora. Los incrementos sumados y promediados se utilizaron para calcular una estimación del tamaño de un potencial de unidad de motor (SMUP). Este tamaño calculado se dividió en la amplitud del CMAP para estimar el número de MU que inervaban el músculo examinado11. MUNE demuestra una alta sensibilidad en la detección y monitorización de la pérdida de unidad motora, lo que permite la identificación de la disfunción de la unidad motora antes de cambios observables en medidas como la amplitud del CMAP o el área14,15. En los pacientes con ELA, MUNE ha demostrado ser excepcionalmente sensible, sirviendo como un biomarcador destacado para el inicio, la progresión y el pronóstico de la enfermedad16,17.

Se han desarrollado y utilizado ampliamente numerosas adaptaciones de MUNE para evaluar la función de MU en condiciones como la neurodegeneración, la lesión neuronal y el proceso natural de envejecimiento 18,19,20,21. Desde la descripción inicial, se han empleado diversas adaptaciones que utilizan tanto respuestas electrofisiológicas como mediciones de fuerza incremental (mecánicas) tanto en estudios humanos como en modelos animales22. MUNE proporciona una evaluación funcional no invasiva de la conectividad de las neuronas motoras con el músculo. La aplicación longitudinal de MUNE permite comprender la progresión de la enfermedad o del fenotipo inducido y evaluar los efectos protectores o regenerativos de las intervenciones terapéuticas, tanto en el ámbito clínico como en el preclínico. Independientemente de la efectividad de las medidas de MUNE para la reproducibilidad y la relevancia clínica de la técnica para las piscinas de MU en la mayor parte del cuerpo humano, los esfuerzos se han centrado en gran medida en los músculos de las extremidades en los músculos de los roedores 10,23,24,25.

Por lo tanto, los objetivos de este estudio fueron describir un enfoque para la obtención del potencial de acción muscular compuesto (CMAP), el SMUP y el número de unidades motoras frénicas (MUNE) como evaluaciones in vivo que se pueden utilizar longitudinalmente en estudios preclínicos con roedores para cuantificar el MUNE, el tamaño de la unidad motora (representado como SMUP) y el CMAP. Además, presentamos datos representativos que destacan la pérdida del número de MU del diafragma tras la administración intrapleural de un agente degenerativo frénico MN, el fragmento B de la toxina del cólera conjugado con saporina (CTB-SAP).

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados y llevados a cabo de acuerdo con las pautas establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Missouri. Los experimentos se realizaron en ratas Sprague-Dawley macho adultas, de 11 a 15 semanas de edad. Estas ratas se alojaron en parejas y se mantuvieron bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12:12, con acceso a alimentos peletizados comerciales estándar y agua tratada con HCl disponible en todo momento.

1. Preparación de animales y administración de anestesia

  1. Use equipo de protección personal adecuado mientras manipula ratas.
  2. Administrar anestésico inhalatorio con isoflurano al 3-5%, asegurando una correcta inducción. Una vez que la rata esté adecuadamente anestesiada, colóquela en posición supina y mantenga la anestesia con isoflurano inhalado al 1-3%. Verifique la suficiencia de la profundidad de la anestesia aplicando suavemente presión sobre la almohadilla del pie de la extremidad posterior con fórceps para asegurarse de que no haya respuesta de retirada.
    NOTA: Según el tamaño y el peso de la rata, controle la profundidad de la anestesia y ajuste la concentración de isoflurano en consecuencia.
  3. Mantenga la temperatura de 37 °C utilizando una placa calefactora termostática para evitar variaciones de temperatura que puedan afectar la amplitud y la latencia del CMAP.
  4. Aplique un ungüento veterinario a base de petróleo en los ojos para prevenir la sequedad. Controle la profundidad de la anestesia observando la frecuencia respiratoria y verificando las respuestas de retirada al aplicar presión a la almohadilla para los pies con pinzas.
  5. Extraer el vello del tercio inferior del pecho y el cuello para estudiarlo con una maquinilla. Monitorea la respiración de la rata durante todo el experimento.
    NOTA: Después de las grabaciones de CMAP y MUNE y la interrupción de la anestesia, no deje a la rata desatendida hasta que haya recuperado la conciencia suficiente. No regrese al animal a la jaula doméstica hasta que esté completamente recuperado.

2. Colocación y configuración de electrodos

  1. Coloque un par de electrodos de aguja monopolar de 28 G para registrar el CMAP, el SMUP y el MUNE como se muestra en la Figura 1.
    1. Colocar el electrodo de aguja activo (E1) por vía subcutánea sobre la línea clavicular media inferior al último borde de la costilla, y el electrodo de aguja de referencia (E2) por vía subcutánea en el ángulo entre la apófisis xifoidea y el último cartílago esternocostal.
      NOTA: Los electrodos de aguja no deben insertarse en el músculo del diafragma; En su lugar, deben colocarse en la zona subcutánea.
  2. Para la estimulación del nervio frénico en la lámina carotídea, se utilizan un par de electrodos de aguja monopolares de 28 G como cátodo y ánodo para la estimulación nerviosa y se colocan subcutáneamente sobre el cuello lateral entre los músculos escaleno anterior y medio, separados por aproximadamente 1 cm. Asegúrese de que la colocación de las agujas estimulantes esté al nivel por debajo de la cuarta vértebra cervical (C4).
    NOTA: Evite insertar los electrodos estimulantes demasiado profundo para evitar lesiones en el nervio frénico u otra estructura. La Figura 1 ilustra la colocación de los electrodos.
  3. Para el electrodo de tierra, coloque un electrodo de superficie desechable en la cola.

3. Adquisición de datos

  1. CMAP frénico
    1. Registre las respuestas frénicas de CMAP mediante la aplicación de pulsos monofásicos catódicos de onda cuadrada con una duración de 0,1 ms y una intensidad que oscila entre 60 y 100 mA para estimular el nervio frénico.
    2. Obtener respuestas CMAP mientras se incrementa progresivamente la intensidad del estímulo hasta que la amplitud de la respuesta deja de mostrar un mayor aumento. Para asegurar la estimulación supramáxima, aumente la intensidad del estímulo a aproximadamente el 120% del nivel utilizado para provocar una respuesta máxima y registre una respuesta adicional. Si el tamaño de CMAP ya no aumenta, considere esta respuesta como el CMAP máximo.
      NOTA: Es preferible administrar estimulación durante la exhalación para minimizar el ruido de la actividad muscular concurrente durante la grabación de CMAP.
    3. Mida y documente las amplitudes pico a pico del CMAP en milivoltios (mV) (Figura 2).
      NOTA: La amplitud del CMAP se puede evaluar de base a pico y de pico a pico. Los sistemas de electrodiagnóstico clínico a menudo se utilizan de forma predeterminada para evaluar la base a la cresta, que se calcula desde la línea de base isoeléctrica hasta el pico negativo inicial.
  2. Tamaño medio del potencial de una sola unidad de motor (SMUP) y cálculo de MUNE
    1. Calcule el tamaño medio del SMUP utilizando una técnica de estimulación incremental.
      1. Para provocar respuestas incrementales, administre estimulación submáxima con una duración de 0,1 ms a una frecuencia de 1 Hz, aumentando gradualmente la intensidad en incrementos de 0,03 mA hasta que se logre una respuesta mínima de todo o nada. Adquirir la respuesta inicial con una intensidad de estímulo comprendida entre 2 mA y 10 mA.
      2. Si la respuesta inicial no se produce con una intensidad de estímulo entre 2 mA y 10 mA, modifique la posición del cátodo estimulador, ya sea acercándolo o alejándolo del nervio frénico en el cuello, para disminuir o aumentar la intensidad del estímulo necesaria, respectivamente.
      3. Si la primera respuesta incremental se logra con una intensidad de estímulo que oscila entre 2 mA y 10 mA, guarde la primera respuesta y adquiera incrementos adicionales con intensidades de estímulo progresivamente más altas, ajustando en incrementos de 0,03 mA, para lograr un total de 9 incrementos adicionales que cumplan los siguientes criterios en el paso 3.2.2.
        NOTA: Cada SMUP se cuantifica restando cada incremento del incremento anterior.
    2. Al medir las respuestas incrementales, asegúrese de que cada incremento cumpla con los siguientes criterios:
      1. Asegúrese de que el pico negativo inicial de las respuestas incrementales se alinee temporalmente con el pico negativo de la respuesta CMAP máxima.
        NOTA: Los ligeros movimientos observados debido al ruido de fondo de los ciclos respiratorios son inherentes a la naturaleza del experimento. Sin embargo, la presencia constante de SMUP durante la observación en vivo confirma su identidad para ese CMAP específico.
      2. Como el diafragma es un músculo dinámico involucrado en la respiración, cada ciclo de respiración puede inducir un movimiento basal. Por lo tanto, verifique la estabilidad y la ausencia de fraccionamiento en cada respuesta incremental confirmando la consistencia en tres respuestas duplicadas.
        NOTA: Para distinguir los potenciales evocados de baja amplitud, especialmente el primer SMUP, del ruido de fondo debido a la actividad respiratoria, es importante permanecer alerta y observar durante 3-4 ciclos respiratorios. También asegúrese de que los picos estén alineados con los del CMAP para mayor precisión.
      3. Asegúrese de que cada incremento sea distinto y mayor que el anterior. Por lo tanto, distinga visualmente las respuestas incrementales en tiempo real, observándolas a medida que se superponen a los incrementos registrados anteriormente.
        NOTA: Se pueden realizar múltiples réplicas del estímulo en cada amplitud para garantizar la coherencia en los incrementos y el cumplimiento de los criterios predefinidos.
      4. Después de verificar visualmente cada incremento con los criterios antes mencionados, confirme que la amplitud del incremento sea de al menos 25 μV. Si el incremento es inferior a 25 μV, descarte la medición y vuelva a evaluar la respuesta.
      5. Después de registrar 10 respuestas incrementales, verifique que la amplitud de cada respuesta incremental no sea superior a un tercio de la amplitud combinada de los 10 incrementos, lo que representa la amplitud total de la respuesta final. Si no se cumple este criterio, repita la medición de las 10 respuestas incrementales.
        NOTA: El umbral de un tercio se basa en la suposición de que cada respuesta incremental representa la activación de una sola unidad motora. Si la amplitud de cualquier respuesta incremental excede un tercio de la amplitud combinada de los diez incrementos, sugiere que la respuesta puede no ser atribuible únicamente a la activación de una sola unidad motora. En cambio, podría estar influenciado por el reclutamiento de unidades motoras adicionales o la presencia de actividad inespecífica, como ruido eléctrico o artefactos22,26.
      6. Para estimar la amplitud media de los SMUP, promedie los valores de los 10 incrementos. Otro método para medir la amplitud media del SMUP es dividir toda la amplitud de la respuesta incremental final por el número total de incrementos11.
    3. Determine MUNE dividiendo la amplitud CMAP máxima (pico a pico) por la amplitud media del SMUP (pico a pico). En ciertos sistemas electrofisiológicos, los SMUP se registran en microvoltios (μV), mientras que el CMAP generalmente se expresa en milivoltios (mV). Si es necesario, convierta las mediciones CMAP y SMUP a las mismas unidades antes de calcular MUNE.
      NOTA: Los sistemas de electromiografía de la clínica suelen calcular automáticamente el CMAP de pico a pico, el SMUP promedio y el MUNE de forma automática):
      figure-protocol-1
      CMAP = Potencial de Acción Muscular Compuesto
      SMUP = Potencial de una sola unidad de motor
      MUNE = Estimación del número de unidades motoras

Resultados

Las técnicas CMAP, SMUP y MUNE descritas en este informe permiten el registro de la función neuromuscular en el músculo del diafragma mediante la colocación de electrodos mínimamente invasivos (Figura 1). Los parámetros de amplitud y área se pueden emplear para caracterizar el tamaño supramáximo del CMAP, proporcionando una medida general de la producción del grupo muscular (Figura 2). Sin embargo, en nuestros métodos actuales, nos basamos en la amplitud para cuantificar los tamaños de CMAP y SMUP. CMAP, SMUP y MUNE se pueden utilizar para medir la función neuromuscular en varios modelos de ratas de enfermedad neuromuscular. Para demostrar la pérdida de MU en el contexto de la degeneración de MN, las ratas se sometieron a una inyección intrapleural bilateral con CTB-SAP (25 μg) para dirigirse a las MN frénicas y CTB extra (25 μg), y las ratas control recibieron CTB (25 μg) y SAP (25 μg) no conjugados1,27.

En la Figura 3, se comparan los hallazgos en una rata control adulta y una rata adulta (12 semanas) siete días después de la inyección intrapleural de CTB-SAP. Después de la inyección intrapleural de CTB-SAP, MUNE se reduce a 60 unidades motoras funcionales estimadas en comparación con los hallazgos normales de 74 unidades motoras funcionales en la rata control. Sin embargo, la amplitud del CMAP en la rata CTB-SAP (14,25 mV pico a pico) mostró cambios mínimos en comparación con el control (14,5 mV pico a pico) probablemente debido a la brotación colateral. En la Figura 4, el diafragma CMAP, SMUP y MUNE se adquirieron bilateralmente y se promediaron al inicio/preinyección (n = 14), así como 7 (n = 14), 14 (n = 14), 21 (n = 6) y 28 (n = 14) días después de la inyección. En la Figura 4 no se encontraron diferencias basales entre los grupos. MUNE mostró un cambio significativo para el tiempo (p < 0.05), CTB-SAP (p < 0.001) y el tiempo de interacción x CTB-SAP (p < 0.01) con una reducción de ~40% de MUNE en ratas CTB-SAP. El promedio de SMUP de las ratas CTB-SAP demostró un cambio significativo con el tiempo (p < 0.05) y CTB-SAP (p < 0.01), pero no hubo interacción significativa con un aumento de ~50-60% en la amplitud del SMUP. El CMAP no mostró cambios significativos.

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Figura 1: Colocación de electrodos. El cátodo estimulante (A) y el ánodo (B) se insertan subcutáneamente en el cuello lateral entre los músculos escaleno anterior y medio a una distancia aproximada de 1 cm. El electrodo "activo" (E1) (C) y el electrodo registrador "de referencia" (E2) (D) se colocan sobre la línea medioclavicular inferior al último borde de la costilla, siguiendo el ángulo entre la apófisis xifoides y el último cartílago costesternal. Además, (E) un electrodo de disco desechable está situado en la cola como tierra para minimizar los artefactos. Creado con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Potencial de acción muscular compuesto. Ilustración de una respuesta CMAP representativa registrada en el músculo hemidiafragma izquierdo. La amplitud de pico a pico CMAP se determina desde el voltaje pico negativo hasta el voltaje pico positivo. Abreviatura: CMAP = Potencial de acción muscular compuesto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Dos registros representativos de CMAP y MUNE de una rata control y una rata adulta siete días después de la inyección intrapleural de CTB-SAP. (A) Potencial de acción muscular del compuesto frénico izquierdo (CMAP) en una rata adulta de control (12 semanas de edad) con amplitud de pico a pico de 14,5 mV. Sensibilidad de la pantalla = 1 mV/división y duración de la pantalla 1 ms/división. (B) Diez respuestas incrementales subsiguientes con una amplitud total de 1.940 mV se dividen por 10 para determinar el tamaño promedio de SMUP (0.194 mV). Sensibilidad de pantalla = 0,2 mV/división y velocidad de barrido de 1 ms/división. MUNE calculado = 74 (MUNE = CMAP/SMUP promedio (14,5 mV/ 0,194 mV)) (C) CMAP frénico siete días después de la inyección de CTB-SAP que casi no muestra cambios en la amplitud pico a pico de CMAP 14,25 mV. Sensibilidad de la pantalla = 1 mV/división y velocidad de barrido de 1 ms/división. (D) Diez respuestas incrementales subsiguientes con una amplitud total de pico a pico de 2,360 mV divididas por 10 para obtener un tamaño medio de SMUP de 0,236 mV. Sensibilidad de la pantalla = 0,2 mV/división y una velocidad de barrido de 1 ms/división. Por lo tanto, el MUNE calculado fue de 60. Abreviaturas: CMAP = potencial de acción muscular compuesto; MUNE = estimación del número de unidades motoras; CTB-SAP = fragmento de toxina B del cólera conjugado con saporina; SMUP = potencial de una sola unidad de motor. *Ilustra el artefacto causado por la estimulación eléctrica; Es importante notar que debido al contraste entre la amplitud del estímulo eléctrico y el CMAP, así como las respuestas incrementales, graficamos solo una parte del estímulo. Se han utilizado colores amigables para cegueras para mejorar la visualización de las respuestas incrementales para mejorar la accesibilidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Evaluación electrofisiológica de CMAP, SMUP y MUNE tras CTB-SAP. No se encontraron diferencias basales entre los grupos (siete ratas macho de 11 semanas de edad en los grupos CTB-SAP y control). (A) CMAP no mostró cambios significativos. (B) El promedio de SMUP de las ratas CTB-SAP mostró un cambio significativo a lo largo del tiempo (p < 0.05) y con CTB-SAP (p < 0.01), sin interacción significativa, lo que indica un aumento del 50-60% en la amplitud del SMUP. (C) Siete días después de la inyección de CTB-SAP, la MUNE media disminuyó significativamente en un 27,07%, de 102,58 ± 20,54 a 72,43 ± 15,59 unidades motoras funcionales estimadas (media ± DE). Esta reducción persistió, con una disminución adicional de 11.75% a 28 días (MUNE: 60.64 ± 11.33, p < 0.01). Todas las mediciones al inicio del estudio, 7, 14 y 28 días después de la inyección se obtuvieron de 14 ratas, con n = 7 ratas inyectadas con CTB-SAP conjugado y n = 7 ratas que recibieron CTB y SAP no conjugados como grupo de control. Se utilizaron seis ratas el día 21. Los datos de CMAP, SMUP y MUNE se presentan como media, y las comparaciones se realizaron mediante ANOVA de dos vías. Los asteriscos indican diferencias en varios puntos temporales: *p < 0,05 y **p < 0,01. Abreviaturas: CMAP = potencial de acción muscular compuesto; MUNE = estimación del número de unidades motoras; CTB-SAP = fragmento de toxina B del cólera conjugado con saporina; SMUP = potencial de una sola unidad de motor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

En las enfermedades degenerativas de la EM, como la ELA, es crucial evaluar las UM implicadas en la ventilación28. A pesar de la ocurrencia de degeneración respiratoria por MN en pacientes con ELA, el inicio específico y la progresión de la muerte por MN siguen siendo incompletamente comprendidos 29,30,31. Reconociendo la importancia de este aspecto, se han empleado varios modelos, tanto genéticos (p. ej., SOD1 2,32) como no genéticos (p. ej., inyección intrapleural CTB-SAP 3,27,33), para emular la insuficiencia respiratoria en modelos animales de enfermedades neurodegenerativas. En consecuencia, la identificación de un biomarcador para el diagnóstico, el seguimiento y la evaluación de los posibles efectos del tratamiento es ventajosa para estos modelos. Además, los biomarcadores pueden facilitar la traslación clínica de los hallazgos de la investigación preclínica.

Para cuantificar el número de MNs inervantes en modelos degenerativos de roedores, se han empleado diferentes técnicas de marcaje, incluyendo trazadores retrógrados y adenovirus 25,34,35,36. Anteriormente, la inmunohistoquímica se ha utilizado para marcar las neuronas motoras frénicas en el asta anterior de la médula espinal cervical 2,3,33. Las técnicas de etiquetado, si bien son valiosas para las evaluaciones de MN, tienen limitaciones para evaluar la funcionalidad de las UM y no son adecuadas para las evaluaciones longitudinales37. Las evaluaciones electrofisiológicas objetivas son cruciales para el éxito de la traducción entre especies, especialmente teniendo en cuenta las pronunciadas diferencias estructurales en las características funcionales y anatómicas de los sistemas motores entre humanos y roedores38,39. La incorporación de las diferencias neurobiológicas presenta un desafío para trasladar los hallazgos de los modelos de roedores a los pacientes. MUNE supera estos obstáculos al servir como una medida electrofisiológica objetiva de la función de la MN, permitiendo la evaluación de la conectividad funcional de la MU como biomarcador en experimentos de modelos degenerativos de MN 3,40.

CMAP, SMUP y MUNE se emplean comúnmente en estudios de investigación y para evaluar pacientes con trastornos neuromusculares 9,10,11. Estos biomarcadores potenciales son mínimamente invasivos, lo que permite la evaluación longitudinal de la función dentro del mismo individuo a lo largo del tiempo. Es importante destacar que, si bien no miden directamente la activación o el reclutamiento de la MU por parte de las MN corticales, sí proporcionan una estimación clínicamente relevante de la integridad de la MN y su contraparte funcional, la MU. Los modelos de roedores de enfermedades degenerativas de MN son cruciales para comprender los mecanismos fisiopatológicos que subyacen a las enfermedades humanas y para el avance preclínico de tratamientos efectivos. El desarrollo de medidas de resultado y biomarcadores que sean traducibles a todas las especies puede simplificar y acelerar la traslación de los hallazgos preclínicos prometedores a los ensayos clínicos11. Dada la relativa complejidad de las medidas, hemos adaptado y refinado estas técnicas desde las extremidades de rata hasta el músculo del diafragma. Esta traducción se ha presentado en un formato visual para facilitar una mayor utilización e implementación en estudios con ratas.

Según nuestra experiencia, los sistemas de electrodiagnóstico clínico son adecuados para los estudios descritos en este contexto. Esta idoneidad se deriva de la mejora de la ergonomía en la interfaz entre el examinador y el sistema de electrodiagnóstico, lo que facilita un control cómodo. En nuestro grupo de laboratorio, utilizamos un sistema de dos canales con dos canales amplificadores no conmutados. Estos canales están equipados con un convertidor de analógico a digital de 24 bits y funcionan a una frecuencia de muestreo de 48 kHz por canal. La ganancia de hardware es ajustable dentro de un rango de 10 nV a 100 mV por división. Empleamos un filtro de baja frecuencia con un rango que abarca de 0,2 Hz a 5 kHz, y los ajustes del filtro de alta frecuencia cubrieron un rango de 30 Hz a 10 kHz. Además, utilizamos un estimulador de corriente constante con una intensidad ajustable que oscilaba entre 0 y 100 mA y una duración de 0,02 a 1 ms. La mayoría de los sistemas clínicos ofrecen características comparables que son adecuadas para registrar las respuestas de CMAP, SMUP y MUNE. Estos sistemas se pueden ajustar en consecuencia para garantizar un registro preciso de los datos deseados. Por ejemplo, la amplitud del CMAP se puede evaluar de base a pico y de pico a pico. Los sistemas de electrodiagnóstico clínico a menudo se utilizan de forma predeterminada para evaluar la base a la cresta, que se calcula desde la línea de base isoeléctrica hasta el pico negativo inicial.

El proceso de obtención de respuestas CMAP, SMUP y MUNE del diafragma implica varios pasos cruciales. La colocación constante y precisa de los electrodos, junto con una profundidad adecuada de los electrodos, es esencial para medir de forma fiable las amplitudes y minimizar los ruidos de fondo durante la grabación. La colocación incorrecta de los electrodos estimulantes puede tener consecuencias no deseadas. La colocación de electrodos estimulantes demasiado atrás puede dar lugar a contracciones exageradas de los músculos de las extremidades anteriores hasta la excitación del plexo braquial, mientras que la colocación a un nivel superior al C4 puede dificultar la estimulación del nervio frénico. La colocación más profunda conlleva el riesgo de lesionar la arteria carótida o evocar el nervio vago, lo que puede causar problemas de conductividad cardíaca. Colocando electrodos de registro más arriba o más abajo que la última costilla, pueden ocurrir mediciones de estimulación intercostal o recto abdominal, respectivamente. Para evitar la grabación de otros músculos, observe que el pico negativo del diafragma de latencia CMAP suele ser de 1,5 a 3,5 ms, y su forma característica se muestra en la Figura 2. Nuestras observaciones indicaron que los electrodos de aguja producen registros CMAP, SMUP y MUNE más consistentes en comparación con los electrodos en forma de disco para el músculo del diafragma. Esta consistencia mejorada se atribuye a la forma de cúpula del músculo del diafragma y a la presencia de otros músculos en las proximidades, como los músculos intercostales y rectos abdominales. Además, la colocación flexible de los electrodos de aguja es otro factor ventajoso. En cuanto a la intensidad de la estimulación eléctrica, se utilizó un rango de 60 a 100 mA para estimular el nervio frénico, lo que supera los rangos reportados para otros sistemas motores. Esta diferencia surge de la ubicación más profunda del nervio frénico en el cuello en comparación con las ubicaciones más superficiales del nervio ciático y el plexo braquial en la extremidad posterior y la extremidad anterior, respectivamente.

La obtención del SMUP promedio plantea mayores desafíos técnicos en comparación con CMAP. El tamaño de respuesta más pequeño, en el rango de microvoltios en lugar de milivoltios, hace que el impacto del ruido de fondo sea más pronunciado. Para mitigar el ruido de fondo, considere optimizar la ubicación de los electrodos ajustando el electrodo de tierra, el cátodo y el ánodo. Además, asegúrese de que haya una interferencia mínima de los dispositivos eléctricos cercanos en la configuración experimental. Una jaula de Faraday, comúnmente utilizada en aplicaciones de electrofisiología intracelular, no es necesaria para esta configuración. La identificación visual de las respuestas individuales de SMUP es una habilidad desafiante que requiere práctica para obtener resultados consistentes y repetibles. Como el diafragma es un músculo dinámico, la línea de base puede cambiar con cada ciclo de ventilación. Estar atento a los incrementos del SMUP para garantizar la alineación con el SMUP anterior es un factor crítico para superar este desafío. Además, es importante asegurarse de que los SMUP se inicien dentro del período de tiempo de latencia del CMAP máximo para obtener grabaciones precisas.

Otro desafío del registro del diafragma es la naturaleza asimétrica de este músculo, caracterizado por grosores variables de izquierda a derecha e influenciado por la presión ejercida por el hígado en el lado derecho41. Para abordar esto, realizamos mediciones electrofisiológicas por separado en los hemidiafragmas izquierdo y derecho. A continuación, calculamos los promedios de las respuestas de CMAP, SMUP y MUNE por separado.

Dado que la respuesta CMAP refleja la despolarización colectiva de las fibras musculares en un músculo específico, cualquier patología que afecte la MN frénica a la fibra muscular del diafragma puede resultar en una reducción en el tamaño de la CMAP. Por lo tanto, el cálculo del CMAP promedio de los hemidiafragmas bilaterales ofrece una excelente evaluación del estado funcional general del sistema neuromuscular respiratorio. Los cambios compensatorios, como la brotación colateral, pueden conducir a la preservación del tamaño del CMAP incluso en presencia de MN o pérdida axonal motora11. El registro de incrementos individuales permite estimar la producción media de MU individuales (tamaño de SMUP), presentando información más detallada sobre el estado funcional de las UM del sistema respiratorio. Por lo tanto, la técnica MUNE se vuelve esencial para evaluar la entrada de los MN frénicos o axones al diafragma. La aplicación de estos biomarcadores en experimentos preclínicos de terapias para el estudio de enfermedades con MN tiene el potencial de mejorar la traslación a ensayos clínicos.

Divulgaciones

WDA ha recibido fondos de investigación de NMD Pharma, Avidity Biosciences y honorarios de consultoría de NMD Pharma, Avidity Biosciences, Dyne Therapeutics, Novartis, Design Therapeutics, Catalyst Pharmaceuticals y Novartis.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por una subvención del Programa de Investigación de Lesiones/Enfermedades de la Médula Espinal del Programa de Investigación de Lesiones/Enfermedades de la Médula Espinal de Missouri (NLN y WDA).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Jeringa de vidrio de 2 mLKent Scientific CorporationSOMNO-2ML
50 mL, jeringa modelo 705 RNHamilton Company7637-01Utilizada para realizar inyección intrapleural
5008 - Formulab DietLabDiet0001325
Agujas esterilizables en autoclave de 26 g (26S RN 9,52 mm 40 grados)Hamilton Company7804-04Utilizado para realizar la inyección intrapleural
Subunidad B de la toxina del cólera (CTB)MilliporeSigmaC9903Utilizado para la inyección intrapleural para marcar las neuronas motoras supervivientes
Subunidad B de la toxina del cólera conjugada con la saporina (CTB-SAP)Sistemas avanzados de focalizaciónIT-14Utilizado para la inyección intrapleural para causar la muerte de las neuronas motoras
Cable desmontableTechnomed202845-0000para conectar el electrodo registrador a la máquina de electrodiagnóstico
Electrodo de disco desechable de 2" x 2" con cablesCadwell302290-000electrodo de tierra
agujas monopolares desechables 28 GTechnomed202270-000electrodos estimuladores de cátodo y ánodo- electrodos de registro
Cable de aguja EMG (caja de interruptores Amp/stim)Cadwell190266-200para conectar electrodos monopolares al estimulador electrodiagnóstico
Helping Hands pinza de cocodrilo con base de hierroRadio Shack64-079Mantenimiento de la colocación de electrodos de registro 
Isoflurano (frasco de 250 ml)Piramal Healthcare
jeringa irrigadora monoyecta de punta curvaCovidien81412012utiliza para la aplicación de gel de electrodos
Sistema de monitoreo fisiológico PhysioSuite con calentamiento homeotérmico RightTempKent Scientific CorporationPS-RTIncluye almohadilla calefactora infrarroja, sonda rectal y sonda de temperatura de la almohadilla
Recortadora Pro Pet Kit de aseoOster078577-010-003maquinillas para depilación
Saporin (SAP)Sistemas de Focalización AvanzadosPR-01Utilizado para inyección intrapleural (agente de control cuando se inyecta solo)
Sistema EMG Sierra SummitCadwell Industries, Inc., Kennewick, WAsistema de electrodiagnóstico portátil
SomnoSuite Sistema de anestesia digital de bajo flujoKent Scientific CorporaciónSOMNOIncluye adaptador antiderrame y antivapor para la tapa de la botella; Tubo adaptador en Y; filtro de barrido de carbón
vegetal rata Sprague-DawleyColonia Envigo 208a, Indianápolis, IN
Ungüento oftálmico veterinario a base de petróleo Puralube26870aplicado durante la anestesia para evitar lesiones en la córnea

Referencias

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