En este estudio, presentamos un método in vivo para estimar el número y el tamaño de la unidad motora para cuantificar la conectividad de la unidad motora de diafragma de rata. Se describe un enfoque paso a paso de estas técnicas.
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Artículo de método
Evaluación de las medidas de resultado de la conectividad de la unidad motora del diafragma de rata como biomarcadores cuantitativos de la degeneración y compensación de las neuronas motoras frénicas
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Resumen
Resumen
La pérdida de la función muscular ventilatoria es una consecuencia de la lesión de la neurona motora y la neurodegeneración (por ejemplo, lesión de la médula espinal cervical y esclerosis lateral amiotrófica, respectivamente). Las neuronas motoras frénicas son el eslabón final entre el sistema nervioso central y el músculo, y sus respectivas unidades motoras (grupos de fibras musculares inervadas por una sola neurona motora) representan la unidad funcional más pequeña del sistema ventilatorio neuromuscular. El potencial de acción muscular compuesto (CMAP), el potencial de unidad motora única (SMUP) y la estimación del número de unidades motoras (MUNE) son enfoques electrofisiológicos establecidos que permiten la evaluación longitudinal de la integridad de la unidad motora en modelos animales a lo largo del tiempo, pero se han aplicado principalmente a los músculos de las extremidades. Por lo tanto, los objetivos de este estudio son describir un enfoque en estudios preclínicos con roedores que se pueda utilizar longitudinalmente para cuantificar el MUNE frénico, el tamaño de la unidad motora (representado como SMUP) y CMAP, y luego demostrar la utilidad de estos enfoques en un modelo de pérdida de neuronas motoras. Los biomarcadores sensibles, objetivos y traslacionalmente relevantes para la lesión, degeneración y regeneración neuronal en lesiones y enfermedades de las neuronas motoras pueden ayudar significativamente y acelerar los descubrimientos de la investigación experimental para las pruebas clínicas.
Introducción
Las neuronas motoras frénicas (MN), que se extienden desde los niveles de miotoma C3 hasta C6, forman el enlace final desde el sistema nervioso central (SNC) hasta el músculo del diafragma1. Las unidades motoras frénicas (UM) están compuestas por una sola MN espinal y sus fibras musculares diafragmáticas inervadas, formando la unidad funcional más pequeña del sistema neuromuscular respiratorio. La función ventilatoria requiere una contracción adecuada del músculo diafragma lograda a través de la activación coordinada de la piscina frénica MU 2,3. Muchas enfermedades neurológicas, incluida la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), provocan una insuficiencia ventilatoria grave, lo que en última instancia contribuye a la causa de la muerte4.
Se pueden emplear varios enfoques electrofisiológicos para evaluar y monitorear la integridad del grupo de la unidad motora (MU) in vivo. El potencial de acción muscular compuesto (CMAP) refleja la despolarización sumada de todas las fibras musculares en un músculo o grupo muscular específico después de la estimulación de los nervios periféricos y es sensible a una variedad de afecciones neuromusculares, incluida la ELA 5,6 y la atrofia muscular espinal (AME)7,8,9. Una limitación de la evaluación de CMAP es que la germinación de colaterales puede conducir a un mantenimiento de la amplitud y el área de CMAP incluso en presencia de pérdida de MU10. Para superar esta limitación, se han realizado modificaciones en la técnica CMAP para evaluar tanto el número de unidades motoras como el tamaño11. Además, un estudio in vivo que investigó la evaluación funcional del CMAP del diafragma mediante un sistema electrofisiológico sugirió que también puede ser factible utilizar la técnica de registro CMAP del diafragma descrita para la estimación del número de unidades motoras12.
La técnica de estimación incremental del número de unidades motoras (MUNE) fue introducida inicialmente a principios de la década de 1970 por McComas et al. para el músculo extensor corto de los dedos en humanos13. El enfoque MUNE incremental fue una modificación de la técnica tradicional de registro CMAP durante la cual se administró una estimulación gradualmente creciente para registrar incrementos submáximos cuánticos, de todo o nada, como índices de respuestas de una sola unidad motora. Los incrementos sumados y promediados se utilizaron para calcular una estimación del tamaño de un potencial de unidad de motor (SMUP). Este tamaño calculado se dividió en la amplitud del CMAP para estimar el número de MU que inervaban el músculo examinado11. MUNE demuestra una alta sensibilidad en la detección y monitorización de la pérdida de unidad motora, lo que permite la identificación de la disfunción de la unidad motora antes de cambios observables en medidas como la amplitud del CMAP o el área14,15. En los pacientes con ELA, MUNE ha demostrado ser excepcionalmente sensible, sirviendo como un biomarcador destacado para el inicio, la progresión y el pronóstico de la enfermedad16,17.
Se han desarrollado y utilizado ampliamente numerosas adaptaciones de MUNE para evaluar la función de MU en condiciones como la neurodegeneración, la lesión neuronal y el proceso natural de envejecimiento 18,19,20,21. Desde la descripción inicial, se han empleado diversas adaptaciones que utilizan tanto respuestas electrofisiológicas como mediciones de fuerza incremental (mecánicas) tanto en estudios humanos como en modelos animales22. MUNE proporciona una evaluación funcional no invasiva de la conectividad de las neuronas motoras con el músculo. La aplicación longitudinal de MUNE permite comprender la progresión de la enfermedad o del fenotipo inducido y evaluar los efectos protectores o regenerativos de las intervenciones terapéuticas, tanto en el ámbito clínico como en el preclínico. Independientemente de la efectividad de las medidas de MUNE para la reproducibilidad y la relevancia clínica de la técnica para las piscinas de MU en la mayor parte del cuerpo humano, los esfuerzos se han centrado en gran medida en los músculos de las extremidades en los músculos de los roedores 10,23,24,25.
Por lo tanto, los objetivos de este estudio fueron describir un enfoque para la obtención del potencial de acción muscular compuesto (CMAP), el SMUP y el número de unidades motoras frénicas (MUNE) como evaluaciones in vivo que se pueden utilizar longitudinalmente en estudios preclínicos con roedores para cuantificar el MUNE, el tamaño de la unidad motora (representado como SMUP) y el CMAP. Además, presentamos datos representativos que destacan la pérdida del número de MU del diafragma tras la administración intrapleural de un agente degenerativo frénico MN, el fragmento B de la toxina del cólera conjugado con saporina (CTB-SAP).
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Protocolo
Todos los procedimientos fueron aprobados y llevados a cabo de acuerdo con las pautas establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Missouri. Los experimentos se realizaron en ratas Sprague-Dawley macho adultas, de 11 a 15 semanas de edad. Estas ratas se alojaron en parejas y se mantuvieron bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12:12, con acceso a alimentos peletizados comerciales estándar y agua tratada con HCl disponible en todo momento.
1. Preparación de animales y administración de anestesia
- Use equipo de protección personal adecuado mientras manipula ratas.
- Administrar anestésico inhalatorio con isoflurano al 3-5%, asegurando una correcta inducción. Una vez que la rata esté adecuadamente anestesiada, colóquela en posición supina y mantenga la anestesia con isoflurano inhalado al 1-3%. Verifique la suficiencia de la profundidad de la anestesia aplicando suavemente presión sobre la almohadilla del pie de la extremidad posterior con fórceps para asegurarse de que no haya respuesta de retirada.
NOTA: Según el tamaño y el peso de la rata, controle la profundidad de la anestesia y ajuste la concentración de isoflurano en consecuencia. - Mantenga la temperatura de 37 °C utilizando una placa calefactora termostática para evitar variaciones de temperatura que puedan afectar la amplitud y la latencia del CMAP.
- Aplique un ungüento veterinario a base de petróleo en los ojos para prevenir la sequedad. Controle la profundidad de la anestesia observando la frecuencia respiratoria y verificando las respuestas de retirada al aplicar presión a la almohadilla para los pies con pinzas.
- Extraer el vello del tercio inferior del pecho y el cuello para estudiarlo con una maquinilla. Monitorea la respiración de la rata durante todo el experimento.
NOTA: Después de las grabaciones de CMAP y MUNE y la interrupción de la anestesia, no deje a la rata desatendida hasta que haya recuperado la conciencia suficiente. No regrese al animal a la jaula doméstica hasta que esté completamente recuperado.
2. Colocación y configuración de electrodos
- Coloque un par de electrodos de aguja monopolar de 28 G para registrar el CMAP, el SMUP y el MUNE como se muestra en la Figura 1.
- Colocar el electrodo de aguja activo (E1) por vía subcutánea sobre la línea clavicular media inferior al último borde de la costilla, y el electrodo de aguja de referencia (E2) por vía subcutánea en el ángulo entre la apófisis xifoidea y el último cartílago esternocostal.
NOTA: Los electrodos de aguja no deben insertarse en el músculo del diafragma; En su lugar, deben colocarse en la zona subcutánea.
- Colocar el electrodo de aguja activo (E1) por vía subcutánea sobre la línea clavicular media inferior al último borde de la costilla, y el electrodo de aguja de referencia (E2) por vía subcutánea en el ángulo entre la apófisis xifoidea y el último cartílago esternocostal.
- Para la estimulación del nervio frénico en la lámina carotídea, se utilizan un par de electrodos de aguja monopolares de 28 G como cátodo y ánodo para la estimulación nerviosa y se colocan subcutáneamente sobre el cuello lateral entre los músculos escaleno anterior y medio, separados por aproximadamente 1 cm. Asegúrese de que la colocación de las agujas estimulantes esté al nivel por debajo de la cuarta vértebra cervical (C4).
NOTA: Evite insertar los electrodos estimulantes demasiado profundo para evitar lesiones en el nervio frénico u otra estructura. La Figura 1 ilustra la colocación de los electrodos. - Para el electrodo de tierra, coloque un electrodo de superficie desechable en la cola.
3. Adquisición de datos
- CMAP frénico
- Registre las respuestas frénicas de CMAP mediante la aplicación de pulsos monofásicos catódicos de onda cuadrada con una duración de 0,1 ms y una intensidad que oscila entre 60 y 100 mA para estimular el nervio frénico.
- Obtener respuestas CMAP mientras se incrementa progresivamente la intensidad del estímulo hasta que la amplitud de la respuesta deja de mostrar un mayor aumento. Para asegurar la estimulación supramáxima, aumente la intensidad del estímulo a aproximadamente el 120% del nivel utilizado para provocar una respuesta máxima y registre una respuesta adicional. Si el tamaño de CMAP ya no aumenta, considere esta respuesta como el CMAP máximo.
NOTA: Es preferible administrar estimulación durante la exhalación para minimizar el ruido de la actividad muscular concurrente durante la grabación de CMAP. - Mida y documente las amplitudes pico a pico del CMAP en milivoltios (mV) (Figura 2).
NOTA: La amplitud del CMAP se puede evaluar de base a pico y de pico a pico. Los sistemas de electrodiagnóstico clínico a menudo se utilizan de forma predeterminada para evaluar la base a la cresta, que se calcula desde la línea de base isoeléctrica hasta el pico negativo inicial.
- Tamaño medio del potencial de una sola unidad de motor (SMUP) y cálculo de MUNE
- Calcule el tamaño medio del SMUP utilizando una técnica de estimulación incremental.
- Para provocar respuestas incrementales, administre estimulación submáxima con una duración de 0,1 ms a una frecuencia de 1 Hz, aumentando gradualmente la intensidad en incrementos de 0,03 mA hasta que se logre una respuesta mínima de todo o nada. Adquirir la respuesta inicial con una intensidad de estímulo comprendida entre 2 mA y 10 mA.
- Si la respuesta inicial no se produce con una intensidad de estímulo entre 2 mA y 10 mA, modifique la posición del cátodo estimulador, ya sea acercándolo o alejándolo del nervio frénico en el cuello, para disminuir o aumentar la intensidad del estímulo necesaria, respectivamente.
- Si la primera respuesta incremental se logra con una intensidad de estímulo que oscila entre 2 mA y 10 mA, guarde la primera respuesta y adquiera incrementos adicionales con intensidades de estímulo progresivamente más altas, ajustando en incrementos de 0,03 mA, para lograr un total de 9 incrementos adicionales que cumplan los siguientes criterios en el paso 3.2.2.
NOTA: Cada SMUP se cuantifica restando cada incremento del incremento anterior.
- Al medir las respuestas incrementales, asegúrese de que cada incremento cumpla con los siguientes criterios:
- Asegúrese de que el pico negativo inicial de las respuestas incrementales se alinee temporalmente con el pico negativo de la respuesta CMAP máxima.
NOTA: Los ligeros movimientos observados debido al ruido de fondo de los ciclos respiratorios son inherentes a la naturaleza del experimento. Sin embargo, la presencia constante de SMUP durante la observación en vivo confirma su identidad para ese CMAP específico. - Como el diafragma es un músculo dinámico involucrado en la respiración, cada ciclo de respiración puede inducir un movimiento basal. Por lo tanto, verifique la estabilidad y la ausencia de fraccionamiento en cada respuesta incremental confirmando la consistencia en tres respuestas duplicadas.
NOTA: Para distinguir los potenciales evocados de baja amplitud, especialmente el primer SMUP, del ruido de fondo debido a la actividad respiratoria, es importante permanecer alerta y observar durante 3-4 ciclos respiratorios. También asegúrese de que los picos estén alineados con los del CMAP para mayor precisión. - Asegúrese de que cada incremento sea distinto y mayor que el anterior. Por lo tanto, distinga visualmente las respuestas incrementales en tiempo real, observándolas a medida que se superponen a los incrementos registrados anteriormente.
NOTA: Se pueden realizar múltiples réplicas del estímulo en cada amplitud para garantizar la coherencia en los incrementos y el cumplimiento de los criterios predefinidos. - Después de verificar visualmente cada incremento con los criterios antes mencionados, confirme que la amplitud del incremento sea de al menos 25 μV. Si el incremento es inferior a 25 μV, descarte la medición y vuelva a evaluar la respuesta.
- Después de registrar 10 respuestas incrementales, verifique que la amplitud de cada respuesta incremental no sea superior a un tercio de la amplitud combinada de los 10 incrementos, lo que representa la amplitud total de la respuesta final. Si no se cumple este criterio, repita la medición de las 10 respuestas incrementales.
NOTA: El umbral de un tercio se basa en la suposición de que cada respuesta incremental representa la activación de una sola unidad motora. Si la amplitud de cualquier respuesta incremental excede un tercio de la amplitud combinada de los diez incrementos, sugiere que la respuesta puede no ser atribuible únicamente a la activación de una sola unidad motora. En cambio, podría estar influenciado por el reclutamiento de unidades motoras adicionales o la presencia de actividad inespecífica, como ruido eléctrico o artefactos22,26. - Para estimar la amplitud media de los SMUP, promedie los valores de los 10 incrementos. Otro método para medir la amplitud media del SMUP es dividir toda la amplitud de la respuesta incremental final por el número total de incrementos11.
- Asegúrese de que el pico negativo inicial de las respuestas incrementales se alinee temporalmente con el pico negativo de la respuesta CMAP máxima.
- Determine MUNE dividiendo la amplitud CMAP máxima (pico a pico) por la amplitud media del SMUP (pico a pico). En ciertos sistemas electrofisiológicos, los SMUP se registran en microvoltios (μV), mientras que el CMAP generalmente se expresa en milivoltios (mV). Si es necesario, convierta las mediciones CMAP y SMUP a las mismas unidades antes de calcular MUNE.
NOTA: Los sistemas de electromiografía de la clínica suelen calcular automáticamente el CMAP de pico a pico, el SMUP promedio y el MUNE de forma automática):
CMAP = Potencial de Acción Muscular Compuesto
SMUP = Potencial de una sola unidad de motor
MUNE = Estimación del número de unidades motoras
- Calcule el tamaño medio del SMUP utilizando una técnica de estimulación incremental.
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Resultados
Las técnicas CMAP, SMUP y MUNE descritas en este informe permiten el registro de la función neuromuscular en el músculo del diafragma mediante la colocación de electrodos mínimamente invasivos (Figura 1). Los parámetros de amplitud y área se pueden emplear para caracterizar el tamaño supramáximo del CMAP, proporcionando una medida general de la producción del grupo muscular (Figura 2). Sin embargo, en nuestros métodos actuales, nos basamos en la amplitud para cu...
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Discusión
En las enfermedades degenerativas de la EM, como la ELA, es crucial evaluar las UM implicadas en la ventilación28. A pesar de la ocurrencia de degeneración respiratoria por MN en pacientes con ELA, el inicio específico y la progresión de la muerte por MN siguen siendo incompletamente comprendidos 29,30,31. Reconociendo la importancia de este aspecto, se han empleado vario...
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Divulgaciones
WDA ha recibido fondos de investigación de NMD Pharma, Avidity Biosciences y honorarios de consultoría de NMD Pharma, Avidity Biosciences, Dyne Therapeutics, Novartis, Design Therapeutics, Catalyst Pharmaceuticals y Novartis.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por una subvención del Programa de Investigación de Lesiones/Enfermedades de la Médula Espinal del Programa de Investigación de Lesiones/Enfermedades de la Médula Espinal de Missouri (NLN y WDA).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Jeringa de vidrio de 2 mL | Kent Scientific Corporation | SOMNO-2ML | |
| 50 mL, jeringa modelo 705 RN | Hamilton Company | 7637-01 | Utilizada para realizar inyección intrapleural |
| 5008 - Formulab Diet | LabDiet | 0001325 | |
| Agujas esterilizables en autoclave de 26 g (26S RN 9,52 mm 40 grados) | Hamilton Company | 7804-04 | Utilizado para realizar la inyección intrapleural |
| Subunidad B de la toxina del cólera (CTB) | MilliporeSigma | C9903 | Utilizado para la inyección intrapleural para marcar las neuronas motoras supervivientes |
| Subunidad B de la toxina del cólera conjugada con la saporina (CTB-SAP) | Sistemas avanzados de focalización | IT-14 | Utilizado para la inyección intrapleural para causar la muerte de las neuronas motoras |
| Cable desmontable | Technomed | 202845-0000 | para conectar el electrodo registrador a la máquina de electrodiagnóstico |
| Electrodo de disco desechable de 2" x 2" con cables | Cadwell | 302290-000 | electrodo de tierra |
| agujas monopolares desechables 28 G | Technomed | 202270-000 | electrodos estimuladores de cátodo y ánodo- electrodos de registro |
| Cable de aguja EMG (caja de interruptores Amp/stim) | Cadwell | 190266-200 | para conectar electrodos monopolares al estimulador electrodiagnóstico |
| Helping Hands pinza de cocodrilo con base de hierro | Radio Shack | 64-079 | Mantenimiento de la colocación de electrodos de registro |
| Isoflurano (frasco de 250 ml) | Piramal Healthcare | ||
| jeringa irrigadora monoyecta de punta curva | Covidien | 81412012 | utiliza para la aplicación de gel de electrodos |
| Sistema de monitoreo fisiológico PhysioSuite con calentamiento homeotérmico RightTemp | Kent Scientific Corporation | PS-RT | Incluye almohadilla calefactora infrarroja, sonda rectal y sonda de temperatura de la almohadilla |
| Recortadora Pro Pet Kit de aseo | Oster | 078577-010-003 | maquinillas para depilación |
| Saporin (SAP) | Sistemas de Focalización Avanzados | PR-01 | Utilizado para inyección intrapleural (agente de control cuando se inyecta solo) |
| Sistema EMG Sierra Summit | Cadwell Industries, Inc., Kennewick, WA | sistema de electrodiagnóstico portátil | |
| SomnoSuite Sistema de anestesia digital de bajo flujo | Kent Scientific Corporación | SOMNO | Incluye adaptador antiderrame y antivapor para la tapa de la botella; Tubo adaptador en Y; filtro de barrido de carbón |
| vegetal rata Sprague-Dawley | Colonia Envigo 208a, Indianápolis, IN | ||
| Ungüento oftálmico veterinario a base de petróleo | Puralube | 26870 | aplicado durante la anestesia para evitar lesiones en la córnea |
Referencias
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