El protocolo presenta dos metodologías para mejorar el aislamiento de bacterias intestinales anaerobias. El primero se centra en el aislamiento de una amplia gama de bacterias utilizando diferentes medios de cultivo. El segundo se centra en los pasos de cultivo de un grupo microbiano específico, posiblemente asimilando mioinositol, para comprender completamente su significado ecológico.
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Artículo de método
Estrategias para mejorar el cultivo de bacterias anaeróbicas del tracto gastrointestinal de pollo
En este artículo
Resumen
Resumen
El tracto gastrointestinal (TGI) del pollo es un ecosistema complejo que alberga billones de microbios que desempeñan un papel fundamental en la fisiología, la digestión, la absorción de nutrientes, la maduración del sistema inmunitario y la prevención de la intrusión de patógenos del huésped. Para una salud y productividad óptimas de los animales, es imperativo caracterizar estos microorganismos y comprender su función. Si bien el TGI de las aves de corral contiene un reservorio de microorganismos con posibles aplicaciones probióticas, la mayor parte de la diversidad permanece inexplorada. Para mejorar nuestra comprensión de la diversidad microbiana no cultivada, se requieren esfuerzos concertados para llevar estos microorganismos al cultivo. El aislamiento y el cultivo de microorganismos colonizadores de GIT producen material reproducible, incluidas células, ADN y metabolitos, que ofrecen nuevos conocimientos sobre los procesos metabólicos en el medio ambiente. Sin el cultivo, el papel de estos organismos en su entorno natural sigue siendo poco claro y limitado a un nivel descriptivo. Nuestro objetivo es implementar estrategias de cultivo destinadas a mejorar el aislamiento de una amplia gama de microbios anaeróbicos del TGI del pollo, aprovechando el conocimiento multidisciplinario de la fisiología animal, la nutrición animal, la metagenómica, la bioquímica de los piensos y las estrategias modernas de cultivo. Además, nuestro objetivo es implementar el uso de prácticas adecuadas para el muestreo, el transporte y la preparación de los medios, que se sabe que influyen en el éxito del aislamiento. Las metodologías apropiadas deben garantizar un entorno constante sin oxígeno, condiciones atmosféricas óptimas, una temperatura de incubación adecuada del huésped y la provisión de requisitos nutricionales específicos en consonancia con sus necesidades distintivas. Al seguir estas metodologías, el cultivo no solo producirá resultados reproducibles para el aislamiento, sino que también facilitará los procedimientos de aislamiento, fomentando así una comprensión integral del intrincado ecosistema microbiano dentro del TGI del pollo.
Introducción
El resurgimiento del cultivo en el estudio de microorganismos ha complementado los conocimientos de los estudios metagenómicos al proporcionar material para probar hipótesis metabólicas que anteriormente solo se describían y cuantificaban parcialmente. El cultivo de bacterias intestinales proporciona material para sustentar futuras investigaciones sobre las interacciones microbiano-huésped, facilitar estudios de colonización dirigidos y mejorar los estudios de interacción molecular 1,2,3. Los conocimientos adquiridos sobre los microorganismos....
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Protocolo
El protocolo se divide en cuatro partes: muestreo, aislamiento bacteriano, identificación y conservación de los microorganismos obtenidos. Los permisos aprobados para el uso de animales fueron emitidos por la comisión de ética de Regierungspräsidium Tübingen, Alemania, con los números de aprobación HOH50/17 TE y HOH67-21TE.
1. Obtención de muestras para el cultivo de bacterias anaerobias
- Mantenimiento de animales
- Mantener a los animales con una dieta comercial ad libitum a base de maíz (Legehennen/Junghennenfutter; ver Tabla de Materiales) y alojar....
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Resultados
Monitoreo de las condiciones anaeróbicas durante el transporte
Debido a la adición de resazurina sódica, el cambio en el color de la solución de transporte a rosa antes de la transferencia de la muestra al tubo indica una interrupción o falla en el mantenimiento de las condiciones anaeróbicas. Por lo tanto, se abstuvo de utilizar el tubo que mostraba cambio de color durante el transporte y solo se utilizaron los tubos que no mostraban cambio de color, como se puede ver en la Figur.......
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Discusión
El propósito de esta metodología es mejorar el cultivo de bacterias intestinales anaeróbicas mediante la mejora de la calidad de las condiciones de muestreo, el procesamiento de muestras y la formulación y preparación de medios. Las condiciones fisicoquímicas de las muestras (pH, disponibilidad de carbono, nitrógeno y cofactores) deben tenerse en cuenta a la hora de formular los medios de cultivo. En comparación con las colecciones de cultivos bacterianos obtenidas de cerdos, humanos o r.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen ningún interés financiero o personal contrapuesto relacionado con el trabajo reportado en este guión.
Agradecimientos
Los autores reconocen el programa de asociación Rehovot-Hohenheim y la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SE 2059/7-2. Este proyecto se desarrolló como parte de la unidad de investigación P-FOWL (FOR 2601).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ácido acético | VWR | 20104.334 | |
| Agar | VWR | 97064-332 | |
| Cloruro de amonio | Carl Roth | P726.1 | |
| Estación anaeróbica | Don Whitley Scientific | A35 HEPA | |
| Ácido butírico | Merck | 8.0045.1000 | |
| Cloruro de calcio dihidratado | VWR | 97061-904 | |
| Centrífuga | Eppendorf | 5424R | |
| Lisozima de pollo (Muramidasa) | VWR | 1.05281.0010 | |
| Cisteína | VWR | 97061-204 | |
| Dextrosa | VWR | 90000-908 | |
| Hidrogenofosfato dipotásico | Carl Roth | P749.1 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | |
| Legehennen/ Junghennenfutter | Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Dü sseldorf, | Alemania-MagAttract | |
| HMW DNA Kit | Qiagen | 67563 | |
| Cloruro de magnesio | Carl Roth | 2189.1 | |
| Gas mezclado (80% N2 (nivel de calidad 5.0), 15% CO2 (nivel de calidad 3.0) y 5% H2 (nivel de calidad 5.0) | Westfalen Gase GmbH, | Alemania-Mutanolysin | |
| , recombinante (liofilizado) | A& A Biotechnology | 1017-10L | |
| Myo-inositol | Carl Roth | 4191.2 | |
| PBS 1X | ChemSolute | 8418.01 | |
| Fosfato de dihidrógeno de potasio | Carl Roth | 3904.2 | |
| Ácido propiónico | Carl Roth | 6026.1 | |
| QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2671 | |
| RNAse A | QIAGEN Ribonucleasa A (RNasa A) | 19101 | |
| Cloruro de sodio | VWR | 27800.291 | |
| Resazurina sódica | VWR | 85019-296 | |
| Tioglicolato de sodio | Sigma-Aldrich | 102933 | |
| Peptona de soja, sin OMG, sin animales | VWR | 97064-186 | |
| Termociclador | Bio-Rad | T100 | |
| Triptona | Carl Roth | 8952.1 | |
| Tween80 | Carl Roth | 9139.2 | |
| Mezcla de vitaminas (suplemento) | VWR | 968290NL | |
| Vortex | Star Lab | 07127/92930 | |
| Extracto de levadura | Carl Roth | 9257.05 | |
| β-D-fructosa | VWR | 53188-23-1 |
Referencias
- Wylensek, D., et al. A collection of bacterial isolates from the pig intestine reveals functional and taxonomic diversity. Nat Comm. 11 (1), 6389(2020).
- Medvecky, M., et al. Whole genome sequen....
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Reimpresiones y permisos
