Cuantificación no destructiva de aflatoxinas y fitoalexinas estilbenoides basadas en SPE-UPLC en maní individual (Arachis spp.) Semillas

Resumen

Demostramos un método de rendimiento medio para la cuantificación de aflatoxinas y fitoalexinas estilbenoides en semillas individuales de maní utilizando cromatografía líquida de ultra rendimiento. Este método fue desarrollado específicamente para el análisis de especies silvestres de Arachis desafiadas por la especie aflatoxigénica Aspergillus .

Resumen

Las aflatoxinas son metabolitos secundarios altamente cancerígenos de algunas especies fúngicas, en particular Aspergillus flavus. Las aflatoxinas a menudo contaminan productos agrícolas de importancia económica, incluidos los cacahuetes, lo que representa un alto riesgo para la salud humana y animal. Debido a la estrecha base genética, los cultivares de maní demuestran una resistencia limitada a los patógenos fúngicos. Por lo tanto, numerosas especies de maní silvestre con tolerancia a Aspergillus han recibido una consideración sustancial por parte de los científicos como fuentes de resistencia a enfermedades.

La exploración del germoplasma vegetal en busca de resistencia a las aflatoxinas es difícil, ya que la acumulación de aflatoxinas no sigue una distribución normal, lo que dicta la necesidad de analizar miles de semillas de maní individuales. Las semillas de maní (Arachis spp.) suficientemente hidratadas, cuando están infectadas por especies de Aspergillus , son capaces de producir estilbenos biológicamente activos (estilbenoides) que se consideran fitoalexinas defensivas. Los estilbenos de maní inhiben el desarrollo de hongos y la producción de aflatoxinas. Por lo tanto, es crucial analizar las mismas semillas para los estilbenoides del maní para explicar la naturaleza de la resistencia/susceptibilidad de las semillas a la invasión de Aspergillus . Ninguno de los métodos publicados ofrece análisis de una sola semilla para aflatoxinas y/o fitoalexinas de estilbeno.

Intentamos satisfacer la demanda de un método que sea respetuoso con el medio ambiente, que utilice consumibles baratos y que sea sensible y selectivo. Además, el método no es destructivo, ya que utiliza solo la mitad de la semilla y deja intacta la otra mitad que contiene el eje embrionario. Dicha técnica permite la germinación y el crecimiento de la planta de maní hasta la madurez completa a partir de la misma semilla utilizada para el análisis de aflatoxinas y estilbenoides. La parte integrada de este método, el desafío manual de las semillas con Aspergillus, es un paso limitante que requiere más tiempo y trabajo en comparación con otros pasos del método. El método se ha utilizado para la exploración de germoplasma silvestre de Arachis con el fin de identificar especies resistentes a Aspergillus y para determinar y caracterizar nuevas fuentes de resistencia genética a este patógeno fúngico.

Introducción

El cacahuete (Arachis hypogaea L.) es uno de los principales cultivos alimentarios del mundo. Se cultiva en más de 100 países con una producción total que supera los 45 millones de toneladas¹. Los productos agrícolas, como el maní, el maíz y la semilla de algodón, a menudo son invadidos por especies de Aspergillus, hongos nacidos^{en el suelo} que producen aflatoxinas. Estos productos son particularmente susceptibles a la contaminación por aflatoxinas antes de la cosecha cuando las condiciones ambientales se caracterizan por altas temperaturas y sequía. Las aflatoxinas se encuentran entre los carcinógenos más potentes que se^conocen. Contaminan una cuarta parte de los productos agrícolas del mundo⁴ , lo que hace que aproximadamente la mitad de la población mundial esté expuesta crónicamente a las aflatoxinas⁵. Debido a su alta carcinogenicidad y toxicidad, la presencia de aflatoxinas en los alimentos está regulada en los límites más bajos prácticamente aceptables en la mayoría de los países del mundo⁶.

La Unión Europea (UE) ha legislado un nivel máximo de 2 ng/g para la aflatoxina_B1 y de 4 ng/g para las aflatoxinas totales (_B1,_B2,_G1 y_G2) en los productos de consumo humano⁷. Estos límites tan bajos ejercen una presión sustancial sobre la agricultura y la industria alimentaria que procesa productos contaminados con aflatoxinas. El monitoreo de las aflatoxinas y el reprocesamiento de los cacahuetes contaminados pueden considerarse una estrategia pasiva y costosa para evitar que las aflatoxinas ingresen a la cadena alimentaria. Es por eso que todos los segmentos principales de la industria del maní experimentan enormes pérdidas de ganancias debido a la contaminación por aflatoxinas de los cultivares de maní actuales que a menudo demuestran una resistencia limitada a las enfermedades fúngicas. Un enfoque prospectivo para resolver el problema de las aflatoxinas es obtener cultivares de maní resistentes a los hongos a través de la introgresión de genes, es decir, la transferencia de información genética de especies de maní silvestre resistentes a cultivares de élite. En los últimos años ^8,9, las especies silvestres de maní han recibido una consideración sustancial como fuentes de resistencia genética a enfermedades debido a que la estrecha base genética de los cacahuetes cultivados ya no puede proporcionar el nivel necesario de rasgos de resistencia a la planta de maní^10,11. La introgresión exitosa de especies silvestres de maní requiere el análisis de miles de semillas individuales, pequeñas y escasas (Figura 1A) ¹².

Figura 1: Diagrama de flujo de análisis de una sola semilla. (A) Tamaño comparativo de diferentes cultivares de maní de tipo comercial frente a Arachis spp. silvestre (1) Virginia; (2) corredor; (3) español; (4) Arachis spp. silvestre (B) Arachis spp. silvestre (lámina A, semilla 4) cortada en tres secciones, (5) media semilla con eje embrionario; esta porción de la semilla se utiliza para cultivar una planta (E). (C) Las partes (6) y (7) se perforan con una broca y (D) se inoculan con esporas de hongos. Después de la incubación durante 72 h a 30 °C, una de las partes de la semilla, (6) o (7) se utiliza para los análisis de aflatoxinas y fitoalexinas, y otra se utiliza para la secuenciación de ARN/transcriptoma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La resistencia del maní a patógenos fúngicos está fuertemente asociada con las fitoalexinas 13,14,15,16,17. Las fitoalexinas del maní están representadas por estilbenoides antimicrobianos que se biosintetizan y acumulan en los tejidos vegetales después de la exposición a estímulos exógenos, en particular, a la invasión de hongos 16,17,18. La acumulación rápida de concentraciones suficientes de fitoalexinas en el sitio de la invasión fúngica es inhibidor del crecimiento fúngico y es fundamental para la defensa de las plantas 19,20,21. El patógeno deja de crecer cuando las fitoalexinas se acumulan a concentraciones inhibitorias^16,22. El papel de los estilbenoides como compuestos defensivos contra hongos aflatoxigénicos en maní fue evaluado hace más de 30 años en experimentos de campo¹³. Esos experimentos apoyaron claramente la hipótesis de que los estilbenoides del maní son un factor de resistencia crucial en la contaminación por aflatoxinas antes de la cosecha. Esas pruebas se basan en el hecho de que los estilbenos se producen naturalmente en los cacahuetes dañados en el campo; los estilbenos demuestran una actividad biológica apreciable contra los hongos aflatoxigénicos; Y la contaminación por aflatoxinas en las semillas solo se detectó cuando los cacahuetes perdieron la capacidad de síntesis de fitoalexinas debido a la deshidratación de las semillas inducida por la sequía. Otro conjunto de experimentos de campo confirmó la asociación entre la producción de fitoalexinas y la resistencia del genotipo del maní a enfermedades del maní de importancia agrícola¹⁷.

Una mejor comprensión del mecanismo natural de resistencia del maní a la invasión fúngica basado en fitoalexinas es una estrategia prometedora para el control de la contaminación por aflatoxinas^15,17.Por lo tanto, además de los análisis de aflatoxinas, es importante analizar cuantitativamente las mismas semillas para las fitoalexinas. Aunque este mecanismo de resistencia no se ha investigado ni comprendido completamente, es crucial para el mejoramiento y la modificación genética de las plantas de maní para obtener nuevos cultivares resistentes a los hongos²³. A pesar de la existencia de diversos procedimientos analíticos para la determinación de aflatoxinas en diferentes productos, sigue siendo necesario contar con métodos sencillos para la investigación específica, en particular cuando los métodos tradicionales no satisfacen los requisitos analíticos y rentables. Los métodos de limpieza más modernos utilizados por la industria del maní, la agricultura y los laboratorios privados son los dispositivos basados en anticuerpos²⁴ y los dispositivos de inmunoensayo 25,26,27. Son selectivos y sensibles, pero sustancialmente más caros que las minicolumnas repletas de adsorbentes comunes. Además, ninguno de esos métodos fue diseñado para el análisis de muestras de pocos miligramos de peso. Sobre la base de nuestra investigación previa sobre el uso analítico de minicolumnas empaquetadas en gel de sílice magnésico (Florisil)²⁸, modificamos este procedimiento para adaptarlo a las necesidades de los programas de premejoramiento y mejoramiento en curso y prospectivos.

El propósito de este trabajo fue desarrollar un método no destructivo, de rendimiento medio y respetuoso con el medio ambiente para la determinación cuantitativa de aflatoxinas y fitoalexinas en semillas individuales de maní. Este método ya se ha desarrollado. Sus ventajas sobre los métodos publicados son una mayor sensibilidad, la capacidad de analizar aflatoxinas y fitoalexinas en un extracto de una sola semilla, la falta de necesidad de pesar las muestras y un menor costo gracias a volúmenes más pequeños de consumibles. El diagrama de flujo del método integrado se muestra en la Figura 1. Los análisis genéticos y otros pasos se mencionan en este texto y se demuestran en la figura para mostrar la importancia del método sugerido y cómo se integra con todo el procedimiento.

Protocolo

1. Preparación de semillas para el desafío fúngico

1. Incubar el Aspergillus flavus NRRL 3357 aflatoxigénico en una inclinación de agar patata dextrosa (PDA) en un tubo de ensayo durante 6 días a 30 °C. Recolectar las esporas de hongos del tubo de ensayo con 10 mL de agua con Tween 20 (100 μL de Tween en 1 L de agua estéril destilada), filtrar a través de lana de vidrio colocada en un embudo y contar las esporas con un hemocitómetro consultando el manual del usuario.
2. Diluir la suspensión de esporas con agua estéril hasta una concentración de 1.000 esporas/μL. Confirme la concentración con un hemocitómetro.
   NOTA: Prepare la suspensión de esporas no antes de 2 horas antes de los desafiantes experimentos.
3. Rompe suavemente las vainas de maní y retira las cáscaras. Coloque las semillas en un vaso de precipitados estéril de modo que el volumen de semillas no supere 1/5 del volumen del vaso de precipitados, añada una solución de peróxido de hidrógeno al 0,05 % hasta aproximadamente el 70 % del volumen del vaso de precipitados y deje que las semillas absorban agua durante 3 h.
4. Decanta la solución de peróxido de hidrógeno de las semillas y añade aproximadamente 3 veces la cantidad de una mezcla de etanol y agua al 80% (v/v) en el vaso de precipitados para cubrir las semillas. Deje reposar durante 1 minuto y luego enjuague las semillas 2 veces con volúmenes iguales de agua destilada estéril.
5. Agregue 5 veces el volumen de peróxido de hidrógeno al 3% al vaso de precipitados con las semillas esterilizadas con etanol y déjelo reposar durante 5 minutos, luego decantar el líquido y enjuagar las semillas dos veces con volúmenes iguales de agua estéril (Figura 2A).

Figura 2: Preparación de semillas de maní para inoculación, incubación y extracción de fracciones de aflatoxina y fitoalexina. (A) Esterilización de semillas empapadas con peróxido de hidrógeno al 3%; (B) quitar la testa (piel) de las semillas; (C) cortar la parte del eje embrionario; (D,E) cavidad de perforación en un medio cotiledón con una broca; (F) colocar partes perforadas de semillas en agar; (G) Aplicación de esporas de hongos en la cavidad perforada. (H) Placa de Petri con semillas después de la incubación; (I) colocación de semillas individuales incubadas (foto de muestras de control) en tubos de cuentas reforzadas; (J) adición del volumen medido de solvente de extracción; (K) pulverización de muestras en un rompedor de perlas; (L) centrifugación de lodos pulverizados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Coloque las semillas sobre una toalla de papel estéril, retire la testa de la semilla con pinzas y corte aproximadamente 1/3 de la semilla que contiene el eje embrionario con un bisturí (Figura 2B, C).
7. Deseche esta parte de la semilla o úsela para cultivar una planta en un tubo de ensayo con medio de crecimiento (Figura 1B, E).
8. Divida la porción restante de la semilla en dos cotiledones, colóquelos en una placa de Petri, cubra las partes de la semilla con papel de filtro estéril húmedo, vuelva a colocar la tapa para evitar la deshidratación y proceda rápidamente a la etapa de inoculación.
9. Antes de realizar los experimentos desafiantes, prepare un número suficiente de placas de Petri con medio de incubación de semillas vertiendo 26 ml de agar estéril al 1,5% en agua en las placas de 100 x 15 mm y deje que se solidifiquen durante la noche.
10. En el centro del lado exterior de cada cotiledón restante, haga una cavidad de 1,5-2 mm de profundidad perforando manualmente la semilla con una broca afilada estéril de 1,6-2,34 mm de diámetro. Se necesitan ~ 2-5 s para hacer una cavidad (Figura 2D, E).
11. Coloque de 4 a 6 piezas "perforadas" de las semillas en una placa de Petri con agar y aplique 2 μL de la suspensión de 1.000 esporas/μL en la cavidad perforada de cada pieza de medio cotiledón con una pipeta de 10 μL. En lugar de la suspensión de esporas, aplique agua estéril a las semillas de control (Figura 2F, G).
12. Cubra todas las placas de Petri con tapa e incube a 30 °C sin luz durante 72 h.

2. Toma de muestras y preparación de las piezas de semillas incubadas para el análisis de aflatoxinas y fitoalexinas

1. Recoja los trozos de semilla a las 72 h retirándolos del agar con pinzas y colocando cada uno de ellos en viales de perlas de 7 ml etiquetados con 13 perlas de cerámica de circonio (12 de 2,8 mm de diámetro y 1 de 6,5 mm de diámetro) (Figura 2H,I).
   NOTA: En este punto, si no se procesan inmediatamente, los viales pueden colocarse en un congelador a -80 °C y conservarse hasta 2 meses antes de continuar con el procesamiento.
2. Las fitoalexinas y las aflatoxinas se determinan en el mismo extracto de semilla. Para la extracción, dependiendo del tamaño visual de la semilla (pequeña, mediana o grande), agregue 2 o 4 mL de mezcla de metanol-agua medida con precisión (90:10, v/v) a los viales de perlas y pulverize a 5,5 m/seg durante 45 s. Coloque los viales con semillas pulverizadas en una centrífuga y centrifuga a 1.860 × g durante 3 min (Figura 2J - L).
   NOTA: Se determinan los siguientes derivados importantes de^17,22 estilbenoides (todos en transconfiguración): resveratrol, araquidina-1, araquidina-2, araquidina-3, 3′-isopentadienil-3,5,4′-trihidroxiestilbeno (IPD) y SB-1.
3. Para los análisis de aflatoxinas, antes de realizar los experimentos desafiantes, prepare un número suficiente de columnas de limpieza de la siguiente manera. Coloque una frita porosa de polietileno (20 μL) a juego en una columna de polipropileno de 1,5 mL con la ayuda de una varilla de vidrio cortada en un ángulo de 90^° . Coloque 50 mg del gel de sílice de magnesio (malla 100-200) en la columna con una cuchara hecha a medida y cubra la columna con una frita idéntica empujándola hacia abajo con una varilla de vidrio (Figura 3A - E).
   NOTA: Esta cantidad de gel de sílice magnésica ocupa un volumen de 75 μL y la altura de la capa adsorbente es de 3 mm.

Figura 3: Preparación de columnas de limpieza y filtros. (A,B) Colocación de una frita porosa en el barril; (C,D) barril de llenado con gel de sílice magnésica; (E) empaquetando el adsorbente e insertando una frita porosa superior en el barril. (F) Colocar un círculo de fibra de vidrio de 11,5 mm de diámetro encima de una pipeta Pasteur. (G,H) Empujar el centro del círculo con una varilla de plástico o madera hasta el fondo del cilindro de la pipeta Pasteur y compactar firmemente la fibra de vidrio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. En este punto, prepare un número coincidente de filtros personalizados como se muestra en la Figura 3F - H.
5. Para los análisis de aflatoxinas, mida con precisión hasta 0,5 mL de alícuota del sobrenadante (obtenida como se describe en el paso 2.2), transfiéralo a la minicolumna empaquetada a medida y deje que el extracto se drene por gravedad en un vial de vidrio de 4 mL. Transfiera 1,0 mL de mezcla de metanol-agua (90:10, v/v) a la columna para lavar las impurezas por gravedad en el mismo vial de 4 mL (Figura 4A).

Figura 4: Purificación de extractos de semillas y preparación para los análisis de UPLC. (A) Bastidor con columnas empaquetadas. (B) Disolvente evaporante con gas N₂ de seis viales de 4 mL con extracto purificado eluido de columnas de limpieza. (C) Llevar los viales y filtros a una temperatura bajo cero en recipientes de espuma (1 y 2) con hielo antes y después de la adición del solvente de inyección (MeOH-H₂O 9:1, v/v) a los viales de 4 mL. (D) Filtrado de extracto enfriado de un vial de 4 ml en un vial de muestreador automático de 400 μl. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Deseche los eluidos combinados. Eluir la fracción de aflatoxina por gravedad desde la columna en un vial de vidrio limpio de 4 mL con una mezcla de 1,2 mL de acetona-acetonitrilo-agua-88% de ácido fórmico (65:31:3.5:0,5, v/v) (Figura 4A).
7. Alternativamente, eluya las aflatoxinas de la columna con 2,0 mL de mezcla de acetonitrilo-agua-88% de ácido fórmico (96:3.5:0.5, v/v), e inyecte una alícuota del eluido, hasta 2 μL, directamente en el sistema de cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) (sin evaporación del solvente con N₂).
   NOTA: En este caso, espere un límite de cuantificación hasta 10 veces menor para las aflatoxinas; En la mayoría de los casos, tal disminución de la sensibilidad es aceptable ya que las concentraciones de aflatoxinas en las semillas desafiadas suelen ser altas.
8. Retire el disolvente de los viales en un chorro de N₂ en un bloque calentado a 45 °C. Tape el vial y colóquelo en un recipiente con hielo picado durante 30-45 s para minimizar la evaporación del solvente que se agrega en el siguiente paso. Coloque los filtros hechos a medida en tubos de ensayo desechables e inserte los tubos en hielo en otro recipiente para minimizar la evaporación del solvente durante la filtración (Figura 4B, C).
9. Después de la evaporación del disolvente, disuelva el residuo seco en 0,25-1,0 mL de mezcla de metanol y agua (90:10, v/v) y vórtice durante 1-2 s. Coloque los viales con extractos purificados en el muestreador automático UPLC e inyecte de 0.1 a 3.0 μL en el sistema UPLC (Figura 5A, B).
   NOTA: Si se sospecha que la solución después del vórtice tiene algunas partículas en suspensión, filtre la solución a través del filtro enfriado (Figura 4D).

Figura 5: El proceso y los resultados de los análisis UPLC de extractos purificados. (A) Colocación de un estante con extractos de muestras purificados en el muestreador automático UPLC. (B) Realizar los análisis instrumentales, obtener datos e interpretar los resultados. (C) UPLC de cuatro aflatoxinas principales; los principales picos de interés, las aflatoxinas_B1 y_B2 representan 0,04 y 0,004 ng, respectivamente. (D) UPLC de aflatoxinas B₁ y B₂; el pico 2 representa la aflatoxina B₁ a un nivel de 2 pg (con una celda de flujo de 8 μL). (E) UPLC de extracto purificado de una semilla cosechada de un campo local de maní con una especie silvestre de Arachis . (F) UPLC del extracto de una semilla de maní desafiada purificada con una minicolumna básica de óxido de aluminio. (G) UPLC del extracto de semilla de maní desafiada purificada con una columna de Florisil; el cromatograma azul presenta impurezas que se lavan de la columna con 1 mL de mezcla de metanol-agua (90:10 v/v); el cromatograma negro muestra picos de aflatoxinas M₁ y B₁. El nivel de aflatoxina B₁ es de 48 ng/g. (H) Cromatograma típico de estilbenoides de maní de una semilla desafiada; abreviatura: IPD = 3′-isopentadienil-3,5,4′-trihidroxiestilbeno. Nota: Todos los estilbenoides en los extractos de semillas están en transconfiguración. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

10. Para los análisis de fitoalexinas, transfiera 200 μL de sobrenadante al filtro de pipeta Pasteur mencionado anteriormente. Utilice gas N₂ de un tanque de nitrógeno comprimido para acelerar la filtración en un vial de muestreador automático UPLC de 400 μL y tape el vial con una tapa correspondiente con un tabique de PTFE (Figura 4D).

3. Análisis de aflatoxinas

1. Para las separaciones de aflatoxinas en extractos de semillas, utilice un sistema UPLC equipado con un muestreador automático, una bomba cuaternaria, un detector fluorescente, un UPLC BEH C18 de 3,0 mm x 100 mm, columna de 1,7 μm con una precolumna correspondiente y un reactor fotoquímico de postcolumna (PHRED) con una bobina de PTFE tejida estándar de 0,25 de diámetro interno cortada al 25% de su longitud original.
   NOTA: El instrumento UPLC y el equipo asociado utilizado por los autores se enumeran en la Tabla de Materiales.
2. Utilice agua (A), metanol (B) y acetonitrilo (C) en el siguiente gradiente: condiciones iniciales, 62,7% A, 24% B, 13,3% C, cambiaron linealmente a 30% A, 45% B, 25% C en 3,75 min, cambiaron a 0% A, 64,4% B, 35,6% C en 3,751 min, se mantuvieron isocráticas durante 3,249 min, luego cambiaron a condiciones iniciales en 0,01 min y se mantuvieron isocráticas durante 2,499 min antes de la siguiente inyección. Ajuste el caudal a 0,45 mL/min y el tiempo de ejecución a 9,5 min. Mantenga la columna a 40 °C en el calentador de columna del sistema. Utilice 362 nm y 440 nm como longitudes de onda de excitación y emisión, respectivamente, para la cuantificación de las aflatoxinas B₁, B₂, G₁, G₂ y M₁ . Las estructuras de las principales aflatoxinas se muestran en la Figura 6A.
   NOTA: En las condiciones experimentales, solo se espera que las aflatoxinas B₁ y B₂ sean producidas por A. flavus NRRL 3357; si se utiliza una cepa de A. parasiticus para el desafío de semillas, se espera la producción de aflatoxinas B₁, B₂, G₁ y G₂ .
3. Determine las concentraciones de aflatoxinas por referencia a las áreas pico de los patrones auténticos correspondientes (curva de calibración) como se describe en el manual del usuario del software.
   NOTA: Dado que el procedimiento UPLC exhibe ruido de referencia en los ajustes de alta sensibilidad para el detector fluorescente, el límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ) para aflatoxinas se evalúan utilizando la relación señal-ruido ampliamente aceptada de 3:1 para LOD y 10:1 para LOQ. En la configuración experimental de rutina para el análisis de semillas de maní, descrita en las secciones 2 y 3, se espera que los límites de cuantificación para las aflatoxinas G₁ y B₁ sean menores o iguales a 0,8 y 0,08 ng/g para las aflatoxinas G₂ y B₂, respectivamente.

4. Análisis de fitoalexinas estilbenoides

1. Para la separación de estilbenoides, use agua (A), metanol (B) y 88% de ácido fórmico (C) en el siguiente gradiente: condiciones iniciales, 53% A, 42% B, 5% C, cambiaron linealmente a 35% A, 60% B, 5% C en 2.0 min, se mantuvieron isocráticos durante 4 min, cambiaron a 0% A, 95% B, 5% C en 0.5 min, se mantuvieron isocráticos durante 2.5 min, Luego cambió a las condiciones iniciales en 0,1 min y se mantuvo isocrático durante 2,9 min antes de la siguiente inyección. Ajuste el caudal a 0,5 mL/min y el tiempo de ejecución a 12,0 min.
2. Determine las concentraciones de estilbenoides por referencia a las áreas de pico de los patrones auténticos correspondientes (curva de calibración) y/o a los coeficientes publicados de extinciones molares como se describe en el manual de usuario del software. Las estructuras de las principales fitoalexinas derivadas del estilbeno se muestran en la Figura 6B.
   NOTA: La separación de las fitoalexinas se logra utilizando el mismo sistema pero sin un detector fluorescente y un reactor PHRED. En su lugar, se utiliza un detector de matriz de diodos para la detección y cuantificación de estilbenoides de maní. El límite de cuantificación (LOQ) para las principales fitoalexinas estilbenoides no tiene un significado práctico, ya que las concentraciones de estilbenoides superan las concentraciones de aflatoxinas en el mismo extracto en algunos órdenes de magnitud; Después de 3 días de incubación, los estilbenoides se cuantifican de forma fiable.

Resultados

El método desarrollado para la cuantificación de aflatoxinas en semillas es el núcleo de todo el procedimiento de evaluación de especies de maní silvestre para determinar su resistencia a la acumulación de aflatoxinas. Las minicolumnas y los filtros empaquetados a medida proporcionan ahorros sustanciales y simplifican el procedimiento general debido a la falta de grandes volúmenes de solventes, filtros comerciales costosos e innecesarios de 0,22 o 0,45 μm y dispositivos de bombeo. El método para los análisis de aflatoxinas proporciona altas recuperaciones, exactitud y precisión dentro del rango probado de 1.0-50.0 ng/g de aflatoxinas de semillas molidas, como se ve en la Tabla 1. Las muestras altamente contaminadas se diluyeron hasta el valor lineal de ensayo. La Figura 5C muestra una separación de referencia de cuatro aflatoxinas principales, B₁, B₂, G₁ y G₂ dentro de un tiempo de elución de 5 min, lo cual es aceptable ya que el desafío fúngico de las semillas de maní es la etapa limitante del procedimiento y no los análisis UPLC.

El método propuesto es suficientemente sensible, con un límite de cuantificación de 2 pg para la aflatoxina_B1 (Figura 5D). La alta pureza de los extractos permite una cuantificación inequívoca de las aflatoxinas como se ve a partir de un UPLC (Figura 5E) de extracto purificado de semillas cosechadas en un campo con una especie de Arachis silvestre. Un método de minicolumna publicado anteriormente²⁹ no es capaz de lograr una pureza satisfactoria para las semillas de maní desafiadas por hongos (Figura 5F) en comparación con el método propuesto (Figura 5G). A partir de la Figura 5F es obvio que las aflatoxinas B₂, G₁ y G₂ no se pueden detectar y cuantificar de manera confiable debido a la presencia de altas concentraciones de impurezas interferentes, muchas de las cuales, eluidas después de las aflatoxinas, son fitoalexinas estilbenoides y metabolitos fúngicos. Por el contrario, la Figura 5G demuestra la alta eficiencia de la columna de gel de sílice de magnesio en la eliminación de impurezas de la fracción de aflatoxinas. El cromatograma azul presenta impurezas interferentes que se lavan de la columna con 1 mL de mezcla de metanol y agua (90:10); el cromatograma negro muestra picos no oscurecidos de las aflatoxinas M₁ y B₁. Este cromatograma representa el extracto de una semilla de una especie silvestre desafiada. El nivel de aflatoxina B₁ es de 48 ng/g.

La cuantificación de las fitoalexinas del maní es una valiosa adición a los análisis de aflatoxinas en la misma semilla, que puede ser una semilla natural de un campo o una semilla con hongos. La Figura 5H muestra un cromatograma típico de estilbenoides defensivos de maní de una semilla desafiada. La separación de los compuestos se logra utilizando la misma columna analítica que se utiliza para los análisis de aflatoxinas. La columna y las condiciones cromatográficas elegidas proporcionan una separación satisfactoria de los picos, lo que permite una cuantificación fiable de los estilbenoides. La evaluación de la relación aflatoxina-fitoalexina en semillas desafiadas está fuera del alcance de esta presentación y el método se sugiere aquí como una herramienta de investigación potencial, que se ha utilizado en el laboratorio de los autores durante varios años y ha demostrado ser útil.

Figura 6: Estructuras de las principales aflatoxinas y fitoalexinas de cacahuete derivadas del estilbeno. (A) Estructuras de las principales aflatoxinas: 1, B₁; 2, B₂; 3, G₁; 4, G₂. (B) Estructuras de las principales fitoalexinas de maní derivadas de estilbenos: 6, resveratrol; 7, araquidina-1; 8, araquidina-2; 9, araquidina-3; 10, IPD (3′-isopentadienil-3,5,4′-trihidroxiestilbeno); 11, SB-1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Nivelde espiga a (ng/g)	Aflatoxinas
	B1	B2	G1	G2
50	85.87 (0.97)	82.33 (0.67)	86.63 (2.89)	84.01 (0.86)
5	91.43 (2.76)	87.32 (0.47)	88.08 (2.08)	87.73 (0.77)
1	81.21 (3.16)	85.33 (1.98)	81.76 (4.66)	88.46 (3.24)

Tabla 1: Recuperación de aflatoxinas de semillas de maní utilizando la columna Florisil y 1,2 mL de la mezcla de elución de la fracción de aflatoxinas. [media (DE), %; n = 5]. Las muestras molidas libres de aflatoxinas (50 g) del cultivar de maní Georgia 06G se enriquecieron uniformemente con la ayuda de una microjeringa con solución de stock de aflatoxinas a un nivel de 50, 5 o 1 ng/g, y se dejaron a temperatura ambiente durante 16 h. ^a Se dan niveles de pico para las aflatoxinas B₁ y G₁; en el caso de las aflatoxinas_B2 y_G2 , se utilizará el factor de multiplicación de 0,33.

Discusión

Sobre la base de nuestra experiencia previa²⁸, hemos desarrollado un procedimiento químico sencillo, barato y respetuoso con el medio ambiente, adecuado para la exploración de colecciones de germoplasma silvestre de Arachis con el fin de identificar especies resistentes al Aspergillus y determinar y caracterizar nuevas fuentes de resistencia genética a este hongo oportunista. Este método se basa en la purificación del extracto de semillas mediante una técnica de extracción en fase sólida (SPE) y la cuantificación de aflatoxinas mediante cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) y se caracteriza por una recuperación, precisión y exactitud suficientemente altas. El método "Florisil" propuesto es una modificación del procedimiento de limpieza de una sola minicolumna que se basa en la propiedad única de Florisil (gel de sílice magnésica) para retener fuerte y selectivamente las aflatoxinas²⁸. Al igual que en el método original, las muestras de semillas se extrajeron con la mezcla MeOH-H₂O, pero en una proporción diferente de 90:10 (v/v) en comparación con el 80:20 (v/v) publicado. Este cambio ha aumentado el caudal de disolventes a través de la columna de limpieza hasta 2,5 veces con la misma tasa de recuperación de aflatoxinas. Esta mezcla de metanol y agua 90:10 (v/v) proporcionó una recuperación de casi el 100% de los estándares de aflatoxinas B₁, B₂, G₁ y G₂ agregados al solvente de extracción a niveles de pico equivalentes a 5-50 ng de concentraciones de aflatoxinas en 1 g de un sustrato, así como proporcionó recuperaciones suficientemente altas de las muestras de semillas de maní enriquecidas (Tabla 1).

Se ha demostrado que las aflatoxinas pueden eluirse del adsorbente Florisil solo con grandes volúmenes de acetona³⁰, acetona-metanol^31,32 y mezclas de acetona y agua 33,34,35,36. En el curso de la presente investigación, descubrimos que el acetonitrilo acidificado se comporta de manera similar a la acetona en su capacidad para eluir aflatoxinas de Florisil. Hasta donde sabemos, esta propiedad del acetonitrilo no ha sido reportada en la literatura. El descubrimiento de esta propiedad permite inyectar extracto purificado directamente en el sistema UPLC omitiendo la etapa de evaporación del solvente, lo que reduce sustancialmente el tiempo de preparación. Incluso cuando el acetonitrilo se mezcló con acetona (acetona-acetonitrilo-agua-88% de ácido fórmico (65:31:3.5:0.5, v/v)), proporcionó una eliminación suave, completa y rápida del agua de los eluidos purificados, reduciendo sustancialmente el tiempo de evaporación del solvente. La presencia de acetonitrilo permitió el uso de un solo solvente, una mezcla de metanol y agua (90:10, v/v) para eliminar eficazmente las impurezas de la columna Florisil en comparación con un método publicado, donde se requerían dos solventes de lavado adicionales, metanol y una mezcla de cloroformo y metanol. ²⁸

En promedio, la recuperación estándar de aflatoxina B₁ fue de ~98% cuando se usaron 1.2 mL para la elución de aflatoxinas. La cantidad de 50 mg de Florisil se seleccionó de manera que 1,2 mL del solvente de elución llenara la minicolumna hasta la parte superior del barril y, al mismo tiempo, proporcionara una recuperación satisfactoria (Tabla 1). Este enfoque acelera el procedimiento de limpieza, ya que el barril de la columna solo debe llenarse una vez. En las primeras etapas de este proyecto, no estaba claro si una fracción comercial de Florisil con un tamaño de partícula relativamente grande, malla 100-200, sería apropiada para una columna pequeña que contiene solo una capa de 3 mm del adsorbente. Por lo tanto, exploramos diferentes fracciones de Florisil obtenidas de un producto comercial de malla 100-200 utilizando tamices de prueba estándar de EE. UU. 120-140, 140-170, 170-200, 200-270, 270-400 y malla >400. Todas estas fracciones proporcionaron resultados reproducibles, casi iguales a los de una recuperación satisfactoria. Aunque las fracciones de tamaño de partícula más pequeñas mostraron bandas de aflatoxinas más estrechas en la columna bajo luz ultravioleta, esas fracciones no fueron superiores en ningún aspecto al producto comercial de malla 100-200. Además, la fracción de malla 100-200 demostró los tiempos de elución más cortos (8-12 min) durante todo el procedimiento.

La administración de solvente UPLC en gradiente permitió una separación satisfactoria de las aflatoxinas, así como la eliminación completa de las impurezas no polares de la columna (Figura 5G). Este enfoque condujo a un funcionamiento impecable de la columna y a resultados reproducibles de los análisis de cientos de muestras. La identidad de las aflatoxinas eluidas de la columna de Florisil se confirmó como se describió anteriormente. ²⁸ La columna analítica UPLC de 3 mm de diámetro utilizada aquí demostró una mayor selectividad y una separación más fiable de las aflatoxinas B₁, B₂, G₁ y G₂ a concentraciones más altas en comparación con la columna de 2,1 mm de diámetro de la misma química. Además, la longevidad de la columna de 3 mm (más de 1.200 inyecciones) fue sustancialmente mayor que la de la columna de 2,1 mm (hasta 800 inyecciones). A pesar de que la columna de 3 mm requirió una mayor tasa de la fase móvil (40% más), este inconveniente fue superado por las ventajas anteriores de la columna.

La minicolumna Florisil fue eficaz para la purificación de extractos de semillas de cacahuete muy contaminados con metabolitos de Aspergillus (Figura 5G); Dichas semillas también contenían altos niveles de fitoalexinas estilbenoides que fueron producidas por las semillas en respuesta a la invasión de hongos. Todas esas impurezas pueden exceder la concentración de aflatoxinas en las semillas hasta 10⁶ veces²², lo que hace que estas semillas sean objetos desafiantes para los análisis de aflatoxinas. La Figura 5G muestra la ausencia de picos de interferencia en el cromatograma dentro de los tiempos de retención de aflatoxinas, lo que hizo que la detección y cuantificación de aflatoxinas no se vieran comprometidas en todos los niveles probados (Tabla 1). Como se observa en la Tabla 1, la exactitud y precisión del método fueron suficientemente altas dentro del rango probado de 1,0-50,0 ng/g, que es también el rango más crítico para la detección de aflatoxinas. Las recuperaciones a diferentes niveles para varios genotipos de maní silvestre fueron uniformes y las desviaciones estándar para cinco extracciones diferentes fueron esencialmente bajas.

El método también se probó en semillas de maní, algodón, maíz y arroz contaminadas naturalmente desde cero hasta niveles extremadamente altos, más de 10,000 ng/g de aflatoxinas totales. La recuperación de aflatoxinas B₁, B₂, G₁ y G₂ del maíz, la semilla de algodón y el arroz a un nivel de 5 ng/g varió de 76,1% a 93,7%, 77,1% a 86,6% y 90,5% a 96,2%, respectivamente. La mayor recuperación de aflatoxinas del arroz fue acompañada por la "pureza" del eluyente, es decir, prácticamente la ausencia de impurezas. Además, el arroz representó el objeto más pequeño probado, en promedio, 19 mg/semilla.

El tiempo total de preparación de una sola semilla de maní (incluyendo descascarillado, pesaje, extracción, centrifugación y purificación) usando una columna Florisil no excedió los 20 minutos. El costo de la minicolumna Florisil es >10 veces menor que el de las columnas de limpieza comerciales. Los ahorros adicionales se derivan del uso de volúmenes más bajos de adsorbentes, solventes y gas nitrógeno en comparación con el procedimiento publicado²⁸. La minicolumna no requiere dispositivos de bombeo o vacío para funcionar y tiene una vida útil indefinida.

La exploración del germoplasma vegetal en busca de resistencia a las aflatoxinas es excepcionalmente difícil porque la acumulación de micotoxinas no sigue una distribución normal^37,38; Se necesita un gran número de análisis de aflatoxinas en semillas individuales para superar este fenómeno. Además del contenido de aflatoxinas, la información sobre la composición cuantitativa de fitoalexinas es muy valiosa a la luz de una gran cantidad de información que se puede obtener de una sola semilla (Figura 1A) y rastrearla hasta una planta específica (Figura 1E). El método se ha utilizado con éxito para la selección de cientos de accesiones, incluidas razas autóctonas, líneas de mejoramiento avanzadas y variedades de maní de élite. El método se sugiere para su uso en programas de investigación de premejoramiento y mejoramiento genético de maní y puede ayudar en la caracterización de los genes de maní para la resistencia a los hongos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Acetona, Optima	Fisher Scientific	A929-4
Acetonitrilo, Optima	Fisher Scientific	A996-4
Acquity BEH C18 2,1 x 5 mm Precolumna Van-Guard	Waters Corporation	186003975
Columna Acquity BEH C18 3 x 100 mm	Waters Corporation	186004661
Columna Acquity BEH C18 2,1 x 100 mm	Waters Corporation
Aflatoxinas B1, B2, G1 y G2	Sigma-Aldrich	A9441-1VL	Disuelva el contenido del vial comercial en 5 mL de metanol para obtener 5 µ g/mL para las aflatoxinas B1 y G1 y 1,5 y micro; g/mL para B2 y G2
Aflatoxina B1 (1mg)	Sigma-Aldrich	A6636-1MG
Aflatoxina B2 (1mg)	Sigma-Aldrich	A9887-1MG
Aflatoxina G1 (1mg)	Sigma-Aldrich	A0138-1MG
Aflatoxina G2 (1mg)	Sigma-Aldrich	A0263-1MG
Aflatoxina M1 (10 µ g)	Sigma-Aldrich	CRM46319
Agar, Granulado (2kg)	Becton Dickinson	BD214510
Óxido de alúmina básico (malla 60-325)	Fisher Scientific	A941-500
Medio basal	Murashige y Skoog	M5519
Bead Ruptor 24	Omni International	19-042E
Vaso de precipitados (1000mL)	Corning (Pyrex)	10001L
Vaso de precipitados (250mL)	Corning (Pyrex)	1000250
Vaso de precipitados (400mL)	Corning (Pyrex)	1000400
Vaso de precipitados (600mL)	Corning (Pyrex)	1000600
Hoja, bisturí	Feather	#10
Centrífuga (LSE Compact)	Modelo Corning	: 6755
Centrífuga, micro	Modelo Corning	: 6770
Perlas de cerámica (2,8 mm)	Omni International	19-646
Perlas de cerámica (6,5 mm)	Omni International	19-682
Chromeleon 7 series Software	Broca Thermo Scientific
	Kyocera	07896	1,6 mm
Broca	Kyocera	07357	2,0 mm
Broca	Kyocera	07985	2,34 mm
Etanol (200 pruebas)	Decon Labs	2805M
Evaporador, nitrógeno	organimation	11106	6 posiciones
Excel, Microsoft	Microsoft	Office 365
Papel de filtro (#4)	Cytiva Whatman	1004-090
Cortador de papel de filtro, acero inoxidable (ID 11,5 mm)	Desconocido
Papel de filtro, fibra de vidrio	Matraz Cytiva Whatman	934-AH
(2800mL)	Corning (Pyrex)	44202XL
Florisil (malla 100-200)	Pinza Fisher Scientific	F101-500
	Integra Lifescience ( Miltex)	PM-0300
Ácido fórmico (88%, ACS)	Fisher Scientific	A118P-500
Congelador (-80oC)	TSX70086D		Fisher Scientific
(15 x 80 mm)	DWK Life Sciences (Kimax)	2902060
Gelzan (medio)	Caisson Labs	G024
Varilla de vidrio (a medida)	A
Lana de vidrio	Corning (Pyrex)	3950
Mango, bisturí	Pluma	#7
Hemocitómetro	Hausser Scientific	3100
Peróxido de hidrógeno	Fisher Scientific	H325-4	30%, Certificado ACS
Cubitera, redonda con tapa	Incubadora	432122
	Corning Percival	136VL
Kimtech SCIENCE Marca	Kimwipes Kimtech	34120	8.2" x 4.39"
Kimtech SCIENCE Marca Kimwipes	Kimtech	34256	16.4" x 14.43"
Bata de laboratorio	Cenmed	B113660SBXL
Metanol, Optima	Fisher Scientific	A454-4
Mini estante de columna (a medida)	Mezclador a medida
, táctil (maxi mix II)	Thermolyne	37600 (modelo 231)
Guantes de nitrilo	Microflex	XC310M
Gas nitrógeno, comprimido (ultra alta pureza)	Jones Welding
Toalla	de papel Georgia-Pacific	20023 (D400)
Medidor de pH	Fisher Scientific (Accumet)	13-636-AB15
electrodo de pH/ATC	Fisher Scientific (Accumet)	13-620-111
PhCR Reactor	fotoquímicoWaters (Vicam)	600001222
Pipeta, pasteur	Fisher Scientific	13-678-20D	9"
Pipeta (1 mL) (Referencia 2)	Pipeta 4924000088
(10 μ L) (Referencia)	Eppendorf	022470051D
pipeta: 10 μ L, 200 μ L, 1 mL	F144054M		Eppendorf
(200 µ L)(Ergofit)	Fisher Scientific	12-146-679
Placas, Petri (100x15mm)	Fisher Scientific	FB0875713
Agar Patata Dextrosa (500g)	Becton Dickinson
Tubo de perlas reforzado (2 mL)	Omni International	19-660
Tubo de perlas reforzado (7 mL)	Repipeta Omni International	19-651
, Dispensador III (10 ml)	Brandtech	4701141
Resveratrol	Sigma-Aldrich	R5010-100MG
Scoop (personalizado)	Hecho a medida
frasco con tapón de rosca (250 mL)	Corning (Pyrex)	1395250
Gel de sílice, esférico (malla 200-400)	Supelco	97727-U	100 g
Hidróxido de sodio	Fisher Scientific	S318-500
SPE extracto limpio de 1,5 ml columna de polipropileno	American Chromotography Supplies	SP-5122382
SPE extract clean PP fritas (para minicolumna de 1,5 mL)	American Chromotography Supplies	SP-3119414
Espectrofotómetro, UV-visible	Fisher Scientific	14-385-351 (Genesys 50)
Tubo de ensayo	Corning (Pyrex)	982516X	16x125mm
Tubo de ensayo (Desechable)(16x125mm)	Fisher Scientific	14-961-31
Tubo de ensayo (desechable)(150x250mm)	Fisher Scientific	14-961-34
Detector Thermo Vanquish DAD (UPLC)	Thermo Scientific	VF-D11-A-01
Detector Thermo Vanquish Fluourescense (UPLC)	Thermo Scientific	VF-D51-A
Bomba cuaternaria Thermo Vanquish F (UPLC)	Thermo Scientific	VF-P20-A
Muestreador dividido Thermo Vanquish FT (UPLC)	Thermo Scientific	VF-A10-A-02
Tween 20 (polisorbato 20) (grado enzimático)	Fisher Scientific	BP337-500
Tapones de vial (4 ml)	Fisher Scientific	C4015-75A
Tapones de vial (muestreador automático)	Fisher Scientific	C4010-60A
Viales y tapones (16 mL)	Thermo Scientific	B7800-4
viales, vidrio (4 ml)	Fisher Scientific	C4015-1
viales, polipropileno (muestreador automático) (400 ml)	Fisher Scientific	C4010-11
agua, Optima	Fisher Científico	W6-4