Aquí, presentamos un protocolo para delinear los métodos de reproducción de ratas, los procedimientos de entrenamiento de natación y los protocolos de enfermería posteriores a la reproducción para ratas embarazadas después del entrenamiento. Este protocolo proporciona un modelo animal para estudiar los efectos del ejercicio materno durante el embarazo en la descendencia y sus mecanismos subyacentes.
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Artículo de método
Protocolo de ejercicios de natación y métodos de cuidado para ratas embarazadas
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Resumen
Resumen
El concepto de los orígenes del desarrollo de la salud y la enfermedad destaca el impacto de los entornos tempranos en las enfermedades crónicas no transmisibles como la diabetes, las enfermedades cardiovasculares y el cáncer. Los estudios que utilizan modelos animales han investigado cómo los factores maternos como la desnutrición, la sobrenutrición, la obesidad y la exposición a productos químicos o hipoxia afectan el desarrollo fetal y la salud de la descendencia, lo que conduce a problemas como bajo peso al nacer, presión arterial alta, dislipidemia y resistencia a la insulina. Dada la creciente prevalencia de sobrepeso y obesidad entre las mujeres en edad reproductiva, es fundamental contar con intervenciones eficaces. El ejercicio materno durante el embarazo se ha convertido en una intervención clave, que beneficia tanto a la madre como a la descendencia y reduce el riesgo de enfermedades. Este estudio compara las diferencias de tres modelos de ejercicio en ratas preñadas: correr con ruedas voluntarias, cintas de correr motorizadas y natación. La natación es la opción más beneficiosa debido a sus niveles de intensidad seguros y controlados. Este protocolo detalla los métodos de reproducción de ratas, el entrenamiento de natación durante el embarazo y los protocolos de enfermería posteriores a la reproducción. Este modelo, adecuado para varias especies de ratas y ratones, es útil para estudiar los beneficios del ejercicio materno en la salud de las crías y el bienestar intergeneracional.
Introducción
En las últimas dos décadas surgió el concepto de Orígenes del Desarrollo de la Salud y la Enfermedad (DOHaD), que ha demostrado que las influencias ambientales durante el desarrollo temprano afectan el riesgo de procesos fisiopatológicos posteriores asociados con las enfermedades crónicas no transmisibles (ENT), especialmente la diabetes, las enfermedades cardiovasculares y algunos tipos de cáncer1. Durante la fase más plástica del desarrollo fetal, en la que las crías están expuestas al entorno intrauterino, la interacción gen-ambiente y la perfusión uteroplacentaria son factores cruciales de la reprogramación fetal2. Estudios previos han utilizado predominantemente modelos animales para investigar los efectos perjudiciales, como la desnutrición materna, la sobrenutrición o la obesidad durante el embarazo, y la exposición prenatal a productos químicos o hipoxia, sobre el desarrollo fetal y los efectos fenotípicos a largo plazo en la descendencia3. Esto produjo bajo peso al nacer y crecimiento tardío y produjo efectos adversos en la descendencia, incluyendo presión arterial elevada, dislipidemia y resistencia a la insulina4. Dado que la tasa de sobrepeso y obesidad está aumentando rápidamente entre las mujeres en edad reproductiva, es urgentemente necesario establecer intervenciones efectivas para prevenir la transmisión intergeneracional de estos trastornos maternos deletéreos, lo que tiene un impacto importante en la salud de la población 5,6.
El ejercicio ha sido reconocido durante mucho tiempo como una importante terapia preventiva para la diabetes tipo 2, la hipertensión y varias otras enfermedades7. El ejercicio durante el embarazo tiene efectos beneficiosos para la madre y confiere efectos beneficiosos a la descendencia, reduciendo así la transmisión materna de enfermedades a la descendencia8. Varios años de investigación han demostrado la seguridad del ejercicio y sus profundos beneficios, incluyendo reducciones sustanciales en condiciones comunes del embarazo, como la diabetes mellitus gestacional 9,10. En cuanto a la seguridad materna y fetal, la realización de entrenamientos con ejercicios y protocolos posteriores a la lactancia es un desafío.
David11y cols. Modelos de ejercicio animal descritos aplicables a la investigación en salud cardiovascular. Los tres modelos de ejercicio comúnmente utilizados, correr con ruedas voluntarias, cintas de correr motorizadas y natación, tienen ventajas y desventajas. El funcionamiento voluntario de la rueda imita de cerca el comportamiento locomotor de las ratas, lo que les permite moverse de acuerdo con su ritmo circadiano. Sin embargo, este tipo de ejercicio necesita una regulación más precisa de la intensidad y la duración. La cinta de correr motorizada puede controlar la intensidad, el volumen y la duración del ejercicio, pero a veces necesita estimulación eléctrica, lo que puede desencadenar estrés físico y psicológico en los animales. La natación es ampliamente utilizada en estudios con roedores debido a la capacidad inherente de natación de las ratas, que también puede evitar la estimulación eléctrica o el daño mecánico en sus patas y colas12. En estudios sobre modelos de ejercicio prenatal13,14, la natación es una modalidad de ejercicio comúnmente utilizada. A medida que avanza el embarazo y el abdomen de la rata se hincha, los ejercicios de correr en cinta y en rueda pueden causar un contacto repetido del abdomen con superficies duras. Por el contrario, el entorno acuático de la natación proporciona flotabilidad, lo que reduce el riesgo de lesiones relacionadas con el ejercicio para las animales embarazadas.
Este protocolo presenta los métodos de cría de ratas, cómo realizar el entrenamiento de natación durante el embarazo y los protocolos de lactancia post-reproducción para ratas embarazadas después del entrenamiento. Este modelo de entrenamiento de natación en embarazadas se puede aplicar a una amplia gama de especies de ratas y ratones, lo que puede proporcionar un modelo de roedor útil para futuras investigaciones utilizando modelos basados en animales para estudiar los mecanismos que regulan los efectos beneficiosos del ejercicio materno en la salud de la descendencia y los beneficios del ejercicio a través de las generaciones.
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Protocolo
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el comité de ética animal de la Universidad del Deporte de Pekín y se han llevado a cabo de conformidad con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y las leyes chinas de protección animal y las directrices institucionales.
1. Apareamiento y alimentación de ratas
- Compre ratas hembras Wistar de 10 semanas de edad y ratas macho Wistar de 11 semanas de edad, libres de patógenos específicos (SPF).
- Implemente la alimentación adaptativa: Alimente a las ratas Wistar ad libitum con una dieta estándar para roedores y proporcione acceso a agua del grifo durante una semana en el centro de alimentación designado. Asegúrese de que todas las ratas estén alojadas en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas a una temperatura constante de 22 °C y una humedad del 45-55%.
- Examina el celo de la rata hembra.
- Prepare el equipo y los materiales, incluidos los portaobjetos de microscopio de vidrio limpio, los hisopos de algodón de 2 mm de diámetro, la solución salina (NaCl al 0,9%) y el microscopio.
- Etiquete cada portaobjetos del microscopio con la fecha y la identificación de la rata.
- Entre las 6 y las 7 p.m., para minimizar el estrés, sujete suavemente a la rata hembra. Agarra la base de la cola con el pulgar y el índice mientras aplicas presión con los otros dedos sobre la vértebra lumbar de la rata.
- Levanta la punta de la cola y expone la vaginal. Humedece un hisopo de algodón con solución salina, luego introduce la punta en la vagina y enrolla suavemente la punta para recoger las secreciones vaginales.
- Haga rodar la punta del hisopo por el portaobjetos, evitando volver a aplicarlo en la misma zona.
- Examine el frotis bajo el microscopio y utilice el objetivo de aumento bajo (10x) para localizar y observar las células.
NOTA: Durante el celo, las secreciones vaginales tienen núcleos epiteliales más grandes que se desvanecen, reemplazados por células epiteliales escamosas exfoliadas queratinizadas que se acumulan en un montículo. - Registre la etapa del ciclo estral de cada rata.
- Entre las 7 y las 8 p.m., coloque una rata macho y una hembra en la jaula de apareamiento.
NOTA: Las ratas hembras necesitan estar en proestro o celo para aparearse. - El segundo día, entre las 7 y las 8 a.m., inspeccione la jaula de apareamiento en busca de tapones copulatorios. Si se encuentra un tapón copulatorio en la base de la jaula de apareamiento, proceda a crear un frotis de secreción vaginal para la rata hembra siguiendo el mismo método descrito en los pasos 1.3.4 a 1.3.6.
NOTA: Los tapones copulatorios son materiales gelatinosos de color blanco lechoso o amarillento hechos de vesículas seminales de ratas macho y secreciones prostáticas combinadas con secreciones vaginales. - Confirmar el embarazo en la rata hembra: después de encontrar tapones copulatorios en la jaula de apareamiento, observe el esperma en el frotis de secreción vaginal. Designe este día como el día de gestación 1 (GD1).
- Aísla a la rata preñada en una jaula separada.
NOTA: Durante las etapas iniciales del embarazo, es imperativo evitar que una rata embarazada se encuentre con señales químicas masculinas desconocidas en su entorno o que cohabite con una rata macho desconocida. - Los períodos de gestación de las ratas suelen durar entre 21 y 23 días. Mida y registre el peso corporal de las ratas desde GD1 hasta GD20.
- En GD20, reemplace la jaula de la rata embarazada por una limpia y coloque algodón absorbente médico (similar en tamaño a la rata) en la jaula. Suministre suficiente agua y comida para siete días de supervivencia, y coloque la jaula en un lugar tranquilo.
NOTA: No cambie la jaula durante al menos 1 semana después del parto de la rata. Al cambiar a una jaula limpia, transfiera el algodón absorbente usado de la jaula sucia a la nueva para asegurarse de que las ratas puedan reconocer el olor de sus crías. - El día 21después del parto, separe a las crías por sexo y colóquelas en dos jaulas.
NOTA: Debido al tamaño más pequeño de la cría de 21 días, coloque los gránulos de alimento duro en una placa de Petri de vidrio dentro de la jaula.
2. Programa de entrenamiento prenatal de natación
- Llevar a cabo un entrenamiento de adaptación para todas las ratas hembras experimentales durante 5 días.
- Prepare un recipiente de plástico transparente de al menos 20 cm de altura y llénelo con 10 cm de agua a 34 ± 1°C.
- Agarra la punta de la cola de la rata y levántela, luego coloca la rata en el agua.
- Durante el entrenamiento adaptativo de 15 minutos, controle de cerca la temperatura del agua cada 5 minutos, agregando agua tibia para mantener la temperatura.
- Después del entrenamiento, transfiera la rata a agua limpia a 34 ± 1 °C para lavar su pelaje. Luego, transfiere a la rata a una jaula con toallas y usa un secador de pelo para secar su pelaje.
NOTA: El ruido y un ambiente caluroso pueden causar estrés a las ratas. Por lo tanto, se recomienda utilizar un secador de pelo ajustable y silencioso. - Por favor, devuelva la rata a sus jaulas respectivas.
- Apareamiento de ratas (siga los pasos 1.3-1.6).
- Después del paso 1.7, asigne aleatoriamente ratas preñadas a un grupo sedentario (SED) y a un grupo de ejercicio (EX).
- Pesa a la rata diariamente antes de cada sesión de entrenamiento.
NOTA: Durante el entrenamiento adaptativo, la pérdida de peso de las ratas no debe superar los 3 g/día. Durante el entrenamiento prenatal, el peso de las ratas debe aumentar gradualmente. Si las ratas pierden más de 3 g por día, reduzca el tiempo de entrenamiento diario en un 50% para permitir la recuperación. - Realizar entrenamiento prenatal de natación para el EX de GD1 a GD20, 6 días a la semana, de 8:00 a 9:00 de la mañana.
- Prepare un cubo de agua circular de 50 cm de diámetro y 50 cm de altura mínima y llénelo con 40 cm de agua a una temperatura de 34 ± 1°C.
- De GD1 a GD5, realizar inicialmente el entrenamiento de natación durante 20 min al día y aumentar progresivamente a 60 min al día.
- De GD6 a GD20, continúe el entrenamiento de ejercicios durante 60 minutos por día durante 6 días a la semana.
- Para el cuidado posterior, consulte los pasos 2.1.4-2.1.5.
- Después del ejercicio, dele a la rata EX 5 g de semillas de girasol para roedores para proporcionar apoyo nutricional.
- Durante el entrenamiento EX todos los días, coloque a la rata SED en el mismo entorno acuático que el entrenamiento adaptativo (paso 2.1.1). Deje que la rata SED pase el mismo tiempo en el entorno acuático que la rata EX. Después del ejercicio, dale a la rata SED 5 g de semillas de girasol para proporcionarle apoyo nutricional y calmar las emociones.
- Después de cada sesión de entrenamiento de natación, limpie y desinfecte todo el equipo con luz ultravioleta, incluidos los cubos de agua y las toallas.
3. Características físicas de los fetos
- En la mañana de GD20.5, anestesiar a la rata hembra con isoflurano al 3% y eutanasiarla en una cámara de CO2 .
- Use un bisturí quirúrgico para hacer una incisión en la parte inferior del abdomen de la rata. Asegúrese de que la incisión esté inclinada hacia ambos lados del abdomen, asegurando una exposición completa del útero.
- Abra cuidadosamente el útero con fórceps y tijeras para exponer los fetos y las placentas. Separe suavemente el amnios delgado que rodea a los fetos con fórceps para evitar daños inducidos por las tijeras a los fetos y las placentas.
- Limpie los cuerpos de los fetos con una gasa estéril para eliminar la sangre y la mucosidad. Separe secuencialmente los fetos y las placentas por sus posiciones anatómicas y luego péselos.
- Observa la distancia entre el ano y los genitales para determinar el sexo de los fetos. Los fetos masculinos tienen una distancia mayor que las mujeres. Registre el sexo y la cantidad de fetos para referencia futura.
- Mida la longitud de los fetos con un calibrador mientras está acostado. Debido a que los fetos aún están vivos, es posible que se acurruquen después de ser diseccionados, así que despliegan sus cuerpos para tomar medidas.
NOTA: Para garantizar la consistencia de los resultados experimentales y los métodos de medición sean consistentes, el mismo experimentador mantiene los mismos estándares en todo momento. Los fetos fueron sacrificados según las pautas recomendadas por las instituciones y se recolectaron muestras de tejido para su posterior análisis según fuera necesario.
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Resultados
En la sección de métodos de cría de ratas (Figura 1), determinamos el ciclo estral de las ratas hembras mediante deslizamientos de secreción vaginal para aumentar la tasa de éxito de la cría. El ciclo estral de las ratas dura de 4 a 5 días, incluyendo proestro, estro, metestro y diestro. Las ratas hembras en metestro o diestro exhiben comportamientos como distanciarse de los machos. Al mismo tiempo, las que están en celo están dispuestas a aparearse, y la ovulación en las ratas hembra ocurre...
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Discusión
Este estudio tiene como objetivo establecer un programa de ejercicio factible para ratas embarazadas, incluyendo métodos detallados de apareamiento de ratas, protocolos de entrenamiento de natación y métodos de investigación para evaluar indicadores fisiológicos en fetos. Hemos desarrollado un modelo de entrenamiento de ejercicios prenatales de natación a través de la práctica, con las correspondientes soluciones a los posibles problemas que pueden surgir en el protocolo (Tabla 1...
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Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32071174, 32200941, 32371183 y 31771312).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Calibrador | Mitutoyo Measuring Instruments (Shanghai) Co., Ltd | 530-101 N15 | Disección de feto |
| Cubo de agua circular | Naliya | N/A | Natación de ratas |
| Instrumento quirúrgico experimental | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | SP0001-G | Disección del feto |
| Portaobjetos de microscopio | de vidrio Jiangsu Shitai equipo experimental Co., LTD | 80312-3161 | Frotis vaginal |
| Placa de Petri de vidrio | Merck Life Technologies | BR455751-10EA | Cría de crías |
| Secador de pelo | Panasonic | EH-WNE5H | Tarjeta de información sobre el cuidado posterior a la natación |
| Zhongke Ciencias de la vida | SS3 | Apareamiento de ratas | |
| Isoflurano | Shenzhen RWD Life Technology Co., LTD | R510-22-10 | Disección de fetos |
| Microscopio | óptico Olympus | IX71-F22PH | Frotis vaginal |
| Jaula de apareamiento | Zhongke Ciencias de la vida | SS3 | Apareamiento de ratas |
| Algodón absorbente médico | Hongxiang Sanitary Materials Co., Ltd N | /A | Las ratas preñadas son anticipando el parto |
| Máquina de anestesia para roedores, anestesia de gas | Shenzhen RWD Life Technology Co., LTD | R500IE | Disección de fetos |
| Alimento de cría de roedores | Beijing Huafukang Biotechnology Co., LTD | 1032 | Alimentación de ratas embarazadas |
| Alimento de mantenimiento para roedores | Beijing Huafukang Biotechnology Co., LTD | 1022 | Cría de crías Semillas de |
| girasol de roedores | Jolly | JP241 | Complemento alimenticio |
| Algodón insonorizado | Instrumento médico Kufu | N/A | Las ratas embarazadas están a punto de dar a luz |
| Hisopo de algodón estéril (2 mm de diámetro) | Instrumento médico Kufu | N/A | Frotis vaginal |
| Gasa estéril | Instrumento médico Kufu | N/A | Disección de feto |
| Solución salina fisiológica para accidentes cerebrovasculares (0,9% NaCl) | Shandong Hualu Pharmaceutical Co., LTD | N/A | Frotis vaginal |
| Termómetro Organismo | Beekman | N/A | El seguimiento de la natación de ratas |
| Toallas | Grace N/A Cuidados posteriores a la | natación | |
| Recipiente de plástico transparente | Naliya | N/A | Natación Entrenamiento adaptado |
| Luz ultravioleta | Merck Life Technologies | Z169633-1EA | Cuidado post-natación |
| Calentador de agua | Haier | EC6001-Q6S | peso de natación para ratas |
| Electronlc Acale | JM. A10001 | Medición del peso corporal | |
| Wistar Rats | Vital river Laboratory Animal Technology Co., Ltd N | /A | Experimento |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
