El método desarrollado de marcaje con 13C6-glucosa combinado con espectrometría de masas de alta resolución por cromatografía líquida es versátil y sienta las bases para futuros estudios sobre los órganos primarios y las vías implicadas en la síntesis de metabolitos secundarios en plantas medicinales, así como la utilización integral de estos metabolitos secundarios.
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Artículo de método
13Marcaje deC-6-glucosa asociado con LC-MS: identificación de órganos primarios de plantas en la síntesis de metabolitos secundarios
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Resumen
Resumen
En este trabajo se presenta un método novedoso y eficiente para certificar órganos primarios implicados en la síntesis de metabolitos secundarios. Como el metabolito secundario más importante en Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.) Mano. -Mzt. (PPY), la saponina de París (PS) tiene una variedad de actividades farmacológicas y la PPY tiene una demanda creciente. Este estudio estableció cuatro tratamientos de alimentación y no alimentación con hoja, rizoma y tallo vascular 13C6-Glucosa para certificar con precisión los órganos primarios involucrados en la síntesis de saponinas de París VII (PS VII). Mediante la combinación de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), se calcularon de forma rápida y precisa las proporciones 13C/12C de hoja, rizoma, tallo y raíz en diferentes tratamientos, y se encontraron cuatro tipos de proporciones de picos de iones isotópicos (M-) de PS: (M+1) −/M−, (M+2) −/M−, (M+3) −/M− y (M+4) −/M−. Los resultados mostraron que la relación de 13C/12C en los rizomas de los tratamientos de alimentación con tallo-haz vascular y rizoma fue significativamente mayor que en el tratamiento sin alimentación. En comparación con el tratamiento sin alimentación, la proporción de moléculas de PS VII (M+2) −/M− en las hojas aumentó significativamente bajo los tratamientos de alimentación con hojas y haces vasculares del tallo. Simultáneamente, en comparación con el tratamiento sin alimentación, la proporción de moléculas de PS VII (M+2) −/M− en las hojas bajo tratamiento con rizoma no mostró diferencias significativas. Además, la proporción de moléculas de PS VII (M+2) −/M− en el tallo, la raíz y el rizoma no mostró diferencias entre los cuatro tratamientos. En comparación con el tratamiento sin alimentación, la proporción de la molécula de saponina Paris II (PS II) (M+2) −/M− en las hojas bajo el tratamiento de alimentación foliar no mostró diferencias significativas, y la relación (M+3) −/M− de las moléculas de PS II en las hojas bajo el tratamiento de alimentación foliar fue menor. Los datos confirmaron que el órgano principal para la síntesis de PS VII son las hojas. Sienta las bases para la futura identificación de los órganos primarios y las vías implicadas en la síntesis de metabolitos secundarios en las plantas medicinales.
Introducción
Las vías biosintéticas de los metabolitos secundarios en las plantas son intrincadas y diversas, e involucran órganos de acumulación altamente específicos y diversos1. En la actualidad, los sitios específicos de síntesis y los órganos responsables de los metabolitos secundarios en muchas plantas medicinales no están bien definidos. Esta ambigüedad plantea un obstáculo significativo para el avance estratégico y la implementación de métodos de cultivo diseñados para optimizar tanto el rendimiento como la calidad de los materiales medicinales.
La biología molecular, la bioquímica y las técnicas de marcaje de isótopos se....
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Protocolo
1. Preparación experimental
- Asegúrese de que durante el crecimiento de la planta, la humedad relativa del invernadero sea del 75%, las temperaturas día/noche sean de 20 °C/10 °C, el fotoperiodo se componga de 12 h de día y 12 h de noche, y la intensidad de la luz sea de 100 μmol·m-2·s-1. Proporcionan irradiación a través de lámparas de diodos emisores de luz (LED), manteniendo una distancia de 30 cm entre la lámpara LED y el dosel de la planta.
NOTA: El fotoperiodo y la intensidad de la luz dependen del número de horas de sol durante el periodo de crecimiento en Yunnan. La irradiancia se mide rutinariamente mediante ....
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Resultados
Para confirmar que elsuministro de 13C6-glucosa en los rizomas fue exitoso, analizamos más a fondo las proporciones de isótopos de 13C/12C en los rizomas. Las proporciones de isótopos 13C/12C de los tratamientos 3 y 4 fueron mucho más altas que las del tratamiento 2 (Figura 1A). Los resultados indicaron que la 13C6-Glucosa del Tratamiento 3 y 4 ingresó a los rizomas a través de la ingestión.
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Discusión
La implementación exitosa de este protocolo depende de una investigación exhaustiva sobre las propiedades fisiológicas, los tejidos, los órganos y los metabolitos secundarios de las plantas. El enfoque de diseño experimental descrito en el protocolo establece una base sólida para investigar las vías biosintéticas de los metabolitos secundarios de las plantas. Los factores críticos en este experimento son (1) determinar la edad de las plántulas perennes y (2) elegir el momento correcto de detección de marcadores de isótop.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el Programa Juvenil de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 82304670).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,1 % Agua de ácido fórmico | Fábrica de reactivos químicos de Chengdu Kelong | 44890 | |
| 13C6-Glucosa en polvo | MERCK | 110187-42-3 | |
| Acetonitrilo | Chengdu Kelong Fábrica de reactivos químicos | 44890 | |
| VIALES DE MUESTREADOR AUTOMÁTICO | Biosharp Biotechnology Company | 44866 | |
| BEH C18 columna | Waters,Milfor,MA | 1.7μ m,2.1 * 100 mm | |
| Limpiador ultrasónico CNC | Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd | KQ-600DE | |
| Compound DiscovererTM software | Thermo Scientific, Fremont,CA | 3 | |
| Compound DiscovererTM software | Thermo Scientific,Fremont,CA | 3 | |
| Horno | DHG-9146A | ||
| Balanza analítica electrónica | Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd | SOP | |
| Etanol | Fábrica de reactivos químicos de Chengdu Kelong | 44955 | |
| Molino rápido de muestras completamente automático | Tecnología Shanghai Jingxin Tecnología | Tissuelyser-48 | |
| Cromatografía de gases-Espectrómetro de masas de relación de isótopos estables | Thermo Fisher | Delta V Advantage | |
| Solución de Hoagland | Sigma-Aldrich | H2295-1L | |
| Tanque hidropónico | JRD | 1020421 | |
| Software Isodat | Thermo Fisher Scientific | 3 | |
| Cromatografía líquida espectrometría de masas de alta resolución | Agilent Technology | Agilent 1260 -6120 | |
| Instrumento de fabricación de nitrógeno | PEAK SCIENTIFIC | Genius SQ 24 | |
| Filtro de fase orgánica | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd | 44890 | |
| Bomba de oxígeno | Magic Dragon | MFL | |
| Sensor cuántico | Highpoint | UPRtek | |
| Bisturí | Handskit | 11-23 | |
| Aspersión puede | CHUSHI | WJ-001 | |
| Xcalibur software | Thermo Fisher Scientific | 4.2 |
Referencias
- Erb, M., Kliebenstein, D. J. Plant secondary metabolites as defenses, regulators, and primary metabolites: The blurred functional trichotomy. Plant Physiol. 184 (1), 39-52 (2020).
- Li, Y., Kong, D., Fu, Y., Sussman, M. R., Wu, H.
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Reimpresiones y permisos
