Artículo de método

Preparación de muestras de retina para microscopía electrónica volumétrica

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DOI:

10.3791/66589

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24 de mayo de 2024

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Eye Hospital, Wenzhou Medical University, 2Laboratory of Retinal Physiology and Disease, School of Ophthalmology and Optometry, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe los pasos detallados para la preparación de muestras de retina para microscopía electrónica de volumen, centrándose en las características estructurales de los terminales fotorreceptores de la retina.

Resumen

La microscopía electrónica de volumen (Volume EM) se ha convertido en una poderosa herramienta para visualizar la estructura 3D de células y tejidos con una precisión de nivel nanométrico. Dentro de la retina, varios tipos de neuronas establecen conexiones sinápticas en las capas plexiformes interna y externa. Si bien las técnicas convencionales de EM han proporcionado información valiosa sobre los orgánulos subcelulares de la retina, su limitación radica en proporcionar datos de imágenes en 2D, lo que puede dificultar mediciones precisas. Por ejemplo, cuantificar el tamaño de tres grupos de vesículas sinápticas distintas, cruciales para la transmisión sináptica, es un desafío en 2D. Volume EM ofrece una solución al proporcionar datos 3D a gran escala y de alta resolución. Vale la pena señalar que la preparación de la muestra es un paso crítico en el volumen EM, lo que afecta significativamente la claridad y el contraste de la imagen. En este contexto, esbozamos un protocolo de preparación de muestras para la reconstrucción en 3D de los terminales axónicos fotorreceptores en la retina. Este protocolo incluye tres pasos clave: disección y fijación de la retina, procesos de inclusión de muestras y selección del área de interés.

Introducción

La retina está densamente repleta de axones neuronales y dendritas entrelazados que forman sinapsis entre ellos1. La microscopía es una herramienta indispensable para el estudio de la anatomía de la retina, ya que tiene estructuras finas, intrincadas y pequeñas. Aunque la microscopía electrónica (EM) proporciona una potencia sin precedentes para investigar la ultraestructura de los orgánulos subcelulares y la localización precisa de proteínas específicas a nivel nanométrico2, produce imágenes limitadas al plano bidimensional (2D), lo que lleva a la pérdida potencial de información clave.

El desarrollo de técnicas emergentes de microscopía electrónica de volumen de alta resolución (Volume EM) apoya el suministro de información estructural tridimensional (3D) más completa y a mayor escala. Algunos métodos de EM 3D han sido revisados recientemente por otros 3,4,5. La EM 3D permite la reconstrucción de la forma neuronal y los detalles de conectividad, lo que permite un análisis cuantitativo preciso de las estructuras de interés. Esto demuestra que los datos obtenidos por volumen EM son más sistemáticos, completos y precisos.

Los fotorreceptores retinianos, que constituyen las neuronas iniciales en la señalización visual 6,7, establecen sinapsis con dendritas de células bipolares y horizontales de segundo orden en el terminal del fotorreceptor para facilitar las señales excitatorias 8,9. Estos terminales, denominados pedículos cónicos y esférulas de bastones, abarcan tres componentes cruciales: mitocondrias, cintas sinápticas y vesículas sinápticas. Si bien los estudios previos se han concentrado predominantemente en la estructura general de las sinapsis en cinta, ha habido una notable ausencia de investigación sobre la estructura fina de los componentes principales, incluidas las mitocondrias, la cinta, los grupos de vesículas y su organización espacial en las terminales 10,11,12,13. Un análisis preciso y sistemático de cada componente, junto con una comprensión de su interasociación dentro de los terminales fotorreceptores, es vital para desentrañar la organización espacial y comprender de manera integral las funciones de procesamiento visual. En los fotorreceptores, las mitocondrias están presentes principalmente en el segmento interno, el cuerpo celular y el terminal. Nos centramos aquí en las mitocondrias de los fotorreceptores terminales. La microscopía electrónica de barrido por haz de iones focalizado (FIB-SEM), un tipo de EM de volumen que cuenta con una alta resolución (resolución x, y y z < 5 nm) y un flujo de volumen relativamente grande 4,14, se erige como una potente herramienta para visualizar con precisión la estructura 3D de los terminales de los fotorreceptores.

Tanto el FIB-SEM como el microscopio electrónico de barrido facial en serie (SBF-SEM) son EM de volumen basados en SEM para obtener la imagen de los tejidos mediante el escaneo de la superficie de la muestra. Las características ultraestructurales de la superficie de un espécimen se revelan a través del contraste creado por la intensidad de los electrones secundarios o retrodispersados (BSE) cuando el haz de electrones escanea la muestra15. Esencialmente, la detección de BSE o electrones secundarios de la superficie de la sección transversal de una muestra de tejido incrustada en resina en SEM permite obtener imágenes de la muestra incrustada16,17. Cuando se generan menos BSE o electrones secundarios, solo se puede obtener información sobre la superficie de la muestra. Para lograr un contraste consistente e imágenes seriales de alta calidad, es necesario depositar suficientes metales pesados en la muestra. Por lo tanto, los protocolos específicos de preparación de muestras son cruciales para la segmentación posterior, la reconstrucción 3D y el análisis cuando se utiliza SEM para imágenes en serie. El método de osmio-tiocarbohidrazida-osmio (OTO) es un esquema típico de preparación de muestras para microscopía electrónica 3D de muestras biológicas, preservando la estructura de las membranas que contienen lípidos y manteniendo un buen contraste18,19.

Aquí, desarrollamos el método OTO para la preparación de muestras de retina para el uso de Volume EM. Este proceso se centra especialmente en la disección de la retina, la determinación del tiempo óptimo de fijación del tejido retiniano y la descripción de los procedimientos y precauciones específicos en la preparación de muestras en 3D. Además, la segmentación y la reconstrucción 3D de la estructura objetivo son pasos integrales en esta aplicación ampliada. La retina, al ser una estructura pequeña y difícil de obtener materiales, requiere operaciones rápidas y precisas para la EM, con tiempos fijos y reactivos frescos preparados para su uso inmediato.

Protocolo

Los protocolos de cuidado y uso de los animales fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Wenzhou y siguieron las pautas establecidas por la Asociación para la Investigación de la Visión y la Oftalmología (ARVO). Todos los ratones se mantuvieron en un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad y se les suministró una dieta estándar de comida.

1. Disección y fijación de la retina

  1. Anestesiar a los ratones (C57BL/6J, machos, 8 semanas de edad, 20-25 g) inyectando 2,2,2-tribromoetanol (0,25 mg/g de peso corporal) por vía intraperitoneal. Confirme la profundidad de la anestesia sin retracción de la pata trasera después de pellizcar el dedo del pie o sin reflejo de parpadeo. Luego, disloque la vértebra cervical mientras aún está bajo anestesia para sacrificar al animal.
    NOTA: Se eligió el tribromoetanol por su eficacia bien documentada para inducir anestesia rápida y confiable en modelos de animales pequeños, particularmente para procedimientos a corto plazo. Si bien se prefieren los anestésicos de grado farmacéutico, el tribromoetanol ofrece ventajas específicas en ciertos protocolos, lo que lo convierte en una alternativa adecuada cuando se prepara y administra adecuadamente. Se tomaron todas las precauciones para garantizar su uso seguro y eficaz. Este estudio se adhiere a las consideraciones éticas al garantizar la preparación, la administración y el seguimiento adecuados para mitigar los riesgos potenciales asociados con su uso.
  2. Retirar los ojos con unas tijeras curvas y sumergirlos en una solución mixta que contenga un 2% de glutaraldehído y un 2% de paraformaldehído en tampón de fosfato (PB, 0,1 M, pH 7,4).
  3. Extraer el segmento anterior y el vítreo de los ojos con pinzas bajo el microscopio de disección.
  4. Pele la esclerótica con las dos pinzas hasta que la retina quede completamente aislada de la copa ocular.
  5. Corte la retina rápidamente en tiras de 100 a 200 μm de grosor con una navaja y manipule las tiras de retina con una pipeta Pasteur en un nuevo tubo de microcentrífuga (EP) que contenga un 2% de glutaraldehído y un 2% de paraformaldehído en tampón de fosfato (PB, 0,1 M, pH 7,4) durante 2 h a temperatura ambiente (RT) en el rotador. Una vez finalizado, coloque los tubos para fijarlos a 4 °C durante 24 h.

2. Proceso de incrustación de muestras

  1. Después de lavar en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,4) 5 veces durante 15 min cada una, incubar las tiras de retina con una solución que contenga 1,5% de ferrocianuro de potasio y 1% de OsO4 (en PB, pH 7,4) en cacodilato de sodio 0,1 M con 4 mM de CaCl2 durante 1,5 h en la oscuridad sobre hielo.
    NOTA: La incubación oscura y la falta de fosfato pueden prevenir la precipitación y los artefactos en la muestra.
  2. Lave las tiras de retina 3 veces en ddH2O durante 10 min cada una, y luego trate con tiocarbohidrazida al 1% en ddH2O durante 30 min en la oscuridad a RT.
  3. Después de enjuagar en ddH2O 3 veces durante 15 min cada una, incubar las tiras de retina en OsO4 al 2% (en PB, PH 7.4) durante 45 min en la oscuridad a RT.
  4. Después de lavar en ddH2O 3 veces durante 15 minutos cada una, sumerja las tiras de retina en acetato de uranilo acuoso al 1% en la oscuridad a 4 °C durante la noche.
  5. Al día siguiente, después de lavar en ddH2O 3 veces durante 15 min cada una, tratar las tiras de retina con nitrato de plomo al 0,66% en ácido L-aspártico (0,03 M, pH 5,5) durante 40 min a 65 °C.
  6. Después de lavar en ddH2O 3 veces durante 15 min cada una, deshidratar las tiras de retina con una concentración ascendente de etanol de 30%, 50%, 70%, 90% y 100% durante 20 min en cada solución.
  7. Trate las tiras de retina con una solución mixta que contenga etanol y acetona en partes iguales durante 20 minutos, seguido de un lavado con acetona 2 veces durante 20 minutos cada una.
  8. Ininfiltrar las tiras de retina en acetona/resina mezclada en una proporción de 7:3 en la oscuridad a RT durante la noche y luego acetona/resina a 3:7 en la oscuridad durante 24 h en RT.
    NOTA: La composición precisa de la resina es la siguiente: Epon812 10,06 mL, DDSA 4 mL, MNA 5,94 mL y DMP-30 0,2 mL.
  9. Cambie los tubos al día siguiente e infiltre las tiras de retina con resina pura durante 24 h a 45 °C. Vuelva a cambiar la resina al día siguiente e incruste las tiras de retina durante 48 h a 60 °C.
    NOTA: El propósito de aumentar la temperatura es mejorar la penetración.

3. Selección de la zona de interés

  1. Corta los bloques de resina en secciones de 1 μm de grosor, tiñe las secciones con azul toluidina al 1% y observa la estructura general de la retina bajo microscopía óptica para seleccionar las regiones rugosas de interés.
  2. Recubra los bloques de resina con platino utilizando un recubridor por pulverización catódica, seguido de un fresado con una sección de 70 nm de espesor utilizando una microscopía electrónica de barrido de haz de iones focalizados bajo una corriente de 0,23 nA y un voltaje de aceleración de 30 kV.
  3. Preselección de la sección mediante FIB-SEM con un aumento de 2000x para identificar las regiones precisas de interés.
  4. Recogida de datos mediante FIB-SEM con una corriente de haz de 0,69 nA y una tensión de aceleración de 2 kV. Los otros parámetros son los siguientes: tiempo de permanencia = 2 μs, tamaño del vóxel = 1,8 nm x 1,8 nm x 15 nm.

Resultados

La Figura 1A muestra la imagen de los terminales fotorreceptores de la retina preparados utilizando el método tradicional de doble fijación química, y la Figura 1B muestra la imagen de los terminales de los fotorreceptores de la retina preparados utilizando el método OTO. Ambos fueron muestreados por FIB-SEM. Se puede ver claramente que la estructura de la membrana celular se puede retener tanto como sea posible mediante el uso del método OTO, e incluso se puede ver claramente el contorno de las vesículas. Además, el contraste de las imágenes obtenidas mediante el método OTO también es más claro.

La Figura 2 ilustra el flujo de trabajo experimental empleado para reconstruir las características ultraestructurales de los terminales fotorreceptores. La reconstrucción se centró en cuatro tipos de terminales fotorreceptores, incluidos los pedículos del cono M, los pedículos del cono S, las esférulas de la varilla 1 y las esférulas de la varilla 2. El énfasis principal se centró en los componentes esenciales, como las mitocondrias, las cintas sinápticas y los grupos de vesículas sinápticas dentro de las terminales fotorreceptoras.

La Figura 3 muestra las mitocondrias reconstruidas y las cintas sinápticas en los terminales de los fotorreceptores de bastones. En particular, las cintas sinápticas de las esférulas de la varilla 2 exhiben una forma de herradura distintiva, generalmente con una sola cinta por esférula. Además, en la Figura 2 se destaca la presencia de dos mitocondrias en esférulas de bastones, con una posición consistente dentro del espacio central de los terminales, ubicadas por encima de las cintas sinápticas. Todas las estructuras fueron trazadas manualmente, página a página.

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Figura 1: Ejemplos de imágenes muestreadas utilizando FIB-SEM para el método tradicional de doble fijación química y el método OTO. (A) Método tradicional de doble fijación química. (B) Método OTO. Barra de escala: 1000 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Flujo de trabajo de reconstrucción 3D para terminales fotorreceptores mediante FIB-SEM. Después de la alineación utilizando un software de visualización de datos en 3D, las imágenes en serie se segmentaron y renderizaron manualmente para su posterior análisis. (A) Imágenes originales en serie. (B) Imágenes alineadas. (C) Imágenes segmentadas. (D) Imágenes reconstruidas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Reconstrucción 3D. Las imágenes representativas de la reconstrucción 3D muestran los terminales fotorreceptores en blanco, las mitocondrias en naranja y las cintas sinápticas en azul. Barra de escala: 500 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Implementamos el protocolo de preparación de muestras Volume EM de OTO para analizar la estructura terminal de los fotorreceptores en el tejido de la retina. La atención se centró en detallar todo el procedimiento, desde el desprendimiento y la fijación de la retina hasta mostrar los resultados de la reconstrucción en 3D de los terminales de los axones fotorreceptores.

La característica distintiva del tejido de la retina, a diferencia del tejido cerebral, radica en su falta de diferencias regionales. Compuesta por tres capas de cuerpos celulares neuronales y dos capas de conexiones sinápticas, la retina exhibe una estructura regular y jerárquica a pesar de la complejidad de sus componentes neuronales y sinápticos20. Al diseccionar la retina, se hace imperativo asegurarse de que las tiras delgadas se minimicen para garantizar un contraste uniforme en las etapas posteriores de preparación de la muestra. Los terminales axónicos fotorreceptores, estructuras críticas de interés, están situados en la capa plexiforme externa (OPL) de la retina. La naturaleza jerárquica y organizada de la retina permite una localización eficiente de las estructuras objetivo, lo que facilita la toma de muestras precisas durante la EM y garantiza la precisión de los resultados posteriores de la reconstrucción 3D.

Volume EM facilita la visualización tridimensional de los circuitos neuronales locales y las conexiones sinápticas dentro de la retina a nanoescala, utilizando secciones seriadas21,22. Esta técnica permite la generación automática de imágenes 3D de alta resolución, y FIB-SEM tiene el potencial de revelar detalles intrincados de las actividades fisiológicas y patológicas. Por lo tanto, mantener un contraste de imagen estable en todo el bloque es crucial durante el proceso de preparación de la muestra. Para lograr una conductividad uniforme, empleamos el método OTO de pre-incrustación, un enfoque clásico ampliamente reconocido por su eficacia para mejorar el contraste en la microscopía electrónica de barrido (SEM)18,23,24. Este método implica un doble recubrimiento de osmio combinado con tiocarbohidrazida, lo que garantiza una conductividad óptima a granel para muestras grandes. Además, el tratamiento con doble osmio contribuye a la preservación superior de las estructuras de las membranas lipídicas, añadiendo una capa de precisión a nuestras investigaciones. Las muestras de retina son jerárquicas, los bloques de tejido son pequeños y fáciles de penetrar, y el método OTO puede mantener un mejor contorno de la membrana celular y un contraste uniforme de la imagen.

Varios factores críticos contribuyen al éxito de este protocolo. En primer lugar, la recolección rápida de retina y los tiempos de fijación precisos son primordiales para mantener una estructura subcelular óptima. En segundo lugar, garantizar concentraciones adecuadas de osmio y tiocarbohidrazida es esencial para preservar el contraste en la estructura de la membrana de las imágenes en serie. El osmio, en particular, desempeña un papel crucial al unirse a las moléculas lipídicas, mejorando la señal de la EEB.

Nuestro protocolo de preparación de muestras de retina es fácil de usar, no requiere equipo adicional y minimiza el tiempo de procesamiento. Esta característica pone de manifiesto su potencial aplicabilidad a otras técnicas de EM de volumen, lo que sugiere versatilidad y facilidad de adopción en diversas configuraciones experimentales. El método de la OTO mejora notablemente el contraste de las imágenes FIB-SEM. Sin embargo, los detalles sobre la membrana celular, especialmente la estructura de la bicapa, aún pueden parecer algo borrosos. Nuestro esquema actual de preparación de muestras implica hasta cierto punto sacrificar pequeños detalles en la estructura de la célula. Nuestro objetivo es desarrollar métodos optimizados en el futuro para abordar y mejorar esta limitación.

Divulgaciones

Los autores no tienen divulgaciones.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2022YFA1105503), el Laboratorio Estatal Clave de Neurociencia (SKLN-202103), la Fundación de Ciencias Naturales de Zhejiang de China (Y21H120019).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2,2,2-tribromoetanolSigma-AldrichT48402
la microscopía electrónicaacetona10000
Amira 6.8Thermo Fisher Scientific
CaCl2SigmaC-2661
Molde de incrustaciónBeijing Zhongjingkeyi TecnologíaGP10590
Epon resinaMicroscopía Electrónica Ciencia14900
EtanolSigma64-17-5
GlutaraldehídoMicroscopía Electrónica Ciencia16020
Helios NanoLab 600i doble haz SEMFEI
Ácido L-aspárticoSigma56-84-8
Nitrato de plomoSigma10099-74-8
Na2HPO4.12H2OSigma71650Un componente del tampón de fosfato
NaH2PO4. H2OSigma71507Un componente del tampón de fosfato
OsO4TED PELLA4008-160501
ParaformaldehídoMicroscopía electrónica Ciencia157-8
Ferrocianuro de potasioSigma14459-95-1
Cacodilato de sodioSigma6131-99-3
Recubrimiento por pulverización catódicaLeicaACE200
TiocarbohidrazidaSigma2231-57-4
Acetato de uraniloTED PELLACA96049
Ciencia de de

Referencias

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