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Artículo de método

Reconstitución del canal receptor de glutamato bacteriano mediante encapsulación de un sistema de expresión libre de células

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DOI:

10.3791/66595

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8 de marzo de 2024

 ,  , 
1Neuroscience Program, University of Michigan, Ann Arbor, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 5Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe el método de emulsión invertida utilizado para encapsular un sistema de expresión libre de células (CFE) dentro de una vesícula unilaminar gigante (GUV) para la investigación de la síntesis e incorporación de una proteína de membrana modelo en la bicapa lipídica.

Resumen

Los sistemas de expresión libre de células (CFE) son herramientas poderosas en biología sintética que permiten la biomímesis de funciones celulares como la biodetección y la regeneración de energía en células sintéticas. Sin embargo, la reconstrucción de una amplia gama de procesos celulares requiere la reconstitución exitosa de las proteínas de membrana en la membrana de las células sintéticas. Si bien la expresión de proteínas solubles suele tener éxito en los sistemas CFE comunes, la reconstitución de proteínas de membrana en bicapas lipídicas de células sintéticas ha demostrado ser un desafío. Aquí, se demuestra un método para la reconstitución de una proteína de membrana modelo, el receptor bacteriano de glutamato (GluR0), en vesículas unilaminares gigantes (GUVs) como células sintéticas modelo basado en la encapsulación e incubación de la reacción CFE dentro de células sintéticas. Utilizando esta plataforma, se demuestra el efecto de la sustitución del péptido señal N-terminal de GluR0 por el péptido señal de proteorrodopsina en la translocación cotraduccional exitosa de GluR0 en membranas de GUV híbridos. Este método proporciona un procedimiento robusto que permitirá la reconstitución libre de células de varias proteínas de membrana en células sintéticas.

Introducción

La biología sintética ascendente ha ganado un interés creciente en la última década como un campo emergente con numerosas aplicaciones potenciales en bioingeniería, administración de fármacos y medicina regenerativa 1,2. El desarrollo de células sintéticas como piedra angular de la biología sintética ascendente, en particular, ha atraído a una amplia gama de comunidades científicas debido a las prometedoras aplicaciones de las células sintéticas, así como a sus propiedades físicas y bioquímicas similares a las de las células que facilitan los estudios biofísicos in vitro 3,4,5,6 . Las células sintéticas a menudo se diseñan en vesículas unilaminares gigantes (GUV) del tamaño de una célula en las que se recrean diferentes procesos biológicos. La reconstitución del citoesqueleto celular 7,8, la regeneración de energía dependiente de la luz9, la comunicación celular10,11 y la biodetección12 son ejemplos de los esfuerzos realizados para reconstruir comportamientos similares a los de las células en células sintéticas.

Si bien algunos procesos celulares dependen de proteínas solubles, muchas características de las células naturales, como la detección y la comunicación, a menudo utilizan proteínas de membrana, incluidos canales iónicos, receptores y transportadores. Un desafío importante en el desarrollo de células sintéticas es la reconstitución de las proteínas de membrana. Aunque los métodos tradicionales de reconstitución de proteínas de membrana en bicapas lipídicas se basan en la purificación mediada por detergentes, estos métodos son laboriosos, ineficaces para proteínas que son tóxicas para el huésped de expresión o, a menudo, no son adecuados para la reconstitución de proteínas de membrana en GUV13.

Un método alternativo para la expresión de proteínas son los sistemas de expresión libre de células (CFE). Los sistemas CFE han sido una poderosa herramienta en biología sintética que permite la expresión in vitro de diversas proteínas utilizando lisado celular o maquinaria de transcripción-traducción purificada14. Los sistemas CFE también pueden encapsularse en GUVs, permitiendo así reacciones de síntesis de proteínas compartimentadas que pueden programarse para diversas aplicaciones, como la creación de células sintéticas de captación de luz9 o biosensores mecanosensibles15,16. De manera análoga a los métodos de expresión de proteínas recombinantes, la expresión de proteínas de membrana es un desafío en los sistemas CFE17. La agregación, el plegamiento incorrecto y la falta de modificación postraduccional en los sistemas CFE son cuellos de botella importantes que dificultan la síntesis exitosa de proteínas de membrana utilizando sistemas CFE. La dificultad de la reconstitución de proteínas de membrana de abajo hacia arriba utilizando sistemas CFE se debe en parte a la ausencia de una vía compleja de biogénesis de proteínas de membrana que se base en péptidos señal, partículas de reconocimiento de señales, translocones y moléculas acompañantes. Sin embargo, recientemente, múltiples estudios han sugerido que la presencia de estructuras membranosas como microsomas o liposomas durante la traducción promueve la expresión exitosa de proteínas de membrana 18,19,20,21. Además, Eaglesfield et al. y Steinküher et al. han descubierto que la inclusión de dominios hidrofóbicos específicos conocidos como péptidos señal en el extremo N-terminal de la proteína de membrana puede mejorar significativamente su expresión22,23. En conjunto, estos estudios sugieren que el desafío de la reconstitución de proteínas de membrana en células sintéticas puede superarse si la traducción de proteínas se produce en presencia de la membrana GUV y si se utiliza el péptido señal N-terminal adecuado.

En este trabajo se presenta un protocolo para la encapsulación de la síntesis de proteínas utilizando reacciones CFE de elementos recombinantes (PURE) para la reconstitución de proteínas de membrana en GUVs. Se selecciona el receptor bacteriano de glutamato24 (GluR0) como proteína modelo de membrana y se estudia el efecto de su péptido señal N-terminal en la reconstitución de su membrana. Se investiga el efecto del péptido señal de proteorrodopsina, que Eaglesfield et al.22 demostraron mejorar la eficiencia de la reconstitución de proteínas de membrana, mediante la construcción de una variante mutada de GluR0 denominada PRSP-GluR0 y se compara su expresión y localización en la membrana con GluR0 de tipo salvaje (en adelante, WT-GluR0) que alberga su péptido señal nativo. Este protocolo se basa en el método de emulsión invertida25 con modificaciones que lo hacen robusto para la encapsulación de CFE. En el método presentado, las reacciones de CFE se emulsionan primero utilizando una solución de lípidos en aceite que genera gotas del tamaño de una micra que contienen el sistema CFE y son estabilizadas por la monocapa de lípidos. A continuación, las gotas de emulsión se colocan sobre una interfaz aceite-agua que está saturada con otra monocapa lipídica. A continuación, las gotas de emulsión se ven obligadas a viajar a través de la interfaz aceite-agua mediante la fuerza centrífuga. A través de este proceso, las gotas obtienen otra monocapa, generando así una vesícula lipídica bicapa. A continuación, se incuban los GUV que contienen la reacción CFE, durante la cual se expresa la proteína de membrana y se incorpora a la membrana GUV. Aunque este protocolo está especificado para la expresión libre de células de GluR0, puede utilizarse para la síntesis libre de células de otras proteínas de membrana o para diferentes aplicaciones de células sintéticas, como la reconstitución de citoesqueletos o los estudios de fusión de membranas26.

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Protocolo

Los reactivos y equipos utilizados para este estudio se proporcionan en la Tabla de Materiales.

1. Reacciones masivas de CFE en presencia de pequeñas vesículas unilaminares (SUV)

  1. Preparación para SUV
    NOTA: Este paso debe realizarse en una campana extractora siguiendo las instrucciones de seguridad para trabajar con cloroformo.
    1. Prepare 5 mM de SUV de 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC) en un vial de vidrio transfiriendo 76 μL de solución madre de POPC de 25 mg/mL disuelta en cloroformo.
    2. Mientras gira suavemente el vial de vidrio, sople un suave chorro de argón en el vial para formar una película de lípidos secos en el fondo. A continuación, transfiera el frasco de vidrio a un desecador con la tapa sin enroscar para evaporar el exceso de cloroformo.
    3. Mantenga el vial de vidrio en el desecador durante 1 h. A continuación, añada 0,5 ml de agua desionizada ultrapura para disolver la película lipídica y el vórtice durante aproximadamente 2 minutos.
    4. Configure un mini aparato de extrusión sumergiendo dos soportes de filtro en agua desionizada y colocándolos en cada uno de los soportes de membrana interna. A continuación, empapa un filtro de policarbonato de 100 nm y colócalo entre los dos soportes de membrana interna unidos por la carcasa exterior del extrusor y la tuerca de retención. Coloque esta configuración en el soporte del extrusor.
    5. Enjuague dos jeringas herméticas al gas de 1 ml 3 veces con agua desionizada ultrapura.
    6. Cargue la muestra de mezcla de lípidos y agua en una de las jeringas herméticas a gas de 1 ml y colóquela en un extremo del mini extrusor utilizando los clips del brazo oscilante para mantener la jeringa en su lugar. Inserte la segunda jeringa en el otro extremo del miniextrusor y asegúrese de que esté completamente presionada.
      NOTA: Cuando cargue la jeringa con la mezcla de lípidos y agua, asegúrese de que no haya aire en la jeringa antes de pasarla a través de la miniextrusora.
    7. Pase suavemente la mezcla de lípidos y agua de la jeringa original a la jeringa vacía a través del aparato miniextrusor. Repita este paso 11 veces para formar SUV. Transfiera los SUV a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
      NOTA: La solución para SUV puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
  2. Conjunto de reacción CFE
    1. Ensamble la reacción CFE siguiendo el protocolo de expresión libre de células proporcionado por el fabricante con ligeras modificaciones que se detallan a continuación.
    2. Mezclar 10 μL de Solución 1 (que contiene aminoácidos, NTPs, ARNt y sustratos para enzimas, y el tampón necesario), 1 μL de Solución 2 (proteínas en glicerol al 20%), 2 μL de Solución 3 (ribosoma (20 μM)), cantidad adecuada de ADN que codifica para sfGFP-sfCherry(1-10)27 soluble (referido sfGFP soluble en adelante), WT-GluR0-sfGFP o PRSP-GluR0-sfGFP (10-60 ng/1000 pares de bases), 1 μL de inhibidor de la ARNasa murina y 4 μL de solución SUV de 5 mM para proteínas de membrana o 4 μL de agua para proteínas solubles.
    3. Lleve el volumen final de la reacción a 20 μL añadiendo agua desionizada ultrapura.
      NOTA: Al ensamblar el sistema CFE, todos los componentes deben mantenerse en hielo. Todos los materiales son sensibles a la temperatura y pueden degradarse si alcanzan la temperatura ambiente.
  3. Incubación y monitoreo de reacciones de CFE
    1. Transfiera la solución de CFE a una placa cónica de fondo en V de 96 pocillos. Para evitar la evaporación durante el curso de la reacción, cubra la placa con una película de sellado.
    2. Cocine la placa a 37 °C en un lector de placas durante 4-5 h mientras supervisa la reacción CFE midiendo la señal GFP con una ganancia de 100 a longitudes de onda de excitación/emisión de 488 nm/528 nm cada 2 minutos.

2. Reacciones de CFE encapsuladas en GUVs

  1. Preparación de la solución tampón externa GUV
    1. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, mezcle 1,5 μL de 1 M de espermidina, 37,5 μL de 100 mM de ATP, 25 μL de 100 mM de GTP, 12,5 μL de 100 mM de CTP, 12,5 μL de 100 mM de UTP, 25 μL de fosfato de creatina 1 M, 18 μL de acetato de magnesio 1 M, 93,33 μL de glutamato de potasio 3 M, 50 μL de 1 M HEPES KOH (pH 7,4), 1,15 μL de ácido folínico 332 mM, 100 μL de glucosa 2 M y 50 μL de solución madre de mezcla de 6 mM de cada uno de los 20 aminoácidos (preparados siguiendo el protocolo descrito por Sun et al.28).
    2. Lleve el volumen final de la solución a 1 mL agregando agua desionizada ultrapurificada.
      NOTA: Todos los componentes deben mantenerse en hielo. Agregue la mezcla de aminoácidos al final para evitar el agotamiento de aminoácidos28. La solución puede alícuota en alícuotas de 330 μL y almacenarse a -20 °C hasta su uso.
  2. Preparación de la mezcla de lípidos en aceite
    NOTA: este paso debe realizarse en una campana extractora siguiendo las instrucciones de seguridad para trabajar con cloroformo.
    1. En una campana extractora, mezcle 17,3 μL de 25 mg/mL de solución madre POPC y 1,08 μL de 50 mg/mL de copolímero de poli(butadieno)-b-poli(óxido de etileno) (PEO-b-PBD) en un vial de vidrio de 15 mL.
      NOTA: La solución final de lípidos en aceite contiene 0,5 mM de lípidos con 95% y 5% de POPC y PEO-b-PBD, respectivamente. El PEO-b-PBD se utilizó para mejorar la estabilidad de la membrana durante la expresión de proteínas, pero se mantuvo en una proporción molar baja para reducir la tendencia del copolímero a agregarse en micelas separadas de las moléculas lipídicas29,30.
    2. Sople con cuidado un suave chorro de gas argón en el vial de vidrio mientras gira el vial para evaporar el cloroformo.
    3. Pipetear 1,2 mL de aceite mineral ligero en el vial de vidrio de 15 mL que contiene los lípidos secos.
    4. Mezclar los lípidos y el aceite mediante vórtice a velocidad máxima durante 10-20 s. La mezcla de lípidos y copolímeros disueltos tendrá un aspecto turbio.
    5. Para asegurarse de que todos los posibles agregados lipídicos en el aceite se disuelvan y dispersen completamente por todo el aceite, coloque el vial de vidrio en un horno a unos 50 °C durante 20 minutos antes de vórtice durante 10-20 s adicionales a velocidad máxima.
  3. Ensamblaje y encapsulación de la reacción CFE (la Figura 1 resume los siguientes pasos).
    1. Prepare 300 μL de la solución externa de GUV en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL mezclando 270 μL de solución tampón externa de CFE preparada en el paso 2.1, 15 μL de 5 M de NaCl y 15 μL de 4,5 M de KCl.
      NOTA: En este paso, agregue 0,45 μL de 1,4-ditiotritol (DTT) de 1 M a la solución externa de GUV. El propósito de agregar NaCl y KCl es ajustar la osmolalidad de la solución externa para que coincida con la solución CFE interna. El volumen exacto de NaCl y KCl depende del ajuste de osmolalidad deseado. Se puede añadir NaCl o KCl o ambos para ajustar la osmolalidad.
    2. Pipetear suavemente 300 μL de mezcla de lípidos en aceite sobre la solución externa de GUV.
      NOTA: Al agregar la mezcla de lípidos y aceite, es importante que el aceite no se mezcle con la solución externa acuosa. Después de la adición, debe haber una interfaz visible entre la mezcla de lípidos en aceite y la solución externa de GUV.
    3. Incubar la interfaz aceite-agua a temperatura ambiente durante 2 h para permitir que se forme la monocapa lipídica y se estabilice en la interfaz.
    4. Mientras tanto, siga la sección 1.2.1 para ensamblar una reacción CFE que contenga el ADN plásmido que codifica las variantes de proteínas de membrana o GFP soluble. Reemplace los 4 μL de solución SUV de 5 mM o el agua con 4 μL de sacarosa 1 M. Esta reacción será la solución interna de GUV.
      NOTA: Se utilizó un osmómetro para medir la osmolalidad de las soluciones internas y externas. A continuación, la osmolalidad de la solución exterior se ajustó en consecuencia mediante la adición de NaCl o agua. La osmolalidad de la reacción CFE suele ser de alrededor de 1600 mOsm/Kg. La adición de sacarosa a la reacción aumenta la densidad de la solución interna, permitiendo así que las vesículas viajen a través de la interfaz aceite-agua durante la etapa de centrifugación. Una alternativa a la sacarosa es la solución de gradiente de densidad Opti-Prep.
    5. Agregue 600 μL de mezcla de lípidos y aceite al tubo de microcentrífuga que contiene la reacción CFE y pipetee hacia arriba y hacia abajo vigorosamente durante ~ 1 minuto para emulsionar la reacción en solución de lípidos en aceite y formar la monocapa de lípidos alrededor de las células sintéticas.
      NOTA: La solución final no debe tener burbujas y debe tener un aspecto opaco.
    6. Pipetear suavemente la emulsión de solución interna sobre la capa de aceite en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml donde se instaló la interfaz aceite-agua.
      NOTA: Tenga cuidado de no perturbar o desestabilizar la interfaz.
    7. Centrifugar durante 10 min a 2.000 x g a 4 °C.
      NOTA: La velocidad de centrifugación se optimizó para este protocolo. Adir et al.31 reportaron una velocidad de centrifugación diferente.
    8. Una vez finalizada la centrifugación, retire con cuidado el exceso de aceite y la solución exterior del tubo de microcentrífuga con una pipeta. Retire la solución exterior hasta que el volumen restante sea de alrededor de 100 μL.
      NOTA: Un pellet de GUV suele ser visible en la parte inferior del tubo de la microcentrífuga. Sin embargo, la falta de un pellet visible no significa necesariamente que no haya rendimiento de GUV. En lugar de usar una pipeta, el exceso de aceite en la parte superior de la solución exterior se puede eliminar por aspiración. Es fundamental asegurarse de que la solución de lípidos en aceite se elimine por completo. La contaminación del aceite en la solución GUV puede causar imágenes de baja calidad.
    9. Vuelva a suspender el gránulo de GUV en la solución restante de 100 μl pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. A continuación, transfiera la solución GUV a una placa de fondo plano limpia de 96 pozos para incubar.

3. Incubación e imagen encapsuladas de la reacción CFE

  1. Cubra la placa con una película de sellado para evitar la evaporación. Incubar la placa a 37 °C durante 5-6 h. Se puede utilizar un lector de placas y seguir el paso 1.3.2 para preparar el lector de placas para la etapa de incubación.
  2. Una vez finalizada la incubación, coloque la placa de 96 pocillos en la platina de imagen de un microscopio invertido equipado con una cámara EMCCD (o una cámara sCMOS), un láser controlado por DAQ-MX (o un sistema combinado de láser integrado) y un disco giratorio CSU-X1 confocal (o un confocal de escaneo láser). Concéntrese en cualquier ROI que contenga GUV y capture imágenes a una longitud de onda de excitación de 488 nm utilizando un objetivo Plan-Apochromat 60 x/1.4 NA.
  3. Guarde imágenes de GUV en formato .tiff.
  4. Abra las imágenes en un software de procesamiento de imágenes (por ejemplo, ImageJ o Fiji). Abra el panel de configuración de Brillo/Contraste . Ajuste el brillo y el contraste a la configuración adecuada que haga visibles las proteínas fluorescentes.
  5. Si el objetivo es comparar la intensidad de la señal de diferentes proteínas expresadas, primero apile imágenes individuales de GUV que contengan diferentes proteínas utilizando el panel Imágenes para apilar ubicado en el submenú Imagen > Pilas . A continuación, ajusta el brillo y el contraste de todas las imágenes con el panel Brillo/Contraste .

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Resultados

Antes de la encapsulación de las reacciones CFE, dos variantes de GluR0-sfGFP que albergaban péptidos señal nativos y proteorrodopsina (las secuencias de péptidos señal se presentan en la Tabla Suplementaria 1), y el sfGFP soluble se expresaron individualmente en reacciones masivas, y su expresión se monitoreó mediante la detección de la señal de sfGFP utilizando un lector de placas (Figura 2A). Las proteínas de membrana se expresaron en ausencia o presencia...

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Discusión

Prácticamente cualquier proceso celular que dependa de la transferencia de moléculas o información a través de la membrana celular, como la señalización celular o la excitación celular, requiere proteínas de membrana. Por lo tanto, la reconstitución de proteínas de membrana se ha convertido en el principal cuello de botella en la realización de varios diseños de células sintéticas para diferentes aplicaciones. La reconstitución tradicional mediada por detergentes de proteínas de membrana en membranas biológicas requiere ...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

APL agradece el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias (EF1935265), los Institutos Nacionales de Salud (R01-EB030031 y R21-AR080363) y la Oficina de Investigación del Ejército (80523-BB)

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Filtro de policarbonato de 100 nmSTERLITECH1270193
96 Placa inferior transparente de 96 pozosThermoFisher Scientific165305
BioTek Synergy H1M Lector multimodo híbridoAgilent11-120-533
Fosfato de creatinaMillipore Sigma10621714001
CSU-X1 Unidad de escáner confocalYokogawaCSU-X1 
Gradiente de densidad medio (Optiprep)Millipore SigmaD1556Opcional para cambiar con sacarosa en solución interna
Soportes de filtroMicrotubos Avanti610014
Fisherbrand (1,5 mL)Fisher Scientific05-408-129 
Ácido folínico, sal, sal, hidratoMillipore SigmaF7878
GlucosaMillipore Sigma158968
HEPESMillipore SigmaH3375
iXon X3 cámara AndorDU-897E-CS0 
Ácido L-glutámico sal de potasio monohidratoMillipore SigmaG1501
Aceite mineral ligeroMillipore SigmaM5904
Acetato de magnesio tetrahidratado;Millipore SigmaM5661
Kit de miniextrusora (incluye soporte para jeringa y soporte para extrusora)Microscopio610020
Olympus IX81 OlympusIX21
Olympus PlanApo N 60x Microscopio de aceite Objetivo Olympus1-U2B933 
PEO-b-PBDFuente de polímeroP41745-BdEO
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP ADN plásmidocaseroN/A
pET28b-sfGFP-sfCereza (1-10) ADN plásmidocaseroN/A
pET28b-WT-GluR0-sfGFP ADN plásmidocaseroN/A
Lípido POPC en cloroformo Avanti850457C
Cloruro de potasioMillipore SigmaP9541
PUREfrex 2.0Cosmo Bio USAGFK-PF201
Juego de soluciones de ribonucleótidosNew England BioLabsN0450
Inhibidor de ARNasa, MurineNew England BioLabsM0314S
RTS Muestreador de aminoácidosBiotechrabbitBR1401801
Cloruro de sodioMillipore SigmaS9888
EspermidinaMillipore SigmaS2626
SacarosaMillipore SigmaS0389
VAPRO Osmómetro de Presión de Vapor modelo 5600ELITechGroupVAPRO 5600
, , , invertido Avanti

Referencias

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