Los modelos de pulmón en chip superan a los cultivos 2D tradicionales al imitar la interfaz aire-líquido y la perfusión de células endoteliales, simulando el flujo sanguíneo y el intercambio de nutrientes cruciales para los estudios de fisiología pulmonar. Esto aumenta la relevancia de la investigación pulmonar, ya que ofrece un entorno dinámico y fisiológicamente preciso para avanzar en la comprensión y el tratamiento de las infecciones respiratorias.
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Artículo de método
Modelo de alvéolo en chip inmunocompetente para el estudio de las respuestas inmunitarias de la mucosa alveolar
En este artículo
Resumen
Resumen
Presentamos un modelo avanzado de pulmón en chip inmunocompetente diseñado para replicar la estructura y función alveolar humana. Este innovador modelo emplea un biochip perfundido microfluídicamente que admite una interfaz aire-líquido que imita el entorno en los alvéolos humanos. La ingeniería de tejidos se utiliza para integrar componentes celulares clave, incluidas las células endoteliales, los macrófagos y las células epiteliales, para crear un modelo de tejido representativo del alvéolo. El modelo facilita el examen en profundidad de las respuestas inmunitarias de la mucosa a diversos patógenos, incluidos virus, bacterias y hongos, avanzando así en nuestra comprensión de la inmunidad pulmonar. El objetivo principal de este protocolo es proporcionar detalles para establecer este modelo de alvéolo en chip como una plataforma in vitro robusta para estudios de infección, lo que permite a los investigadores observar y analizar de cerca las complejas interacciones entre los patógenos y el sistema inmunológico del huésped dentro del entorno pulmonar. Esto se logra mediante la aplicación de técnicas basadas en microfluídica para simular las condiciones fisiológicas clave de los alvéolos humanos, incluido el flujo sanguíneo y la estimulación biomecánica de las células endoteliales, junto con el mantenimiento de una interfaz aire-líquido crucial para la exposición realista de las células epiteliales al aire. El sistema modelo es compatible con una serie de ensayos estandarizados, como la tinción de inmunofluorescencia, el perfil de citocinas y el análisis de unidades formadoras de colonias (UFC)/placa, lo que permite obtener información completa sobre la dinámica inmunitaria durante la infección. El alvéolo en chip está compuesto por tipos de células esenciales, incluidas las células epiteliales pulmonares distales humanas (H441) y las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) separadas por membranas porosas de tereftalato de polietileno (PET), con macrófagos primarios derivados de monocitos estratégicamente ubicados entre las capas epitelial y endotelial. El modelo de tejido mejora la capacidad de diseccionar y analizar los factores matizados implicados en las respuestas inmunitarias pulmonares in vitro. Como herramienta valiosa, debería contribuir al avance de la investigación pulmonar, proporcionando un modelo in vitro más preciso y dinámico para estudiar la patogénesis de las infecciones respiratorias y probar posibles intervenciones terapéuticas.
Introducción
El pulmón humano tiene un papel notable en la respiración y la defensa inmunitaria, con interacciones complejas entre las respuestas inmunitarias de la mucosa alveolar1. La capacidad de los alvéolos para crear una respuesta inmunitaria eficiente es vital para prevenir infecciones pulmonares y garantizar la salud pulmonar. Dado que los pulmones están constantemente expuestos a una amplia gama de riesgos potenciales, incluidas bacterias, virus, hongos, alergias y partículas, comprender las complejidades de las respuestas inmunitarias de la mucosa alveolar es fundamental para descubrir los mecanismos detrás de las infecciones respiratorias, los trastornos inflamatorios y el tratamientode las enfermedades pulmonares.
Para estudiar in vitro los procesos relacionados con la infección y la inflamación de las vías respiratorias, se requieren modelos que puedan imitar fielmente el medio alveolar y las respuestas inmunitarias. Los módulos de cultivo celular y animal en 2D se han utilizado durante décadas como herramientas esenciales para la investigación biomédica sobre la respuesta inmunitaria pulmonar. Sin embargo, a menudo tienen limitaciones en su potencial de traducción a situaciones humanas. Los modelos lung-on-chip pueden contribuir a llenar el vacío entre los modelos tradicionales in vitro e in vivo y proporcionar un enfoque novedoso para estudiar las respuestas inmunitarias específicas de los humanos 2,3. Los modelos de pulmón en chip pueden imitar la interfaz aire-líquido, que es necesaria para que las células pulmonares recapitulen las condiciones fisiológicas del tracto respiratorio y desarrollen un modelo de tejido más preciso y robusto. Esta técnica de cultivo permite un examen preciso de la diferenciación, el funcionamiento y las respuestas celulares a fármacos o estímulos relacionados con enfermedades in vitro2.
En este estudio, presentamos un modelo basado en microfluídica del alvéolo humano como una herramienta eficaz para recapitular el medio alveolar humano mediante la aplicación de perfusión para imitar el flujo sanguíneo y la estimulación biomecánica de las células endoteliales e incorporando una interfaz aire-líquido con células epiteliales expuestas hacia una fasede aire 4. Hemos desarrollado un alvéolo microfluídico perfundido en chip que imita la estructura física y las interacciones biológicas del alvéolo humano, con un enfoque particular en la interfaz aire-líquido. Esta interfaz desempeña un papel crucial en la diferenciación de las células epiteliales respiratorias, que es esencial para modelar con precisión el entorno pulmonar. El modelo utiliza células epiteliales pulmonares distales humanas (H441) y células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), separadas por membranas porosas de tereftalato de polietileno (PET), con macrófagos primarios derivados de monocitos colocados entre las capas celulares. Esta configuración replica la intrincada disposición celular del alvéolo y es fundamental para simular con precisión la interfaz aire-líquido, que es un factor importante en la función fisiológica del tejido pulmonar.
La razón de ser del desarrollo del modelo se extiende a la integración de las células inmunitarias circulantes y residentes en los tejidos. Este enfoque está diseñado para imitar con precisión la respuesta inflamatoria del huésped a las infecciones respiratorias humanas, proporcionando un entorno dinámico para estudiar las interacciones patógeno-huésped. La presencia de macrófagos permite examinar las respuestas inmunitarias inmediatas y su interacción con los patógenos, lo que refleja la primera línea de defensa contra las infecciones respiratorias. Además, el diseño de la plataforma de biochip facilita la manipulación cómoda y precisa de las señales biofísicas y bioquímicas, lo que es crucial para replicar la función de los alvéolos in vitro. Esta flexibilidad es fundamental para diseccionar los factores que contribuyen a las infecciones humanas, lo que permite a los investigadores ajustar las condiciones para reflejar diversos estados de enfermedad o probar posibles intervenciones terapéuticas. La compatibilidad de la plataforma con múltiples tecnologías de lectura, incluida la microscopía avanzada, los análisis microbiológicos y el análisis bioquímico de efluentes, mejora su utilidad. Estas capacidades permiten una evaluación exhaustiva de la respuesta de los tejidos a las infecciones, incluida la evaluación del comportamiento celular, la proliferación de patógenos y la eficacia de las respuestas inmunitarias.
Presentamos un protocolo detallado y técnicas para crear y utilizar un modelo de alvéolo humano en chip centrado en replicar la interfaz aire-líquido e integrar células inmunitarias para estudiar las infecciones humanas in vitro.
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Protocolo
Las células HUVEC se aíslan de los cordones umbilicales y se utilizan hasta el paso 4. Los monocitos primarios se aíslan de donantes sanos a partir de sangre entera. El estudio fue aprobado por el comité de ética del Hospital Universitario de Jena, Jena, Alemania (3939-12/13). De acuerdo con la Declaración de Helsinki, todas las personas que donaron células para el estudio dieron su consentimiento informado.
1. Día 1: Preparación del biochip
- Los biochips están disponibles en diferentes tamaños y modelos. Para los experimentos aquí, use el modelo BC002. Coloque el biochip en una placa de Petri de vidrio, llene la placa y enjuague todas las cavidades con etanol estéril al 70% (EthOH). Incubar durante 45 min a temperatura ambiente. A continuación, enjuague las cavidades 2 veces con ddH2O. Estéril Retire el ddH2O.
- Cubra la membrana del biochip de ambas cavidades con una solución intravenosa estéril de colágeno (0,5 mg/ml en ácido acético 0,5 mM; utilice una concentración de 1:100 en la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco que contiene PBS de magnesio y calcio (+/+)) enjuagando suavemente la solución de colágeno IV a través de ambas cavidades utilizando una pipeta de 1.000 μL con puntas azules. Incubar durante 15 min a 37 °C y 5% deCO2.
NOTA: Se recomienda utilizar una pipeta de 1.000 μL con puntas de filtro azul (P1000) durante todo el protocolo. El diámetro de la abertura de la punta del filtro cubre completamente la apertura de los puertos que conectan los canales, lo que evita la inserción de burbujas de aire en el chip. - Después de 30 minutos de incubación, enjuague las cámaras inferior y superior 2 veces con PBS estéril (+/+) para eliminar el colágeno y el ácido acético restantes.
- Prepare el medio EC añadiendo penicilina/estreptomicina 1:100 (v/v) (10.000 U/mL). Llene la cámara superior de cada cavidad con 250 μL de medio EC y la cámara inferior con 150 μL de medio EC.
- Cosechar HUVEC de un matraz T25 confluente: Lavar con 5 mL de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin PBS de magnesio y calcio (-/-), añadir 1 mL de tripsina al 0,25% + 1 mM de EDTA en PBS (-/-) e incubar durante 3 min a 37 °C. Detenga la actividad de la tripsina añadiendo 5 mL de PBS (+/+) + 5% FCS y centrifugue a 350 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT) en un tubo cónico de 50 mL. Retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en 1 mL de medio EC.
- Utilice una dilución en serie 1:10 cuando realice el recuento de células. Añada 10 μL del pellet de célula resuspendida a 90 μL de medio celular. Combine las muestras con cuidado. Utilice un tubo de microcentrífuga con 10 μL de tinte azul de tripano. Diluya la solución celular con azul de tripán (1:1) utilizando portaobjetos de la cámara de recuento de células. Cuente las células manualmente con una cámara de Neubauer o con un contador de células automatizado. Determine el recuento de células y ajuste la concentración a 0,4 x 106 células por 200 μL.
- Sustituya el medio de células endoteliales en la cámara superior del biochip por 200 μL de medio EC que contenga HUVEC en suspensión. Pipetear suavemente para evitar la formación de burbujas de aire en los canales o cámaras. Coloque la placa de Petri de vidrio con los biochips a 37 °C y 5% de CO2.
2. Día 2: Comprobación de la capa celular
- El día 2, compruebe visualmente la confluencia de la capa de células HUVEC en la cámara superior. Realice el intercambio de medio en la cámara superior con 300 μL de medio EC. Pipetear suavemente para evitar el desprendimiento de células de la membrana. Realice el intercambio de medios diariamente después de 24 horas. Vuelva a colocar la placa de Petri de vidrio con los biochips a 37 °C y 5% deCO2.
3. Día 3: Preparación de la cámara inferior
- Comprobar visualmente la confluencia de la capa de células endoteliales. En este punto, determine la presencia de una capa confluente y una morfología similar a un adoquín (Figura 1). Realice el intercambio de medio en la cámara superior con 300 μL de medio EC.
- A continuación, prepare la cámara inferior para sembrar las células que forman la capa epitelial. Enjuague suavemente la cámara inferior con 150 μL del medio RPMI (agregue 1:100 (v/v) de penicilina/estreptomicina (10,000 U/mL), suero fetal de vaca al 5%, 1 μM de dexametasona).
- Para la cámara inferior, siembra 0,5 x 106 células H441 suspendidas en 200 μL de medio RPMI (RPMI) por cavidad.
- Recolección de células H441
- Lave las células con 5 mL de PBS (-/-) una vez. Añadir 2 mL de tripsina al 0,25% + 1 mM de EDTA en PBS (-/-).
- Incubar las células durante 5 min a 37 °C y 5% de CO2. El tiempo de incubación varía en función de la confluencia de la capa. En 5-7 minutos, las células deberían desprenderse por completo.
- Detenga la actividad de tripsina con 10 mL de PBS (+/+) + 5% de FBS, recoja las células y centrifugue a 200 x g durante 4 min.
- Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 1 mL de RPMI y cuente.
- Siembre 0,5 x 106 células por cámara pipeteando suavemente la solución celular en la cámara inferior. Cierre todos los puertos y voltee el biochip al revés para que las células puedan adherirse a la membrana PET. Mantenga el biochip boca abajo e incube durante la noche en una incubadora de cultivo celular a 37 °C y 5% de CO2.
4. Día 4 - Día 7: Mantenimiento de células y recolección de monocitos
- Realice el intercambio diario de medios en la cámara superior e inferior. Para la cámara superior, realice el intercambio de medio con 300 μL de medio EC.
- Utilice 200 μL de RPMI+ (medio RPMI más 1:100 (v/v) de penicilina/estreptomicina (10.000 U/mL), 10 ng/mL GM-CSF, 10% de suero humano autólogo, 1 μM de dexametasona) para la cámara inferior. El día 7, enjuague la cámara inferior con RPMI+ para preparar la cavidad para la siembra de monocitos.
- Semilla 0,1 x 106 monocitos suspendidos en 200 μL RPMI+ en la cámara inferior.
- Recolección de monocitos
- Lavar las células con 1 mL de PBS (-/-) e incubar durante 7 min a 37 °C en PBS precalentado (-/-) que contenga 4 mg/mL de lidocaína + 5 mM de EDTA a 37 °C y 5% de CO2.
- Recoja las células y centrifugue a 350 x g durante 7 minutos, vuelva a suspender las células en 1 ml de RPMI+ y cuente. Coloque los puertos del biochip hacia abajo para que las células se adhieran a la membrana.
5. Día 8: Perfusión de biochips
- En este punto, asegúrese de que los biochips estén listos para conectarse al flujo y perfundirse. Antes de iniciar la perfusión, prepare una incubadora vacía y coloque la bomba peristáltica en su interior.
- Perfusión de los biochips
- Antes de conectar el tubo esterilizado al biochip, enjuague el tubo con 200 μL de PBS (+/+), seguido de 200 μL de medio EC. El tubo tiene un diámetro interior de 0,5 mm, que consta de lados más largos (20 cm) y más cortos (12 cm) divididos por dos tapones de bomba peristáltica. Deje el tubo a un lado y prepare los depósitos para el medio.
- Realice el intercambio de medios en las cámaras superior e inferior enjuagándolas con el respectivo medio de cultivo celular recién preparado.
- Inserte el depósito en el lado de salida del biochip y conecte el depósito con la tubería a la entrada del biochip (Figura 2). Conecte el tubo al depósito y al biochip de modo que haya una perfusión circular del medio entre el depósito y el biochip.
- Una vez que todo esté conectado a los puertos, llene el depósito con 500 μL de medio EC. Conecte el biochip con el tubo en una perfusión con un caudal de 21 μL/min (Figura 2). Observar de cerca durante los primeros 15 min de perfusión para la inserción de burbujas. Realizar el intercambio de medios diariamente en ambas cámaras.
6. Día 9 - Día 11: Establecimiento de una interfaz aire-líquido
- Detenga la perfusión, vacíe los depósitos y vuelva a llenar con medio recién preparado debajo de un gabinete de seguridad estéril. Pipetear 500 μL de medio EC en los depósitos y enjuagar suavemente la cámara inferior con 200 μL de RPMI+. Iniciar de nuevo la perfusión con una tasa de perfusión de 21 μL/min.
- Interfaz aire-líquido (ALI)
- Establecer el ALI desde el día 12 hasta el final del experimento (día 14). Durante el cultivo de ALI, exponga las células epiteliales al aire.
- Para establecer el cultivo de ALI, prepare un nuevo medio vascular EC (añadir 1:100 (v/v) de penicilina/estreptomicina (10.000 U/mL), 10 ng/ml de GM-CSF, 20% de suero humano autólogo, 1μM de dexametasona) para mantener todos los tipos de células en el chip. En este punto, el medio contiene una mayor concentración de AS (20%).
- Abra los tapones en la cámara inferior debajo de un gabinete de seguridad estéril y absorba cuidadosamente el medio hasta que se vea una burbuja de aire, como se muestra en la Figura 3. Asegúrese de que se haya retirado todo el líquido del canal y de la cámara y cierre los puertos con cuidado.
- Llene los depósitos con medio EC (-/-) y continúe el cultivo de perfusión con un caudal de 21 μL/min. Intercambie el medio solo en la cámara superior hasta el día 14 y mantenga las células epiteliales en la cámara inferior solo con aire.
7. Día 14: Recolección y análisis de tejidos
- Desconecte el biochip del flujo. Conecte el tubo y verifique en el microscopio la confluencia celular. Debido al aire en la cámara inferior, las capas celulares pueden parecer borrosas y difíciles de visualizar. En este punto, el modelo está listo para una mayor experimentación.
- Fijación y tinción de tejido en biochip
- Lave las cavidades con PBS (+/+) para eliminar el medio de cultivo celular. Pipetear 300 μL de paraformaldehído (PFA) al 4% disuelto en PBS (-/-) en la cámara superior y 200 μL en la cámara inferior e incubar durante 10 min en RT.
NOTA: Cuando trabaje con productos químicos de fijación como PFA, use una campana extractora. Recoja y elimine los desechos en consecuencia. - Lave las cámaras 3 veces con PBS (+/+). Después de la fijación, almacene los biochips a 4 °C o utilícelos directamente para la tinción con inmunofluorescencia de las células.
- Para la permeabilización, pipetea 300 μL de Triton X-100 al 0,25% en PBS (+/+). Incubar durante 30 min en RT.
- Después de la incubación, lavar ambas cámaras con PBS (+/+) y pipetear 300 μL de albúmina sérica bovina (BSA) al 3% en PBS (+/+) en ambas cámaras. Incubar durante 1 h en RT.
- Mientras tanto, prepare el panel de anticuerpos para la tinción de inmunofluorescencia. Para preparar el panel de anticuerpos para la tinción de inmunofluorescencia, se colocó un tubo con una cantidad suficiente de BSA al 3% para diluir los anticuerpos. Utilice 50 μL de diluciones de anticuerpos para cada membrana. Utilice una proporción de dilución de 1:100 para los paneles de anticuerpos primarios y de 1:200 para los paneles de anticuerpos secundarios. Además, para el panel de anticuerpos secundarios, prepare DAPI en una proporción de dilución de 1:2.000. Para los anticuerpos correspondientes, ver (Tabla 1).
- Para acceder directamente a las células dentro del biochip, se debe quitar la lámina de unión. Para abrir las cámaras microfluídicas, haga un corte exacto en el exterior de la cavidad y retire la lámina de unión. Corta la membrana quitando los bordes sellados al biochip con el bisturí.
NOTA: Trabaje con precisión y exactitud durante este paso para evitar daños en la membrana y lesiones debidas al filo del bisturí. - Después de separar la membrana del biochip, divida la membrana en dos partes. Recoja las piezas de membrana con una pinza y colóquelas en un portaobjetos microscópico para teñirlas.
- Pipetear 50 μL de solución de anticuerpos por pieza de membrana. Incubar durante la noche a 4 °C, protegido de la luz.
- Después de la incubación, coloque la membrana en 500 μL de PBS (-/-) en una placa de 24 pocillos y lave la membrana 3 veces durante 5 minutos cada una en PBS (+/+). Después del lavado, pipetear 50 μL de solución de anticuerpos secundarios e incubar durante 1 h a RT protegido de la luz.
- Lave la membrana con PBS (+/+) 3 veces durante 5 minutos cada una. Mientras tanto, prepare y etiquete los portaobjetos microscópicos para el experimento. Coloque una gota de medio de montaje en la corredera y coloque la membrana correspondiente. Repita este paso para todas las membranas. Al final, coloque una gota más del medio de montaje en la parte superior de la membrana y use un cubreobjetos. Conservar a 4 °C.
- Lave las cavidades con PBS (+/+) para eliminar el medio de cultivo celular. Pipetear 300 μL de paraformaldehído (PFA) al 4% disuelto en PBS (-/-) en la cámara superior y 200 μL en la cámara inferior e incubar durante 10 min en RT.
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Resultados
Un examen de las alteraciones morfológicas y la expresión de proteínas marcadoras podría realizarse mediante tinción de inmunofluorescencia. Después de co-cultivar durante 14 días, los lados vascular y epitelial se analizan para la expresión de los marcadores celulares respectivos. Este método es útil para estudiar las interacciones y la integridad de los componentes vasculares y epiteliales, lo cual es esencial para el modelado de enfermedades como una lectura biológica funcional relacionada con la infección. La tinción...
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Discusión
El modelo de alvéolo en chip representa un modelo de tejido multicapa del alvéolo humano, que integra tipos de células esenciales del tracto respiratorio inferior, incluidas las células epiteliales pulmonares, las células endoteliales y los macrófagos, cultivadas en una disposición organotípica en un ALI con perfusión media del revestimiento endotelial. Las células de diferentes capas expresan proteínas marcadoras celulares específicas, como la E-cadherina, una molécula de adhesión dependiente del calcio de las células e...
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Divulgaciones
K.R. es director ejecutivo de Dynamic42 GmbH y posee acciones en la empresa. A.S.M. es asesor científico de Dynamic 42 GmbH y posee acciones en la empresa. Todos los demás autores no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
H.K. y A.S.M. reconocen la financiación del Leibniz Science-Campus InfectoOptics Jena, financiada por la línea de financiación Strategic Networking de la Asociación Leibniz. M.A. y A.S.M. recibieron el apoyo del proyecto IMPROVE del IGF, financiado por el Ministerio Federal de Economía y Energía sobre la base de una resolución del Bundestag alemán. A.S.M agradece además el apoyo financiero del Clúster de Excelencia Balance of the Microverse en el marco de la Estrategia de Excelencia de Alemania - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Consumibles | |||
| células (Countess) | Invitrogen | C10283 | |
| Cultivo celular Placas multipocillo, 24 pocillos, estéril | Greiner Bio-One | 662 160 | |
| Cultivo celular Placas multipocillo, 6 pocillos, estériles | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| cubreobjetos (24x40mm; #1.5) | Menzel-Glä ser | 15747592 | |
| Toallitas ecológicas | Dr. Schuhmacher | 00-915-REW10003-01 | |
| Eppies 2.0 | Sarstedt | 72.691 | |
| Eppis 0.5 | Sarstedt | 72.699 | |
| Eppis 1.5 | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Halcones 15mL | Greiner Bio-One | 188 271-TRI | |
| Halcones 50mL | Greiner Bio-One | 227 261-TRI | |
| Hisopo de gasa | Noba | PZN 2417767 | |
| Guantes Nitril 3000 | Meditrade | 1280 | |
| Portaobjetos de microscopio | Menzel-Glä ser | AAAA000001##12E | |
| Placas Multipocillos 24 Pocillos, estériles | Greiner Bio-One | 662 160 | |
| Pipetas Pasteur (vidrio) 150mm | Assistent | 40567001 | |
| pipetas Pasteur (vidrio) 230mm | Assistent | 40567002 | |
| Tubos de fondo redondo (PS, 5mL) | Falcon | 352052 | |
| Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm | Sarstedt | 85.1637.235 | |
| Bisturíes | Dahlhausen | 11.000.00.715 | |
| Pipetas serológicas 10mL | Greiner Bio-One | 607 160-TRI | |
| Pipetas serológicas 25mL | Greiner Bio-One | 760 160-TRI | |
| Pipetas serológicas 2mL | Greiner Bio-One | 710 160-TRI | |
| Pipetas serológicas 50mL | Greiner Bio-One | 768 160-TRI | |
| Pipetas serológicas 5mL | Greiner Bio-One | 606 160-TRI | |
| S-Monovette, 7,5ml Z-Gel | Sarstedt | 1.1602 | |
| S-Monovette, 9,0ml K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | |
| Matraz Softasept | N Braun | 3887138 | |
| T25 | Greiner Bio-One | 690 960 | |
| Puntas estériles 10µ L | Greiner Bio-One | 771 261 | |
| Puntas estériles 1250µ L | Greiner Bio-One | 750 261 | |
| Puntas estériles 300µ L | Greiner Bio-One | 738 261 | |
| Puntas no estériles 10µ L | Greiner Bio-One | 765 290 | |
| Puntas no estériles 1000µ L | Greiner Bio-One | 739 291 | |
| Puntas no estériles 200µ L | Pinzas Greiner Bio-One | 686 290 | |
| (Prä zisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) | Roth | K343.1 | |
| Chemicals | |||
| Descosept AF | Dr. Schuhmacher | N-20338 | |
| Etanol 96% | Nordbrand-Nordhausen | 410 | |
| Isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano (3-5kDa) | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Medio de montaje fluorescente | Dako | S3023 | |
| Metanol | VWR | 20847.295 | |
| Saponina | Fluka | 47036 | |
| Tergazyme | Alconox | 1304-1 | |
| Cell culture | |||
| Collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533-5MG | |
| Dexametason | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DPBS (-/-) | Lonza | BE17-516F | |
| DPBS (+/+) | Lonza | BE17-513F | |
| Solución EDTA | Sigma-Aldrich | E788S | |
| Suero fetal bovino | Sigma-Aldrich | E2129-10g | |
| H441 | ATCC | ||
| Recombinante humano GM-CSF | Peprotech | 300-30 | |
| Lidocaína | Sigma-Aldrich | L5647-15G | |
| Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 /-163 | |
| RPMI | Gibco | ||
| Tinción azul de tripano 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
| Tripsina | Gibco | 15090-046 | |
| Anticuerpos primarios | |||
| Cadherina-5 / VE-Cadherina (cabra) | BD | 610252 | |
| CD68 (conejo) | CellSignaling | 76437 | |
| E-Cadherin (cabra) | R& D | AF748 | |
| SP-A (ratón) | Abcam | ab51891 | |
| Anticuerpos secundarios | |||
| AF488 (anti ratón burro) | Invitrogen | R37114 | |
| AF647 (anti ratón burro) | invitrogen | A31571 | |
| AF647 (anti conejo burro) | Invitrogen | A31573 | |
| Cy3 (burro anti cabra) | jackson research | 705-165-147 | |
| Microfluídico | |||
| Chip | Dynamic 42 | BC002 | |
| Macho Luer Lock (pequeño) | ChipShop | 09-0503-0270-09 | |
| Enchufes mini luer macho, fila de cuatro,PP, verde | Chipshop microfluídico | 09-0558-0336-11 | |
| Tapones mini luer macho, fila de cuatro,PP, opaco | Chipshop microfluídico | 09-0556-0336-09 | |
| Tapones mini luer macho, fila de cuatro,PP, rojo | Chipshop microfluídico | 09-0557-0336-10 | |
| Tapones | Cole Parmer | GZ-45555-56 | |
| Depósito 4.5mL | ChipShop | 16-0613-0233-09 | |
| Tubo | Dynamic 42 | ST001 | |
| Equipment | |||
| Autoclave | Tuttnauer | 5075 ELV | |
| Centrífuga | Eppendorf | 5424 | |
| Incubadora de CO2 | Heracell | 150i | |
| Countess contador de células automatizado | Invitrogen | C10227 | |
| Citómetro de flujo | BD | FACS Canto II | |
| Congelador (-20 ° C) | Congelador Liebherr | LCexv 4010 | |
| (-80 ° C) | Heraeus | Herafreeze HFU 686 | |
| Nevera | Liebherr | LCexv 4010 | |
| Heraeus Multifuge | Microscopio Thermo Scientific | X3R | |
| Leica | DM IL LED | ||
| Agitador orbital | Heidolph | Reax2000 | |
| Bomba peristáltica | REGLO Digital MS-4/12 | ISM597D | |
| Pipetas 10µ L | Eppendorf Research plus | 3123000020 | |
| Pipetas 100µ L | Eppendorf Research plus | 3123000047 | |
| Pipetas 1000µ L | Eppendorf Research plus | 3123000063 | |
| Pipetas 2.5µ L | Eppendorf Research plus | 3123000012 | |
| Pipetas 20µ L | Eppendorf Research plus | 3123000039 | |
| Pipetas 200µ L | Eppendorf Research plus | 3123000055 | |
| Escala | Sartorius | 6101 | |
| Escala | Sartorius | TE1245 | |
| Banco estéril | Kojair | Biowizard SL-130 | |
| Baño de agua | Julabo SW-20C | ||
| Configuración de microscopio de fluorescencia | |||
| Apotome.2 | Zeiss Dispositivo de | ||
| iluminación | Zeiss | HXP 120 C | |
| Microscopio | Zeiss | Axio Observer 5 | |
| Seccionamiento óptico | Zeiss | ApoTome | |
| Microscopio | Zeiss | Eplax Vp232 | |
| Software | |||
| ZEN Edición Azul | Zeiss |
Referencias
- Mettelman, R. C., Allen, E. K., Thomas, P. G. Mucosal immune responses to infection and vaccination in the respiratory tract. Immunity. 55 (5), 749-780 (2022).
- Artzy-Schnirman, A., et al. Advanced in vitro lung-on-chip platforms for inhalation assays: From prospect to pipeline. Eur J Pharma Biopharma. 144, 11-17 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nat Meth. 13 (2), 151-157 (2016).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. A multi-organ chip with matured tissue niches linked by vascular flow. Nat Biomed Eng. 6 (4), 351(2022).
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- Schicke, E., et al. Staphylococcus aureus lung infection results in down-regulation of surfactant protein-a mainly caused by pro-inflammatory macrophages. Microorganisms. 8 (4), 577(2020).
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- Hoang, T. N. M., et al. Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection. Biomaterials. 283, 121420(2022).
- Yuksel, H., Ocalan, M., Yilmaz, O. E-cadherin: An important functional molecule at respiratory barrier between defence and dysfunction. Front Physiol. 12, 720227(2021).
- Van Roy, F., Berx, G. The cell-cell adhesion molecule e-cadherin. Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).
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