Artículo de método

Modelo inmunocompetente de intestino en chip para analizar las respuestas inmunitarias de la mucosa intestinal

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DOI:

10.3791/66603

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24 de mayo de 2024

 ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry II, Jena University Hospital, 2Cluster of Excellence Balance of the Microverse, Friedrich Schiller University, 3Jena School of Microbial Communication, Friedrich Schiller University, 4Dynamic42 GmbH, 5Jena Center for Sepsis Control and Care, Jena University Hospital

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Nuestro protocolo detallado describe la creación y el uso del modelo avanzado de intestino en chip, que simula la mucosa intestinal humana con estructuras 3D y varios tipos de células, lo que permite un análisis en profundidad de las respuestas inmunitarias y las funciones celulares en respuesta a la colonización microbiana.

Resumen

Se ha desarrollado un modelo avanzado de intestino en chip que recrea estructuras epiteliales organotípicas en 3D, vellosidades y criptas. El modelo inmunocompetente incluye células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), células epiteliales intestinales Caco-2, macrófagos residentes en el tejido y células dendríticas, que se autoorganizan dentro del tejido, reflejando las características de la mucosa intestinal humana. Un aspecto único de esta plataforma es su capacidad para integrar células inmunitarias primarias humanas circulantes, lo que mejora la relevancia fisiológica. El modelo está diseñado para investigar la respuesta del sistema inmunitario intestinal a la colonización e infección bacteriana y fúngica. Debido al tamaño de su cavidad ampliada, el modelo ofrece diversas lecturas funcionales, como ensayos de permeación, liberación de citocinas e infiltración de células inmunitarias, y es compatible con la medición de inmunofluorescencia de estructuras 3D formadas por la capa de células epiteliales. Por lo tanto, proporciona información completa sobre la diferenciación y la función celular. La plataforma de intestino en chip ha demostrado su potencial para dilucidar interacciones complejas entre sustitutos de una microbiota viva y tejido huésped humano dentro de una plataforma de biochip microfisiológico perfundido.

Introducción

Los sistemas Organ-on-Chip (OoC) representan una técnica emergente de cultivo celular en 3D que es capaz de cerrar la brecha entre el cultivo celular 2D convencional y los modelos animales. Las plataformas OoC suelen consistir en uno o más compartimentos que contienen células específicas de tejido cultivadas en una amplia gama de andamios, como membranas o hidrogeles1. Los modelos son capaces de imitar una o más funciones organotípicas definidas. Las bombas permiten la perfusión microfluídica continua del medio de cultivo celular para la eliminación de productos de desecho celular, el suministro de factores de nutrición y crecimiento para mejorar la diferenciación celular y la recreación de condiciones esenciales in vivo. Con la integración de células inmunitarias, los sistemas OoC pueden imitar la respuesta inmunitaria humana in vitro2. Hasta la fecha, se ha presentado una amplia gama de órganos y unidades funcionales1. Estos sistemas incluyen modelos de la vasculatura3, el pulmón4, el hígado 2,5 y el intestino6 que pueden facilitarse para las pruebas de drogas 5,7 y los estudios de infección 6,8.

Aquí presentamos un modelo de intestino humano en chip que integra células epiteliales humanas formando una topografía organotípica en 3D de estructuras en forma de vellosidades y criptas combinadas con un revestimiento endotelial y macrófagos residentes en los tejidos. El modelo se cultiva en un biochip perfundido microfluídicamente en formato de portaobjetos microscópico. Cada biochip consta de dos cavidades microfluídicas separadas. Cada cavidad está dividida por una membrana porosa de tereftalato de polietileno (PET) en una cámara superior e inferior. La membrana en sí también sirve como andamio para que las células crezcan a cada lado. Los poros de la membrana permiten la diafonía celular y la migración celular entre las capas celulares. Se puede acceder a cada cámara por dos puertos hembra del tamaño de una cerradura Luer. Opcionalmente, un puerto adicional del tamaño de una cerradura mini-luer puede proporcionar acceso a la cámara superior o inferior (Figura 1).

La plataforma OoC ofrece una serie de lecturas que se pueden obtener de un solo experimento. El intestino en chip está diseñado para combinar el cultivo de células 3D perfundidas, el análisis de efluentes y la microscopía de fluorescencia para evaluar la expresión de marcadores celulares, las tasas de metabolización, la respuesta inmunitaria, la colonización e infección microbiana y la función de barrera 3,6,8. El modelo incluye células inmunitarias residentes en los tejidos y el contacto directo de microorganismos vivos con el tejido del huésped, lo que supone una ventaja en comparación con otros modelos publicados9. Además, las células epiteliales se autoorganizan en estructuras tridimensionales que proporcionan una interfaz fisiológicamente relevante para la colonización con una microbiota viva6.

Protocolo

Este protocolo requiere acceso a ~20 mL de sangre fresca por biochip de donantes sanos para aislar monocitos humanos primarios. Todos los donantes dieron su consentimiento informado por escrito para participar en este estudio, que fue aprobado por el comité de ética del Hospital Universitario de Jena (número de permiso 2018-1052-BO). Para obtener más información sobre los materiales, consulte la Tabla de materiales. Para obtener detalles sobre la composición de todas las soluciones y medios, consulte la Tabla 1.

1. Observaciones generales sobre el manejo de biochips

  1. Separe con cuidado una tira de depósitos y separe las tapas con un cuchillo caliente para obtener depósitos y tapas individuales. Ensancha el orificio de la tapa para que el tubo de silicona quede bien ajustado.
  2. El tubo de silicona tiene un diámetro interior de 0,5 mm, es asimétrico y está separado en lados más largos (20 cm) y más cortos (12 cm) por dos tapones peristálticos de la bomba. Ensamble dos tubos de cada simetría por biochip mediante la conexión de un tubo a un conector de bloqueo Luer macho y la tapa en el lado opuesto del tubo. También ensamble cuatro depósitos por biochip.
    NOTA: Prepare los tubos y los depósitos con anticipación y esterilícelos en autoclave antes de usarlos. Como el tubo de silicona tiene una vida útil limitada, cámbielo después de 3 a 5 experimentos. Para ciertos intereses de investigación, como las pruebas de medicamentos, se recomienda preparar nuevos tubos para cada experimento. Muchos pasos de este protocolo se ejecutan en paralelo; consulte la figura de descripción general, que destaca los diferentes pasos realizados en un día, como se muestra en la Figura 2.

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Figura 1: Representación esquemática del modelo de intestino en chip. (A) El biochip se presenta en una vista transversal. (B) La dimensión de todo el biochip, así como de la membrana de PET plana y extraíble, es visible. El volumen total de la cámara superior, incluidos los puertos del tamaño de la cerradura Luer hembra, es de 290 μL y 270 μL para la cámara inferior, respectivamente. (C) Se puede ver una composición esquemática del biochip intestinal, el epitelio de crecimiento tridimensional que se asemeja a estructuras en forma de vellosidades y criptas que incluyen células inmunitarias diferenciadas y una capa de moco. El otro lado de la membrana PET está cubierto por una monocapa endotelial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Resumen esquemático de la línea de tiempo de construcción del modelo y la configuración experimental. Esta figura muestra la descripción general esquemática del protocolo presentado. Los procedimientos importantes, como la siembra de células y el desafío epitelial con LPS, se indican con flechas. Abreviaturas: HUVECs = células endoteliales venosas umbilicales humanas; LPS = lipopolisacárido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Esterilización de biochips

  1. Llene una placa de Petri de vidrio estéril, que posea un diámetro de 15 cm, con un 70% de etanol sin desnaturalizar. Coloque el biochip en el interior de modo que todos los puertos del biochip queden completamente cubiertos por la solución de etanol.
  2. Dos veces por puerto, extraiga 1 ml de etanol al 70% a través de todas las cámaras del chip. Incubar durante 45-60 min a temperatura ambiente (RT).
    NOTA: Asegúrese de que no quede aire atrapado dentro del biochip. A partir de este momento, no debe entrar aire en el sistema de biochip y las cavidades deben permanecer llenas de líquido.
  3. Retire el etanol de la placa de Petri y reemplácelo con agua estéril de doble destilación (ddH2O) hasta que todos los puertos estén completamente cubiertos. De nuevo, dos veces por puerto, extraiga 1 mL deddH2O a través de la cavidad del biochip. Actualice el ddH2O en la placa de Petri y repita el procedimiento.
  4. Retire todo el líquido de la placa de Petri. A partir de ahora, mantenga los biochips completamente esterilizados dentro de la placa de Petri cerrada siempre que estén fuera de un entorno estéril. Agregue un pequeño depósito (por ejemplo, la tapa de un tubo de 50 ml) de 2-5 mL ddH2O a la placa de Petri para reducir la evaporación del líquido dentro del biochip.
    NOTA: Los biochips se pueden esterilizar con hasta 3 días de anticipación si se mantienen en un ambiente estéril hasta su uso. Esto permite flexibilidad en la carga de trabajo en un solo día.

3. Cosecha y siembra de HUVECs

NOTA: Las células endoteliales venosas umbilicales humanas (HUVECs) fueron aisladas de cordones umbilicales como se publicó anteriormente10.

  1. Antes de sembrar los HUVEC, cubra la membrana con colágeno humano IV. Para ello, prepare una dilución 1:100 de una solución madre de colágeno (Tabla 1) en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco que contiene magnesio y calcio (PBS +/+). Añada 350 μL de la solución madre diluida a la cámara correspondiente. Incubar durante 5 min en RT.
    NOTA: Si manipula el biochip en la campana estéril, le recomendamos que coloque un pañuelo estéril debajo para recoger el exceso de medio.
  2. Enjuague todas las cámaras dos veces con 350 μL de PBS +/+ para lavar el colágeno y el ácido acético restantes. A continuación, añada 350 μL de medio de crecimiento de células endoteliales (EC) a cada cámara.
    NOTA: A partir de aquí, los biochips están listos para la siembra de células y se pueden almacenar a 37 °C hasta su uso.
  3. Utilice HUVEC en los pasajes 1-3 con un 80-90% de confluencia celular. Cultive HUVEC en medio EC que contenga una mezcla de suplementos definida proporcionada por el fabricante. En la Figura 3A se presenta una imagen representativa de campo claro de un cultivo celular HUVEC.
    NOTA: Dependiendo del donante, los HUVEC de los pasajes superiores pueden comenzar a desdiferenciarse y no pueden formar de manera confiable una monocapa densa y confluente dentro del biochip. El uso de antibióticos, es decir, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina, es opcional, pero se recomienda como complemento del medio CE para prevenir la contaminación microbiana.
  4. Retire el medio de cultivo celular de un matraz de cultivo celular T25 y lave las células suavemente con 3-5 mL de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin magnesio ni calcio (PBS -/-). Retire el PBS -/- y agregue 1 mL de reactivo de disociación de tripsina (Tabla 1). Incubar durante 5 min a 37 °C hasta que las células se desprendan del matraz de cultivo celular.
  5. Transfiera las células desprendidas a un tubo utilizando 9 mL de suero fetal bovino (FBS) al 5% en PBS -/-. Centrifugar a 350 × g durante 5 min a RT. Retirar el sobrenadante, resuspender en 1 mL de medio EC y determinar el número de células. Ajuste la concentración de células a 0,4 × 106 células por 150 μL (siembra en la cámara inferior) o por 250 μL (siembra en la cámara superior).
  6. Agregue el volumen respectivo de celdas a la cámara. Si siembra en la cámara inferior, cierre todos los puertos e inmediatamente coloque el biochip boca abajo para que las células caigan sobre la membrana PET. Incubar los biochips en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% deCO2.
  7. Realice un cambio de medio de la cámara que contiene HUVEC con 350 μL de medio EC después de 24 h. El medio en la cámara opuesta no necesita ser reemplazado.

4. Recolección de suero humano y aislamiento de monocitos derivados de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)

NOTA: Las PBMC se aislaron como se describe en Mosig et al.11.

  1. Extraer sangre venosa humana de donantes sanos. Por biochip, obtenga un mínimo de 10 ml de sangre completa en tubos de recolección de sangre que contengan silicato para la recolección de suero. Después de la coagulación completa, centrifugar los tubos de extracción de sangre a 2.500 × g durante 10 min en RT. Recoja el suero, la alícuota y almacene a -20 °C hasta su uso posterior.
  2. Obtener un mínimo de 10 mL de sangre entera del mismo donante en tubos de recolección de sangre que contengan EDTA para el aislamiento de PBMC. Mezcle suavemente la sangre no coagulada 1:1 con iso-tampón (Tabla 1) por inversión y coloque lentamente 35 mL de esta mezcla sobre 15 mL de un medio de gradiente de densidad con una densidad de 1.077 g/mL en un tubo de 50 mL.
  3. Centrifugar a 800 × g durante 20 min sin freno en RT. Retire con cuidado la capa de células inmunitarias resultante, que aparece en la parte superior del medio de gradiente de densidad, y transfiérala a un nuevo tubo de 50 mL. Llene hasta 50 ml con iso-buffer frío y lave las células mediante una inversión suave.
  4. Centrifugar a 200 × g durante 8 min sin freno a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender en 10 mL de iso-tampón por gradiente de densidad. Opcional: Agrupe las PBMC de un donante si se ejecutan varios gradientes en paralelo.
  5. Centrifugar a 150 × g durante 8 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 10 mL de isotampón por gradiente de densidad. Repita el paso de centrifugación 4.4. Finalmente, desechar el sobrenadante y resuspender las células en 2 mL de medio de diferenciación de monocitos (Tabla 1).
    NOTA: La adición de M-CSF y GM-CSF refuerza la diferenciación de los monocitos aislados hacia macrófagos derivados de monocitos y células dendríticas derivadas de monocitos (en combinación con lipopolisacárido [LPS], que se agrega en un punto posterior de este protocolo). El uso de antibióticos, es decir, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina, es opcional, pero se recomienda como complemento del medio para prevenir la contaminación microbiana.
  6. Determine el número de células y la semilla ~ 10 ×10 6 células por pocillo de una placa de 6 pocillos en 2 mL de medio de diferenciación de monocitos (Tabla 1). Incubar en una incubadora humidificada a 37 °C durante 1 h para permitir la fijación de los monocitos al plástico de la placa de 6 pocillos.
  7. Deseche cuidadosamente el sobrenadante y lávese 2 veces con 2 mL precalentados de medio celular hematopoyético para eliminar las células no unidas. Incubar a 37 °C durante otras 24 h en medio de diferenciación de monocitos.
  8. Para recolectar los monocitos, deseche cuidadosamente el sobrenadante y lávese una vez con 2 mL de PBS precalentado -/-. Véase la Figura 3B para ver un ejemplo de una imagen de campo claro del cultivo de monocitos en este punto. A continuación, incubar las células durante 7 min en 1 mL de reactivo de desprendimiento de monocitos precalentado (Tabla 1) a 37 °C para forzar el desprendimiento de los monocitos del plástico de la placa de 6 pocillos.
  9. Transfiera los monocitos desprendidos a un tubo de baja fijación. Opcional: para lograr un mayor rendimiento celular, lave cuidadosamente la placa de 6 pocillos varias veces con PBS -/-.
  10. Centrifugar a 300 × g durante 8 min a RT. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender en medio acondicionado por la CE (Tabla 1). Determine el número de células y ajuste la concentración de células a 0,1 × 106 células por 150 μL (siembra en la cavidad inferior) o por 250 μL (siembra en la cavidad superior).
    NOTA: Sea cuidadoso en todos los pasos del aislamiento de las células inmunitarias y reduzca las fuerzas de cizallamiento para evitar la activación de las células inmunitarias. Al establecer este aislamiento, verifique la pureza de los monocitos derivados de PBMC (por ejemplo, mediante citometría de flujo). Más del 95% de todas las células deben ser positivas para marcadores típicos de monocitos, como CD14.

5. Siembra de monocitos

  1. Realice un intercambio de medio en la cámara que contiene HUVEC con 350 μL de medio acondicionado CE precalentado.
  2. Añada 150 μL (cámara inferior) o 250 μL (cámara superior) de la suspensión de monocitos preparada (ver paso 4.10) a la misma cámara. Si se siembra en la cámara inferior, cierre todos los puertos e inmediatamente coloque el biochip boca abajo para que las células caigan sobre la capa HUVEC. Incubar el biochip en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% deCO2.
  3. Realizar un intercambio de medio en la cámara que contiene monocitos HUVEC + con 350 μL de medio acondicionado CE cada 24 h.

6. Cosecha y siembra de C2BBe1

NOTA: El borde del cepillo Caco-2 que expresa las celdas 1 (C2BBe1)12 se utiliza hasta el paso 35 y se toma de matraces con un 80-90% de confluencia. En la Figura 3C se presenta una imagen representativa de campo claro de un cultivo C2BBe1.

  1. Cultivar células C2BBe1 en medio C2 (Tabla 1).
    NOTA: El uso de antibióticos, es decir, 20 μg/mL de gentamicina, es opcional, pero se recomienda como suplemento del medio C2 para prevenir la contaminación microbiana.
  2. Retire el medio de cultivo celular de un matraz de cultivo celular T25 y lave las células suavemente con 3-5 mL de PBS -/-. Retire el PBS -/- y agregue 1 mL de reactivo de disociación de tripsina (Tabla 1). Incubar durante 5 min a 37 °C hasta que las células se desprendan del matraz de cultivo celular.
  3. Transfiera las células desprendidas a un tubo utilizando 9 mL de suero fetal bovino (FBS) al 5% en PBS -/-. Centrifugar a 350 × g durante 5 min en RT. Retirar el sobrenadante, resuspender en 1 mL de medio C2 y determinar el número de células. Ajuste la concentración de células a 0,5 × 106 células por 150 μL (siembra en la cámara inferior) o por 250 μL (siembra en la cámara superior).
  4. Antes de sembrar el C2BBe1, lave suavemente la cámara respectiva con 350 μL de medio C2.
  5. Añada 150 μL (cámara inferior) o 250 μL (cámara superior) de la suspensión C2BBe1 preparada (consulte el paso 6.3) a la cámara correspondiente. Si siembra en la cámara inferior, cierre todos los puertos e inmediatamente coloque el biochip boca abajo para que las células caigan sobre la membrana PET. Incubar los biochips en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% deCO2.

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Figura 3: Morfología celular de HUVECs, monocitos y C2BBe1 antes de la siembra en el biochip. Esta figura muestra imágenes representativas de campo claro de las diferentes fuentes celulares utilizadas en todo el protocolo. Las imágenes se tomaron con un microscopio de campo claro inverso con un aumento de 10x. Todos los tipos de células, (A) HUVECs, (B) monocitos y (C) C2BBe1 se cultivaron en cultivo celular monocapa 2D como se describe en sus secciones específicas del protocolo. Barras de escala = 200 μm. Abreviaturas: HUVECs = células endoteliales venosas umbilicales humanas; PBMC = células mononucleares de sangre periférica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

7. Conexión a bomba peristáltica y perfusión circular

  1. Prepare una incubadora vacía con la adición de una bomba peristáltica. Limpie a fondo todas las áreas de la incubadora y la bomba con desinfectante para proporcionar un entorno casi estéril.
    NOTA: Las bombas peristálticas pueden producir mucho calor mientras funcionan. En incubadoras bien aisladas o laboratorios con aire acondicionado deficiente, el número de bombas utilizables por incubadora puede ser limitado, ya que las incubadoras tienden a sobrecalentarse. Dos bombas peristálticas por incubadora deberían ser suficientes.
  2. Antes de conectar los tubos esterilizados al biochip, enjuague cada tubo con 700 μL de PBS +/+ seguido de 500 μL de medio C2 o medio acondicionado con CE. Prepare un tubo de cada simetría por medio (consulte el paso 1.2). Utilice el tubo con la distancia corta desde el bloqueo luer hasta el tapón de la bomba peristáltica para la cavidad izquierda y el tubo con la otra simetría para la cavidad derecha.
  3. Recupere el biochip de la incubadora y realice un intercambio de medio con 350 μL para cada cámara. Retire todos los enchufes y llene todos los puertos hasta la parte superior.
  4. Comenzando en la cavidad izquierda, conecte el primer tubo al puerto derecho de la cámara superior insertando el adaptador Luer Lock en el puerto del biochip. Luego, conecte el segundo tubo al puerto izquierdo de la cámara inferior. Repita este procedimiento para la cavidad microfluídica correcta.
  5. Tome un depósito y agregue una pequeña gota de medio de cultivo celular al fondo del depósito. Luego, inserte el depósito en el lado opuesto del primer tubo y repita para la otra cámara. Una vez que todos los puertos estén conectados a un tubo o depósito, llene los depósitos con 3,5 ml de medio de cultivo celular.
  6. Coloque el lado suelto del tubo, que tiene la tapa adjunta, en la parte superior del depósito para cerrar el sistema microfluídico de cada cámara. En este estado, transporte el biochip a la bomba peristáltica.
    NOTA: Dependiendo de la distancia a la incubadora y del entorno del laboratorio, se puede utilizar una caja previamente limpia y esterilizada en autoclave para transferir las fichas a la incubadora.
  7. Utilice los tapones peristálticos de la bomba para conectar el tubo a la bomba. Conecte cada tubería a la bomba peristáltica de tal manera que el medio fluya desde el depósito hacia la cavidad, hacia la tubería y, a través de la bomba, de regreso al depósito (Figura 4). El depósito sirve como trampa de burbujas en la perfusión circular y evita que el aire quede atrapado en el sistema. Perfundir cada cámara con un caudal de 50 μL/min, lo que da como resultado un esfuerzo cortante de 0,013 dyn/cm2 en la cámara superior y de 0,006 dyn/cm2 en la cámara inferior8.
    NOTA: Si el medio de las cavidades inferior y superior se mueve en direcciones opuestas, se puede lograr un mayor crecimiento tridimensional del tejido intestinal13. Por lo tanto, los depósitos de las cavidades superior e inferior se colocan en lados opuestos (Figura 4). La perfusión circular reduce la cantidad de medio de cultivo celular necesario, pero podría resultar en el enriquecimiento de citocinas y metabolitos. Si se desea, también es posible una perfusión lineal del biochip.
  8. Perfundir el biochip durante 72 h a 37 °C y 5% de CO2.

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Figura 4: Biochip conectado a la bomba peristáltica. Se presenta un ejemplo de un biochip conectado a una bomba peristáltica. Las células epiteliales C2BBe1 se cultivan en la cámara inferior (el medio C2 rojo se encuentra en los reservorios de la parte delantera), mientras que las HUVEC se cultivan en la cámara superior (el medio acondicionado de EC amarillento se encuentra en los reservorios de la parte posterior). Los diferentes medios de cultivo celular no se mezclan debido a la función de barrera del tejido cultivado. El biochip está conectado a la bomba peristáltica de tal manera que el medio fluye desde el depósito hasta la cavidad. Desde aquí, el medio fluye de regreso al depósito a través de la tubería a través de la bomba. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

8. Acondicionamiento de LPS de la barrera epitelial

  1. Después de 72 h de preperfusión, detenga la bomba peristáltica y retire la tapa conectada al tubo de cada depósito. Colóquelo sobre un pañuelo de papel estéril junto a la bomba.
  2. Retire todo el medio y llene los depósitos con 2 ml de medio recién preparado. Para el lado epitelial que contiene las células C2BBe1, agregue 100 ng/mL de LPS al medio.
    NOTA: El LPS aumenta la función de barrera del tejido, estimula a los macrófagos derivados de monocitos para que migren al tejido epitelial y permite la diferenciación de células dendríticas derivadas de monocitos.
  3. Vuelva a conectar el tubo y las tapas al depósito y continúe la perfusión circular a un caudal de 50 μL/min durante 24 h adicionales.
    NOTA: A partir de este momento, el modelo de chip se puede utilizar en experimentos, pruebas de compuestos o estudios de infección. Recomendamos un cambio medio de 2 mL por depósito cada 24 h.

9. Acceso al tejido para diferentes métodos de lectura

  1. Recoger los sobrenadantes del medio de cultivo celular de los depósitos en todo momento de la perfusión. Abra el depósito y recoja el volumen deseado (consulte los pasos 8.1-8.3). Utilice estos sobrenadantes para la detección de metabolitos, citocinas u otras moléculas.
  2. Para acceder al tejido, utilice un bisturí para hacer un corte preciso a lo largo del exterior de la cámara superior y retire la lámina de unión para abrir la cavidad microfluídica. El tejido del modelo de biochip intestinal ya es accesible. Corta con cuidado a lo largo del exterior de la cámara microfluídica para separar la membrana del biochip. Recoja la membrana que contiene el tejido con pinzas.
    PRECAUCIÓN: Tenga en cuenta la colocación de los dedos durante este paso y trabaje con cuidado para evitar accidentes. Se recomienda el uso de guantes resistentes a los cortes.
  3. Alternativamente, recoja las células de capas separadas dentro del biochip usando soluciones enzimáticas, es decir, tripsina o células lisadas usando tampones que contienen Triton X-100.

10. Evaluación de la permeabilidad mediante difusión de dextrano FITC

NOTA: La función de barrera del tejido se puede analizar mediante un ensayo de permeabilidad al dextrano FITC después de la desconexión de la bomba peristáltica. La evaluación de la permeabilidad al dextrano FITC fue adaptada de Deinhardt-Emmer et al.4.

  1. Prepare una solución madre de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano (peso molecular de 3-5 kDa, Tabla 1).
  2. Vacíe los depósitos y desconecte el chip de la perfusión.
  3. Realice un intercambio de medio en la cámara superior e inferior con medio libre de rojo fenol.
    NOTA: Este paso no es necesario si ya se utilizó un medio libre de rojo de fenol durante el experimento.
  4. Añadir 350 μL de 1 mg/mL de solución de FITC-dextrano a la cámara que contiene las células C2BBe1.
  5. Cierre los puertos e incube el chip durante 60 minutos a 37 °C con el lado epitelial hacia arriba.
  6. Después del tiempo de incubación, recoja el medio de cultivo de ambas cámaras del chip por separado y guárdelo a 4 °C, protegido de la luz hasta la medición.
  7. Para la medición, prepare una curva estándar en medio C2 y en medio acondicionado CE sin rojo de fenol en el rango de 1.000 μg/mL a 0 μg/mL de FITC-dextrano con 11 diluciones seriadas consecutivas 1:2.
  8. Transfiera 200 μL de cada muestra a una placa negra de 96 pocillos con un fondo transparente. Mida la fluorescencia con un lector de microplacas a una longitud de onda de excitación de 495 nm y una longitud de onda de emisión de 517 nm.
  9. Utilice la curva estándar para calcular la concentración de dextrano FITC de las muestras y, por lo tanto, el coeficiente de permeabilidad.

11. Tinción de inmunofluorescencia

NOTA: El tejido vivo se puede investigar microscópicamente. Para facilitar el manejo, recomendamos el desprendimiento del biochip de la bomba peristáltica y el uso de objetivos de larga distancia en un microscopio invertido. Como análisis de punto final, el tejido se puede fijar dentro del biochip para procedimientos como la tinción de inmunofluorescencia.

  1. Detenga la bomba peristáltica y abra los depósitos de todas las cavidades. Vacíe los depósitos y desconecte los tubos, así como los depósitos del biochip.
  2. Dos veces por cámara, lavar las cavidades microfluídicas con 500 μL de PBS frío +/+. Añadir 500 μL de metanol helado a todas las cavidades e incubar durante 15 min a -20 °C. A continuación, dos veces por cavidad, lavar la cámara microfluídica con 500 μL de PBS+/+.
    NOTA: Otros métodos de fijación, como la fijación con paraformaldehído al 4% o el fijador de Carnoy, también son adecuados. Después de la fijación, los chips pueden almacenarse a 4 °C o proceder directamente a la tinción con fluorescencia inmune. PRECAUCIÓN: Los productos químicos fijadores como el metanol o el paraformaldehído son tóxicos. Realice las tareas respectivas bajo una campana extractora y recoja los residuos en consecuencia.
  3. Abra el chip como se describe en el paso 9.2 para acceder al tejido. Cortar la membrana PET que contiene tejido en hasta tres pedazos para teñir en paralelo con diferentes inmunopaneles.
  4. Transfiera cada una de las piezas de la membrana a una placa separada de 24 pocillos que contenga una solución de bloqueo y permeabilización (Tabla 1) utilizando pinzas de precisión. Asegúrese de que la capa celular de interés siempre mire hacia arriba durante todo el proceso de tinción. Incubar las piezas de membrana durante 30 min en RT.
    NOTA: Los mejores resultados de tinción se obtienen cuando el suero coincide con el anticuerpo secundario. Por ejemplo, si se obtienen anticuerpos secundarios de especies de cabras, recomendamos el uso de suero de cabra normal.
  5. Transfiera las piezas de la membrana a un portaobjetos de vidrio limpio dentro de una cámara húmeda. Prepare el panel de anticuerpos primarios en la solución de tinción (Tabla 1) y agregue 50 μL a cada pieza de membrana. Incubar durante la noche a 4 °C.
    NOTA: La concentración óptima de anticuerpos y la eficacia de la tinción pueden diferir entre los fabricantes y los clones. Recomendamos probar previamente los paneles de tinción en un cultivo celular 2D.
  6. Después de la incubación, transfiera las muestras a una placa de 24 pocillos y lave suavemente las membranas durante 3 x 5 min con solución de lavado (Tabla 1).
  7. Nuevamente, transfiera las piezas de la membrana a un portaobjetos de vidrio limpio dentro de una cámara húmeda. Preparar el panel de anticuerpos secundarios en solución de tinción (Tabla 1) y añadir 50 μL a cada pieza de membrana. Si es necesario, agregue una contratinción nuclear como 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) o Hoechst. Incubar durante 30 min en RT.
    NOTA: Mientras trabaja con fluoróforos, mantenga las muestras protegidas de la luz para evitar el fotoblanqueo y aumentar la calidad de la imagen.
  8. Después de la incubación, transfiera las muestras a una placa de 24 pocillos y lave suavemente las membranas 2 x 5 min con solución de lavado (Tabla 1). Luego, lavar una vez con PBS +/+ durante 5 min.
  9. Monte las piezas de membrana en un portaobjetos de vidrio limpio utilizando un medio de montaje de fluorescencia y un cubreobjetos. Almacenar a 4 °C hasta obtener imágenes microscópicas.

Resultados

Estos resultados representativos muestran las distintas capas de tejido del modelo de intestino en chip. Se tiñen con inmunofluorescencia como se describe en la sección 11 del protocolo. Las imágenes se tomaron con un microscopio de epifluorescencia o fluorescencia confocal como pilas z y se procesaron en una proyección ortogonal. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre la configuración microscópica y el software. La figura 5 muestra la capa vascular, una monocapa endotelial formadora de barreras, formada por HUVEC y macrófagos. Se tiñen marcadores celulares representativos como VE-Cadherin y el factor de von Willebrand para las células endoteliales y CD68 para los macrófagos. La capa epitelial tridimensional formada por células C2BBe1 se muestra en la Figura 6 y la Figura 7. La integridad del tejido se confirma mediante la tinción de E-Cadherin y ZO-1. Un análisis detallado de todos los marcadores tisulares esperados y la polarización tisular se puede encontrar en Maurer et al.6. La figura 8 muestra una imagen ejemplar que carece de excrecencia tridimensional de estructuras similares a vellosidades intestinales. En comparación con una capa celular tridimensional típica (Figura 6), el número de núcleos teñidos es muy reducido y las células solo están presentes en una monocapa. Este fenotipo específico se creó mediante la adición de un inhibidor de la histona desacetilasa al medio de cultivo celular que inhibe la proliferación celular. La permeabilidad de la barrera se evalúa mediante un ensayo de permeación con FITC-dextrano. La permeabilidad aumentó tras la infección con el patógeno oportunista C. albicans, como se muestra en la Figura 9A. La infección da lugar a un aumento de la liberación de citocinas IL-1β, IL-6, IL-8 e IL-10 en el sobrenadante del medio vascular (Figura 9B)8.

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Figura 5: Lado vascular fijado del intestino en chip. Imagen representativa de inmunofluorescencia de la barrera vascular a los cinco días de perfusión. El tejido se fijó con metanol. Se tomó una pila z de secciones de 1 μm con un microscopio de epifluorescencia, y se muestra una proyección máxima ortogonal de esta pila z. (A) El ADN dentro de los núcleos se tiñó con DAPI. (B) Los macrófagos derivados de monocitos completamente diferenciados expresan CD68 y se extienden por todo el tejido vascular. (C) Los HUVEC crean una capa confluente que muestra la integridad del tejido mediante la formación de uniones adherentes como VE-Cadherin. Además, (D) el factor de von Willebrand es altamente expresado por los HUVECs. Finalmente, (E) todos los marcadores se muestran en una superposición. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; HUVECs = células endoteliales venosas umbilicales humanas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Cara epitelial fijada del intestino en chip. Imagen representativa de inmunofluorescencia de la capa de células epiteliales polarizadas después de 5 días de perfusión que expresa las proteínas de unión E-Cadherina y ZO-1. El tejido se fijó con metanol. Se tomó una pila z de secciones de 1 μm con un microscopio de epifluorescencia. Se muestra una proyección máxima ortogonal de esta pila z. (A) El ADN en los núcleos se tiñó con DAPI. Se desarrolla una barrera epitelial hermética por la formación de (B) uniones adherentes, teñidas con E-Cadherina, y (C) uniones apicales herméticas, teñidas con ZO-1. Las uniones estrechas y las uniones adherentes se colocalizan en la membrana celular apical, como se ve en la imagen de superposición (D). Barras de escala = 100 μm. Abreviatura: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: Lado epitelial fijado del intestino en chip con excrecencia en forma de vellosidades. Imagen representativa de inmunofluorescencia de la capa tridimensional de células epiteliales después de seis días de perfusión. El tejido se fijó con el fijador de Carnoy. Se tomó una pila z de secciones de 1 μm con un microscopio de barrido láser confocal, y (A) se muestra una proyección máxima ortogonal de esta pila z. El ADN de los núcleos se tiñó con Hoechst. Además, el tejido se tiñó con aglutina de germen de trigo, una lectina, que tiñe la mucina humana. (B) El crecimiento tridimensional de las estructuras en forma de vellosidades y criptas del epitelio se puede detectar en las secciones x e y de la pila z. Barras de escala = 50 μm. Abreviatura: WGA = aglutinina de germen de trigo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 8: Lado epitelial fijado del intestino en chip sin excrecencia en forma de vellosidades. Imagen representativa de inmunofluorescencia de la capa de células epiteliales tratada con ácido hidroxámico suberoilanilida (SAHA), un inhibidor de la histona desacetilasa, que previene la proliferación celular. El tejido se fijó con metanol. Se tomó una pila z de secciones de 1 μm con un microscopio de epifluorescencia. Se muestra una proyección máxima ortogonal de esta pila z. (A) El ADN en los núcleos se tiñó con DAPI. En (B), las uniones adherentes se tiñen con E-Cadherin, y en (C), las uniones estrechas se tiñen con ZO-1. Las uniones estrechas y las uniones adherentes se colocalizan, como se ve en la imagen de superposición (D). Barras de escala = 100 μm. Abreviatura: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 9: Respuesta inmunitaria dependiente de patógenos de las células inmunitarias innatas integradas: Esta figura es una modificación de Kaden et al.8. Se analizó el modelo de intestino en chip no infectado (-) o infectado (+) con C. albicans SC5314 para (A) permeabilidad con FITC-Dextrano (3-5 kDa) y (B) secreción de citocinas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Solución/medioComposición
Solución madre de colágeno0,5 mg/mL de colágeno IV en ácido acético 0,5 mM
Iso-tampónPBS -/-, 1 mg/mL de fracción V de albúmina sérica bovina, EDTA 2 mM
Medio de diferenciación de monocitosMedio de células hematopoyéticas + 10% de suero autólogo humano + 10 ng/mL de factor estimulante de colonias de macrófagos recombinantes (M-CSF) + 10 ng/mL de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos recombinantes (GM-CSF)
Reactivo de disociación de tripsina0,25% de tripsina + 1 mM de EDTA en PBS -/-
Reactivo de desprendimiento de monocitos4 mg/mL de lidocaína + 5 mM de EDTA en PBS -/-
Medio acondicionado por la CEEC-medio +10% suero autólogo humano +10 ng/mL M-CSF + 10 ng/mL GM-CSF
C2-medioDMEM glucosa alta (4,5 g/L) + 10% FBS + 1% GlutaMax + 1% MEM solución de aminoácidos no esenciales + 1 mM de piruvato de sodio + 10 μg/mL de holotransferrina humana
Solución madre de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano1 mg/mL en medio C2 precalentado sin rojo fenol
Solución de bloqueo y permeabilidad3% suero de burro normal (NDS) + 0,1% de saponina en PBS +/+
Solución de tinción0,3% de suero de burro normal (NDS) + 0,1% de saponina en PBS +/+
Solución de lavado0,1% de saponina en PBS +/+
Fijador de Carnoy60% etanol, 30% cloroformo, 10% ácido acético glacial

Tabla 1: Lista y composición de las soluciones utilizadas en este protocolo. Abreviatura: PBS -/- = Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin magnesio ni calcio.

Discusión

El protocolo presentado detalla los pasos necesarios para generar un modelo de intestino en chip inmunocompetente. Describimos técnicas específicas y posibles métodos de lectura, como la microscopía de inmunofluorescencia, el análisis de citocinas y metabolitos, la citometría de flujo, el análisis genético y de proteínas y la medición de la permeabilidad.

El modelo descrito consiste en HUVECs primarios, macrófagos derivados de monocitos y células dendríticas derivadas de monocitos co-cultivadas con una capa 3D de células epiteliales intestinales que representan aspectos de poblaciones secretoras de moco, absorbentes, enteroendocrinas y similares a las células de Paneth, como se describió anteriormente 6,14. Hay que tener en cuenta algunos puntos críticos al realizar los pasos del protocolo. En todos los pasos, se debe evitar la formación de burbujas de aire dentro del sistema microfluídico. Por lo tanto, siempre pipetea al revés (toma el volumen de la segunda parada y dispensa solo hasta la primera parada) cuando manipules el biochip o el tubo. Para evitar altas presiones o fuerzas de cizallamiento sobre las células dentro del biochip, siempre pipetee suavemente y mantenga la cámara opuesta cerrada al pipetear en el biochip (por ejemplo, al intercambiar el medio en la cámara superior, cierre la cámara inferior con los tapones respectivos). El biochip permite la siembra de células en dos lados de una membrana PET. Por lo tanto, el modelo se puede configurar con estructuras intestinales similares a vellosidades debajo de la membrana PET o creciendo en la membrana hacia arriba. Dependiendo del interés de la investigación, una u otra orientación de las células tiene ciertos beneficios en términos de interacción física, como la unión celular de las células circulantes suspendidas en el medio de flujo que ayuda a la gravedad.

Debido al flujo del medio microfluídico, las células intestinales polarizadas forman un tejido tridimensional que se asemeja a estructuras en forma de cripta y vellosidades, que forman una barrera de tejido apical profunda mediante una densa red de uniones estrechas y uniones adherentes6. Además, las células inmunitarias innatas integradas aumentan la función de barrera intestinal y permiten la investigación detallada de las respuestas de las citocinas y las células inmunitarias a diversos estímulos, incluidas las respuestas inmunitarias específicas del donante 3,6. El modelo ofrece una plataforma fisiológicamente relevante para estudiar los comensales microbianos (por ejemplo, Lactobacillus rhamnosus6) y los patógenos (por ejemplo, Candida albicans 6,8 ) del intestino humano. El modelo se aprovechó para investigar los mecanismos de los cambios en la composición microbiana intestinal y la regulación de la respuesta inmunitaria de la mucosa6. En el estudio, demostramos cómo recrear la tolerancia inmune fisiológica de la luz intestinal y apoyar la colonización homeostática por microorganismos vivos. Además, la precolonización del lado luminal del modelo con el probiótico Lactobacillus rhamnosus redujo la invasión tisular de Candida albicans y limitó su translocación al compartimento vascular, similar a la situación in vivo. El estudio demostró el potencial del modelo para estudiar in vitro las interacciones microbianas, las respuestas inmunitarias y los mecanismos de patogenicidad del intestino en condiciones fisiológicamente relevantes.

Aún así, esta plataforma de chips tiene limitaciones, a saber, el uso de células intestinales derivadas del cáncer, que no son completamente capaces de representar el intestino humano, y el uso de células endoteliales e inmunitarias primarias. Las condiciones de cultivo hipóxico se pueden establecer cultivando el modelo en una incubadora de hipoxia en condiciones de perfusión para reflejar mejor la situación in vivo del intestino humano.

En comparación con otras plataformas de OoC, como el modelo "gut-on-a-chip" publicado por Kim et al.14,15, el número inicial de células que forman el modelo de tejido presentado es aproximadamente 10 veces mayor. Esto, por ejemplo, permite el análisis simultáneo de hasta tres paneles de tinción de inmunofluorescencia dentro de un solo experimento. Los números de células más grandes simplifican aún más los análisis de criterio de valoración, incluida la citometría de flujo, el análisis de Western blot y otros ensayos estándar listos para usar, que requieren sobrenadantes de cultivo celular como el perfil de citocinas y la medición de lactato deshidrogenasa (LDH). Obtener múltiples lecturas de un solo experimento reduce los costos generales y el tiempo experimental. Las soluciones de hardware listas para usar de un amplio espectro de fabricantes están disponibles gracias a la plataforma de biochip estandarizada que cuenta con interfaces y huellas de la industria (formato de portaobjetos microscópico del chip, puertos en formato de bloqueo Luer y alineados en la matriz de 96 pocillos). Esto también incluye muchas membranas de diferentes materiales y tamaños de poro. El tamaño de los poros puede influir en el crecimiento celular y la integridad de los tejidos16, así como en la migración celular.

En resumen, este protocolo presenta un modelo detallado y adaptable de intestino en chip que replica elementos cruciales del entorno intestinal humano. Proporciona una plataforma escalable y eficaz para llevar a cabo investigaciones exhaustivas sobre la microbiota intestinal y el tejido intestinal del huésped, con especial atención a las respuestas inmunitarias del huésped y la fisiopatología intestinal. Así, el modelo es capaz de tender un puente entre los modelos tradicionales in vitro y la biología humana, lo que lo convierte en una herramienta esencial para estudios en profundidad sobre biología intestinal.

Divulgaciones

M.R. es director general de Dynamic42 GmbH y posee acciones en la empresa. A.S.M. es asesor científico de Dynamic 42 GmbH y posee acciones en la empresa.

Agradecimientos

El trabajo contó con el apoyo financiero del Centro de Investigación Colaborativa PolyTarget 1278 (proyecto número 316213987) para que V.D.W. y A.S.M. A.F. y A.S.M. reconozcan además el apoyo financiero del Clúster de Excelencia "Balance of the Microverse" en el marco de la Estrategia de Excelencia de Alemania - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860. Queremos agradecer a Astrid Tannert y al Laboratorio de Biofotónica e Imagen de Jena (JBIL) por proporcionarnos acceso a su microscopio de barrido láser confocal ZEISS LSM980. La Figura 1C y la Figura 2 se crearon con Biorender.com.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placa de 96 pocillos negra, fondo transparenteConsumibles Thermo Fisher10000631
Ácido acéticoRoth3738.4Productos químicos
Alexa Fluor 488 AffiniPure, burro, anti-ratón IgG (H+L)Jackson Immuno Research715-545-150Anticuerpo secundario Tinción vascular y tinción epitelial
Alexa Fluor 647 AffiniPure, burro, anti-conejo IgG (H+L)Jackson Immuno Research711-605-152Tinción epitelial secundaria de anticuerpos
Alexa Fluor 647, burro, anti-conejo IgG (H+L)Thermo Fisher Scientific, InvitrogenA31573Tinción vascular de anticuerpos secundarios
Cámara Axiocam ERc5sZeiss426540-9901-000Equipo técnico
Medio basal MV, sin rojo fenolPromocellC-22225Consumibles para cultivos celulares
BiochipDynamic 42BC002Consumibles microfluídicos
BSA fracción VGibco15260-037Consumibles para cultivos celulares
C2BBe1 (clon de Caco-2)ATCCCRL-2102Fuente de células epiteliales
CloroformoSigmaC2432Productos químicos
Incubadora de CO2Heracell150iEquipamiento técnico
Colágeno IV de placenta humanaSigma-AldrichC5533Consumibles de cultivo celular
Cubreobjetos (24 x 40 mm; #1.5)Menzel-Glä ser15747592Consumibles
Cy3 AffiniPure, burro, anticabra IgG (H+L)Jackson Immuno Research705-165-147Tinción vascular secundaria de anticuerpos
Cy3 AffiniPure, burro, anti-ratas IgG (H+L)Jackson Immuno Research712-165-150Tinción epitelial secundaria
de anticuerpos Descosept PURDr.Schuhmacher00-323-100Consumibles para cultivos celulares
DMEM alta glucosaGibco41965-062Consumibles para cultivos celulares
DMEM alta glucosa sin rojo fenolGibco31053028Consumibles para cultivos celulares
DPBS (-/-)Gibco14190-169Consumibles para cultivos
celulares DPBS (+/+)Gibco14040-133Consumibles para cultivos celulares
Solución EDTAInvitrogen15575-038Consumibles para cultivos celulares
Medio de crecimiento celular endotelialPromocellC-22020Consumibles para cultivo celular
Medio de crecimiento celular endotelial Mezcla de suplementosPromocellC-39225Consumibles para cultivos celulares
Etanol 96%, sin desnaturalizarNordbrand-Nordhausen410Productos químicos
Bovino fetalSuero invitrogen10270106Cultivo celular consumibles
Isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano (3-5 kDa)Sigma AldrichFD4-100MGQuímicos
Medio de montaje fluorescenteDakoS3023Productos químicos
Gentamicina (10mg/mL)Sigma AldrichG1272Consumibles para cultivos celulares
GlutaMAX Suplemento (100x)Gibco35050061Consumibles
de cultivo celularHistopaqueSigma-Aldrich10771Consumibles para cultivos celulares
Hoechst (bisBenzimid) H33342Sigma-Aldrich14533Tinción epitelial
Holotransferrina (5 mg/mL) Transferrina, holo, plasma humanoMillipore616397Consumibles para cultivos celulares
Humano GM-CSF recombinantePeprotech300-30Consumibles para cultivos celulares
Humano M-CSF recombinantePeprotech300-25Consumibles para cultivos celulares
Dispositivo de iluminaciónZeissHXP 120 CConfiguración del microscopio de fluorescencia
Microscopio de barrido lásermicroscopio de fluorescenciaZeissCLSM980
Clorhidrato de lidocaínaSigma-AldrichL5647Consumibles para cultivos celulares
Lipopolisacárido (LPS)SigmaL2630Consumibles para cultivos celulares
Toallitas LoftexConsumibles1250115Loftex
Tubos de fijación baja (PS, 5 mL)Consumibles Falcon352052
Adaptador Luer para la tapa superior (M)Mo Bi TecM3003Consumibles microfluídicos Tapones
mini luer macho, fila de cuatro,PP, opaco Tienda dechips microfluídicos09-0556-0336-09Consumibles microfluídicos
MEM Solución de aminoácidos no esencialesGibco11140Consumibles para cultivos celulares
MetanolRoth8388.2Productos químicos
MicroscopioZeissAxio Observer 5Configuración del microscopio de fluorescencia Portaobjetos
microscopioMenzelMZ-0002Consumibles
Monoclonal, de ratón, antihumano Anticuerpo CD68 ( KP1)Thermo Fisher Scientific, Invitrogen14-0688-82Anticuerpo primario Tinción vascular
Monoclonal, rata, antihumano Anticuerpo E-Cadherina (DECMA-1)Sigma-Aldrich, MilliporeMABT26Anticuerpo primario Tinción epitelial
Lector de placas Multiskan GoThermo Fisher51119300Equipo técnico
Suero de burro normalBiozolLIN-END9010-10productos químicos
Seccionamiento ópticomicroscopio de fluorescenciaZeissApoTome
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)Gibco15140-122Consumibles para cultivos celulares Tapones
Cole ParmerGZ-45555-56Consumibles microfluídicos
Policlonal, de cabra, antihumano Anticuerpo VE-CadherinR& D SystemsAF938Anticuerpo primario Tinción vascular
policlonal, conejo, antihumano Von Willebrand Anticuerpo FactorDakoA0082Anticuerpo primario Tinción vascular
policlonal, conejo, antihumano Anticuerpo ZO-1Thermo Fisher Scientific, Invitrogen61-7300Anticuerpo primario Tinción epitelial
MicroscopioZeissEplax Vp232Configuración del microscopio de fluorescencia
Microscopio PrimovertZeiss415510-1101-000Equipo técnico
Bomba peristáltica Reglo ICCIsmatec ISM4412Equipo técnico
SAHA (Vorinostat)Sigma AldrichSML0061-25MGChemicals
SaponinaFluka47036Productos químicos
S-Monovette, 7,5 mL Z-GelSarstedt01.1602Consumibles
S-Monovette, 9,0 mL K3ESarstedt02.1066.001Consumibles
Piruvato de sodioGibco11360-088Consumibles para cultivos celulares
Tanque 4,5 mLChipShop10000079Consumibles microfluídicos
Tinción azul de tripano 0,4%InvitrogenT10282Consumibles para cultivos celulares
TripsinaGibco11538876Consumibles para cultivos celulares
TubingDynamic 42ST001Consumibles microfluídicos
Pinzas (Prä zisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)RothK343.1Consumibles
Aglutinina de germen de trigo (WGA)Thermo Fisher Scientific, InvitrogenW32464Tinción epitelial
X-VIVO 15LonzaBE02-060FConsumibles para cultivos celulares, medio celular hematopoyético
Zellkultur Multiwell Platten, 24 Pocillos, estérilGreiner Bio-One662 160Consumibles
Zellkultur Multiwell Platten, 6 Pocillos, estérilGreiner Bio-One657 160Consumibles
Zen Blue SoftwareZeissversión 3.7Software de microscopía
Configuración del de Configuración del

Referencias

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Respuesta inmunitaria intestinalestructuras de vellosidades 3Destructuras similares a criptasmacr fagos residentes en los tejidosc lulas dendr ticasbiochip microflu dicoinfiltraci n de c lulas inmunitariasensayo de permeaci nmedici n de inmunofluorescencia
Modelo inmunocompetente de intestino en chip para analizar las respuestas inmunitarias de la mucosa intestinal
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