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Aplicaciones de la espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida en la investigación de productos naturales: alcaloides tropanos como estudio de caso

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DOI:

10.3791/66620

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8 de marzo de 2024

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1Department of Chemistry, Northern Michigan University

En este artículo

Resumen

Presentamos un método para la anotación y clasificación de alcaloides tropanos basada en espectrometría de masas (MS) rápida/espectrometría de masas, útil tanto para la dereplicación preliminar de muestras que contienen tropano como para el descubrimiento de nuevos alcaloides para el aislamiento.

Resumen

Aunque muchos de los fármacos utilizados hoy en día son de origen sintético, los productos naturales siguen siendo una rica fuente de nueva diversidad química y bioactividad, y pueden dar pistas prometedoras para enfermedades resistentes o emergentes. El desafío, sin embargo, es doble: los investigadores no solo deben encontrar productos naturales y dilucidar sus estructuras, sino que también deben identificar lo que vale la pena aislar y analizar (y lo que ya se sabe, un proceso conocido como dereplicación). Con el advenimiento de la instrumentación analítica moderna, el ritmo del descubrimiento y la desreplicación de productos naturales se ha acelerado. La cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) se ha convertido en una técnica especialmente valiosa para identificar y clasificar estructuras químicas. Los alcaloides tropanos (AT) son compuestos derivados de plantas de gran importancia medicinal y toxicológica. En este estudio, desarrollamos un flujo de trabajo de cribado basado en LC-MS/MS utilizando las múltiples configuraciones de MS/MS disponibles en un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (QQQ) para anotar y clasificar las estructuras de TA en función de sus distintos patrones de fragmentación. Mediante el uso de una combinación de escaneos de iones de productos dependientes de datos (DD), escaneos de iones precursores (PrIS) y escaneos de pérdida neutra (NLS), aplicamos este método a extractos ricos en TA de las solanáceas Datura stramonium y Datura metel. Este método es rápido, sensible y se empleó con éxito tanto para la dereplicación preliminar de muestras complejas que contienen TA como para el descubrimiento de un nuevo candidato para el aislamiento, la purificación (y el eventual bioensayo).

Introducción

Aunque las moléculas totalmente sintéticas se han vuelto más prominentes en el descubrimiento de fármacos en las últimas décadas, casi dos tercios de todos los medicamentos aprobados en los últimos 39 años son productos naturales o inspirados en productos naturales,1,2  lo que subraya la importancia continua de la investigación de productos naturales. Los alcaloides, ciertos productos naturales que contienen nitrógeno, son especialmente apreciados por sus propiedades medicinales. Alcaloides tropanos (AT) que contienen el [3.2.1.]-sistema bicíclico que contiene nitrógeno, son producidos principalmente por plantas de las familias Solanaceae (solanáceas), Erythroxylaceae y Convolvulaceae. Algunos ejemplos son la atropina, la escopolamina y la cocaína; Múltiples tropanos semisintéticos o sintéticos también se utilizan clínicamente3. Los TA y sus derivados se utilizan para tratar muchas afecciones 3,4 y varios de estos fármacos aparecen en la Lista de Medicamentos Esenciales 2023 de la OMS5. Debido a sus potentes actividades, los TA también se utilizan con fines recreativos (como estimulantes o delirantes) y pueden causar envenenamiento por ingestión de plantas (o preparados) que los contienen 6,7. Los TA son indeseables en la alimentación humana y animal8 y pueden contaminar tés, especias, granos, miel y suplementos herbales 9,10. Debido tanto a su promesa medicinal como a su capacidad para envenenar, los métodos analíticos que pueden ayudar en el descubrimiento de nuevos ATs (y la identificación de los AT conocidos) son útiles.

En la espectrometría de masas en tándem (MS/MS), los "filtros de masas" (por ejemplo, cuadrupolos, tubos de tiempo de vuelo) se acoplan físicamente ("en el espacio"), o un instrumento emplea pasos adicionales de reacción/separación "en el tiempo". La MS/MS en el espacio utiliza diferentes modos para seleccionar y fragmentar diferentes iones en los diferentes filtros de masa (por ejemplo, los cuadrupolos de un instrumento de triple cuadrupolo o QQQ). Estos diferentes modos se pueden utilizar para determinar qué fragmentos específicos son formados por un ion dado (escaneo de iones de producto), qué iones en una muestra producen ciertos fragmentos (escaneo de iones precursores o PrIS) o sufren pérdidas de una masa característica (escaneo de pérdida neutra o NLS), o qué compuestos específicos poseen qué fragmentos específicos (monitoreo de reacciones múltiples). MS/MS, por lo tanto, proporciona fragmentos que son útiles para proponer estructuras para nuevos compuestos o confirmar la presencia de un compuesto existente. La MS/MS se utiliza cada vez más en los campos del descubrimiento de fármacos, la química de productos naturales y la metabolómica11,12, y se ha utilizado para perfilar especies que contienen alcaloides (para la caracterización fitoquímica o el análisis quimiotaxonómico) y para detectar y cuantificar alcaloides específicos en alimentos o plantas medicinales 10,13,14,15,16.

A pesar de las muchas técnicas de espectrometría de masas disponibles, existen desafíos para encontrar nuevos alcaloides. Además de encontrar un organismo candidato para el cribado, la confirmación estructural completa de un alcaloide es un proceso arduo que puede incluir muchas técnicas analíticas diferentes. Además, los investigadores pudieron aislar un compuesto que ya se conoce, desperdiciando trabajo, tiempo y recursos. Esto es especialmente difícil para las AT, donde se reportan cientos, si no miles de TA, muchas de las cuales son isoméricas entre sí. El proceso de "identificar lo conocido y distinguirlo de lo desconocido" se conoce como dereplicación. Se publican bases de datos de los tiempos de retención (r.t.s) y fragmentos de masa de diferentes ATs y otros compuestos para ayudar en este proceso 17,18. No obstante, la dereplicación es laboriosa; El mero hecho de anotar (es decir, asignar estructuras putativas a) los alcaloides en todo el cromatograma LC-MS/MS de una muestra lleva mucho tiempo. Recientemente, tanto la red molecular1 9,20 como la dereplicación manual 18,21,22 se han utilizado para la bencilisoquinolina, el indol monoterpénico y los alcaloides tropanos, y los PrISs se han utilizado para el "filtrado estructural" de espectros para identificar pirrolizidina y alcaloides de tipo solanina 23,24. Sin embargo, no hay métodos o flujos de trabajo específicos disponibles para la dereplicación rápida basada en LC-MS/MS de muestras que contienen TA, a pesar de que los TA poseen fragmentos comunes y fácilmente identificables (Figura 1). El método descrito aquí utiliza una combinación de escaneos de iones de productos dependientes de datos (DD), PrISs y NLSs para anotar y clasificar las estructuras de TA en plantas en función de los distintos patrones de fragmentación para tropanos mono-, di- y trisustituidos (Figura 1A) y las pérdidas de grupos de ésteres comunes encontrados en estos alcaloides (Figura 1B). Los organismos de estudio son varias especies del género de solanáceas Datura. Una rica fuente de diversos ATs, la Datura se ha utilizado a lo largo de la historia del mundo con fines medicinales y culturales17- y es una matriz difícil de replicar debido a sus numerosos TA estructuralmente similares, lo que nos proporciona muestras atractivas sobre las que probar nuestro método.

Protocolo

PRECAUCIÓN: Consulte todas las hojas de datos de seguridad de materiales (MSDS) relevantes antes de utilizar los productos químicos enumerados.

1. Preparación de la muestra

PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido puede causar quemaduras criogénicas. Use guantes criogénicos y protección para los ojos en un área bien ventilada. Las muestras de plantas que contienen alcaloides pueden ser irritantes para la piel; Manéptelos siempre con guantes. El metanol es tóxico e inflamable y debe manipularse en una campana extractora lejos de posibles fuentes de ignición.

NOTA: En teoría, se puede utilizar tejido vegetal cultivado o silvestre (seco o molido fresco); El siguiente procedimiento es precisamente el que se utiliza durante el desarrollo del método.

  1. Si el tejido vegetal de interés es fresco, congélalo colocándolo en un tubo cónico de polipropileno y sumergiéndolo en nitrógeno líquido durante 2-3 min.
  2. Coloque el tejido vegetal congelado en un mortero preenfriado (en un enfriador de poliestireno con nitrógeno líquido) y, con un mortero preenfriado, muela el tejido hasta obtener un polvo uniforme.
  3. Pese rápidamente la cantidad deseada de tejido en un tubo de microcentrífuga de polipropileno tarado utilizando una espátula preenfriada e inmediatamente agregue metanol al 20% (a temperatura ambiente [RT]) a una concentración de 1 ml por cada 100 mg de tejido.
    NOTA: El metanol (20%) se usa comúnmente para extraer TAs25. Ocasionalmente, se añade ácido fórmico al 0,1%, aunque no se observaron diferencias en la eficiencia de extracción durante el desarrollo de este método y otros.
  4. Coloque los tubos tapados en un agitador oscilante (velocidad media) durante un mínimo de 3 h a RT.
  5. Centrifugar los tubos a 9464 x g durante 10 min. Pipetear el sobrenadante en un vial de muestreador automático LC-MS o, si aún está turbio, filtrar primero a través de un filtro de jeringa de 0,45 μm.
    NOTA: El protocolo puede ser pausado aquí, aunque las muestras y extractos de plantas frescas procesadas deben almacenarse en un congelador a -80 °C antes del análisis para evitar cualquier posible degradación de alcaloides.

2. Configuración del instrumento LC-MS y recopilación de datos

PRECAUCIÓN: El acetonitrilo es tóxico e inflamable; Manténgalo alejado de fuentes de ignición y controle los vapores con una campana extractora. El ácido fórmico es corrosivo; Evite el contacto con la piel y los ojos y use el equipo de protección personal adecuado.

  1. Utilice un instrumento LC-MS con una fuente de ionización por electrospray (ESI) y una columna de HPLC de fase reversa (C18, 4,6 x 100 mm).
  2. Para HPLC, use ácido fórmico al 0,1% en H2O como solvente A y ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo como solvente B; equilibre la columna con 99% A y 1% B. Configure un gradiente de 30 min de 1%-50% B durante 26 min, volviendo a 1% B a 26.01 min y manteniéndose en 1% B durante 4 min. Utilice una temperatura de horno de columna de 45 °C y un caudal de 0,5 mL/min.
  3. En el método LC-MS, utilice los siguientes parámetros de funcionamiento para el espectrómetro de masas: voltaje de la interfaz: 4,0 kV, flujo de gas de nebulización: 3 L/min, flujo de gas de calefacción: 10 L/min, temperatura DL: 250 °C, temperatura del bloque térmico: 400 °C, temperatura de la interfaz: 300 °C, flujo de gas de secado: 10 L/min y presión de gas (argón) de disociación inducida por colisión (CID) de 17 kPa.
  4. Cree un método MS en modo ESI positivo que incluya un escaneo Q3 y un escaneo Q1 (100-1000 Da) que funcione como un evento topográfico (establecido en la longitud del método LC), con la exclusión automática de isótopos habilitada. Incluya un escaneo de iones de producto como un evento dependiente del escaneo Q1 (análisis DD), con una ventana de masa de 50-1000 Da, una energía de celda de colisión de -20 V y un tiempo de evento de <0,2 s.
    NOTA: El umbral de recuento para activar el escaneo de iones del producto DD de Q1 puede ser variable, pero normalmente se utiliza un nivel de 7.000-10.000 recuentos. En algunos instrumentos, como el utilizado para desarrollar el método, el escaneo Q3 proporciona una mayor precisión y sensibilidad de masa que el Q1 y se incluye para confirmar los iones observados en el escaneo Q1, aunque se puede omitir en el paso 2.4 sin problemas.
  5. Al método MS anterior, añádase PrISs de modo positivo iguales a la longitud del método LC con energías de celda de colisión de -20 V y tiempos de evento de 0,75 s. Asegúrese de que, en todos los casos, las funciones de exclusión automática de isótopos o desisótopos estén habilitadas. Asegúrese de que los valores m/z de interés para los fragmentos de TA (en Da, véase la Figura 1A) sean 124,1 (para los TA monosustituidos, ventana de masa de 125-1000 Da), 122,1 y 140,1 (para los AT disustituidos, ventanas de masa que comienzan en 123 y 141 Da, respectivamente) y 156,1 y 138,1 (para TA trisustituidos, ventanas de masa que comienzan en 157 y 139 Da, respectivamente).
    NOTA: Durante el desarrollo del método, los PrIS se dividieron en dos métodos diferentes, uno para los TA mono y disustituidos y otro para los TA trisustituidos, aunque pueden dividirse o combinarse de cualquier manera.
  6. Cree un segundo método MS que incluya los parámetros del paso 2.4.
    1. A este método MS/MS hay que añadir un NLS de modo positivo igual a la longitud del método LC, con energías de célula de colisión de -20 V y tiempos de suceso de 0,75 s. Asegúrese de que, en todos los casos, las funciones de exclusión automática de isótopos o desisótopos estén habilitadas.
    2. Asegúrese de que las masas de pérdida neutra de interés para los ésteres en los TA (en Da, véase la Figura 1B) sean 100,05 (para los ésteres derivados del ácido tíglico, ventana de masa de 110-1000 Da), 60,03 (para grupos acetilo, ventana de masa de 100-1000 Da) y 166,06 (ésteres fenillácticos o de ácido tropical, ventana de masa de 170-1000 Da).
  7. Descargue el método LC-MS y cree archivos de datos para las muestras de interés. Una vez que la columna de HPLC esté equilibrada a 45 °C, ejecute las muestras de interés en un lote o archivo de proyecto con disolventes de extracción apropiados entre diferentes especies o tipos de tejidos. Un volumen de inyección típico es de 10-20 μL.
    NOTA: A volúmenes especialmente altos, el detector de espectrómetro de masas puede estar saturado. Si se procesan muestras muy concentradas, asegúrese de que la fuente ESI esté limpia y de que el instrumento esté afinado regularmente. El protocolo se puede pausar aquí después de recopilar todos los datos.

3. Análisis de datos

  1. Examine el cromatograma iónico total de los escaneos Q1 y Q3 (y el escaneo iónico del producto DD), y observe la masa principal de cualquier ion abundante que tenga características similares a TA: a) masa <500 Da para el ion [M + H]+ , generalmente una masa uniforme, b) r.t. típicos entre 2 y 22 min usando el método LC anterior, y c) fragmentos de la siguiente lista: m/z 93, 124, 142, 140, 122, 138, 156, 174, 110 o 128 Da.
  2. Examine el cromatograma/canal PrIS para m/z 124 y observe qué picos/iones están en los que los r.t.s (registrados en el paso 3.1) producen este fragmento. Haga clic escaneo por escaneo a través del cromatograma, así como examine los espectros completos de MS/MS obtenidos en el escaneo de iones del producto DD, especialmente para las especies de menor abundancia.
    NOTA: Existirá una especie verdadera que contenga este fragmento para múltiples escaneos y aparecerá tanto en los escaneos Q1 como en los Q3 (si se usa este último). Se adjunta una hoja de cálculo en la información de apoyo (archivo complementario 1) para ayudar con las anotaciones.
  3. Repita el paso 3.2 con los otros cromatogramas PrIS. Dado que tanto m/z 122 como 140 son indicativos de TA disustituidos y que tanto m/z 138 como 156 son indicativos de TA trisustituidos, examine estos cromatogramas/canales juntos.
  4. Examine el cromatograma/canales NLS para m/z 100, 60 y 166, y observe qué picos/iones en los que r.t.s (registrados en el paso 3.1) producen estas pérdidas neutras. Al igual que con el PrIS, haga clic escaneo por escaneo a través del cromatograma y compárelo con la fragmentación obtenida en el escaneo de iones del producto DD, especialmente para las especies de menor abundancia.
  5. Utilizando la combinación de datos de PrIS y NLS, respaldados por los resultados del escaneo de iones del producto DD, haga anotaciones putativas de los alcaloides observados agregando la masa tropana más pequeña (por ejemplo, 124, 122 o 138) y la pérdida neutra y luego contabilizando la masa restante restante.
    NOTA: Los grupos típicos que sustituyen a los TA (y sus masas en Da) son hidroxilo (18), acetilo (60), propionilo (74), isobutililio (88), tigloilo (100), tigloilo/2-metilbutiril saturado (102) o fenillactato/ácido trópico (166).
  6. Compare las anotaciones de los alcaloides con las reportadas en la literatura17 y las bases de datos (por ejemplo, MoNA)26 para determinar qué patrones de sustitución de AT se reportan (y cuáles son potencialmente nuevos). Además, use patrones de algunos alcaloides tropanos comunes (por ejemplo, atropina, littorina, escopolamina) que están disponibles comercialmente para su confirmación.
  7. Para obtener información estructural adicional para muestras de baja abundancia (el PrIS y el NLS pueden recoger iones por debajo de los umbrales de eventos dependientes), recoja un escaneo de iones de producto específico (utilizando la masa de interés como ion precursor) en una muestra más concentrada.
    NOTA: Este método se desarrolló en un instrumento QQQ de baja resolución. Para todos los nuevos compuestos putativos, se debe utilizar un instrumento MS de alta resolución para obtener espectros de masas precisos.

Resultados

Para demostrar la efectividad del método, se analizó una mezcla estándar de TA (10 μg/mL de una mezcla de acetiltropina/acetilpseudotropina [monosustituida], 10 μg/mL de cada una mezcla de dos isómeros de anisodamina [disustituidos], junto con hiosciamina [monosustituida], littorina [monosustituida] y escopolamina [trisustituida]) como control positivo (Figura 2). En la Figura 2A se muestra un cromatograma de exploración Q1 completo (que se muestra en la vista de cromatograma de pico base), con las estructuras estándar de TA indicadas por sus picos correspondientes. El PrIS para m/z 124 (Figura 2B) muestra picos en su cromatograma para los TA monosustituidos; ergo, se muestra la mezcla de acetiltropina/pseudotropina, hiosciamina y littorina. Los picos correspondientes a acetiltropina y pseudotropina en el cromatograma m/z 124 son pequeños (posiblemente porque están a una concentración más baja que los otros patrones y posiblemente porque podrían producir un fragmento m/z 124 menos abundante que los otros TA monosustituidos). No obstante, siguen siendo detectables tanto en este cromatograma como en el canal PrIS correspondiente. La Figura 2C y la Figura 2D son cromatogramas PrIS para m/z 122 y 140, respectivamente. Al detectar fragmentos de TA disustituidos, ambos marcan los dos isómeros de anisodamina, con una señal más fuerte visible en el canal m/z 140. Dado que diferentes TA pueden poseer fragmentos de diferentes intensidades, los canales m/z 122 y 140 deben examinarse conjuntamente. Por último, los canales m/z 156 (Figura 2E) y m/z 138 (Figura 2F), que diagnostican los TA trisustituidos, muestran un pico para la escopolamina (el único TA trisustituido en la mezcla estándar).

A continuación, se utilizaron cromatogramas NLS para asignar los grupos éster presentes. La figura 2G muestra el cromatograma NLS para 60 Da (pérdida de ácido acético de los ésteres de acetato): los dos isómeros de TA monosustituidos acetilados son visibles. El cromatograma NLS para 166 Da (Figura 2I), destinado a identificar ésteres fenillácticos o tropicales, identifica correctamente todos los alcaloides que contienen cualquiera de estos grupos (hiosciamina, littorina, los dos isómeros de anisodamina y escopolamina). Finalmente, como se predijo, el cromatograma (Figura 2H) para la pérdida de 100 Da (diagnóstico de ésteres de tigloilo) está en blanco con la excepción de una impureza menor a r.t. 1,75 min, ya que ninguno de los alcaloides estándar contiene este grupo.

A continuación, se probó el método en busca de falsos positivos. Un extracto acuoso/metanol de hoja de tomate (Solanum lycopersicum) sirvió como control negativo. A pesar de ser solanáceas, los tomates no producen TA. En la Figura 3A se muestra un cromatograma de pico base de exploración Q1 completo. El PrIS para m/z 124 (Figura 3B) está en su mayor parte en blanco, con pequeñas fluctuaciones de referencia que probablemente sean ruido del detector (ninguna señal coincidió con esas masas en los escaneos Q1 o Q3). Dos características con r.t.s de 2,6 y 3,4 min producen un fragmento de 124, pero el examen de la exploración de iones de producto DD revela que estas características no producen ningún otro fragmento de tropano monosustituido (m/z 93 o 142), lo que sugiere que no son TA. Este ejemplo también destaca la utilidad de incluir el escaneo de iones del producto DD en este método para descartar falsos positivos. De manera similar, el canal m/z 122 para TA disustituidos (Figura 3C) también muestra solo ruido. En la Figura complementaria 1A-F se muestran los cromatogramas PrIS para m/z 140, m/z 138 y m/z 156, y los tres NLS, que sugieren solo características no TA en las exploraciones DD.

Para demostrar los usos de este método en la dereplicación de una muestra que contiene TA, se analizó un extracto de raíz de D. metel var. 'fastuosa'. Las raíces son el sitio principal de la biosíntesis de TA en las solanáceas, y se predijo la presencia de muchos TA diversos. El cromatograma de exploración Q1 completo se muestra en la Figura 4A. Como era de esperar, se detectaron numerosas características de diversa abundancia en los PriSA para m/z 124 (Figura 4B), m/z 122 (Figura 4C), m/z 140 (Figura 4D), m/z 156 (Figura 4E) y m/z 138 (Figura 4F). Muchos de estos TA también fueron acetilados o tigloilados, o derivados del ácido fenilláctico/trópico, como lo muestran las numerosas señales en los cromatogramas NLS en la Figura 4G-I, respectivamente.

Se utilizó una hoja de cálculo, proporcionada como un archivo de .xls (una hoja vacía para uso del lector es el Archivo Suplementario 1, la raíz de D. metel está en el Archivo Suplementario 2), para documentar por primera vez qué características (masas o r.t.s) parecían similares a TA (utilizando los criterios del paso 3.1). A continuación, se anotaron fragmentos y pérdidas neutras pertenecientes a estas características. El método es extremadamente sensible: los canales PrIS incluso detectaron fácilmente TA de baja abundancia que no produjeron picos visibles en los cromatogramas correspondientes. Utilizando los fragmentos y las pérdidas neutras, se podría proponer una estructura para el alcaloide siguiendo el paso 3.5.

En la Figura 5 se proporciona un ejemplo del uso de los datos espectrales para anotar alcaloides. El cromatograma de barrido Q1 completo para la raíz de D. metel se encuentra en la Figura 5A. Se seleccionó una función a los 14,4 minutos; el espectro de exploración Q1 (Figura 5B) muestra una masa inicial de m/z 224 para este pico. El espectro de escaneo de iones del producto DD se muestra en la Figura 5C. El canal PrIS para m/z 124 (Figura 5D) indica que el ion 224 produce este fragmento (también visible en el escaneo de iones del producto DD). El canal NLS para 100 Da (para detectar TA tigloilados) también marca m/z 224 (también confirmado por el escaneo de iones del producto DD). La suma de la pérdida neutra y el fragmento TA de menor masa (100 + 124 Da) es igual a la masa principal, 224, lo que confirma que el grupo tigloyl es la única sustitución; una estructura probable para este alcaloide se indica en la Figura 5C. En el caso de los TA di- y trisustituidos, se añadieron las masas de pérdida neutra observadas a la masa TA más baja, y luego se propuso otra sustitución para dar cuenta de la masa restante: por ejemplo, m/z 222, con fragmentos de TA disustituidos de 140 y 122 y una pérdida neutra de 100 Da, tiene una masa sobrante de 100 (222-122 = 100), Es probable que se trate de un segundo grupo Tigloyl. Este flujo de trabajo se puede utilizar intuitivamente para el proceso de eliminación: es poco probable que una característica que carezca de fragmentos de tropano (incluso si puede perder 60, 100 o 166 Da) sea un TA. En un ejemplo de dereplicación completa y rápida utilizando este flujo de trabajo, se identificaron 71 TA distintos de diversa abundancia y polaridad en la raíz de D. metel , incluidos múltiples compuestos isoméricos (Archivo suplementario 2). Algunos de estos compuestos tenían grupos éster que no se podían asignar fácilmente, y algunos compuestos adicionales se marcaron como posibles AT, pero no se pudieron anotar con alta confianza.

También se analizó un extracto metanol/agua de semillas molidas de D. stramonium. En la Figura 6A se muestra el cromatograma completo de pico base de exploración Q1 para la raíz de D. metel. El PrIS para m/z 124 se muestra en la Figura 6B y el PrIS para m/z 122 se muestra en la Figura 6C; los otros cromatogramas se muestran en la Figura suplementaria 2A-F. La Figura 6B indica un alcaloide tropano monosustituido muy abundante a un r.t. = 12,6 min, probablemente hiosciamina. La hoja de cálculo que muestra las anotaciones de TA inicial se incluye en el Archivo Complementario 3. El rendimiento del método pareció menor con esta muestra en particular: dos características muy abundantes con un m/z de 259 a r.t.s de 8,5 y 10,2 mins produjeron picos en los cromatogramas NLS para 60 y 100 Da (Figura suplementaria 2 D,E) con una masa de m/z 260 (un isótopo M+1) indicada en los espectros correspondientes. Estos compuestos no son ATs, sino fragmentos formados consistentes con los alcaloides beta-carbolinos27. No están acetilados ni tigloilados, pero pierden 60 o 100 de su isótopo M+1, lo que hace que su aparición en estos dos canales NLS sea incorrecta. Además, la escopolamina (r.t. = 10,5 min) produjo un fragmento m/z 122 de su pico de isótopo m/z 305 M+1, un isótopo del fragmento m/z 121 esperado de la escopolamina. A pesar de que estos métodos emplean funciones de desisótopos, es posible que se produzcan algunas "fugas" de isótopos a estas altas concentraciones de muestra. Si bien esto puede ser un hecho exclusivo del instrumento utilizado en este estudio o en esta muestra, vale la pena señalarlo.

Se anotaron cuarenta TA en semillas de D. stramonium utilizando este método, incluyendo varias que parecen estar glicosiladas, perdiendo masas de 162 (hexosa), 146 (desoxihexosa) o 132 Da (xilosa o un azúcar similar). Si bien se han reportado TA que contienen hexosa en Merremia (Convolvulaceae)28, Duboisia29 y Atropa25, este es el primer reporte de TA que contienen desoxihexosa o xilosa. Un AT tenía una t.r. de 13,8 min (Figura 7A) y una masa de m/z 436 (exploración Q1 en la Figura 7B). Esta característica produjo una señal en el canal m/z 124, lo que indica un TA monosustituido (Figura 7D), pero no produjo señales en ningún otro canal PrIS o NLS. El escaneo de iones del producto DD (Figura 7C) indicó el m/z esperado 124, una pérdida de 312 Da, posiblemente 166 + 146 Da, del ion padre. Se obtuvo MS/MS de alta resolución en un instrumento de tiempo de vuelo cuadrupolar (espectro en la Figura 7E), lo que indicó un fragmento m/z 290, lo que sugiere hiosciamina o littorina glicosilada en la porción de éster hidroxilo con ramnosa o un azúcar similar; la masa exacta medida también fue muy cercana a la masa exacta calculada para la ramnosil-hiosciamina o littorina (estructura en la Figura 7E). Debido a su estructura y abundancia sin precedentes, este alcaloide merece ser aislado de las semillas de D. stramonium , un ejemplo que demuestra el uso de este método en el descubrimiento de nuevos alcaloides.

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Figura 1: Fragmentos relevantes y pérdidas observadas en MS de ATs. (A) Fragmentos característicos (y sus masas diagnósticas) formados a partir de TAs monosustituidos, disustituidos y trisubsituados, así como ejemplos representativos de alcaloides en cada clase. (B) Pérdidas neutras comunes observadas de grupos éster en TAs (y sus masas diagnósticas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Escaneo de iones precursores de control positivo y pérdidas neutras. Para todos los cromatogramas, el eje X es el tiempo de retención y el eje Y es el recuento (abundancia de iones). (A) El cromatograma iónico total, en vista de cromatograma de pico base, de la mezcla estándar de alcaloides. Se indican las estructuras de las normas; Los picos correspondientes se indican con flechas rojas. (B-F) son cromatogramas PrIS para (B) m/z 124, (C) 122, (D) 140, (E) 156 y (F) 138. (G-I) Cromatogramas NLS para 60 Da (acetilo, G), 100 Da (tigoil, H) y 166 Da (ácido fenilláctico/tropical, I). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Escaneo de iones precursores de control negativo y pérdida neutra. Para todos los cromatogramas, el eje X es el tiempo de retención y el eje Y es el recuento (abundancia de iones). (A) El cromatograma iónico total, en vista de cromatograma de pico base, de un extracto de metanol/agua de hoja de S. lycopersicum . (B) El cromatograma PrIS para m/z 124 que muestra solo dos características no tropánicas a r.t. 2.6 y 3.4 min. (C) El cromatograma PrIS para m/z 122, en blanco excepto para el ruido del detector. Las escalas utilizadas son las mismas que en la Figura 2; los cromatogramas restantes se encuentran en la Figura Suplementaria 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Aplicación del método MS/MS a raíces de D. metel var. 'fastuosa'. Para todos los cromatogramas, el eje X es el tiempo de retención y el eje Y es el recuento (abundancia de iones). (A) El cromatograma iónico total, en vista de cromatograma de pico base, de un extracto de metanol/agua de raíces de D. metel var. 'fastuosa'. (B-F) son cromatogramas PrIS para m/z (B) 124, (C) 122, (D) 140, (E) 156 y (F) 138. (G-I) son cromatogramas NLS para 60 Da (acetilo, G), 100 Da (tigoil, H) y 166 Da (ácido fenilláctico/trópico, I). Obsérvese las abundantes señales en cada cromatograma correspondientes a numerosos TA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-5
Figura 5: Aplicación del método combinado de escaneo de iones de productos DD, escaneo de iones precursores y escaneo de pérdida neutra para proponer la estructura de un TA. (A) El cromatograma iónico total, en vista de cromatograma de pico base, de un extracto de metanol/agua de raíces de D. metel var. ' fastuosa' . Un pico en r.t. = 14,4 min se indica con una flecha roja. (B) El Q1 (escaneo topográfico), con una masa abundante de m/z 224 para este pico. Para todos los espectros, el eje X es la masa y el eje Y es la intensidad. (C) El escaneo de iones de producto DD, que muestra la fragmentación del ion m/z 224, lo que indica una pérdida de 100 Da y un fragmento m/z 124 (flechas rojas). Este compuesto aparece tanto en el canal (D) m/z 124 PrIS como en el canal NLS (E) 100 Da, lo que indica que es a la vez monosustituido y tigloilado (estructura en el panel C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-6
Figura 6: Aplicación del método MS/MS a semillas de D. stramonium . Para todos los cromatogramas, el eje X es el tiempo de retención y el eje Y es el recuento (abundancia de iones). (A) El cromatograma iónico total, en vista de cromatograma de pico base, de un extracto de metanol/agua de semillas de D. stramonium. (B) El cromatograma PrIS para m/z 124; (C) representa el cromatograma PrIS para m/z 140. El resto de los cromatogramas se encuentran en la Figura Suplementaria 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: Anotación de un nuevo alcaloide en semillas de D. stramonium . Para todos los cromatogramas, el eje X es el tiempo de retención y el eje Y es el recuento (abundancia de iones). (A) El cromatograma iónico total, en vista de cromatograma de pico base, de un extracto de metanol/agua de semillas de D. stramonium. Se indica una característica en r.t. = 13,7 min. (B) El Q1 (escaneo topográfico) que muestra una masa de m/z 436 para este pico. Para todos los espectros, el eje X es la masa y el eje Y es la intensidad. (C) El escaneo de iones del producto DD que muestra la fragmentación del ion m/z 436. (D) Este compuesto de TA monosustituido aparece en el canal PrIS m/z 124. (E) El espectro MS/MS de alta resolución para este nuevo AT, junto con las estructuras propuestas y la masa exacta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Escaneos adicionales de iones precursores de control negativo y pérdida neutra. (A-C) Cromatogramas PrIS para m/z (A) 140, (B) 156 y (C) 138. (D-F) Cromatogramas NLS para 60 Da (acetilo, D), 100 Da (tigoil, E) y 166 Da (ácido fenilláctico/trópico, F). Las escalas utilizadas son las mismas que en la Figura 2. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Aplicación del método MS/MS a semillas de D. stramonium; cromatogramas adicionales. (A-C) son cromatogramas PrIS para m/z (A) 140, (B) 156 y (C) 138. (D-F) Cromatogramas NLS para 60 Da (acetilo, D), 100 Da (tigoil, E) y 166 Da (ácido fenilláctico/trópico, F). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 1: Hoja de cálculo en blanco utilizada para anotaciones de alcaloides. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Ficha complementaria 2: Hoja de cálculo de anotaciones y estructuras de alcaloides para raíces de D. metel var. ' fastuosa' . Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 3: Hoja de cálculo de anotaciones y estructuras de alcaloides para semillas de D. stramonium. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Aunque los parámetros del instrumento proporcionados en el protocolo permiten un rendimiento satisfactorio, el uso exitoso de este método puede requerir una atención cuidadosa o la optimización de varios pasos críticos. Si bien el gradiente de disolventes de HPLC proporcionado en el paso 2.2 es generalmente apropiado para los alcaloides tropanos, puede ser necesario modificarlo en función del perfil de alcaloides tropanos de la muestra o de la especie vegetal que se esté examinando. El volumen de inyección de la muestra también se puede cambiar en función de la sensibilidad del instrumento y de cómo se utilice el método. El perfil metabólico "profundo" o la dereplicación deben utilizar un volumen de inyección mayor (en este estudio se utilizaron 15-20 μL), mientras que la detección simple de alcaloides podría utilizar volúmenes más pequeños. Se debe tener cuidado al usar grandes volúmenes de muestra para (a) mantener la fuente de iones limpia regularmente, (b) monitorear la columna de HPLC para detectar cambios de presión u obstrucciones (siempre se debe usar una columna de protección adecuada), (c) evitar el arrastre entre muestras y (d) examinar los cromatogramas en busca de posibles "fugas de isótopos" como se describe anteriormente. Las temperaturas y voltajes de la interfaz no deben cambiarse significativamente de los especificados en el método para evitar la fragmentación prematura en la fuente. Además, aunque se recomienda un voltaje de celda de colisión de 20 V, es posible que no proporcione una señal de cromatograma óptima (o fragmentos de escaneo iónico de productos DD de diagnóstico) para todos los TA. Algunos instrumentos y funciones de MS tienen una función de "rampa de energía de colisión", o la capacidad de recopilar escaneos a energías de colisión múltiples u optimizadas, que también podrían encontrar utilidad en un método como este30.

Este método de MS en sí mismo también es fácilmente modificable: mientras que los ésteres de ácido tíglico, acético y fenilláctico/trópico son comunes en las especies de Datura, los patrones de sustitución del éster de TA pueden ser diferentes en otras plantas o muestras. Las masas NLS se pueden cambiar para detectar otros grupos de ésteres (por ejemplo, una pérdida de 74 Da para ésteres propiónicos) o potencialmente detectar glicosilaciones (por ejemplo, una pérdida de 162 Da para hexosas). Las masas PrIS también se pueden cambiar. Por ejemplo, un TA en ambas muestras de Datura (r.t. = 12,5 min; ver Archivo Suplementario 1 y Archivo Suplementario 2) se anotó como norhiosciamina o norlittorina (hiosciamina/littorina menos el grupo N-metilo tropano) sobre la base de sus fragmentos de escaneo de iones de producto DD (m/z 110 y 93) y coinciden con los espectros de la literatura31; este TA no apareció en ninguno de los canales PrIS del fragmento de tropano. Se podría añadir un canal para estas dos masas para detectar nortropanos. El fragmento m/z 93 también está presente en la mayoría de los AT monosustituidos17; La adición de este canal podría proporcionar una confirmación adicional de la presencia de un TA monosustituido y ayudar a reducir los falsos positivos.

Además de su adaptabilidad para diferentes tipos de AT, una de las principales ventajas de este protocolo (sobre los métodos de anotación de alcaloides existentes) es su velocidad. Dependiendo de cómo esté configurado el método MS (y del tiempo de ejecución de la HPLC utilizado), todos los datos MS/MS de una muestra se pueden recopilar en un plazo de 60-90 minutos. Por ejemplo, durante nuestros estudios, los TA PrISs mono y di-sustituidos se incorporaron en un método, los TA PrISs trisustituidos estaban en otro método, y los NLS estaban en un tercero (todos los métodos contenían el escaneo iónico del producto DD), para un total de tres inyecciones a treinta minutos cada una. La anotación completa de la muestra utilizando los datos combinados de MS/MS es mucho más rápida que el examen manual de cada pico o la recopilación de escaneos de iones de productos individuales para numerosos picos de interés. Este método se puede realizar en cualquier instrumento con modos de escaneo de iones de producto, PrIS y NLS y se puede utilizar para una evaluación cualitativa rápida (es decir, ¿hay TA presentes o ausentes?), para distinguir o "tomar las huellas dactilares" de diferentes géneros de plantas, especies, variedades o cultivares, órganos o etapas de crecimiento, y para comparar los TA observados con los informados (como parte de un flujo de trabajo de dereplicación). Como se ha demostrado, el protocolo también se puede utilizar para el descubrimiento de nuevos TA como pistas para el aislamiento, la purificación o el bioensayo, así como para la identificación de especies y tejidos candidatos para aislarlos. Este método podría utilizarse en los campos de los productos naturales y la metabolómica, incluso para ayudar a comprender la bioquímica de las plantas y para la investigación de descubrimiento de fármacos en las primeras etapas. Se podrían encontrar aplicaciones adicionales en seguridad alimentaria o medicina forense (por ejemplo, detección de TA en alimentos, suplementos o biofluidos).

El método tiene varios inconvenientes que justifican la discusión. En primer lugar, dependiendo del instrumento utilizado y del propósito de emplear el protocolo, podría ser necesario un gran volumen de inyección de muestra, lo que podría causar problemas de rendimiento del instrumento y la posibilidad de falsos positivos en algunos casos (como se describió anteriormente). En segundo lugar, este método se desarrolló en un instrumento QQQ de baja resolución, y los falsos positivos podrían ser el resultado de la baja resolución (por ejemplo, la característica que contiene un fragmento m/z 124 en el control negativo que no es un TA). Un instrumento de mayor resolución proporcionaría una mejor capacidad diagnóstica, y se deben obtener espectros MS/MS de masa precisa para cualquier nuevo alcaloide propuesto. Los inconvenientes adicionales de este método son simplemente las desventajas del análisis MS/MS en su conjunto. Si bien MS/MS es útil para proponer estructuras ("anotación" según lo designado por la Iniciativa de Estándares de Metabolómica32), no proporciona asignaciones concretas de conectividad molecular ("identificación"). Por ejemplo, en ambas muestras de Datura, encontramos varios isómeros de un m/z 306 TA, que parecían tener fragmentos m/z 124 y m/z 140 (Archivo Suplementario 2), lo que dificulta la asignación definitiva del patrón de sustitución. Esto podría representar un mecanismo de fragmentación aún no descubierto, y otra técnica (como la espectroscopia de resonancia magnética nuclear) puede ser útil para resolver ambigüedades. Los métodos basados en MS/MS con frecuencia luchan con la isomería: el éster de ácido fenilláctico littorina (o sus derivados) es difícil de distinguir de la hiosciamina (éster de ácido trópico), y otras plantas solanáceas contienen TA sustituidos por los grupos isoméricos tigloyl, senecoilo y angeloilo33,34; En ausencia de estándares, estos compuestos pueden ser difíciles, si no imposibles, de distinguir. El método tampoco diferenciará enantiómeros (p. ej., 3,6- vs. 3,7-dihidroxitropano; consulte la Figura 1 para la numeración) o regioisómeros (p. ej., distinguiendo 3-acetilo de 7-acetilo sin un estándar). Hemos asignado la mayoría de los tropanos monosustituidos como 3-sustituidos basándonos en patrones previos reportados en el género Datura y otras plantas solanáceas17,35. Ergo, cualquier conocimiento bioquímico o literatura sobre el organismo estudiado (si está disponible) siempre debe consultarse junto con cualquier análisis instrumental.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por una beca de investigación de la facultad (Universidad del Norte de Michigan, otorgada a M.A.C.), una beca de investigación de pregrado (Universidad del Norte de Michigan, otorgada a J.C) y el Departamento de Química. Los autores desean agradecer a John Berger (NMU) por su ayuda con la preparación del tejido vegetal, a Hannah Hawkins (NMU) por el mantenimiento de LC-MS y la asistencia para la resolución de problemas, y al Dr. Ryan Fornwald y sus estudiantes de CH 495 (Síntesis de Productos Naturales) por su preparación de la mezcla de acetiltropina. Los autores también desean agradecer al Dr. Daniel Jones (Universidad Estatal de Michigan) por adquirir espectros MS/MS de alta resolución.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Acetonitrilo, para UHPLC, apto para espectrometría de masasSigma-Aldrich900667disolvente de HPLC
Gas argónAirGasAR UHP300CID
gas Ácido fórmico, 99% para análisisAditivo Thermo ScientificAC270480010 HPLC
Soporte de columna de protecciónRestek25812
HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D PlusShimadzu228-65802-58 Columna deHPLC
LCMS, SHIMDAZU LCMS-8045Shimadzu225-31800-44Espectrómetro de masas; ejecutamos el software LabSolutions, que es estándar para los instrumentos de Shimadzu
Nitrógeno líquidoAirGasNI 180LT22
Metanol, para HPLC/UHPLC/LCMSVWRBDH 85800.400solvente de extracción
 VWR2400-37
Tubos de microcentrífuga, 1,5 mLFisher Scientific 05-408-129
Mortero Fisher ScientificFB961CPara la molienda de tejidos vegetales
MortleFisher ScientificFB961MPara la molienda de tejidos vegetales
Pipeta 1000 mLGilson 
Punta de pipeta 1000 mLFisher scientific02-707-404
Tejidos vegetalesDiversas fuentesN/APuede ser cualquier cosa silvestre o cultivada
Tubos cónicos de polipropileno, 15 mLFisher Scientific05-539-4
Enfriador de poliestirenoULINES-18312El tipo de refrigeradores en los que se envían los reactivos para biología molecular sería
apropiado Roc C18 3 µ m, 100 mm x 4,6 mmColumnade HPLCRestek 9534315
Roc C18, 10 mm x 4 mmColumna de protección Restek953450210Agitador
oscilanteThemo Scientific11-676-680
Kit de conveniencia para viales con rosca de rosca (9 mm)Fisher scientific13-622-190Viales para muestreador automático LCMS
Jeringa, 3 mLFisher Scientific03-377-27
Filtro de jeringa 0.45 y micro; m Avantor/VWR76479-008
Agua, para uso en cromatografía líquida y espectrometría de masasJT Baker9831-03Para la fabricación de disolvente de extracción
Solución de agua, contiene 0,1% v/v de ácido fórmico, Para UHPLC, apto para espectrometría de masasSigma-Aldrich900687-1LDisolvente de HPLC
Para hacer microcentrífuga F144059M

Referencias

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