El protocolo actual describe un modelo de rata de oclusión/reperfusión de la arteria cerebral media que preserva la estructura anatómica de los vasos cerebrales sin causar daño.
Artículo de método
Un modelo en ratas de oclusión/reperfusión de la arteria cerebral media sin dañar la estructura anatómica de los vasos cerebrales
En este artículo
Resumen
Resumen
El accidente cerebrovascular isquémico es la principal causa de discapacidad y mortalidad a largo plazo entre los adultos de todo el mundo. Los modelos animales de accidente cerebrovascular isquémico han contribuido significativamente a nuestra comprensión de sus mecanismos patológicos y al desarrollo de posibles tratamientos. En la actualidad, existen dos métodos comunes que involucran técnicas de filamento (sutura endovascular) para inducir modelos animales de isquemia cerebral. Sin embargo, estos métodos tienen limitaciones inherentes, como la reducción de la perfusión de sangre al cerebro, el daño al sistema de la arteria carótida externa, el deterioro de la ingesta de alimentos y/o agua y la disfunción sensorial de la cara. Este artículo presenta un nuevo método para inducir un modelo de accidente cerebrovascular isquémico en ratas sin comprometer la anatomía vascular cerebral. En este estudio, se expuso la arteria carótida común (CCA) de ratas Sprague-Dawley y se realizó una incisión. A continuación, se insertó un filamento a través de la incisión en la arteria carótida interna para ocluir la arteria cerebral media. Después de 1,5 h de isquemia inducida, el filamento oclusivo se retiró completamente tanto de la arteria carótida interna como del CCA. Posteriormente, la incisión en el CCA se suturó con suturas microquirúrgicas 11-0 al microscopio (aumento 4x). A través de la utilización de técnicas microquirúrgicas para reparar el CCA, este estudio desarrolló con éxito un método único para inducir un modelo de accidente cerebrovascular isquémico en ratas, al tiempo que preserva la integridad anatómica de los vasos sanguíneos cerebrales.
Introducción
El accidente cerebrovascular, la principal causa de muerte y disfunción neurológica a largo plazo en adultos en todo el mundo, abarca varios tipos, siendo el accidente cerebrovascular isquémico el que representa aproximadamente el 81,9% de los casos, mientras que la hemorragia cerebral y la hemorragia subaracnoidea representan el 14,9% y el 3,1%, respectivamente1. El accidente cerebrovascular isquémico a menudo es el resultado de la aterosclerosis o la oclusión de la arteria cerebral media (ACM), lo que lleva a una reducción del flujo sanguíneo cerebral local y daño cerebral posterior. Esta reducción en el suministro de nutrientes a las células isquémicas desencadena el agotamiento de la energía, lo que provoca la pérdida de la integridad de la membrana, la hinchazón celular y, finalmente, la lisis. Además, factores como el aumento del calcio intracelular, la liberación excitatoria de aminoácidos, el aumento de la producción de radicales libres y la activación de las células inflamatorias contribuyen a la lesión del tejido cerebral después de un accidente cerebrovascular2.
Los objetivos del tratamiento para el accidente cerebrovascular isquémico son multifacéticos: reducir el daño neurológico continuo y disminuir la mortalidad y la discapacidad a largo plazo; prevenir las complicaciones derivadas de la inmovilidad y la disfunción neurológica; y minimizar el riesgo de recurrencia del accidente cerebrovascular. Dada la complejidad de la fisiopatología del ictus isquémico, un modelo sólido de ictus es esencial para la investigación y el desarrollo de tratamientos dirigidos al ictus isquémico.
Actualmente, la oclusión de la arteria cerebral media (MCAo) es un modelo animal común de accidente cerebrovascular isquémico3. La MCAo se realiza típicamente insertando un monofilamento con punta de silicona o embotado con llama a través de los vasos cervicales hasta que llega al origen de la arteria cerebral media (MCA). En 1986, Koizumi y sus colegas desarrollaron una técnica que implicaba la inserción de un monofilamento con punta de silicona a través de una incisión en la arteria carótida común (CCA), lo que le permitía llegar a la entrada del MCA y bloquear su flujo sanguíneo4. En 1989, el grupo de Longa informó de otro método MCAo que consistía en introducir un monofilamento a través de una incisión en la arteria carótida externa (ECA). A continuación, el monofilamento atraviesa la bifurcación de la arteria carótida interna (ICA) y la ECA antes de alcanzar el punto de partida del MCA5.
Las limitaciones de los dos métodos existentes para inducir MCAo son evidentes. El método de Koizumi requiere el bloqueo permanente del CCA ipsilateral, lo que conduce a una reducción de la perfusión de MCA, ya que la reperfusión se basa únicamente en el círculo de Willis4. Por el contrario, el método de Longa consiste en cortar el ECA, lo que provoca daños en el sistema ECA y el consiguiente deterioro de la función de los músculos faciales5. Este daño puede afectar la ingesta de alimentos y agua, así como causar una disfunción sensorial de la cara, afectando la rehabilitación y la evaluación de la función neurológica después de un accidente cerebrovascular isquémico6.
El protocolo actual busca abordar estas limitaciones mediante el desarrollo de un nuevo método para inducir un modelo de accidente cerebrovascular isquémico sin dañar la estructura anatómica de los vasos cerebrales. Este novedoso enfoque utiliza técnicas microquirúrgicas para reparar la CCA, evitando así los inconvenientes asociados con los métodos anteriores.
Protocolo
El procedimiento experimental recibió la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yantai (Número de aprobación: YTDX20230410) y se adhirió a las Directrices de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Para este estudio se utilizaron ratas macho Sprague-Dawley con un peso de entre 300 y 350 g. En la Tabla de Materiales se proporciona una lista completa de los animales, reactivos y equipos utilizados.
1. Preparación animal
- Aloje a los animales en un ambiente que mantenga un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas, temperatura y humedad controladas. Asegúrese de que tengan acceso sin restricciones a alimentos y agua.
2. Anestesia
- Anestesiar las ratas mediante inyección intraperitoneal con una mezcla que contenga ketamina (80 mg/kg) y xilacina (20 mg/kg)
NOTA: Incline la cabeza y el cuerpo de las ratas hacia abajo. El lugar de la inyección se encuentra en el cuadrante inferior derecho del abdomen del animal. Tire hacia atrás del émbolo antes de inyectar. El volumen medio de inyección es de 0,4 mL. - Confirmar la inducción de la anestesia evaluando el reflejo de retirada de la pata trasera y el reflejo de parpadeo. Si no se logra una profundidad adecuada de anestesia, suplementar con isoflurano durante el procedimiento quirúrgico.
3. Procedimiento de modelado isquémico
- Esterilice las herramientas quirúrgicas con un autoclave. Desinfecte las mesas de operaciones y el equipo relacionado con etanol al 70%.
- Prepare el sitio quirúrgico afeitando el pelaje alrededor del sitio de la incisión anticipada. Desinfectar la piel en el sitio quirúrgico tres veces con betadine y etanol al 70%.
- Realice una incisión en la línea media en el lado ventral, de aproximadamente 1,5 cm de largo, y abra la fascia superficial.
- Realice una disección aguda y roma para exponer la arteria carótida externa (ECA), la arteria carótida interna (ICA) y la arteria carótida común (CCA) según el método descrito anteriormente7.
- Coloque tres suturas de seda 4-0 alrededor del CCA y otra sutura de seda a través del ECA cerca de la bifurcación del ICA. Ata un nudo corredizo liberable en el CCA proximal. Apriete la sutura en el CCA distal usando un hemostático para bloquear el flujo sanguíneo. Ate sin apretar otro nudo corredizo alrededor del CCA durante la sutura para asegurarse de que el vaso no esté ocluido.
NOTA: Asegúrese de que el nudo corredizo no esté demasiado apretado, solo lo suficiente para bloquear el flujo sanguíneo, ya que deberá liberarse durante la sutura vascular. - Realice una incisión de 0,5 mm entre la sutura de seda proximal y la sutura media en el CCA con unas tijeras.
NOTA: Asegúrese de que la incisión permita que el filamento (punta recubierta de silicona) ingrese al CCA. - Introducir un filamento 4-0 de 3 cm de longitud (punta recubierta de silicona) en el CCA. Apriete las suturas de seda alrededor del CCA para asegurar el filamento intraluminal y evitar el sangrado; a continuación, retire la sutura del CCA distal.
- Continúe insertando el filamento en el lumen del MCA, controlando las suturas alrededor del ECA para asegurarse de que el filamento no ingrese al ECA. La longitud de inserción suele ser de 18 mm a 20 mm.
- Inicie un temporizador y registre la hora en que comienza la oclusión. Suturar la incisión del cuello con suturas de seda 3-0 y colocar cuidadosamente al animal en una jaula de recuperación. Administrar 0,5 mL de suero fisiológico normal por vía intraperitoneal.
4. Sutura microquirúrgica del ACC
- Reanestesiar a la rata 1,5 h después de la isquemia. Desinfecte el sitio de la incisión tres veces con etanol al 70% y vuelva a abrir la incisión.
- Retire suavemente el filamento oclusivo hasta que la punta blanca sea claramente visible cerca de la incisión del CCA. Coloque una micro pinza horizontalmente cerca del nudo de sutura intraluminal asegurado cerca de la bifurcación CCA.
NOTA: Evite sujetar la punta del filamento blanco para evitar el desprendimiento de silicona y la posterior trombosis. - Suelte el nudo de sutura intraluminal asegurado y retire completamente el filamento.
- Coloque otra micropinza cerca del lado del extremo del corazón del nudo CCA proximal. A continuación, retire el nudo de sutura alrededor del CCA proximal.
NOTA: La colocación adecuada de las pinzas es crucial para elevar los vasos fijos en pasos posteriores para facilitar la sutura microvascular. Coloque las pinzas horizontalmente en los músculos circundantes para evitar el deslizamiento. - Enjuague el sitio de la incisión con solución salina normal y seque el área con una bola de algodón estéril para eliminar la sangre y lograr un campo quirúrgico limpio.
- Bajo un microscopio (aumento de 4x), sutura la incisión de CCA usando suturas microquirúrgicas 11-0 en un patrón interrumpido, que generalmente requiere dos puntos dependiendo del tamaño de la incisión.
- Después de la sutura, retire las micropinzas de ambos extremos del CCA para restaurar el flujo sanguíneo.
- Aplique presión con una bola de algodón estéril en el sitio de sutura del CCA durante 30 s. Observe el CCA durante 2 minutos para asegurarse de que no se produzca sangrado. Suturar la incisión del cuello de la rata y colocar al animal en una caja de cuidados a 35 °C para la recuperación de la anestesia antes de devolverlo a la jaula.
NOTA: Administrar por vía intraperitoneal con meloxicam a una dosis de 2 mg/kg para la analgesia postoperatoria.
5. Tinción con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC)
- Tres días después de la isquemia-reperfusión, eutanasiar a los animales bajo anestesia profunda con isoflurano al 4% y luxación cervical.
- Retira los sesos y córtalos en secciones coronales de 2 mm de grosor con una hoja de bisturí8.
- Incubar las secciones del cerebro con TTC al 2% durante 20 min a 37 °C.
- Enjuague las secciones del cerebro dos veces con formalina al 10%, luego fíjelas con formalina al 10% durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Capture fotografías digitales de cortes consecutivos y mida cuantitativamente las áreas de infarto con el software Image J.
6. Prueba de función neurológica
NOTA: La función neurológica se evaluó utilizando el test de García, siguiendo un informe anterior9.
- Evaluar la actividad espontánea, la simetría en el movimiento de las cuatro extremidades, el estiramiento de las patas delanteras, la escalada, la propiocepción corporal y la respuesta al tacto de las vibrisas. Asigne puntuaciones basadas en los criterios de la prueba de García, con una puntuación máxima de 18 puntos que indica una función neurológica normal.
7. Análisis estadístico
- Utilice GraphPad Prism para realizar análisis estadísticos utilizando la prueba t de Student. Expresa los datos como la media ± la desviación estándar. Considere las diferencias entre medias estadísticamente significativas si P < 0.05.
Resultados
El proceso de microsutura
El filamento se retiró cerca de la incisión de la ACC hasta que la punta blanca del filamento quedó visible (Figura 1A). Luego, se colocaron pinzas microquirúrgicas sobre la ACC (Figura 1B). Bajo un microscopio con aumento de 4x, la incisión de la ACC se suturó utilizando suturas microquirúrgicas en un patrón interrumpido (Figura 1C). Posteriormente, se retiraron las pinzas microquirúrgicas de la ACC, restableciendo la estructura anatómica y el flujo sanguíneo (Figura 1D).
Tinción con TTC y tasa de mortalidad
Un total de 12 ratas macho adultas se dividieron aleatoriamente en dos grupos: falso operado y modelo (n = 6 en cada grupo). Desafortunadamente, un animal del grupo falso operado murió debido a una sobredosis de anestésico, y un animal del grupo modelo murió dentro de las 24 horas. Los infartos resultantes de la isquemia cerebral se observaron tanto en el estriado como en la corteza (Figura 2A). A los 3 días posteriores al accidente cerebrovascular isquémico, el porcentaje total de infarto se midió en un 29,3% ± 1,6% del hemisferio (Figura 2B), con una tasa de mortalidad del 16,7% después de la cirugía.
Evaluación de la función neurológica
A los 1 y 3 días posteriores al accidente cerebrovascular isquémico, las puntuaciones de los grupos modelo disminuyeron significativamente en comparación con las de los grupos sham (17,8 ± 0,4 frente a 8,2 ± 1,5, Figura 3A; 17,6 ± 0,9 frente a 9,6 ± 1,3, Figura 3B, respectivamente).
Figura 1: El proceso de microsutura. (A) El filamento se retira de la ACC. Las flechas azules indican las pinzas microvasculares. (B) La flecha negra indica la incisión tras la extracción completa del filamento. Las flechas azules indican las pinzas microvasculares. (C) Bajo un microscopio (aumento 4x), la incisión en la ACC se suturó utilizando suturas microquirúrgicas 11-0 en un patrón interrumpido. Las flechas azules indican las pinzas microvasculares. La flecha negra indica la incisión suturada. (D) Se retiran las pinzas microquirúrgicas y se restablece el flujo sanguíneo en la ACC. La flecha negra indica el sitio suturado de la ACC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resultados de la tinción con TTC del modelo de isquemia. (A) Imágenes representativas de cortes cerebrales teñidos con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) tras la isquemia cerebral. En el tejido viable, el TTC se reduce enzimáticamente por deshidrogenasas a 1,3,5-trifenilformazán, que tiene color rojo. Los tejidos en las áreas necróticas permanecen blancos debido a la ausencia de dicha actividad enzimática. (B) Porcentaje de área isquémica en ratas a los 3 días posteriores a la isquemia cerebral. En comparación con el grupo Sham, **P < 0,01. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. Había cinco ratas en cada grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Evaluación de la función neurológica. (A) Puntuaciones de Garcia a los 1 día después de la isquemia cerebral. (B) Puntuaciones de Garcia a los 3 días después de la isquemia cerebral. En comparación con el grupo Sham, **P < 0,01. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. Había cinco ratas en cada grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discusión
MCAo es un método ampliamente utilizado para crear modelos animales de accidente cerebrovascular, replicando eficazmente el proceso de accidente cerebrovascular observado en pacientes al restaurar el flujo sanguíneo después de la isquemia 10,11,12. Nuestro laboratorio ha desarrollado un modelo de ictus isquémico que permite la reperfusión desde el CCA sin causar daños en el ECA. Después de la inducción de la isquemia, se realiza la reparación microquirúrgica de la CCA. Aunque no se realizó una medición directa del flujo sanguíneo de CCA, los experimentadores observaron pulsaciones vasculares en el CCA antes de proceder con la reconversión. Esta técnica preserva la integridad anatómica de los vasos del cuello mientras se asemeja mucho al proceso de accidente cerebrovascular en los pacientes. Además, las evaluaciones de la función neurológica y el área de isquemia cerebral han confirmado la validez del accidente cerebrovascular inducido por este enfoque quirúrgico.
Los modelos de accidente cerebrovascular isquémico descritos anteriormente pueden verse afectados por varios factores. En el método de Koizumi et al.4, la reperfusión sanguínea depende en gran medida del círculo de Willis debido a la ligadura de la CCA. Sin embargo, las variaciones en la vasculatura cerebral pueden influir en el volumen final del infarto cerebral, aumentando potencialmente la tasa de mortalidad del modelo de accidente cerebrovascular debido a la baja perfusión sanguínea13,14. Además, la isquemia de la ECA puede afectar la función de los músculos y nervios faciales, lo que afecta la evaluación de diversas funciones neurológicas15,16.
El método actual aborda estos desafíos a través de tres pasos clave: (1) Mantener la incisión CCA lo más pequeña posible, solo lo suficientemente grande para la inserción de filamentos, reduciendo el tiempo y el daño asociado con la sutura vascular. (2) Colocar pinzas microvasculares lo más cerca posible de la bifurcación de la CCA al sujetar la CCA distal para evitar que se sujete la punta del filamento blanco, lo que podría provocar el desprendimiento de silicona y la trombosis. (3) Observar el CCA para detectar la reanudación de la pulsación y la falta de sangrado sustancial antes de suturar la incisión del cuello de la línea media después de la reparación vascular.
El método actual tiene varias limitaciones. En primer lugar, existe la posibilidad de formar émbolos en el sitio de la sutura, lo que podría provocar una mayor isquemia cerebral si se desprenden. Este riesgo debe considerarse y gestionarse cuidadosamente en experimentos futuros. En segundo lugar, el estudio no controló el peso corporal de las ratas, lo que dificulta determinar si el método afectó su ingesta de alimentos. La ingesta de alimentos es un indicador directo de las ventajas del método, y su evaluación podría proporcionar información valiosa. Por último, el método actual requiere competencia técnica en operaciones microquirúrgicas, lo que puede limitar su uso generalizado sin la capacitación y la experiencia adecuadas.
En resumen, si bien el método de modelado MCAo ofrece una alta relevancia fisiológica e integridad estructural, tiene limitaciones que deben abordarse para una experimentación más sólida. Preservar la integridad anatómica de los vasos del cuello y simular de cerca los procesos de accidente cerebrovascular en los pacientes son fortalezas significativas del método. Sin duda, este enfoque contribuirá significativamente a la investigación del accidente cerebrovascular isquémico, mejorando la confiabilidad y precisión de los modelos experimentales. En última instancia, esto puede conducir a que se necesiten menos grupos experimentales para probar los efectos terapéuticos, lo que resulta en resultados experimentales más confiables.
Divulgaciones
Los autores no tienen ningún conflicto potencial de intereses que divulgar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Proyecto de Introducción de Inteligencia Extranjera de la Provincia de Hebei en 2023. Agradecemos a Lisa Kreiner, PhD, de Liwen Bianji, (Edanz) (www.liwenbianji.cn), por editar el texto en inglés de un borrador de este manuscrito.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 10% formalin | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. | BL913A | |
| 11-0 suturas microquirúrgicas | Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd. | 3/8 1&veces; | |
| Cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) | SIGMA | T8877 | |
| 3-0 sutura de seda | Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd. | 3-0 | |
| 4% de isoflurano | Tianjin Ringpu Bio-Tecnología Co., Ltd. | ||
| 6-0 sutura de seda | Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd. | 6-0 | |
| 70% etanol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. | ||
| Filamento: | Xinong Technologies Co Ltd. | 2838-A5 | |
| Ketamina | Jiangsu Hengrui Farmacéutica Co., Ltd. | 230613BL | |
| Ratas macho Sprague Dawley | Jinan Pengyue Cría Experimental de Animales Co., Ltd. | SCXK (Lu) 20190003 | |
| Microclips | Shanghai Jinzhong Fábrica de dispositivos médicos | W40150 | |
| Microscopio | ZEISS | S100 OPMI pico | |
| Caja de enfermería | Beijing Fuyi Electrical Appliance Co., Ltd. | FYL-YS-100L | |
| Xilacina | SIGMA | PHR3263 |
Referencias
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