Las bacterias colonizan los tejidos del huésped que varían en biodisponibilidad de oxígeno y hierro, sin embargo, la mayoría de los enfoques para estudiar las bacterias utilizan medios aireados y ricos. Este protocolo describe el cultivo del patógeno humano Yersinia pseudotuberculosis bajo diferentes concentraciones de hierro y tensión de oxígeno, y cuantifica la actividad del sistema de secreción de Yersinia tipo III, que es un factor de virulencia importante.
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Cuantificación de la actividad del sistema de secreción de Yersinia pseudotuberculosis tipo III después de la inanición de hierro y el crecimiento anaeróbico
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Resumen
Resumen
Un mecanismo de virulencia clave para muchos patógenos gramnegativos es el sistema de secreción de tipo III (T3SS), un apéndice en forma de aguja que transloca proteínas efectoras citotóxicas o inmunomoduladoras en las células huésped. El T3SS es un objetivo para las campañas de descubrimiento de antimicrobianos, ya que es accesible extracelularmente y está en gran medida ausente de bacterias no patógenas. Estudios recientes demostraron que las T3SS de Yersinia y Salmonella están reguladas por factores que responden al hierro y al oxígeno, que son importantes señales específicas de nicho que se encuentran durante la infección de mamíferos. Aquí se describe un método para la inanición de hierro de Yersinia pseudotuberculosis, con la posterior suplementación opcional de hierro inorgánico. Para evaluar el impacto de la disponibilidad de oxígeno, se demuestra este proceso de inanición de hierro tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas. Por último, la incubación de los cultivos a una temperatura de 37 °C en el huésped de los mamíferos induce la expresión de T3SS y permite cuantificar la actividad de Yersinia T3SS mediante la visualización de las proteínas efectoras liberadas en el sobrenadante. Los pasos detallados aquí ofrecen una ventaja sobre el uso de quelantes de hierro en ausencia de inanición de hierro, que es insuficiente para inducir una inanición robusta de hierro, presumiblemente debido a los eficientes sistemas de absorción y eliminación de hierro de Yersinia . Del mismo modo, se detalla el lavado con ácido de la cristalería de laboratorio para garantizar la eliminación del hierro residual, que es esencial para inducir una fuerte inanición de hierro. Además, se describe el uso de un agente quelante para eliminar el hierro residual de los medios y cultivar las bacterias durante varias generaciones en ausencia de hierro para agotar las reservas de hierro bacterianas. Al incorporar protocolos estándar de precipitación de proteínas inducida por ácido tricloroacético, SDS-PAGE y tinción con plata, este procedimiento demuestra formas accesibles de medir la actividad de T3SS. Si bien este procedimiento está optimizado para Y. pseudotuberculosis, ofrece un marco para estudios en patógenos con sistemas de absorción de hierro robustos similares. En la era de la resistencia a los antibióticos, estos métodos pueden ampliarse para evaluar la eficacia de los compuestos antimicrobianos dirigidos a la T3SS en condiciones relevantes para el huésped.
Introducción
Muchos patógenos gramnegativos clínicamente relevantes como Yersinia, Vibrio, Escherichia, Pseudomonas y Shigella codifican el sistema de secreción de tipo III (T3SS) para inyectar proteínas efectoras en las células huésped1. En muchas especies bacterianas, el T3SS está bajo un estricto control regulatorio2. Por ejemplo, la translocación de las proteínas efectoras Yersinia T3SS a las células huésped diana es fundamental para subvertir los mecanismos de defensa del huésped y permitir la colonización bacteriana de los tejidos del huésped. Sin embargo, la actividad de Yersinia T3SS es metabólicamente onerosa y puede desencadenar el reconocimiento por parte de los receptores inmunitarios del huésped3. En consecuencia, los reguladores que detectan señales ambientales específicas controlan la expresión de los genes T3SS en muchas especies bacterianas. Dado que patógenos como Yersinia experimentan cambios ambientales durante su ciclo de infección que afectan la expresión de factores críticos de virulencia, es importante desarrollar condiciones de laboratorio que imiten las características sobresalientes de los nichos de huéspedes ocupados por patógenos bacterianos. Específicamente, la tensión de oxígeno y la disponibilidad de hierro difieren entre varios sitios tisulares de manera espacio-temporal e impactan la expresión de genes de virulencia como el T3SS 4,5,6. Por lo tanto, el objetivo de este método es evaluar cómo el oxígeno y el hierro impactan en la expresión de Yersinia T3SS. Esto proporcionará información sobre la dinámica de la interacción huésped-patógeno.
El método descrito aquí detalla cómo cultivar Yersinia pseudotuberculosis aeróbica y anaeróbicamente, así como cómo agotar las reservas de hierro de Yersinia durante el crecimiento aeróbico o anaeróbico. Hay algunas consideraciones importantes destacadas aquí con respecto al cultivo exitoso de bacterias en estas condiciones variables. En primer lugar, el cultivo anaeróbico requiere una suplementación adicional de glucosa, una modificación que se observa en la receta de los medios. En segundo lugar, dado que Y. pseudotuberculosis emplea sideróforos y otros sistemas de absorción de hierro que pueden eliminar el hierro del medio ambiente de manera robusta, se presta especial atención a garantizar que los medios de cultivo y el material de vidrio de laboratorio estén lo más libres de hierro posible7. Estudios previos han utilizado quelantes de hierro como el dipiridil para agotar el hierro de cultivos bacterianos de medios ricos para imitar la inanición de hierro 8,9. Sin embargo, el agotamiento de las reservas de hierro de Yersinia para inducir la inanición de hierro requiere la eliminación del hierro residual en la cristalería y los medios, así como un crecimiento prolongado en ausencia de hierro. Este protocolo detalla cómo lavar con ácido la cristalería y quelar los medios para eliminar el hierro residual, además de cultivar las bacterias durante varias generaciones para garantizar una inanición completa del hierro. La inanición de hierro se puede garantizar midiendo los niveles relativos de transcripción de genes que responden al hierro bien caracterizados en todas las condiciones, como se demuestra aquí con yfeA y bfd.
La culminación de este protocolo demuestra cómo precipitar las proteínas efectoras T3SS secretadas de cada una de estas condiciones mediante el tratamiento del sobrenadante de cultivo con ácido tricloroacético (TCA) y la visualización de las proteínas secretadas a través de SDS-PAGE. Por último, la actividad relativa de T3SS se evalúa mediante la visualización de las proteínas secretadas mediante la tinción de plata y la cuantificación de los niveles relativos de las proteínas efectoras de T3SS, denominadas proteínas externas de Yersinia (Yops)10.
Los ensayos de actividad de T3SS generalmente utilizan anticuerpos específicos para detectar los niveles de proteína efectora de T3SS en el sobrenadante del cultivo. Sin embargo, los anticuerpos western blot para las proteínas efectoras T3SS a menudo no están disponibles comercialmente. Por lo tanto, se ha prestado especial atención a garantizar que la visualización final de la actividad de T3SS en este método no requiera anticuerpos específicos, sino que pueda aprovechar la tinción de plata, que permite la visualización de todas las proteínas secretadas. Si bien este método está específicamente diseñado y optimizado para Y. pseudotuberculosis, se puede adaptar a otras especies bacterianas, aunque las condiciones exactas del medio y los tiempos de incubación variarán.
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Protocolo
Los detalles de los reactivos, la composición del medio, las secuencias de cebadores y el equipo se enumeran en la Tabla de materiales. La figura 1 ilustra el flujo de trabajo experimental general.
1. Preparación de cristalería lavada con ácido y medios M9 quelados
NOTA: Antes de comenzar, consulte la sección de materiales para conocer los reactivos y recetas exactos que se utilizarán. Los medios M9 se utilizaron por primera vez para los ensayos de Yersinia T3SS en Cheng et al.11.
- Vierta 100 mL de HCl 6 N en un matraz de vidrio de 250 mL.
PRECAUCIÓN: El HCl es extremadamente peligroso; Asegúrese de que se tomen las precauciones adecuadas al manipular esta sustancia. - Selle la boca del recipiente de vidrio con un tapón de vidrio y agite con cuidado el matraz durante 1 minuto para distribuir bien el HCl, cambiando de dirección de vez en cuando.
- Deseche el HCl 6 N de manera adecuada.
- Enjuague el recipiente de vidrio agregando 100 mL de H2O desionizado, sellando la boca, agitando durante 20 s y luego arroje el agua.
- Repita el paso de enjuague un total de 3 veces.
- Deje secar al aire. Autoclave para esterilizar.
- Para quelar los medios, mezcle los componentes M9 junto con el reactivo quelante y agite con una barra de agitación magnética a temperatura ambiente durante ~ 18 h. Filtrar-esterilizar y añadir MgSO4 hasta una concentración final de 1 mM.
2. Cultivo de Y. pseudotuberculosis bajo diferentes niveles de hierro y tensión de oxígeno
- Streak Y. pseudotuberculosis (cepa IP2666pIB1 se utiliza en este estudio) en placas de agar Lysogeny Broth (LB) e incubar a temperatura ambiente.
NOTA: La incubación de Yersinia a 37 °C, particularmente en un medio con bajo contenido de calcio, conduce a la actividad de T3SS, la detención del crecimiento y, en última instancia, selecciona la pérdida del plásmido para la regla de Yersinia vi(pYV) que codifica el T3SS12. Por lo tanto, este protocolo utiliza una incubación de Yersinia a 26 °C hasta que sea necesario medir la actividad de T3SS. - Después de 48 h, una vez que se forman las colonias visibles, inocular 4 mL de medio M9 que contiene 0,2% de glucosa, 1 mg/L de FeSO4,7H 2O, y suplementado con ácidos casamino (denominados aquí medios M9) de una sola colonia aislada y cultivo durante la noche a 26 °C con aireación a 250 rpm durante aproximadamente 18 h.
NOTA: Utilice cristalería lavada con ácido a partir del siguiente paso y continúe. - Subcultivo en medios M9 quelados siguiendo los pasos a continuación.
NOTA: Para todos los pasos posteriores, se utilizan medios M9 con 0,9% de glucosa en lugar del 0,2% de glucosa estándar.- Con un espectrofotómetro, mida la densidad óptica (OD600) del cultivo durante la noche.
- Diluir el cultivo durante la noche hasta un valor de OD600 de 0,1 en un total de 14 mL de medio M9 quelado estéril que contiene 0,9% de glucosa y no FeSO4,7H 2O en un matraz de 250 mL lavado con ácido sin suplementación de hierro.
- Incubar durante 8 h a 26 °C con aireación a 250 rpm.
- Subcultivo en cultivos aeróbicos y anaeróbicos en paralelo.
- Mida el OD600 de los cultivos en crecimiento.
- Para continuar la incubación aeróbica, subcultive los cultivos en crecimiento hasta un valor de OD600 de 0,1 en 14 mL de medio M9 quelado estéril que contenga 0,9% de glucosa y sin FeSO4,7H 2O en un matraz lavado con ácido de 250 mL y cultivo con aireación a 26 °C durante 12 h sin suplementación de hierro.
- Para el cultivo anaeróbico, subcultivo a un valor OD600 de 0,1 en 14 mL de medio M9 quelado estéril en dos tubos de vidrio lavados con ácido. En el primer tubo, añada FeSO4,7H 2O esterilizado por filtro (con membrana de polietersulfona de 0,22 μm) para obtener una concentración final de 1 mg/L (denominada "alto contenido de hierro"). En el segundo tubo, agregue FeSO4.7H 2O para una concentración final de 0.01 mg/L (denominada "hierro bajo"). Esto se puede hacer utilizando una solución madre de FeSO4.7H 2O de 10 mg/mL. Incubar ambos tubos anaeróbicamente en una cámara anaeróbica a temperatura ambiente durante 12 h.
NOTA: 1 mg/L FeSO4.7H 2O proporciona las condiciones repletas de hierro para un crecimiento robusto de Yersinia . Por el contrario, la adición de sólo 0,01 mg/L de FeSO4,7H 2O a los cultivos anaeróbicos garantiza un crecimiento suficiente en condiciones anaeróbicas, pero aún permite respuestas de inanición de hierro, mientras que los cultivos aeróbicos se cultivan durante 12 h en ausencia de hierro añadido para estimular las respuestas de inanición de hierro antes de la estimulación de la actividad de T3SS.
- Inducir la actividad del sistema de secreción de tipo III.
- Cambie los cultivos anaeróbicos a 37 °C y continúe la incubación anaeróbica durante 4 h para inducir el T3SS.
- Mida el OD600 del cultivo en crecimiento aeróbico.
- En dos matraces lavados con ácido, subcultive los cultivos en crecimiento aeróbico hasta un valor OD600 de 0,2 en 14 mL de medio M9 quelado estéril. En el primer matraz, añadir FeSO4.7H 2O esterilizado con filtro para una concentración final de 1 mg/L. En el segundo matraz, añadir FeSO 4.7H2O para una concentración final de 0,01 mg/L. Incubar ambos matraces con aireación a 26 °C a 250 rpm durante 2 h.
- Después de 2 h, cambie los cultivos aeróbicos a 37 °C con aireación a 250 rpm e incube durante 4 h para inducir el T3SS.
3. Precipitación de ácido tricloroacético (TCA) de proteínas efectoras T3SS
- Una vez completada la incubación anaeróbica, mida el OD600 de los cultivos.
- Normalice todas las muestras anaeróbicas para lograr la misma masa celular (consulte el ejemplo proporcionado en la Tabla 1). Para el cultivo anaeróbico, generalmente se espera un valor de OD600 de ~0,5 en cultivos hambrientos de hierro y de ~1 para cultivos repletos de hierro. En este caso, use 6 mL de los cultivos sin hierro y 3 mL de los cultivos repletos de hierro.
NOTA: El cultivo restante se puede utilizar para otros fines, como la recolección de ARN total y el uso de PCR cuantitativa para medir los niveles de ARNm objetivo en estado estacionario (no descrito aquí). - Transfiera los volúmenes normalizados de cada cultivo a tubos de 15 mL.
- Para controlar la eficiencia de la precipitación de proteínas secretadas, agregue 4 μL de 0,5 mg/mL de albúmina sérica bovina (BSA) en cada tubo.
- Cultivos de pellets a 3200 x g durante 15 min a 4 °C.
- Conecte un filtro de PVDF de 0,22 μm a una jeringa de 10 mL y filtre el sobrenadante de cada cultivo granulado en un tubo nuevo de 15 mL.
NOTA: Este paso de filtración minimiza las posibilidades de transferir células bacterianas completas, lo que daría lugar a proteínas citoplasmáticas no deseadas en la muestra. - Añadir el 10% del volumen sobrenadante de TCA de 6,1 N a cada muestra.
- Vórtice vigorosamente durante 1 min. Incubar los tubos en hielo en una cámara fría a 4 °C durante la noche.
NOTA: La duración de la incubación se puede optimizar en función de las necesidades. Tan solo 1 h de incubación puede funcionar para condiciones o cepas en las que la secreción es robusta. - Repita los pasos de recolección de pellets y precipitación de TCA con los cultivos aeróbicos una vez que se complete la incubación de 4 h.
NOTA: Normalice los cultivos aeróbicos mediante la granulación de volúmenes con masa celular equivalente. - Añadir 2 mL de cada muestra a un tubo nuevo de 2 mL y centrifugar a 21.000 x g durante 15 min a 4 °C.
- Aspire el sobrenadante con un accesorio de vacío y tenga cuidado de no tocar el fondo o los lados del tubo.
NOTA: El gránulo puede ser difícil de visualizar y puede aparecer como una neblina a lo largo del tubo. - Repita los pasos 3.10 y 3.11 hasta que todo el contenido de cada reacción de precipitación se precipite en un solo tubo de 2 mL. Esto puede requerir tres o cuatro pasos de centrifugación secuenciales, pero permite la concentración de todas las proteínas secretadas de cada muestra en un tubo de 2 mL.
- Para lavar los gránulos, agregue suavemente 1 ml de acetona 100% helada en cada tubo. Para evitar la pérdida de la muestra, no vuelva a suspender y no toque los lados del tubo.
- Centrifugar las muestras a 21.000 x g durante 15 min a 4 °C.
- Aspire el sobrenadante y tenga cuidado de no tocar la parte inferior o los lados del tubo.
- Repita los pasos de lavado con acetona helada 3.13 y 3.14.
- Después de aspirar el sobrenadante por última vez, abra los tubos y deje que el pellet se seque completamente en el banco durante aproximadamente 1 h.
- Añadir 50 μL de la solución FSB: DTT a cada muestra seca. Para evitar la pérdida de proteínas, no vuelva a suspender.
- Agite minuciosamente cada muestra durante 1 minuto, asegurándose de que la solución FSB: DTT cubra las paredes de todo el tubo. Esto se puede optimizar mediante el uso de un accesorio de vórtice capaz de sostener varios tubos a la vez.
- Hervir las muestras a 95 °C durante 15 min.
- Centrifugar las muestras brevemente durante 30 s a la velocidad máxima a temperatura ambiente.
- Almacenar a -80 °C hasta su uso futuro.
4. SDS-PAGE y tinción de plata para visualizar las proteínas efectoras T3SS
- Cargue 15 μL de cada muestra anaeróbica y 10 μL de cada muestra aeróbica en un gel SDS-PAGE al 12,5%, junto con 3 μL de un estándar sin teñir disponible comercialmente como escalera.
- Haga funcionar el gel durante unos 90 minutos a 100 V. Estos ajustes pueden variar en función del aparato utilizado.
- Siga el protocolo de tinción de plata siguiendo las instrucciones del fabricante, lo que dará como resultado un gel, como se muestra en la Figura 2.
5. Cuantificación de la actividad relativa de T3SS
- Coloque el gel en el sistema de imágenes, asegurándose de que todas las bandas destinadas a la cuantificación estén en el marco de la imagen.
NOTA: El peso molecular de BSA es de ~66 kDa, mientras que el peso molecular de la proteína efectora T3SS YopE es de ~23 kDa. - En el software, seleccione todas las bandas YopE en todos los pozos.
- Establezca la banda YopE de referencia en la muestra adecuada.
- Exporte los valores de cuantificación relativos calculados por el software para todas las bandas de YopE.
- Volviendo al software, seleccione todas las bandas BSA en todos los pozos.
- Establezca la banda BSA de referencia para asegurarse de que proceda de la misma muestra que la banda YopE de referencia.
- Exporte los valores de cuantificación relativos calculados por el software para todas las bandas BSA.
- Para calcular los niveles de expresión de YopE relativos, divida el valor de cantidad relativa de YopE por el valor de cantidad relativa de BSA para cada muestra.
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Resultados
Este método permite la comparación relativa de los Yops secretados a través de varias condiciones en relación con una condición de referencia de interés. El flujo de trabajo experimental general se muestra en la Figura 1. La Tabla 1 muestra una representación de cómo la normalización del cultivo celular ocurriría típicamente en el caso de cada condición de cultivo y el volumen de TCA que se agregaría a cada sobrenadante. Aquí, se muestran los resultados representativos utili...
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Discusión
El T3SS es un factor de virulencia importante en muchas bacterias patógenas; Por lo tanto, el desarrollo de técnicas de laboratorio para estudiar su regulación es importante para comprender la patogénesis y desarrollar posibles terapias1. Se sabe que el hierro y el oxígeno son importantes señales del huésped detectadas por los patógenos bacterianos para regular la expresión de T3SS5; por lo tanto, este método presenta una estrategia para el...
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Imágenes gráficas creadas con BioRender.com. Este estudio contó con el apoyo de la subvención de los Institutos Nacionales de Salud (www.NIH.gov, por sus siglas en inglés) R01AI119082.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Jeringa de punta Luer-Lok de 10 ml | BD | 301029 | |
| 10x SDS Running Buffer | Hecho en | 0.25 M Tris base, 1.92 M glicina, 1% SDS en 1 L | |
| de volumen 12.5% SDS-Page Gel Tubos de | caseros | ||
| de 15 mL Falcon | 352059 | Para la noche inicial | |
| Tubos Falcon de 15 mL Falcom | 352196 | Para la recolección de sobrenadante | |
| Matraz de cultivo de 250 mL | Belco | 251000250 | |
| 500 mL | Corning | 431097 | |
| 6 N Solución de ácido clorhídrico | Fisher Scientific | 7732185 | |
| Acetona | Fisher Chemical | A949-4 | 4 L |
| Bio Rad ChemiDoc MP Imaging Sistema | Bio Rad | Número de modelo: Campana universal III | |
| Tubos de cultivo de vidrio de borosilicato | Fisherbrand | 14-961-34 | Para cultivo anaeróbico |
| Chelex 100 Resina | Bio Rad | 142-1253 | |
| Chelex M9 +0.9% Medios de glucosa | Hecho en | casa6 g/L Na2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 0,5 g/L de NaCl, 1 g/L de NH4Cl, 1% de ácidos casamino, 0,9% dextrosa, 0,0005% tiamina, 5 g/L de resina Chelex 100. Agite el medio durante 18 h a temperatura ambiente, filtre con una unidad de filtración Corning de 500 ml, luego agregue MgSO4 para obtener 1 mM de solución sub>4 MgS | |
| Tampón de muestra final (FSB) | Hecho en | 0.1 M Tris-HCl, 4% SDS, 20% glicerol, 0.2% de azul de bromofenol | |
| FSB: Solución de TDT Hecho | en casa | FSB+0.2M DTT | |
| Image Lab Software | Bio Rad | https://www.bio-rad.com/en-us/product/image-lab-software?ID=KRE6P5E8Z | Software |
| Isotemp Heat Block | Fisher Scientific | 88860021 | |
| LB Placas de Agar Caseras | Levadura, 10 g de NaCl, 15 g de Agar en 1 L de volumen total. | ||
| Medios de glucosa M9 + 0.2% | de | 6 g/L Na2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 0,5 g/L de NaCl, 1 g/L 4Cl, 1 mM de MgSO4, 1 mg/L de FeSO47H2O, 1% de ácidos casamino, 0,2% dextrosa, 0,0005% tiamina | |
| Accesorio de filtro Millex-GP PES 0.22um para jeringa | Millipore | SLGPR33RS | para filtración FeSO47H2O |
| Accesorio de filtro Millex-GV PVDF 0.22um para jeringa | Millipore | SLGVR33RS | para filtración de sobrenadante |
| Precision Plus Protein Unstained Standard | Bio Rad | 1610363 | |
| SDS-PAGE Aparato de gel | Rad | Número de modelo: Mini PROTEAN Tetra Cell | |
| Kit de tinción de plata SilverXpress | Invitrogen | LC6100 | |
| The BellyDancer Shaker | IBI Scientific | BDRAA1155 | |
| solución de ácido tricloroacético 6.1N | Sigma Aldrich | T0699 | |
| Cámara anaeróbica de vinilo | Coy Lab Products | https://coylab.com/products/anaerobic-chambers/vinyl-anaerobic-chambers/#details | |
| qPCR Primer sequences | |||
| yfeA adelante - CAC AGT CAG CAG ACC TTA TCT T | |||
| yfeA reversa - GGC AGA CGG GAC ATC TTT AAT A | |||
| bfd adelante - ccagcatcagccccatacag | |||
| bfd reversa - tggcttgtcggatgcacttc | |||
| yopE adelante - CCATAAACCGGTGGTGAC | |||
| yopE reverse - CTTGGCATTGAGTGATACTG |
Referencias
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