Cuantificación de la actividad del sistema de secreción de Yersinia pseudotuberculosis tipo III después de la inanición de hierro y el crecimiento anaeróbico

Resumen

Las bacterias colonizan los tejidos del huésped que varían en biodisponibilidad de oxígeno y hierro, sin embargo, la mayoría de los enfoques para estudiar las bacterias utilizan medios aireados y ricos. Este protocolo describe el cultivo del patógeno humano Yersinia pseudotuberculosis bajo diferentes concentraciones de hierro y tensión de oxígeno, y cuantifica la actividad del sistema de secreción de Yersinia tipo III, que es un factor de virulencia importante.

Resumen

Un mecanismo de virulencia clave para muchos patógenos gramnegativos es el sistema de secreción de tipo III (T3SS), un apéndice en forma de aguja que transloca proteínas efectoras citotóxicas o inmunomoduladoras en las células huésped. El T3SS es un objetivo para las campañas de descubrimiento de antimicrobianos, ya que es accesible extracelularmente y está en gran medida ausente de bacterias no patógenas. Estudios recientes demostraron que las T3SS de Yersinia y Salmonella están reguladas por factores que responden al hierro y al oxígeno, que son importantes señales específicas de nicho que se encuentran durante la infección de mamíferos. Aquí se describe un método para la inanición de hierro de Yersinia pseudotuberculosis, con la posterior suplementación opcional de hierro inorgánico. Para evaluar el impacto de la disponibilidad de oxígeno, se demuestra este proceso de inanición de hierro tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas. Por último, la incubación de los cultivos a una temperatura de 37 °C en el huésped de los mamíferos induce la expresión de T3SS y permite cuantificar la actividad de Yersinia T3SS mediante la visualización de las proteínas efectoras liberadas en el sobrenadante. Los pasos detallados aquí ofrecen una ventaja sobre el uso de quelantes de hierro en ausencia de inanición de hierro, que es insuficiente para inducir una inanición robusta de hierro, presumiblemente debido a los eficientes sistemas de absorción y eliminación de hierro de Yersinia . Del mismo modo, se detalla el lavado con ácido de la cristalería de laboratorio para garantizar la eliminación del hierro residual, que es esencial para inducir una fuerte inanición de hierro. Además, se describe el uso de un agente quelante para eliminar el hierro residual de los medios y cultivar las bacterias durante varias generaciones en ausencia de hierro para agotar las reservas de hierro bacterianas. Al incorporar protocolos estándar de precipitación de proteínas inducida por ácido tricloroacético, SDS-PAGE y tinción con plata, este procedimiento demuestra formas accesibles de medir la actividad de T3SS. Si bien este procedimiento está optimizado para Y. pseudotuberculosis, ofrece un marco para estudios en patógenos con sistemas de absorción de hierro robustos similares. En la era de la resistencia a los antibióticos, estos métodos pueden ampliarse para evaluar la eficacia de los compuestos antimicrobianos dirigidos a la T3SS en condiciones relevantes para el huésped.

Introducción

Muchos patógenos gramnegativos clínicamente relevantes como Yersinia, Vibrio, Escherichia, Pseudomonas y Shigella codifican el sistema de secreción de tipo III (T3SS) para inyectar proteínas efectoras en las células huésped¹. En muchas especies bacterianas, el T3SS está bajo un estricto control regulatorio². Por ejemplo, la translocación de las proteínas efectoras Yersinia T3SS a las células huésped diana es fundamental para subvertir los mecanismos de defensa del huésped y permitir la colonización bacteriana de los tejidos del huésped. Sin em....

Protocolo

Los detalles de los reactivos, la composición del medio, las secuencias de cebadores y el equipo se enumeran en la Tabla de materiales. La figura 1 ilustra el flujo de trabajo experimental general.

1. Preparación de cristalería lavada con ácido y medios M9 quelados

NOTA: Antes de comenzar, consulte la sección de materiales para conocer los reactivos y recetas exactos que se utilizarán. Los medios M9 se utilizaron por primera vez para los ensayos de Yersinia T3SS en Cheng et ^al.11.

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Resultados

Este método permite la comparación relativa de los Yops secretados a través de varias condiciones en relación con una condición de referencia de interés. El flujo de trabajo experimental general se muestra en la Figura 1. La Tabla 1 muestra una representación de cómo la normalización del cultivo celular ocurriría típicamente en el caso de cada condición de cultivo y el volumen de TCA que se agregaría a cada sobrenadante. Aquí, se muestran los resultados representativos utili.......

Discusión

El T3SS es un factor de virulencia importante en muchas bacterias patógenas; Por lo tanto, el desarrollo de técnicas de laboratorio para estudiar su regulación es importante para comprender la patogénesis y desarrollar posibles terapias¹. Se sabe que el hierro y el oxígeno son importantes señales del huésped detectadas por los patógenos bacterianos para regular la expresión de T3SS⁵; por lo tanto, este método presenta una estrategia para el.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Jeringa de punta Luer-Lok de 10 ml	BD	301029
10x SDS Running Buffer	Hecho en		0.25 M Tris base, 1.92 M glicina, 1% SDS en 1 L
de volumen 12.5% SDS-Page Gel Tubos de	caseros
de 15 mL Falcon		352059	Para la noche inicial
Tubos Falcon de 15 mL Falcom		352196	Para la recolección de sobrenadante
Matraz de cultivo de 250 mL	Belco	251000250
500 mL	Corning	431097
6 N Solución de ácido clorhídrico	Fisher Scientific	7732185
Acetona	Fisher Chemical	A949-4	4 L
Bio Rad ChemiDoc MP Imaging Sistema	Bio Rad	Número de modelo: Campana universal III
Tubos de cultivo de vidrio de borosilicato	Fisherbrand	14-961-34	Para cultivo anaeróbico
Chelex 100 Resina	Bio Rad	142-1253
Chelex M9 +0.9% Medios de glucosa	Hecho en		casa6 g/L Na2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 0,5 g/L de NaCl, 1 g/L de NH4Cl, 1% de ácidos casamino, 0,9% dextrosa, 0,0005% tiamina, 5 g/L de resina Chelex 100. Agite el medio durante 18 h a temperatura ambiente, filtre con una unidad de filtración Corning de 500 ml, luego agregue MgSO4 para obtener 1 mM de solución sub>4 MgS
Tampón de muestra final (FSB)	Hecho en		0.1 M Tris-HCl, 4% SDS, 20% glicerol, 0.2% de azul de bromofenol
FSB: Solución de TDT Hecho	en casa		FSB+0.2M DTT
Image Lab Software	Bio Rad	https://www.bio-rad.com/en-us/product/image-lab-software?ID=KRE6P5E8Z	Software
Isotemp Heat Block	Fisher Scientific	88860021
LB Placas de Agar Caseras			Levadura, 10 g de NaCl, 15 g de Agar en 1 L de volumen total.
Medios de glucosa M9 + 0.2%	de		6 g/L Na2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 0,5 g/L de NaCl, 1 g/L 4Cl, 1 mM de MgSO4, 1 mg/L de FeSO47H2O, 1% de ácidos casamino, 0,2% dextrosa, 0,0005% tiamina
Accesorio de filtro Millex-GP PES 0.22um para jeringa	Millipore	SLGPR33RS	para filtración FeSO47H2O
Accesorio de filtro Millex-GV PVDF 0.22um para jeringa	Millipore	SLGVR33RS	para filtración de sobrenadante
Precision Plus Protein Unstained Standard	Bio Rad	1610363
SDS-PAGE Aparato de gel	Rad	Número de modelo: Mini PROTEAN Tetra Cell
Kit de tinción de plata SilverXpress	Invitrogen	LC6100
The BellyDancer Shaker	IBI Scientific	BDRAA1155
solución de ácido tricloroacético 6.1N	Sigma Aldrich	T0699
Cámara anaeróbica de vinilo	Coy Lab Products		https://coylab.com/products/anaerobic-chambers/vinyl-anaerobic-chambers/#details
qPCR Primer sequences
yfeA adelante - CAC AGT CAG CAG ACC TTA TCT T
yfeA reversa - GGC AGA CGG GAC ATC TTT AAT A
bfd adelante - ccagcatcagccccatacag
bfd reversa - tggcttgtcggatgcacttc
yopE adelante - CCATAAACCGGTGGTGAC
yopE reverse - CTTGGCATTGAGTGATACTG

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