Artículo de método

Métodos alternativos para la detección de la generación de aniones superóxido en plaquetas

DOI:

10.3791/66647

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29 de marzo de 2024

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1Medicines and Healthcare Regulatory Agency, South Mimms laboratories, 2Hull York Medical School, University of Hull

En este artículo

Resumen

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La generación de anión superóxido es esencial para la estimulación de las plaquetas y, si está desregulada, es fundamental para las enfermedades trombóticas. En este trabajo se presentan tres protocolos para la detección selectiva de aniones superóxido y el estudio de la regulación plaquetaria dependiente de redox.

Resumen

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Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son moléculas que contienen oxígeno altamente inestables. Su inestabilidad química los hace extremadamente reactivos y les da la capacidad de reaccionar con moléculas biológicas importantes como proteínas, ácidos nucleicos y lípidos. Los aniones superóxido son ROS importantes generadas por la reducción de la reducción de oxígeno molecular (es decir, la adquisición de un electrón). A pesar de su implicación inicial exclusivamente en el envejecimiento, los procesos degenerativos y patogénicos, recientemente se ha puesto de manifiesto su participación en importantes respuestas fisiológicas. En el sistema vascular, se ha demostrado que los aniones superóxido modulan la diferenciación y la función de las células del músculo liso vascular, la proliferación y migración de las células endoteliales vasculares en la angiogénesis, la respuesta inmunitaria y la activación de las plaquetas en la hemostasia. El papel de los aniones superóxido es particularmente importante en la desregulación de las plaquetas y las complicaciones cardiovasculares asociadas con una gran cantidad de afecciones, como el cáncer, la infección, la inflamación, la diabetes y la obesidad. Por lo tanto, se ha vuelto extremadamente relevante en la investigación cardiovascular poder medir de manera efectiva la generación de aniones superóxido por parte de las plaquetas humanas, comprender los mecanismos dependientes de redox que regulan el equilibrio entre hemostasia y trombosis y, finalmente, identificar nuevas herramientas farmacológicas para la modulación de las respuestas plaquetarias que conducen a trombosis y complicaciones cardiovasculares. Este estudio presenta tres protocolos experimentales adoptados con éxito para la detección de aniones superóxido en plaquetas y el estudio de los mecanismos dependientes de redox que regulan la hemostasia y la trombosis: 1) detección de aniones superóxido basados en dihidroetidio (DHE) por citometría de flujo; 2) Visualización y análisis de aniones superóxido basados en DHE mediante imágenes de plaquetas individuales; y 3) cuantificación basada en sonda de espín de la salida de aniones superóxido en plaquetas mediante resonancia paramagnética electrónica (EPR).

Introducción

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El anión superóxido (O2•-) es la ROS funcionalmente más relevante generada en las plaquetas1. O2•- es el producto de la reducción del oxígeno molecular y el precursor de muchas ROS 2 diferentes. La dismutación deO2•- conduce a la generación de peróxido de hidrógeno (H2,O2) a través de reacciones espontáneas en solución acuosa o reacciones catalizadas por superóxido dismutasas (SODs3). Aunque se han sugerido diferentes fuentes enzimáticas (por ejemplo, xantina oxidasa4, lipoxigenasa5, ciclooxigenasa6 y óxido nítrico sintasa7), la respiración mitocondrial 8,9 y las nicotinamida adenina dinucleótido fosfato-oxidasas (NOXs)10 son las fuentes más prominentes de anión superóxido en las células eucariotas. Este también parece ser el caso de las plaquetas, donde la fuga de electrones de la respiración mitocondrial11,12 y la actividad enzimática de los NOX13,14 se han descrito como los principales contribuyentes a la producción de aniones superóxido.

Aunque varios estudios se han centrado en la regulación de las plaquetas porO2•-, no existe consenso sobre los mecanismos moleculares responsables. La modulación de la actividad de los receptores de superficie a través de la oxidación directa y la formación de enlaces disulfuro se ha propuesto para diferentes receptores de plaquetas. Se ha sugerido la regulación positiva de la integrina αIIbβ3 por ROS a través de la oxidación directa de residuos de cisteína 15,16,17. De manera similar, dado que las respuestas plaquetarias al colágeno dependen de la dimerización dependiente de disulfuro y la consecuente dimerización de la glicoproteína VI (GPVI)18, se ha propuesto la potenciación de la actividad del receptor por oxidación dependiente deROS19, aunque no completamente probada experimentalmente. Por último, se demostró que la oxidación inducida por ROS de los grupos sulfhidrilo de la glicoproteína Ib (GPIb) promueve la adhesión plaquetaria y la interacción plaqueta-leucocto durante la inflamación20. Por el contrario, como posible consecuencia de la disminución de la oxidación del grupo sulfhidrilo y de la activación del receptor, el desprendimiento del ectodominio de GPVI y GPIb se ve disminuido por las condiciones reductoras21.

También se han propuesto modos de acción independientes de la oxidación directa de los receptores de superficie plaquetaria. Se ha demostrado que las ROS, incluida laO2•-, modulan positivamente el receptor de colágeno GPVI al atenuar la actividad de la proteína tirosina fosfatasa 2 (SHP-2) que contiene la región de homología Src 2, que regula negativamente la cascada de señalización de este receptor22. Además, elO2•- puede generar ONOO- (peroxinitrito) por reacción rápida con el óxido nítrico (NO), que normalmente inhibe las plaquetas a través de la guanilil ciclasa sensible al NO (NO-GC) y la generación del regulador plaquetario negativo GMP cíclico (cGMP)23,24. La disminución resultante en los niveles de NO puede conducir a la potenciación de las plaquetas. Alternativamente, se ha sugerido que la generación deO2•- por NOX2 contribuye a la peroxidación lipídica y a la formación de isoprostano, que es esencial para la activación y adhesión plaquetaria25. Por último, la proteína quinasa 5 (ERK5) regulada por señales extracelulares activada por mitógenos (MAPK), una proteína quinasa propuesta como sensor de estrés redox en las plaquetas26, es activada por O2•- e induce un fenotipo procoagulante en las plaquetas (según lo estimado por la medición de la externalización de la fosfatidilserina basada en citometría de flujo)27.

La desregulación de laO2•- y otras ROS generadas en las plaquetas se ha asociado con la respuesta hemostática exagerada que conduce a complicaciones cardiovasculares trombóticas asociadas con aterosclerosis, diabetes mellitus, hipertensión, obesidad y cáncer28,29. En estos entornos patológicos, la producción de ROS por parte de las plaquetas aumenta, lo que conduce a una potenciación de sus respuestas adhesivas y agregatorias. Además del efecto sobre las respuestas plaquetarias, la producción de radicales libres de las plaquetas puede tener consecuencias sobre otras células sanguíneas y estructuras vasculares, que es un área poco conocida y poco investigada de la salud cardiovascular30. A pesar de nuestra limitada comprensión de los mecanismos moleculares que relacionan el estrés oxidativo con las afecciones trombóticas, la relevancia clínica de los antioxidantes para la protección contra las enfermedades cardiovasculares ha recibido una atención considerable. Se ha demostrado que los niveles plasmáticos de antioxidantes se correlacionan inversamente con el riesgo de desarrollar afecciones cardiovasculares, y se ha demostrado que el consumo de antioxidantes en la dieta protege contra la enfermedad de las arterias coronarias31,32. En consecuencia, el uso de antioxidantes dietéticos ha sido defendido como un enfoque prometedor para la prevención de enfermedades cardiovasculares 33,34,35. Entre los efectos de la generación de ROS en las plaquetas, el aumento de la apoptosis puede tener importantes efectos fisiopatológicos36,37. En general, los protocolos fiables para detectar y cuantificar la producción deO2•- por parte de las plaquetas son cada vez más relevantes en la investigación cardiovascular.

En la actualidad, las técnicas disponibles para la detección de ROS tienen importantes limitaciones de especificidad (es decir, se desconoce la naturaleza química de las moléculas oxidantes detectadas) y fiabilidad (es decir, la interacción no deseada con moléculas biológicas y reactivos experimentales conduce a resultados no fisiológicos sesgados)38,39. El enfoque más utilizado para la detección de ROS en plaquetas se basa en el uso de diacetato de diclorodihidrofluoresceína (DCFDA), que se convierte en diclorodihidrofluoresceína (DCFH) por las esterasas intracelulares y, en consecuencia, en diclorofluoresceína (DCF) altamente fluorescente por oxidantes celulares, incluidos los radicales hidroxilo y los intermedios de peroxidasa-H2O2 40,41. A pesar de su amplio uso, se han planteado serias dudas sobre la fiabilidad de este enfoque para la medición de ROS38 intracelular. De hecho, la oxidación de DCFH a DCF puede ser inducida por iones de metales de transición (por ejemplo, Fe2+) o enzimas que contienen hemo (por ejemplo, citocromos) en lugar de ROS42. Además, el DCFDA es convertido por las peroxidasas celulares en su forma de radicales libres de semiquinona (DCF--), que a su vez se oxida a DCF por reacción con el oxígeno molecular (O2) con la liberación deO2-, lo que conduce a la amplificación artificial de las respuestas oxidativas 41,43,44. Por lo tanto, la detección de ROS intracelulares por DCFDA es útil para obtener información inicial, pero requiere una consideración cautelosa y controles experimentales extensos38,39.

En este estudio se presentan tres técnicas alternativas para la detección y medición del regulador clave de la función plaquetaria O2•-1. La primera técnica es la detección mediante DHE y citometría de flujo, que ofrece ventajas de fiabilidad y especificidad sobre la DCFDA. La segunda técnica propuesta aquí también utiliza DHE, pero el método de detección es la fluorescencia de plaquetas vivas, que permite el estudio de la generación de O2•- tras la señalización plaquetaria con cinética rápida y resolución de una sola célula. Por último, un protocolo basado en el uso de la sonda de espín de hidroxilamina 1-hidroxi-3-metoxicarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina (CMH) en experimentos de resonancia EPR ofrece la posibilidad de cuantificar la tasa de generación deO2•- por las plaquetas y compararla en diferentes condiciones.

Protocolo

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La recolección de sangre periférica de voluntarios que dan su consentimiento está aprobada por el Comité de Ética local y la Autoridad de Investigación Sanitaria del Servicio Nacional de Salud (referencia REC: 21/SC/0215; IRAS ID: 283854).

1. Método 1: Detección de aniones superóxido mediante DHE por citometría de flujo

  1. Precalentar (37 °C) la solución de citrato de sodio (4% p/v) y utilizarla como anticoagulante añadiéndola directamente a la sangre en el momento de la venopunción en una proporción de 1:7 (0,5% p/v final).
  2. Extracción de sangre humana periférica de voluntarios sanos mediante venopunción de venopunción de venopunción cubital mediana.
  3. Obtener plasma rico en plaquetas (PRP) a partir de sangre total mediante una etapa inicial de centrifugación a 200 x g durante 20 min.
  4. Centrifugar PRP a 500 x g durante 10 min con los inhibidores plaquetarios reversibles indometacina (10 μM) y PGE1 (40 ng/mL).
  5. Vuelva a suspender el pellet de plaquetas resultante en un tampón Tyrode modificado (145 mM de NaCl, 2,9 mM de KCl, 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetano sulfónico (HEPES), 1 mM de MgCl2, 5 mM de glucosa, pH 7,3) (37 °C) a una densidad de 2 x 108 plaquetas/mL.
  6. Después del aislamiento, descanse las plaquetas durante 30 min a 37 °C.
  7. Prepare DHE en dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración de stock de 5 mM.
  8. Añadir DHE a la suspensión de plaquetas a una concentración final de 5 μM (diluir la solución madre de 1 a 1.000, con una concentración final de DMSO del 0,1% v/v) e incubar durante 15 min a 37 °C.
  9. Tratar las plaquetas con agentes farmacológicos y/o eliminadores de ROS durante 15 min antes de la estimulación con los estímulos fisiológicos y las concentraciones deseadas (p. ej., 0,1 unidad/mL de trombina o 3 μg/mL de colágeno).
  10. Después de la estimulación, diluya las suspensiones de plaquetas 1 a 10 en tampón HEPES modificado en frío como hielo.
  11. Para la citometría de flujo, establezca la ganancia de dispersión lateral (SSC) y dispersión directa (FSC) a 40 mV y 220 mV, respectivamente, y utilice diagramas de dispersión a escala logarítmica para visualizar la población de partículas en la suspensión (ejemplo en la Figura 1A).
  12. (OPCIONAL) Inmunotinción de una alícuota de suspensión plaquetaria utilizando un anticuerpo anti-CD41 para identificar la población de eventos correspondientes a las plaquetas (ejemplo en la Figura 1B).
  13. Analice las muestras por citometría de flujo utilizando excitación a 405 nm (láser violeta) y emisión a una longitud de onda de 580 nm, que detecta selectivamente el producto específico del anión superóxido 2-hidroxi-etidio (2OH-Et+) (Figura 2).
    NOTA: La fijación con paraformaldehído y el almacenamiento de muestras a largo plazo no son aconsejables.

2. Método 2: Detección de aniones superóxido mediante DHE mediante imágenes de fluorescencia de una sola plaqueta

  1. El día del experimento, cubra un portaobjetos de μ de 8 pocillos con 0,1 mg/ml de colágeno fibrilar I de tendones equinos (colágeno Horm), 0,2 mg/ml de fibrinógeno o 1 mg/ml de poli-L-lisina (PLL) en tampón Tyrode modificado durante 2 h a 37 °C.
  2. Lavar dos veces con tampón Tyrode modificado (10 min cada uno).
  3. Enfriar la adherencia inespecífica mediante incubación en tampón Tyrode modificado más 5 mg/mL de albúmina sérica bovina (BSA) durante un mínimo de 30 min (o hasta el experimento).
  4. Precalentar (37 °C) la solución de citrato de sodio (4% p/v) y utilizarla como anticoagulante añadiéndola directamente a la sangre en el momento de la venopunción en una proporción de 1:7 (0,5% p/v final).
  5. Extracción de sangre humana periférica de voluntarios sanos mediante venopunción de venopunción de venopunción cubital mediana.
  6. Obtener plasma rico en plaquetas (PRP) a partir de sangre total mediante una etapa inicial de centrifugación a 200 x g durante 20 min.
  7. Centrifugar PRP a 500 x g durante 10 min con los inhibidores plaquetarios reversibles indometacina (10 μM) y PGE1 (40 ng/mL).
  8. Vuelva a suspender el gránulo de plaquetas resultante en un tampón Tyrode modificado (145 mM de NaCl, 2,9 mM de KCl, 10 mM de HEPES, 1 mM de MgCl2, 5 mM de glucosa, pH 7,3) (37 °C) a una densidad de 4 x 107 plaquetas/mL.
  9. Después del aislamiento, descanse las plaquetas durante 30 min a 37 °C.
  10. Prepare DHE en dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración de stock de 10 mM.
  11. Añadir DHE a una concentración final de 10 μM a la suspensión de plaquetas (diluir la solución madre de 1 a 1.000, con una concentración final de DMSO del 0,1% v/v) e incubar durante 1 min (37 °C).
  12. Después de 1 minuto de incubación con DHE, retire la solución de bloqueo de los pocillos elegidos, coloque el portaobjetos de μ en la platina del microscopio listo para la obtención de imágenes y dispense suavemente las plaquetas.
  13. Monitorice la conversión de DHE a 2OH-Et+ mediante imágenes confocales invertidas durante 10 minutos (405/580 nm ex/em), con imágenes recogidas cada 10 s con una lente de inmersión en aceite de 40x.
  14. (OPCIONAL) En el caso de pocillos recubiertos con PLL, se monitoriza la generación de aniones superóxido en respuesta a un agonista soluble (por ejemplo, 0,1 unidades/ml de trombina o 3 μg/ml de colágeno) añadiendo el agonista 10 minutos después de la dispensación de plaquetas y la recogida de imágenes de fluorescencia durante otros 10 minutos, como se describe en el paso 2.13.
  15. (OPCIONAL) Si es necesario, agregue eliminadores de aniones de superóxido o inhibidores selectivos (por ejemplo, inhibidor de NOX) dispensando suavemente al costado del pocillo durante el curso del tiempo y recoja imágenes de fluorescencia como se describe en 2.13 durante 10 minutos más.
  16. Cuantifique el análisis de fluorescencia de una sola célula seleccionando la región de interés (ROI) que contiene plaquetas individuales representativas y analizando la intensidad de fluorescencia en diferentes fotogramas con la herramienta Medir del conjunto de imágenes ImageJ 1.53t.

3. Método 3: Detección de aniones superóxido por plaquetas mediante resonancia paramagnética electrónica (EPR)

  1. Precalentar (37 °C) la solución de citrato de sodio (4% p/v) y utilizarla como anticoagulante añadiéndola directamente a la sangre en el momento de la venopunción en una proporción de 1:7 (0,5% p/v final).
  2. Extracción de sangre humana periférica de voluntarios sanos mediante venopunción de venopunción de venopunción cubital mediana.
  3. Obtener plasma rico en plaquetas (PRP) a partir de sangre total mediante una etapa inicial de centrifugación a 200 x g durante 20 min.
  4. Centrifugar PRP a 500 x g durante 10 min con los inhibidores plaquetarios reversibles indometacina (10 μM) y PGE1 (40 ng/mL).
  5. Vuelva a suspender el pellet de plaquetas resultante en un tampón Tyrode modificado (145 mM de NaCl, 2,9 mM de KCl, 10 mM de HEPES, 1 mM de MgCl2, 5 mM de glucosa, pH 7,3) (37 °C) a una densidad de 2 x 108 plaquetas/mL.
  6. Después del aislamiento, descanse las plaquetas durante 30 min a 37 °C.
  7. Añadir 5 μM de dietilditiocarbamato (DETC) y 25 μM de deferoxamina a la suspensión plaquetaria.
  8. Sin incubación, añadir 200 μM de 1-hidroxi-3-metoxicarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina (CMH).
  9. Cargue muestras en el agregador dentro de cubetas de agregación (incluidos los imanes de agitación recubiertos de teflón).
  10. Después de 1 min, agregue los estímulos a la concentración deseada (por ejemplo, 1 unidad/ml de trombina o 3 μg/ml de colágeno). Incubar durante 10 min.
  11. (OPCIONAL) Obtenga la generación de aniones superóxido en diferentes puntos de tiempo procediendo al paso 3.12 en el momento deseado.
  12. Transfiera la suspensión de plaquetas de la cubeta de agregación a un tubo de microcentrífuga y gire rápidamente a 6.000 x g durante 10 s.
  13. Cargue 50 μL del sobrenadante en micropipetas capilares y selle con cera de sellado EPR.
  14. Transfiera las muestras al escáner EPR.
  15. Configure el escáner EPR de la siguiente manera: campo central 3.492,5 G, barrido de campo 60 G, amplitud de modulación 2 G, tiempo de barrido 10 s, número de exploraciones 10, frecuencia de microondas 9,39 GHz, potencia de microondas 20 mW, tiempo de conversión 327,68 ms, constante de tiempo 5242,88 ms.
  16. Estime la oxidación de CMH a CM● como el área bajo la curva (AUC) de los picos de EPR registrados utilizando los parámetros anteriores.
  17. Construya una curva de calibración que trace la intensidad de EPR medida como se describe en el paso 3.16 en el eje y y las concentraciones del CM● disponible comercialmente en el eje x (por ejemplo, 0, 0,3, 1, 3, 10 y 30 μM).
  18. A partir de la concentración de CM● en las muestras, obtenga la cantidad de anión superóxido generado por las plaquetas en las muestras utilizando las fórmulas descritas en la sección Resultados representativos.

Resultados

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Para la detección por citometría de flujo de fluorescencia de DHE, mostramos resultados representativos de las plaquetas en reposo (Figura 3A) o estimuladas con 0,1 unidades/mL de trombina (Figura 3B). La salida deO2•- se cuantificó como intensidad de fluorescencia media plaquetaria (MFI), como se muestra para la estimulación con 0,1 unidades/mL de trombina (Figura 3C) o 3 μg/mL de péptido relacionado con el colágeno (PCR) (Figura 3D). Se observó un aumento de dos o tres veces en la tinción de DHE como resultado de la estimulación plaquetaria. Para confirmar que se mide el O2•-, sugerimos el uso de lao2•-scavenger dismutasa pegilado-superóxido dismutasa permeable a las células (PEG-SOD, 100 unidades/mL), mientras que para identificar la fuente deO2•- utilizamos el inhibidor de NOX VAS2870 (10 μM). Tanto para el colágeno como para la trombina, PEG-SOD y VAS2870 suprimieron el aumento de la fluorescencia de DHE causado por la activación de las plaquetas, lo que confirma que la medición es específica para elO2•- y que sus fuentes en estas condiciones son las enzimas NOX.

Para la detección por imagen de la fluorescencia de DHE, presentamos datos de experimentos que evalúan la generación deO2•- en el momento de la adhesión al colágeno o fibrinógeno (y los siguientes 10 min) (Figura 4A) o de experimentos que tienen como objetivo evaluar la generación deO2•- a partir de plaquetas previamente adheridas a PLL tras la estimulación con trombina (Figura 4B). Como era de esperar, la adherencia a PLL no desencadena una producción robusta de O2•-. Lo más probable es que esta forma de adhesión dependa de la interacción electrostática sin el inicio de ninguna respuesta de señalización45, lo que hace que este enfoque sea adecuado para medir la salida deO2•- en respuesta a la adición de agonistas solubles. Para confirmar que este protocolo permite la detección deO2•-, se pueden utilizar secuestrantes o inhibidores selectivos. Hemos demostrado en estudios previos que la N-acetilcisteína (NAC) puede eliminar elO2•- y abolir la fluorescencia plaquetaria en estos experimentos46. Aquí, demostramos que el inhibidor selectivo de NOX VAS2870 eficaz e instantáneamente disminuye la fluorescencia en las plaquetas que se adhieren al colágeno o al fibrinógeno (Figura 4A) o que responden a la trombina (Figura 4B). Esto sugiere que los NOX son la fuente deO2•- en estas condiciones experimentales. Las películas representativas de la fluorescencia DHE (excitación a 405 nm) en respuesta a la adhesión al colágeno o al fibrinógeno o a la estimulación por trombina de las plaquetas que se adhieren a la PLL se incluyen como Archivo Suplementario 1, Archivo Suplementario 2 y Archivo Suplementario 3, respectivamente. Cabe destacar que el PEG-SOD, que se ha utilizado con éxito en otras configuraciones experimentales como un eliminador de O2--, no es eficaz en este tipo de experimento. No tenemos una explicación clara para esto en este momento. Podemos plantear la hipótesis de que PEG-SOD llega a los compartimentos celulares en los que elO2•- induce un aumento de la fluorescencia en los ensayos basados en imágenes, ya sea con poca eficiencia o con una cinética lenta. Es posible que se requieran más investigaciones específicas para aclarar este punto.

Aplicamos la medida deO2•- por EPR en plaquetas en diferentes estudios publicados previamente 1,13,47,48,49,50. Un paso crucial para esta técnica es la preparación de una curva de calibración utilizando CM● disponible comercialmente (es decir, el producto de la reacción entre la sonda de espín CMH yO2•- y las especies resonantes medidas por EPR). La reacción de CMH yO2•- se muestra en la Figura 5A, y ejemplos representativos de la señal EPR inducida por diferentes concentraciones de CM● se muestran en la Figura 5B. Los datos de diferentes concentraciones de CM● se utilizaron para construir una curva de calibración que describe la correlación lineal entre la cantidad de CMH oxidado y la intensidad de la señal EPR en las muestras (Figura 5C). La siguiente ecuación describe la correlación entre la concentración de CM● y la intensidad de la señal EPR y es el punto de partida para el cálculo de la curva de calibración para los experimentos de este estudio (Ecuación 1):

figure-results-1

Como tanto las concentraciones de CM● como su correspondiente intensidad de EPR se obtuvieron experimentalmente, se pueden calcular la pendiente y la intersección del eje Y de la curva de calibración. En el ejemplo que se muestra en la Figura 5C, Pendiente = 1.002.169 e Intercepción = 596.383. Por lo tanto, la ecuación para la curva de calibración se puede reescribir como:

figure-results-2

Al reorganizar la ecuación anterior, es posible calcular la concentración de CM● para diferentes muestras en función de sus valores de intensidad EPR (Ecuación 2):

figure-results-3

Una vez conocida la concentración de CM● en las muestras, es posible calcular su tasa de generación por plaqueta y unidad de tiempo con la siguiente ecuación (Ecuación 3):

figure-results-4

Usando la Ecuación 2, la Ecuación 3 se puede reescribir como (Ecuación 4):

figure-results-5

Que en el ejemplo que se muestra en la Figura 5C se puede reescribir como:

figure-results-6

La tasa de oxidación de CMH se expresará como attomoles de CM● generados por plaqueta por minuto. Este valor se puede utilizar para comparar la tasa de generación deO2•- entre los experimentos y los donantes, lo que no es posible con sondas fluorescentes como DHE (o DCFDA). Las sondas fluorescentes generalmente solo permiten una estimación del efecto de diferentes condiciones en la generación deO2•- como cambios en la intensidad de fluorescencia dentro del mismo experimento. Al igual que en todas las técnicas descritas en este artículo, se confirmó la especificidad de la detección con eliminadores de ROS (p. ej., PEG-SOD, NAC) o inhibidores selectivos de enzimas generadoras de anión superóxido (p. ej., VAS2870 para inhibir NOXs). Aquí, presentamos datos para la estimulación plaquetaria (Figura 6) con trombina (Figura 6A, C, E) o colágeno (Figura 6B, D, F). Para ambos agonistas, se utilizó PEG-SOD para confirmar que se detectaO2•-, mientras que la falta de efecto para la catalasa pegilada (PEG-Cat.) sugiere que el peróxido de hidrógeno no se detecta por esta técnica (Figura 6C,D, respectivamente). VAS2870 suprime las señales EPR inducidas por trombina (Figura 6E) y colágeno (Figura 6F), lo que sugiere que los NOX son la principal fuente deO2•- plaquetaria en respuesta a estos dos agonistas.

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Figura 1: Análisis de citometría de flujo de suspensiones plaquetarias. (A) Presentación típica de gráficos de dispersión directa (FSC) y lateral (SSC) para plaquetas aisladas. (B) La inmunotinción de la suspensión plaquetaria con un anticuerpo anti-CD41 confirma el >98% de las partículas en la preparación como plaquetas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Reacción química del DHE con el anión superóxido y otras ROS y propiedades espectrales de sus productos. Estructura y propiedades espectrales del DHE y sus dos productos de oxidación 2-hidroxi-etidio (2OH-Et+), generado por reacción con aniones superóxido, y etidio (Et+), generado por reacción con otros tipos de ROS (por ejemplo, radical hidroxilo y peróxido de hidrógeno). El pico de excitación a 405 nm, resaltado por un rectángulo azul discontinuo en la figura, es específico para 2OH-Et+ y, por lo tanto, puede usarse para detectar/medirO2•-. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Generación de aniones superóxido dependientes de trombina y colágeno detectada por DHE y citometría de flujo. Histogramas representativos de la tinción con DHE de plaquetas (A) en reposo y (B) estimuladas por trombina. La barra indica valores de tinción de DHE por debajo de 500, que es del 70,7% y del 16,1% para las plaquetas en reposo y estimuladas por trombina, respectivamente. Esta técnica se utilizó para estimar la generación de aniones superóxido en (C) 0,1 unidad/mL de trombina y (D) 3 μg/mL de plaquetas estimuladas por colágeno. Se utilizó PEG-SOD (100 unidades/mL) para confirmar que en este experimento se miden aniones superóxido, mientras que se utilizaron 10 μM VAS2870 para identificar las enzimas NOX como fuente de aniones superóxido. Cada punto de datos se calculó como la intensidad de fluorescencia media (MFI) de 50.000 plaquetas, y cada experimento se repitió cinco veces independientes (n = 5), con la media ± SEM mostrada en los gráficos. La significación estadística se evaluó mediante ANOVA de una vía con postest de Tukey para comparaciones pareadas (** = p < 0,01, *** = p < 0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Generación de aniones superóxido dependientes de colágeno, fibrinógeno y trombina detectada por imágenes de fluorescencia DHE. (A) Se evaluó la cinética de generación de aniones superóxido para las plaquetas adheridas al colágeno o al fibrinógeno. Las plaquetas se dispensaron en portaobjetos de μ recubiertos 1 min después del inicio de la imagen, mientras que 10 μM VAS2870 se añadieron 5 min desde el inicio de la recolección de imágenes. (B) Cinética de generación de aniones superóxido para plaquetas tras la estimulación con trombina. Se permitió que las plaquetas se adhirieran a los portaobjetos de μ recubiertos de PLL durante 10 minutos antes del comienzo de la recolección de imágenes. Después de 2 min, se añadió 0,1 unidad/mL de trombina, y después de otros 5 min, se añadieron 10 μM VAS2870 (es decir, 7 min desde el inicio de la imagen). El esquema experimental se presenta en la parte superior de los paneles, mientras que en el centro de los paneles se muestran imágenes representativas de 0 min, 1 min, 3 min, 6 min y 9 min. La cuantificación de la fluorescencia DHE de una sola plaqueta se muestra en la parte inferior de los paneles y se obtuvo mediante análisis de intensidad de fluorescencia utilizando ImageJ. Los datos son medios ± SEM de 8-12 plaquetas por condición en 4 experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Curva de calibración y cálculos de la tasa de oxidación de CMH. (A) Estructura química y propiedades EPR de CMH y CM●. (B) Ejemplos representativos de datos de EPR para diferentes concentraciones de CM● (100 nM a 10 μM). (C) Curva de calibración de la intensidad de EPR frente a la concentración de CM● . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Detección de la producción de aniones superóxido por parte de las plaquetas tras la estimulación con trombina o colágeno. La producción de aniones superóxido se midió por EPR con la sonda de espín CMH en plaquetas estimuladas con (A) 0,1 unidades/mL de trombina o (B) 3 μg/mL de colágeno. (C, D) Se incluyó una concentración de 100 unidades/mL del eliminador de aniones superóxido PEG-SOD o 100 unidades/mL de la catalasa pegilada del peróxido de hidrógeno (PEG-Cat.) en las condiciones probadas para ambos agonistas. La fuente del anión superóxido se investigó mediante co-incubación con el inhibidor de NOX VAS2870 (10 μM). Tanto la trombina (E) como el colágeno (F) dependen de la actividad de NOX para la generación de anión superóxido. A lo largo de la figura, se calculó la velocidad de reacción del anión CMH/superóxido a partir de las trazas de EPR, como se describe en el manuscrito (Ecuación 4). Los datos son medias ± SEM de 5 (C,D) y 4 experimentos independientes (E,F). La significación estadística se evaluó mediante ANOVA de una vía con postest de Tukey para comparaciones pareadas (** = p < 0,01, *** = p < 0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Legajo Complementario 1: Película representativa de la fluorescencia DHE (excitación a 405 nm) en respuesta a la adhesión al colágeno. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Legajo Complementario 2: Película representativa de la fluorescencia DHE (excitación a 405 nm) en respuesta a la adhesión del fibrinógeno. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Legajo Complementario 3: Película representativa de la fluorescencia DHE (excitación a 405 nm) en respuesta a la estimulación por trombina de las plaquetas adheridas a PLL. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

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En este manuscrito, presentamos tres técnicas diferentes con el potencial de avanzar en la capacidad de investigar la regulación dependiente de redox de la función plaquetaria a través de la detección selectiva deO2•-. Los dos primeros métodos son una mejora con respecto a las técnicas existentes debido a la sonda redox utilizada (DHE en lugar del más común pero menos confiable DCFDA). Por lo tanto, estas técnicas son de fácil acceso, y la mayoría de los laboratorios pueden adoptarlas de manera efectiva sin costos particulares de equipo o capacitación. La tercera técnica se basa en el uso de equipos especializados para el análisis de la oxidación de la sonda de espín CMH mediante EPR. Esta técnica requiere la compra de equipos y reactivos especializados y la capacitación específica del usuario del laboratorio. En consecuencia, parece adecuado para laboratorios que se centran específicamente en el estudio de eventos dependientes de redox en plaquetas (u otras células).

Para las técnicas que utilizan DHE, la selección de la longitud de onda para la excitación es crucial para obtener la detección específica deO2•-. El 2-hidroxi-etidio (2OH-Et+) generado por la reacción de DHE conO2•- se excita a 405 nm, mientras que el etidio (Et+) generado por la reacción general de DHE con ROS (por ejemplo, radical hidroxilo y peróxido de hidrógeno) tiene un pico de excitación alrededor de 520 nm pero no hay excitación a 405 nm (Figura 1)51. El uso de DHE en lugar de DCFDA protege de los artefactos causados por la reacción directa de esta sonda con componentes celulares como peroxidasas, otras enzimas que contienen hemo y agentes reductores de iones metálicos 42,43,44. El DHE ha sido sugerido como una herramienta más segura para los estudios redox celulares38,39. Aquí, proponemos el uso de DHE con dos técnicas de lectura diferentes: 1) citometría de flujo y 2) imágenes de fluorescencia.

La citometría de flujo es generalmente una técnica que permite el manejo contemporáneo de múltiples muestras con un rendimiento bajo a medio52. Desafortunadamente, el enfoque utilizado en este estudio no permite la fijación de la muestra. Aunque la dilución de las muestras con tampón Tyrode modificado en frío estabiliza la fluorescencia en las muestras hasta por 30 minutos, el análisis de todas las muestras debe realizarse en este período de tiempo. Esto limita significativamente el número de muestras por experimento. Son posibles múltiples ejecuciones experimentales controladas internamente en el mismo día y utilizando la misma preparación plaquetaria, aunque los resultados deben normalizarse a controles y no considerarse como experimentos independientes. Esta técnica ha sido utilizada por los autores de este manuscrito para destacar el papel de la modulación plaquetaria dependiente de redox en las respuestas a diferentes agonistas y moduladores46,50. Este método puede modificarse mediante la adopción del uso de una versión modificada químicamente de DHE que permite dirigirse a las mitocondrias (es decir, Mitosox)53, que se ha utilizado para estudios de plaquetas centrados en NOX254. Esta es una oportunidad interesante que aún no ha sido aprovechada por nuestros laboratorios.

La técnica de imagen de fluorescencia que se propone aquí tiene la ventaja de determinar el curso temporal de la generación deO2•- en las plaquetas tras la adhesión (agonistas absorbidos en la superficie del pocillo de imagen) o la estimulación (agonistas en suspensión). Esto permite la interpretación de la interacción de las diferentes fases del proceso de activación plaquetaria y la evaluación de la contribución de diferentes fuentes deO2•- (por ejemplo, diferentes enzimas generadoras de ROS, por ejemplo, NOXs). Ninguna técnica existente permite este tipo de investigación. Esto tiene un coste en términos de rendimiento del ensayo, ya que cada condición probada tarda 30 minutos (lo que incluye la configuración del portaobjetos μ, el enfoque y la selección de campo, la obtención de imágenes y el almacenamiento de datos). Por lo tanto, esta técnica permite probar un pequeño número de condiciones por día de trabajo (es decir, menos de 10). Aunque se utilizó un microscopio confocal para los datos que se muestran aquí, hemos confirmado que se pueden obtener resultados igualmente buenos con un microscopio de epifluorescencia con capacidad de excitación de 405 nm. Esto reduce la necesidad de costosas configuraciones de microscopía confocal y hace que esta técnica sea más asequible.

El protocolo EPR ha sido desarrollado a partir de estudios previos en diferentes tipos celulares55. Esta técnica es ampliamente reconocida como la herramienta más confiable para el estudio de la generación de ROS y la investigación de eventos dependientes de redox en células38. Además de una fiabilidad superior en comparación con otras técnicas debido a la especificidad de la reacción de las sondas de espín de hidroxilamina con radicales libres de oxígeno56, la EPR permite la cuantificación de la tasa de generación deO2•- y su comparación entre diferentes individuos y experimentos. Esto no es posible con las técnicas basadas en fluorescencia, que solo nos permiten estimar el efecto de condiciones seleccionadas sobre la intensidad de fluorescencia dentro de un solo experimento y preparación de plaquetas. Aunque este protocolo EPR se desarrolló como una técnica para combinar con la agregación plaquetaria para el monitoreo paralelo de la activación plaquetaria y la generación 1 deO2-, estos experimentos se pueden realizar sin el análisis paralelo de la agregación. Incluso sin un análisis paralelo de la agregación plaquetaria, sugerimos realizar la incubación en un agregador para garantizar una estimulación plaquetaria efectiva, que requiere el esfuerzo de cizallamiento proporcionado por la agitación continua. Si los experimentos deben realizarse en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL sin agitación, los niveles de producción deO2•- son significativamente más bajos. Por lo tanto, si se elige este enfoque experimental, sugerimos realizar la incubación de CMH en una rueda giratoria y con plaquetas más densamente concentradas (es decir, 1 x 109/mL), lo que conduce a una señal lo suficientemente fuerte como para ser detectada por el espectrómetro EPR.

En resumen, aquí presentamos tres técnicas validadas para la detección deO2•- en plaquetas. Ofrecen diferentes ventajas y se pueden elegir de acuerdo con los objetivos y prioridades experimentales. La primera técnica basada en el uso de DHE por citometría de flujo es la menos laboriosa y requiere menos tiempo y, por lo tanto, puede elegirse como un análisis de nivel de entrada. La segunda técnica, basada en el uso de DHE por microscopía de fluorescencia, permite apreciar la rápida cinética de la generación deO2•- y estudiar cómo diferentes cascadas de señalización pueden afectar a la respuesta oxidativa en la escala de tiempo de segundos (mientras que otras técnicas sólo permiten la investigación de puntos finales de los eventos que ocurren a los pocos minutos de la estimulación). Por último, la RAP permite cuantificar la tasa de generación deO2•- y su comparación entre experimentos e individuos. Por esta razón, esta última técnica es particularmente útil para estudios clínicos que tienen como objetivo caracterizar la respuesta oxidativa en plaquetas de diferentes individuos (por ejemplo, comparación entre pacientes o pacientes versus controles sanos). En general, estas tres técnicas ofrecen ventajas significativas sobre los métodos existentes y representan un avance significativo en las herramientas experimentales de las que disponemos para estudiar los eventos dependientes de redox en plaquetas.

Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue financiado por la Fundación Británica del Corazón (PG/15/40/31522), Alzheimer Research UK (ARUK-PG2017A-3) y el Consejo Europeo de Investigación (#10102507) a G. Pula.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1-hidroxi-3-metoxicarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina (CMH)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-02.1-50mgReactivo para EPR (sonda de espín)
BD FACSAria IIIBD Biosciences NACitómetro de flujo
Albúmina sérica bovinaMerck/SigmaA7030Para μ-recubrimiento deslizante
Bruker E-scan M (Noxyscan)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH  NOX-E.11-BES Espectrómetro EPR
Catalase– polietilenglicol (PEG-Cat.)Merck/SigmaC4963Eliminador de peróxido de hidrógeno (control de especificidad)
ChronoLog Model 490+4Labmedics/ChronologNAAggregometer
CM radicalNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-20.1-100mg Reactivo para EPR (control de calibración)
deferoxamina Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-09.1-100mg Reactivo para EPR
dietilditiocarbamato (DETC) Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-10.1-1g Reactivo para EPR
DihidroetidioThermo Fisher ScientificsD11347Sonda de anión superóxido
Dimetilsulfóxido Merck/Sigma34869Para la preparación de soluciones madre 
Placas de cera de sellado EPR NoxygenScience trasfer and Diagnostics GmbHNOX-A.3-VPMConsumible para agua de
grado EPRNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-07.7.1-0.5L Reactivo para EPR
Fibrinógeno de plasma humanoMerck/SigmaF4883Para recubrimiento de portaobjetos
FITC anti-humano Anticuerpo CD41BioLegend303704Tinción específica de plaquetas para citometría de
flujo Cubetas de vidrio Labmedics/ChronologN/P 312Consumible para incubación en aggregómetro
Horm CollagenLabmedics/ChronologN/P 385Para la estimulación plaquetaria
ImageJ Institutos Nacionales de Salud (NIH)NAImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
IndometacinaMerck/SigmaI7378Para el aislamiento de plaquetas
Micropipetas DURAN 50µ lNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-G.6.1-50µ LConsumible para EPR
Clorhidrato de poli-L-lisinaMerck/SigmaP2658Para recubrimiento de deslizamiento μ-
Prostaglandina E1 (PGE1)Merck/SigmaP5515Para el aislamiento de plaquetas
Citrato de sodio (solución al 4% p/v)Merck/SigmaS5770Para el aislamiento de plaquetas
Barras de agitación (recubiertas de teflón)Labmedics/ChronologP/N 313Consumible para incubación en aggregómetro
Superóxido dismutasa– polietilenglicol (PEG-SOD)Merck/SigmaS9549Eliminador de aniones superóxido (control de especificidad)
Trombina de plasma humanoMerck/SigmaT6884Para la estimulación plaquetaria y el recubrimiento de portaobjetos VAS2870
Enzo Life ScienceBML-EI395Inhibidor de NOX
Microscopio confocal Zeiss 510 LSMMicroscopio confocalZeissNA

Referencias

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