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Artículo de método

Métodos alternativos para la detección de la generación de aniones superóxido en plaquetas

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DOI:

10.3791/66647

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29 de marzo de 2024

 ,  ,  , 
1Medicines and Healthcare Regulatory Agency, South Mimms laboratories, 2Hull York Medical School, University of Hull

En este artículo

Resumen

La generación de anión superóxido es esencial para la estimulación de las plaquetas y, si está desregulada, es fundamental para las enfermedades trombóticas. En este trabajo se presentan tres protocolos para la detección selectiva de aniones superóxido y el estudio de la regulación plaquetaria dependiente de redox.

Resumen

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son moléculas que contienen oxígeno altamente inestables. Su inestabilidad química los hace extremadamente reactivos y les da la capacidad de reaccionar con moléculas biológicas importantes como proteínas, ácidos nucleicos y lípidos. Los aniones superóxido son ROS importantes generadas por la reducción de la reducción de oxígeno molecular (es decir, la adquisición de un electrón). A pesar de su implicación inicial exclusivamente en el envejecimiento, los procesos degenerativos y patogénicos, recientemente se ha puesto de manifiesto su participación en importantes respuestas fisiológicas. En el sistema vascular, se ha demostrado que los aniones superóxido modulan la diferenciación y la función de las células del músculo liso vascular, la proliferación y migración de las células endoteliales vasculares en la angiogénesis, la respuesta inmunitaria y la activación de las plaquetas en la hemostasia. El papel de los aniones superóxido es particularmente importante en la desregulación de las plaquetas y las complicaciones cardiovasculares asociadas con una gran cantidad de afecciones, como el cáncer, la infección, la inflamación, la diabetes y la obesidad. Por lo tanto, se ha vuelto extremadamente relevante en la investigación cardiovascular poder medir de manera efectiva la generación de aniones superóxido por parte de las plaquetas humanas, comprender los mecanismos dependientes de redox que regulan el equilibrio entre hemostasia y trombosis y, finalmente, identificar nuevas herramientas farmacológicas para la modulación de las respuestas plaquetarias que conducen a trombosis y complicaciones cardiovasculares. Este estudio presenta tres protocolos experimentales adoptados con éxito para la detección de aniones superóxido en plaquetas y el estudio de los mecanismos dependientes de redox que regulan la hemostasia y la trombosis: 1) detección de aniones superóxido basados en dihidroetidio (DHE) por citometría de flujo; 2) Visualización y análisis de aniones superóxido basados en DHE mediante imágenes de plaquetas individuales; y 3) cuantificación basada en sonda de espín de la salida de aniones superóxido en plaquetas mediante resonancia paramagnética electrónica (EPR).

Introducción

El anión superóxido (O2•-) es la ROS funcionalmente más relevante generada en las plaquetas1. O2•- es el producto de la reducción del oxígeno molecular y el precursor de muchas ROS 2 diferentes. La dismutación deO2•- conduce a la generación de peróxido de hidrógeno (H2,O2) a través de reacciones espontáneas en solución acuosa o reacciones catalizadas por superóxido dismutasas (SODs3). Aunque se han sugerido diferentes fuentes enzimáticas (por ejemplo, xantina oxidasa4, lipoxigenasa5, ciclooxigenasa6 y óxido nítrico sintasa7), la respiración mitocondrial 8,9 y las nicotinamida adenina dinucleótido fosfato-oxidasas (NOXs)10 son las fuentes más prominentes de anión superóxido en las células eucariotas. Este también parece ser el caso de las plaquetas, donde la fuga de electrones de la respiración mitocondrial11,12 y la actividad enzimática de los NOX13,14 se han descrito como los principales contribuyentes a la producción de aniones superóxido.

Aunque varios estudios se han centrado en la regulación de las plaquetas porO2•-, no existe consenso sobre los mecanismos moleculares responsables. La modulación de la actividad de los receptores de superficie a través de la oxidación directa y la formación de enlaces disulfuro se ha propuesto para diferentes receptores de plaquetas. Se ha sugerido la regulación positiva de la integrina αIIbβ3 por ROS a través de la oxidación directa de residuos de cisteína 15,16,17. De manera similar, dado que las respuestas plaquetarias al colágeno dependen de la dimerización dependiente de disulfuro y la consecuente dimerización de la glicoproteína VI (GPVI)18, se ha propuesto la potenciación de la actividad del receptor por oxidación dependiente deROS19, aunque no completamente probada experimentalmente. Por último, se demostró que la oxidación inducida por ROS de los grupos sulfhidrilo de la glicoproteína Ib (GPIb) promueve la adhesión plaquetaria y la interacción plaqueta-leucocto durante la inflamación20. Por el contrario, como posible consecuencia de la disminución de la oxidación del grupo sulfhidrilo y de la activación del receptor, el desprendimiento del ectodominio de GPVI y GPIb se ve disminuido por las condiciones reductoras21.

También se han propuesto modos de acción independientes de la oxidación directa de los receptores de superficie plaquetaria. Se ha demostrado que las ROS, incluida laO2•-, modulan positivamente el receptor de colágeno GPVI al atenuar la actividad de la proteína tirosina fosfatasa 2 (SHP-2) que contiene la región de homología Src 2, que regula negativamente la cascada de señalización de este receptor22. Además, elO2•- puede generar ONOO- (peroxinitrito) por reacción rápida con el óxido nítrico (NO), que normalmente inhibe las plaquetas a través de la guanilil ciclasa sensible al NO (NO-GC) y la generación del regulador plaquetario negativo GMP cíclico (cGMP)23,24. La disminución resultante en los niveles de NO puede conducir a la potenciación de las plaquetas. Alternativamente, se ha sugerido que la generación deO2•- por NOX2 contribuye a la peroxidación lipídica y a la formación de isoprostano, que es esencial para la activación y adhesión plaquetaria25. Por último, la proteína quinasa 5 (ERK5) regulada por señales extracelulares activada por mitógenos (MAPK), una proteína quinasa propuesta como sensor de estrés redox en las plaquetas26, es activada por O2•- e induce un fenotipo procoagulante en las plaquetas (según lo estimado por la medición de la externalización de la fosfatidilserina basada en citometría de flujo)27.

La desregulación de laO2•- y otras ROS generadas en las plaquetas se ha asociado con la respuesta hemostática exagerada que conduce a complicaciones cardiovasculares trombóticas asociadas con aterosclerosis, diabetes mellitus, hipertensión, obesidad y cáncer28,29. En estos entornos patológicos, la producción de ROS por parte de las plaquetas aumenta, lo que conduce a una potenciación de sus respuestas adhesivas y agregatorias. Además del efecto sobre las respuestas plaquetarias, la producción de radicales libres de las plaquetas puede tener consecuencias sobre otras células sanguíneas y estructuras vasculares, que es un área poco conocida y poco investigada de la salud cardiovascular30. A pesar de nuestra limitada comprensión de los mecanismos moleculares que relacionan el estrés oxidativo con las afecciones trombóticas, la relevancia clínica de los antioxidantes para la protección contra las enfermedades cardiovasculares ha recibido una atención considerable. Se ha demostrado que los niveles plasmáticos de antioxidantes se correlacionan inversamente con el riesgo de desarrollar afecciones cardiovasculares, y se ha demostrado que el consumo de antioxidantes en la dieta protege contra la enfermedad de las arterias coronarias31,32. En consecuencia, el uso de antioxidantes dietéticos ha sido defendido como un enfoque prometedor para la prevención de enfermedades cardiovasculares 33,34,35. Entre los efectos de la generación de ROS en las plaquetas, el aumento de la apoptosis puede tener importantes efectos fisiopatológicos36,37. En general, los protocolos fiables para detectar y cuantificar la producción deO2•- por parte de las plaquetas son cada vez más relevantes en la investigación cardiovascular.

En la actualidad, las técnicas disponibles para la detección de ROS tienen importantes limitaciones de especificidad (es decir, se desconoce la naturaleza química de las moléculas oxidantes detectadas) y fiabilidad (es decir, la interacción no deseada con moléculas biológicas y reactivos experimentales conduce a resultados no fisiológicos sesgados)38,39. El enfoque más utilizado para la detección de ROS en plaquetas se basa en el uso de diacetato de diclorodihidrofluoresceína (DCFDA), que se convierte en diclorodihidrofluoresceína (DCFH) por las esterasas intracelulares y, en consecuencia, en diclorofluoresceína (DCF) altamente fluorescente por oxidantes celulares, incluidos los radicales hidroxilo y los intermedios de peroxidasa-H2O2 40,41. A pesar de su amplio uso, se han planteado serias dudas sobre la fiabilidad de este enfoque para la medición de ROS38 intracelular. De hecho, la oxidación de DCFH a DCF puede ser inducida por iones de metales de transición (por ejemplo, Fe2+) o enzimas que contienen hemo (por ejemplo, citocromos) en lugar de ROS42. Además, el DCFDA es convertido por las peroxidasas celulares en su forma de radicales libres de semiquinona (DCF--), que a su vez se oxida a DCF por reacción con el oxígeno molecular (O2) con la liberación deO2-, lo que conduce a la amplificación artificial de las respuestas oxidativas 41,43,44. Por lo tanto, la detección de ROS intracelulares por DCFDA es útil para obtener información inicial, pero requiere una consideración cautelosa y controles experimentales extensos38,39.

En este estudio se presentan tres técnicas alternativas para la detección y medición del regulador clave de la función plaquetaria O2•-1. La primera técnica es la detección mediante DHE y citometría de flujo, que ofrece ventajas de fiabilidad y especificidad sobre la DCFDA. La segunda técnica propuesta aquí también utiliza DHE, pero el método de detección es la fluorescencia de plaquetas vivas, que permite el estudio de la generación de O2•- tras la señalización plaquetaria con cinética rápida y resolución de una sola célula. Por último, un protocolo basado en el uso de la sonda de espín de hidroxilamina 1-hidroxi-3-metoxicarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina (CMH) en experimentos de resonancia EPR ofrece la posibilidad de cuantificar la tasa de generación deO2•- por las plaquetas y compararla en diferentes condiciones.

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Protocolo

La recolección de sangre periférica de voluntarios que dan su consentimiento está aprobada por el Comité de Ética local y la Autoridad de Investigación Sanitaria del Servicio Nacional de Salud (referencia REC: 21/SC/0215; IRAS ID: 283854).

1. Método 1: Detección de aniones superóxido mediante DHE por citometría de flujo

  1. Precalentar (37 °C) la solución de citrato de sodio (4% p/v) y utilizarla como anticoagulante añadiéndola directamente a la sangre en el momento de la venopunción en una proporción de 1:7 (0,5% p/v final).
  2. Extracción de sangre humana periférica de voluntarios sanos mediante venopunción de venopunción de venopunción cubital mediana.
  3. Obtener plasma rico en plaquetas (PRP) a partir de sangre total mediante una etapa inicial de centrifugación a 200 x g durante 20 min.
  4. Centrifugar PRP a 500 x g durante 10 min con los inhibidores plaquetarios reversibles indometacina (10 μM) y PGE1 (40 ng/mL).
  5. Vuelva a suspender el pellet de plaquetas resultante en un tampón Tyrode modificado (145 mM de NaCl, 2,9 mM de KCl, 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetano sulfónico (HEPES), 1 mM de MgCl2, 5 mM de glucosa, pH 7,3) (37 °C) a una densidad de 2 x 108 plaquetas/mL.
  6. Después del aislamiento, descanse las plaquetas durante 30 min a 37 °C.
  7. Prepare DHE en dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración de stock de 5 mM.
  8. Añadir DHE a la suspensión de plaquetas a una concentración final de 5 μM (diluir la solución madre de 1 a 1.000, con una concentración final de DMSO del 0,1% v/v) e incubar durante 15 min a 37 °C.
  9. Tratar las plaquetas con agentes farmacológicos y/o eliminadores de ROS durante 15 min antes de la estimulación con los estímulos fisiológicos y las concentraciones deseadas (p. ej., 0,1 unidad/mL de trombina o 3 μg/mL de colágeno).
  10. Después de la estimulación, diluya las suspensiones de plaquetas 1 a 10 en tampón HEPES modificado en frío como hielo.
  11. Para la citometría de flujo, establezca la ganancia de dispersión lateral (SSC) y dispersión directa (FSC) a 40 mV y 220 mV, respectivamente, y utilice diagramas de dispersión a escala logarítmica para visualizar la población de partículas en la suspensión (ejemplo en la Figura 1A).
  12. (OPCIONAL) Inmunotinción de una alícuota de suspensión plaquetaria utilizando un anticuerpo anti-CD41 para identificar la población de eventos correspondientes a las plaquetas (ejemplo en la Figura 1B).
  13. Analice las muestras por citometría de flujo utilizando excitación a 405 nm (láser violeta) y emisión a una longitud de onda de 580 nm, que detecta selectivamente el producto específico del anión superóxido 2-hidroxi-etidio (2OH-Et+) (Figura 2).
    NOTA: La fijación con paraformaldehído y el almacenamiento de muestras a largo plazo no son aconsejables.

2. Método 2: Detección de aniones superóxido mediante DHE mediante imágenes de fluorescencia de una sola plaqueta

  1. El día del experimento, cubra un portaobjetos de μ de 8 pocillos con 0,1 mg/ml de colágeno fibrilar I de tendones equinos (colágeno Horm), 0,2 mg/ml de fibrinógeno o 1 mg/ml de poli-L-lisina (PLL) en tampón Tyrode modificado durante 2 h a 37 °C.
  2. Lavar dos veces con tampón Tyrode modificado (10 min cada uno).
  3. Enfriar la adherencia inespecífica mediante incubación en tampón Tyrode modificado más 5 mg/mL de albúmina sérica bovina (BSA) durante un mínimo de 30 min (o hasta el experimento).
  4. Precalentar (37 °C) la solución de citrato de sodio (4% p/v) y utilizarla como anticoagulante añadiéndola directamente a la sangre en el momento de la venopunción en una proporción de 1:7 (0,5% p/v final).
  5. Extracción de sangre humana periférica de voluntarios sanos mediante venopunción de venopunción de venopunción cubital mediana.
  6. Obtener plasma rico en plaquetas (PRP) a partir de sangre total mediante una etapa inicial de centrifugación a 200 x g durante 20 min.
  7. Centrifugar PRP a 500 x g durante 10 min con los inhibidores plaquetarios reversibles indometacina (10 μM) y PGE1 (40 ng/mL).
  8. Vuelva a suspender el gránulo de plaquetas resultante en un tampón Tyrode modificado (145 mM de NaCl, 2,9 mM de KCl, 10 mM de HEPES, 1 mM de MgCl2, 5 mM de glucosa, pH 7,3) (37 °C) a una densidad de 4 x 107 plaquetas/mL.
  9. Después del aislamiento, descanse las plaquetas durante 30 min a 37 °C.
  10. Prepare DHE en dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración de stock de 10 mM.
  11. Añadir DHE a una concentración final de 10 μM a la suspensión de plaquetas (diluir la solución madre de 1 a 1.000, con una concentración final de DMSO del 0,1% v/v) e incubar durante 1 min (37 °C).
  12. Después de 1 minuto de incubación con DHE, retire la solución de bloqueo de los pocillos elegidos, coloque el portaobjetos de μ en la platina del microscopio listo para la obtención de imágenes y dispense suavemente las plaquetas.
  13. Monitorice la conversión de DHE a 2OH-Et+ mediante imágenes confocales invertidas durante 10 minutos (405/580 nm ex/em), con imágenes recogidas cada 10 s con una lente de inmersión en aceite de 40x.
  14. (OPCIONAL) En el caso de pocillos recubiertos con PLL, se monitoriza la generación de aniones superóxido en respuesta a un agonista soluble (por ejemplo, 0,1 unidades/ml de trombina o 3 μg/ml de colágeno) añadiendo el agonista 10 minutos después de la dispensación de plaquetas y la recogida de imágenes de fluorescencia durante otros 10 minutos, como se describe en el paso 2.13.
  15. (OPCIONAL) Si es necesario, agregue eliminadores de aniones de superóxido o inhibidores selectivos (por ejemplo, inhibidor de NOX) dispensando suavemente al costado del pocillo durante el curso del tiempo y recoja imágenes de fluorescencia como se describe en 2.13 durante 10 minutos más.
  16. Cuantifique el análisis de fluorescencia de una sola célula seleccionando la región de interés (ROI) que contiene plaquetas individuales representativas y analizando la intensidad de fluorescencia en diferentes fotogramas con la herramienta Medir del conjunto de imágenes ImageJ 1.53t.

3. Método 3: Detección de aniones superóxido por plaquetas mediante resonancia paramagnética electrónica (EPR)

  1. Precalentar (37 °C) la solución de citrato de sodio (4% p/v) y utilizarla como anticoagulante añadiéndola directamente a la sangre en el momento de la venopunción en una proporción de 1:7 (0,5% p/v final).
  2. Extracción de sangre humana periférica de voluntarios sanos mediante venopunción de venopunción de venopunción cubital mediana.
  3. Obtener plasma rico en plaquetas (PRP) a partir de sangre total mediante una etapa inicial de centrifugación a 200 x g durante 20 min.
  4. Centrifugar PRP a 500 x g durante 10 min con los inhibidores plaquetarios reversibles indometacina (10 μM) y PGE1 (40 ng/mL).
  5. Vuelva a suspender el pellet de plaquetas resultante en un tampón Tyrode modificado (145 mM de NaCl, 2,9 mM de KCl, 10 mM de HEPES, 1 mM de MgCl2, 5 mM de glucosa, pH 7,3) (37 °C) a una densidad de 2 x 108 plaquetas/mL.
  6. Después del aislamiento, descanse las plaquetas durante 30 min a 37 °C.
  7. Añadir 5 μM de dietilditiocarbamato (DETC) y 25 μM de deferoxamina a la suspensión plaquetaria.
  8. Sin incubación, añadir 200 μM de 1-hidroxi-3-metoxicarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina (CMH).
  9. Cargue muestras en el agregador dentro de cubetas de agregación (incluidos los imanes de agitación recubiertos de teflón).
  10. Después de 1 min, agregue los estímulos a la concentración deseada (por ejemplo, 1 unidad/ml de trombina o 3 μg/ml de colágeno). Incubar durante 10 min.
  11. (OPCIONAL) Obtenga la generación de aniones superóxido en diferentes puntos de tiempo procediendo al paso 3.12 en el momento deseado.
  12. Transfiera la suspensión de plaquetas de la cubeta de agregación a un tubo de microcentrífuga y gire rápidamente a 6.000 x g durante 10 s.
  13. Cargue 50 μL del sobrenadante en micropipetas capilares y selle con cera de sellado EPR.
  14. Transfiera las muestras al escáner EPR.
  15. Configure el escáner EPR de la siguiente manera: campo central 3.492,5 G, barrido de campo 60 G, amplitud de modulación 2 G, tiempo de barrido 10 s, número de exploraciones 10, frecuencia de microondas 9,39 GHz, potencia de microondas 20 mW, tiempo de conversión 327,68 ms, constante de tiempo 5242,88 ms.
  16. Estime la oxidación de CMH a CM● como el área bajo la curva (AUC) de los picos de EPR registrados utilizando los parámetros anteriores.
  17. Construya una curva de calibración que trace la intensidad de EPR medida como se describe en el paso 3.16 en el eje y y las concentraciones del CM● disponible comercialmente en el eje x (por ejemplo, 0, 0,3, 1, 3, 10 y 30 μM).
  18. A partir de la concentración de CM● en las muestras, obtenga la cantidad de anión superóxido generado por las plaquetas en las muestras utilizando las fórmulas descritas en la sección Resultados representativos.

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Resultados

Para la detección por citometría de flujo de fluorescencia de DHE, mostramos resultados representativos de las plaquetas en reposo (Figura 3A) o estimuladas con 0,1 unidades/mL de trombina (Figura 3B). La salida deO2•- se cuantificó como intensidad de fluorescencia media plaquetaria (MFI), como se muestra para la estimulación con 0,1 unidades/mL de trombina (Figura 3C) o 3 μg/mL de péptido relacionad...

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Discusión

En este manuscrito, presentamos tres técnicas diferentes con el potencial de avanzar en la capacidad de investigar la regulación dependiente de redox de la función plaquetaria a través de la detección selectiva deO2•-. Los dos primeros métodos son una mejora con respecto a las técnicas existentes debido a la sonda redox utilizada (DHE en lugar del más común pero menos confiable DCFDA). Por lo tanto, estas técnicas son de fácil acceso, y la mayoría de los ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la Fundación Británica del Corazón (PG/15/40/31522), Alzheimer Research UK (ARUK-PG2017A-3) y el Consejo Europeo de Investigación (#10102507) a G. Pula.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1-hidroxi-3-metoxicarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina (CMH)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-02.1-50mgReactivo para EPR (sonda de espín)
BD FACSAria IIIBD Biosciences NACitómetro de flujo
Albúmina sérica bovinaMerck/SigmaA7030Para μ-recubrimiento deslizante
Bruker E-scan M (Noxyscan)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH  NOX-E.11-BES Espectrómetro EPR
Catalase– polietilenglicol (PEG-Cat.)Merck/SigmaC4963Eliminador de peróxido de hidrógeno (control de especificidad)
ChronoLog Model 490+4Labmedics/ChronologNAAggregometer
CM radicalNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-20.1-100mg Reactivo para EPR (control de calibración)
deferoxamina Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-09.1-100mg Reactivo para EPR
dietilditiocarbamato (DETC) Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-10.1-1g Reactivo para EPR
DihidroetidioThermo Fisher ScientificsD11347Sonda de anión superóxido
Dimetilsulfóxido Merck/Sigma34869Para la preparación de soluciones madre 
Placas de cera de sellado EPR NoxygenScience trasfer and Diagnostics GmbHNOX-A.3-VPMConsumible para agua de
grado EPRNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-07.7.1-0.5L Reactivo para EPR
Fibrinógeno de plasma humanoMerck/SigmaF4883Para recubrimiento de portaobjetos
FITC anti-humano Anticuerpo CD41BioLegend303704Tinción específica de plaquetas para citometría de
flujo Cubetas de vidrio Labmedics/ChronologN/P 312Consumible para incubación en aggregómetro
Horm CollagenLabmedics/ChronologN/P 385Para la estimulación plaquetaria
ImageJ Institutos Nacionales de Salud (NIH)NAImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
IndometacinaMerck/SigmaI7378Para el aislamiento de plaquetas
Micropipetas DURAN 50µ lNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-G.6.1-50µ LConsumible para EPR
Clorhidrato de poli-L-lisinaMerck/SigmaP2658Para recubrimiento de deslizamiento μ-
Prostaglandina E1 (PGE1)Merck/SigmaP5515Para el aislamiento de plaquetas
Citrato de sodio (solución al 4% p/v)Merck/SigmaS5770Para el aislamiento de plaquetas
Barras de agitación (recubiertas de teflón)Labmedics/ChronologP/N 313Consumible para incubación en aggregómetro
Superóxido dismutasa– polietilenglicol (PEG-SOD)Merck/SigmaS9549Eliminador de aniones superóxido (control de especificidad)
Trombina de plasma humanoMerck/SigmaT6884Para la estimulación plaquetaria y el recubrimiento de portaobjetos VAS2870
Enzo Life ScienceBML-EI395Inhibidor de NOX
Microscopio confocal Zeiss 510 LSMMicroscopio confocalZeissNA

Referencias

  1. Vara, D., Cifuentes-Pagano, E., Pagano, P. J., Pula, G. A novel combinatorial technique for simultaneous quantification of oxygen radicals and aggregation reveals unexpected redox patterns in the activation of platelets by different physiopathological stimuli. Haematologica. 104 (9), 1879-1891 (2019).
  2. Fridovich, I. Superoxide radical: An endogenous toxicant. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 239-257 (1983).
  3. Keele, B. B., Mccord, J. M., Fridovich, I. Superoxide dismutase from Escherichia coli B. A new manganese-containing enzyme. J Biol Chem. 245 (22), 6176-6181 (1970).
  4. Berry, C. E., Hare, J. M. Xanthine oxidoreductase and cardiovascular disease: Molecular mechanisms and pathophysiological implications. J Physiol. 555, Pt 3 589-606 (2004).
  5. Kim, C., Kim, J. Y., Kim, J. H. Cytosolic phospholipase a(2), lipoxygenase metabolites, and reactive oxygen species. BMB Rep. 41 (2), 555-559 (2008).
  6. Armstead, W. M., Mirro, R., Busija, D. W., Leffler, C. W. Postischemic generation of superoxide anion by newborn pig brain. Am J Physiol. 255 (2), Pt 2 H401-H403 (1988).
  7. Mayer, B., et al. Nitric oxide synthase-catalyzed activation of oxygen and reduction of cytochromes: Reaction mechanisms and possible physiological implications. J Cardiovasc Pharmacol. 20, Suppl 12 S54-S56 (1992).
  8. Du, G., Mouithys-Mickalad, A., Sluse, F. E. Generation of superoxide anion by mitochondria and impairment of their functions during anoxia and reoxygenation in vitro. Free Radic Biol Med. 25 (9), 1066-1074 (1998).
  9. Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, Pt 2 335-344 (2003).
  10. Jiang, F., Zhang, Y., Dusting, G. J. Nadph oxidase-mediated redox signaling: Roles in cellular stress response, stress tolerance, and tissue repair. Pharmacol Rev. 63 (1), 218-242 (2011).
  11. Wang, Z., et al. The role of mitochondria-derived reactive oxygen species in hyperthermia-induced platelet apoptosis. PLoS One. 8 (9), e75044(2013).
  12. Wachowicz, B., Olas, B., Zbikowska, H. M., Buczynski, A. Generation of reactive oxygen species in blood platelets. Platelets. 13 (3), 175-182 (2002).
  13. Vara, D., et al. Nadph oxidases are required for full platelet activation in vitro and thrombosis in vivo but dispensable for plasma coagulation and hemostasis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 41 (2), 683-697 (2021).
  14. Violi, F., Pignatelli, P. Platelet nox, a novel target for anti-thrombotic treatment. Thromb Haemost. 111 (5), 817-823 (2014).
  15. Begonja, A. J., et al. Platelet NAD(P)H-oxidase-generated ros production regulates alphaiibbeta3-integrin activation independent of the NO/CGMP pathway. Blood. 106 (8), 2757-2760 (2005).
  16. Vara, D. S., et al. Autocrine amplification of integrin αIIbβ3 activation and platelet adhesive responses by deoxyribose-1-phosphate. Thromb Haemost. 109 (6), 1108-1119 (2013).
  17. Essex, D. W. The role of thiols and disulfides in platelet function. Antioxid Redox Signal. 6 (4), 736-746 (2004).
  18. Arthur, J. F., et al. Ligand binding rapidly induces disulfide-dependent dimerization of glycoprotein vi on the platelet plasma membrane. J Biol Chem. 282 (42), 30434-30441 (2007).
  19. Arthur, J. F., Gardiner, E. E., Kenny, D., Andrews, R. K., Berndt, M. C. Platelet receptor redox regulation. Platelets. 19 (1), 1-8 (2008).
  20. Kim, K., Li, J., Tseng, A., Andrews, R. K., Cho, J. Nox2 is critical for heterotypic neutrophil-platelet interactions during vascular inflammation. Blood. 126 (16), 1952-1964 (2015).
  21. Hosseini, E., Solouki, A., Roudsari, Z. O., Kargar, F., Ghasemzadeh, M. Reducing state attenuates ectodomain shedding of GPVI while restoring adhesion capacities of stored platelets: Evidence addressing the controversy around the effects of redox condition on thrombosis. J Thromb Thrombolysis. 50 (1), 123-134 (2020).
  22. Jang, J. Y., et al. Reactive oxygen species play a critical role in collagen-induced platelet activation via SHP-2 oxidation. Antioxid Redox Signal. 20 (16), 2528-2540 (2014).
  23. Beckman, J. S., Koppenol, W. H. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite: The good, the bad, and ugly. Am J Physiol. 271 (5), Pt 1 C1424-C1437 (1996).
  24. Koppenol, W. H., Kissner, R., Beckman, J. S. Syntheses of peroxynitrite: To go with the flow or on solid grounds. Methods Enzymol. 269, 296-302 (1996).
  25. Cammisotto, V., et al. Nox2-mediated platelet activation by glycoprotein (GP) VI: Effect of rivaroxaban alone and in combination with aspirin. Biochem Pharmacol. 163, 111-118 (2019).
  26. Yang, M., et al. Platelet CD36 promotes thrombosis by activating redox sensor ERK5 in hyperlipidemic conditions. Blood. 129 (21), 2917-2927 (2017).
  27. Yang, M., et al. Platelet CD36 signaling through ERK5 promotes caspase-dependent procoagulant activity and fibrin deposition in vivo. Blood Adv. 2 (21), 2848-2861 (2018).
  28. Freedman, J. E. Oxidative stress and platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (3), s11-s16 (2008).
  29. Masselli, E., et al. ROS in platelet biology: Functional aspects and methodological insights. Int J Mol Sci. 21 (14), 4866(2020).
  30. Madamanchi, N. R., Vendrov, A., Runge, M. S. Oxidative stress and vascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (1), 29-38 (2005).
  31. Riemersma, R. A., et al. Risk of angina pectoris and plasma concentrations of vitamins a, c, and e and carotene. Lancet. 337 (8732), 1-5 (1991).
  32. Rimm, E. B., et al. Vitamin E consumption and the risk of coronary heart disease in men. N Engl J Med. 328 (20), 1450-1456 (1993).
  33. Zhang, W., Zheng, Y., Yan, F., Dong, M., Ren, Y. Research progress of quercetin in cardiovascular disease. Front Cardiovasc Med. 10, 1203713(2023).
  34. Russell, C., Keshavamurthy, S., Saha, S. Nutraceuticals in the management of cardiovascular risk factors: Where is the evidence. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 21 (3), 150-161 (2021).
  35. Rotariu, D., et al. Oxidative stress - complex pathological issues concerning the hallmark of cardiovascular and metabolic disorders. Biomed Pharmacother. 152, 113238(2022).
  36. Hosseini, E., Ghasemzadeh, M., Atashibarg, M., Haghshenas, M. R. O. S. scavenger, n-acetyl-l-cysteine and NOX specific inhibitor, VAS2870 reduce platelets apoptosis while enhancing their viability during storage. Transfusion. 59 (4), 1333-1343 (2019).
  37. Hosseini, E., Nodeh, F. K., Ghasemzadeh, M. Gamma irradiation induces a pro-apoptotic state in longer stored platelets, without progressing to an overt apoptosis by day 7 of storage. Apoptosis. 28 (7-8), 1141-1153 (2023).
  38. Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: A scientific statement from the American heart association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
  39. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
  40. Hempel, S. L., Buettner, G. R., O'malley, Y. Q., Wessels, D. A., Flaherty, D. M. Dihydrofluorescein diacetate is superior for detecting intracellular oxidants: Comparison with 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, 5(and 6)-carboxy-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, and dihydrorhodamine 123. Free Radic Biol Med. 27 (1-2), 146-159 (1999).
  41. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: Challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
  42. Burkitt, M. J., Wardman, P. Cytochrome c is a potent catalyst of dichlorofluorescin oxidation: Implications for the role of reactive oxygen species in apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 282 (1), 329-333 (2001).
  43. Rota, C., Fann, Y. C., Mason, R. P. Phenoxyl free radical formation during the oxidation of the fluorescent dye 2',7'-dichlorofluorescein by horseradish peroxidase. Possible consequences for oxidative stress measurements. J Biol Chem. 274 (40), 28161-28168 (1999).
  44. Rota, C., Chignell, C. F., Mason, R. P. Evidence for free radical formation during the oxidation of 2'-7'-dichlorofluorescin to the fluorescent dye 2'-7'-dichlorofluorescein by horseradish peroxidase: Possible implications for oxidative stress measurements. Free Radic Biol Med. 27 (7-8), 873-881 (1999).
  45. Rodig, S. J. Attaching suspension cells to slides for staining. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (12), (2020).
  46. Abubaker, A. A., Vara, D., Eggleston, I., Canobbio, I., Pula, G. A novel flow cytometry assay using dihydroethidium as redox-sensitive probe reveals NADPH oxidase-dependent generation of superoxide anion in human platelets exposed to amyloid peptide beta. Platelets. 30 (2), 181-189 (2019).
  47. Gaspar, R. S., et al. Protein disulphide isomerase and NADPH oxidase 1 cooperate to control platelet function and are associated with cardiometabolic disease risk factors. Antioxidants (Basel). 10 (3), 497(2021).
  48. Gaspar, R. S., Ferreira, P. M., Mitchell, J. L., Pula, G., Gibbins, J. M. Platelet-derived extracellular vesicles express NADPH oxidase-1 (NOX-1), generate superoxide and modulate platelet function. Free Radic Biol Med. 165, 395-400 (2021).
  49. Vara, D., et al. NADPH oxidase 1 is a novel pharmacological target for the development of an antiplatelet drug without bleeding side effects. FASEB J. 34 (10), 13959-13977 (2020).
  50. Lopes-Pires, M. E., et al. Zinc regulates reactive oxygen species generation in platelets. Platelets. 32 (3), 368-377 (2021).
  51. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and mitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: Another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).
  52. Linden, M. D. Platelet flow cytometry. Methods Mol Biol. 992, 241-262 (2013).
  53. Kauffman, M. E., et al. MitoSOX-based flow cytometry for detecting mitochondrial ROS. React Oxyg Species (Apex). 2 (5), 361-370 (2016).
  54. Sonkar, V. K., et al. NOX2 NADPH oxidase is dispensable for platelet activation or arterial thrombosis in mice. Blood Adv. 3 (8), 1272-1284 (2019).
  55. Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radic Res. 45 (4), 417-430 (2011).
  56. Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).

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