Artículo de método

Registro de bases: una técnica para analizar las respuestas de las neuronas gustativas en Drosophila

DOI:

10.3791/66665

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1 de marzo de 2024

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, Yale University, 2Department of Entomology, The Connecticut Agricultural Experiment Station

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un método de registro electrofisiológico poco utilizado, el registro de base, permite el análisis de las características de la codificación del gusto que no pueden ser examinadas por los métodos convencionales de registro. El registro de la base también permite el análisis de las respuestas gustativas a estímulos hidrofóbicos que no pueden estudiarse con los métodos electrofisiológicos tradicionales.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los insectos saborean el mundo exterior a través de pelos gustativos, o sensilla, que tienen poros en sus puntas. Cuando un sensillum entra en contacto con una fuente potencial de alimento, los compuestos de la fuente de alimento entran a través del poro y activan las neuronas internas. Durante más de 50 años, estas respuestas se han registrado utilizando una técnica llamada registro de propinas. Sin embargo, este método tiene limitaciones importantes, incluida la incapacidad de medir la actividad neuronal antes o después del contacto con el estímulo y el requisito de que los saborantes sean solubles en soluciones acuosas. Describimos aquí una técnica que denominamos grabación base, que supera estas limitaciones. El registro de bases permite medir la actividad de las neuronas gustativas antes, durante y después del estímulo. Por lo tanto, permite un análisis exhaustivo de las respuestas OFF que ocurren después de un estímulo gustativo. Se puede utilizar para estudiar compuestos hidrofóbicos como las feromonas de cadena larga que tienen una solubilidad muy baja en agua. En resumen, el registro de bases ofrece las ventajas de la electrofisiología de un solo sensillum como medio para medir la actividad neuronal (alta resolución espacial y temporal, sin necesidad de herramientas genéticas) y supera las limitaciones clave de la técnica tradicional de registro de puntas.

Introducción

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Los insectos, incluidas las moscas drosófilas, están dotados de un sofisticado sistema de sabor que les permite extraer información química compleja de su entorno. Este sistema les permite discernir la composición química de diversas sustancias, distinguiendo entre las que son nutritivas y las que son dañinas 1,2.

En el núcleo de este sistema se encuentran estructuras especializadas conocidas como pelos gustativos o sensilla, ubicadas estratégicamente en varias partes del cuerpo. En las moscas drosófilas, estas sensilas se encuentran en el labelo, que es el principal órgano gustativo de la cabeza de la mosca 1,2,3,4, así como en las patas y alas 1,2,5,6. El labelo se encuentra en la punta de la probóscide y contiene dos lóbulos 4,7,8. Cada lóbulo está cubierto con 31 sensillas gustativas categorizadas como cortas, largas e intermedias 4,7,8. Cada uno de estos sensilla alberga de 2 a 4 neuronas gustativas 1,2,9,10. Estas neuronas gustativas expresan miembros de al menos cuatro familias de genes diferentes, a saber, los genes receptor gustativo (Gr), receptor ionotrópico (Ir), carterista (Ppk) y receptor de potencial transitorio (Trp) 1,2,11,12,13. Esta diversidad de receptores y canales dota a los insectos de la capacidad de reconocer una amplia gama de compuestos químicos, incluyendo tanto las señales no volátiles como las volátiles 1,2,14.

Durante más de 50 años, los científicos han cuantificado la respuesta de las neuronas gustativas y sus receptores utilizando una técnica llamada registro de puntas 3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,
29,30,31,32,33,34,35. Sin embargo, este método tiene importantes limitaciones. En primer lugar, la actividad neuronal sólo puede medirse durante el contacto con el estímulo, y no antes o después del contacto. Esta limitación impide la medición de la actividad de aumento espontáneo e impide la medición de las respuestas OFF. En segundo lugar, solo se pueden probar los saborizantes que son solubles en soluciones acuosas.

Estas limitaciones pueden superarse mediante una técnica electrofisiológica alternativa poco utilizada llamada "registro base". Aquí describimos esta técnica, que hemos adaptado de un método utilizado por Marion-Poll y sus colegas24, y mostramos las características cruciales de codificación del sabor que ahora puede medir convenientemente14.

Protocolo

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El siguiente protocolo cumple con todas las pautas de cuidado animal de la Universidad de Yale.

1. Moscas

  1. Colocar de 10 a 15 moscas recién emergidas en viales de cultivo estándar frescos a 25 °C y 60% de humedad relativa en un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h.
  2. Use moscas cuando tenga de 3 a 7 días de edad.

2. Estímulos quimiosensoriales

  1. Obtener estímulos quimiosensoriales de la más alta pureza disponible. Guárdelos según lo recomendado por el proveedor hasta su uso.
  2. Disuelva los estímulos quimiosensoriales y diluya hasta las concentraciones deseadas en agua u otro solvente no tóxico deseado, como el aceite de parafina. Agitar las soluciones preparadas durante un mínimo de 1 h en el caso de compuestos sólidos disueltos.

3. Estímulo de vidrio capilar

  1. Tire de un capilar de vidrio para contener el estímulo de un capilar de vidrio de borosilicato (100 mm de longitud, 1 mm de diámetro exterior, 0,58 mm de diámetro interior) utilizando un instrumento extractor de pipetas. Trate de lograr un diámetro de punta entre 3 μm y 10 μm.
  2. Llene el capilar de vidrio con la solución de estímulo preferida utilizando la punta de una pipeta con microcargador. Tenga cuidado de evitar las burbujas, que se pueden eliminar con un suave golpecito.
  3. Si el estímulo se cristaliza en la punta, limpie o reemplace el capilar de estímulo de vidrio.

4. Electrodos de referencia y registro

  1. Utilice varillas de tungsteno (127 μm de diámetro y 76,2 mm de longitud) para los electrodos de referencia y de registro. Afile los electrodos de referencia y de registro hasta aproximadamente 1 μm de diámetro en la punta (las formas de estos electrodos se describen en Delventhal et al.36) sumergiéndolos repetidamente durante varios segundos en una solución de KNO3 al 10% (~1 M) o en una solución de KOH al 10% (1,8 M).
    NOTA: Esta solución requiere corriente (0,3-3 mA) para facilitar este proceso.

5. Preparación de la mosca para el registro de la base

  1. Extraiga una sola mosca del vial y conéctela a un aspirador. Retire el aspirador y atrape al animal colocando un dedo sobre el extremo.
  2. Expulse la mosca en una punta de pipeta de plástico de 200 μL. Manteniendo el extremo del aspirador en la punta de la pipeta, utilice el extremo para empujar la mosca hacia adelante, de cabeza, hacia el extremo estrecho de la punta de la pipeta.
  3. Recorte la punta de la pipeta en cada extremo (es decir, anterior y posterior al animal) con una cuchilla de afeitar.
  4. Use arcilla o un pequeño trozo de algodón para empujar la mosca hacia adelante, hasta que la mitad de la cabeza sobresalga del extremo de la punta de la pipeta recortada. Use fórceps para empujar suavemente hasta que el labelo en la parte delantera de la cabeza quede expuesto.
  5. Fije la punta de pipeta recortada en un portaobjetos de vidrio para microscopio con arcilla (Figura 1).
  6. Bajo el microscopio estereoscópico, coloque el labelo lateralmente en un cubreobjetos de modo que un lóbulo, junto con sus 31 sensilas gustativas, quede expuesto (Figura 1). El cubreobjetos mantiene el labelo en su lugar.

6. Equipo de electrofisiología

  1. Seleccione una habitación para la instalación del equipo que tenga una temperatura y humedad relativa estables (<70%) y que esté aislada de fuentes de ruido eléctrico y mecánico, como refrigeradores y centrífugas.
  2. Coloque el microscopio en el centro de una mesa antivibratoria.
  3. Fije un micromanipulador manual a la mesa antivibratoria (Figura 2).
  4. Conecte un eje de acero inoxidable que sostiene el electrodo de referencia de tungsteno al micromanipulador manual (Figura 2).
  5. Conecte los manipuladores motorizados, uno con un soporte para la sonda del electrodo registrador y un segundo con un soporte conectado a un eje de acero inoxidable para el capilar de estímulo de vidrio, a la misma mesa mediante soportes (Figura 2).
  6. Conecte la sonda del electrodo registrador a un sistema de controlador inteligente de adquisición de datos (IDAC) u otro sistema amplificador/digitalizador.
  7. Conecte este sistema IDAC al ordenador de la estación de trabajo.
  8. Conecte los manipuladores manuales y motorizados a la misma ubicación dentro de la plataforma.
  9. Instale el software de adquisición adecuado para el sistema IDAC en el equipo. Asegúrese de que los controladores de adquisición digital sean compatibles con el sistema operativo (por ejemplo, Windows XP-7, -8 o -10) del equipo.

7. Grabación de la sensilla del gusto

  1. Coloque el portaobjetos de preparación en la platina del microscopio con un objetivo de bajo aumento (por ejemplo, 10x) en posición. Mueva la platina hasta que el labelo esté enfocado en el centro del campo de visión tanto en objetivos de baja ampliación como de gran aumento (por ejemplo, 50x).
  2. Inserte el electrodo de referencia en el ojo utilizando el objetivo de aumento bajo. Para insertar el electrodo de referencia, apunte el ojo en el lado de la mosca opuesto al lado con el electrodo de registro, por ejemplo, si el electrodo de registro se acerca desde la derecha, coloque el electrodo de referencia en el ojo izquierdo. Utilice un micromanipulador manual para una inserción precisa.
  3. Coloque la punta del capilar de estímulo de vidrio en el centro del campo de visión de los objetivos de bajo y alto aumento utilizando un micromanipulador motorizado (Figura 3).
  4. Con un aumento bajo, acerque el electrodo de registro al labelo utilizando un segundo micromanipulador motorizado.
  5. Con un gran aumento, inserte el electrodo de registro en la base de un sensor de sabor utilizando el micromanipulador motorizado hasta que se escuche el sonido de la actividad de disparo neuronal de la salida de audio del sistema IDAC.
  6. Una vez que se haya establecido una señal estable, comience a grabar la señal utilizando el software que viene con el sistema IDAC (Figura 4A-D). Para comenzar a grabar, presione el botón Iniciar grabación.
  7. Lleve la punta del capilar del vidrio estimulante para cubrir la punta del sensillum del gusto utilizando el manipulador motorizado.
  8. Para finalizar el estímulo, retire el capilar de estímulo de vidrio del sensillum utilizando el manipulador motorizado.
  9. Marque el inicio y el final de la estimulación manualmente con un pedal. El pedal está conectado al IDAC, y su comunicación con el software se facilita a través del IDAC para marcar el inicio/fin del estímulo.

8. Análisis

  1. Utilice las diferentes funciones del software que viene con el sistema IDAC para clasificar las poblaciones de picos por amplitud (cuando sea posible) y analizar la dinámica de respuesta.
    1. Para contar los picos, haga clic con el botón izquierdo en el registro de interés, mostrando una ventana para seleccionar. Elija A picos, iniciando otra ventana denominada Convertir ondas en picos. Introduzca un nombre en el campo Nuevo y pulse el botón Aceptar .
    2. Al introducir el nombre en el campo Nuevo en el paso 8.1.1, se accede a la vista Histograma de amplitud . Elija la amplitud que desea contar y, a continuación, cierre esta vista. Haga clic con el botón izquierdo para agregar un contador.
    3. Examine los picos manualmente para confirmar las conclusiones basadas en el análisis con software.
      NOTA: El software también permite la exportación de datos en diferentes formatos para su posterior análisis.

Resultados

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La figura 4A muestra picos espontáneos que surgen de un sensillum. Se dividen en dos clases según la amplitud, con los picos más grandes que se derivan de la neurona que es sensible a los compuestos amargos y los picos más pequeños de la neurona que responde a los azúcares. La relación entre la amplitud de la espícula y la especificidad funcional ha sido corroborada por experimentos genéticos 4,14,37,38,39 .

La figura 4B muestra la respuesta de la neurona sensible al amargo del sensillum S5 al olor del DEET; esta respuesta se produjo sin ningún contacto entre la solución de DEET y el sensillum. Un pico parece ser de amplitud intermedia y puede ser el resultado de la superposición de dos picos más pequeños, uno de la neurona del azúcar y otro de la neurona mecanosensorial.

La figura 4C muestra la respuesta ON que se produce tras el contacto entre un estímulo amargo y el sensilum I1, seguida de una respuesta OFF que se produce tras la terminación del contacto. No es que la magnitud de la respuesta OFF, medida en picos/s, sea mayor que la respuesta ON.

La Figura 4D muestra una respuesta ON y OFF al compuesto amargo berberina de un sensillum I1 de otra especie de mosca, Drosophila virilis. Una de las ventajas de esta técnica es que se puede realizar sobre otras especies, incluidos los mosquitos, sin necesidad de introducir ningún transgén en ellos.

La Figura 4E ilustra dos problemas que pueden ocurrir durante la grabación. En primer lugar, si el labelo no está bien asegurado, puede moverse, produciendo picos de la neurona mecanosensorial del sensillum. En segundo lugar, el electrodo registrador puede desprenderse del sensillum, a menudo como resultado del movimiento del labelo. En este caso, se pierde el contacto y se debe volver a insertar el electrodo para registrar los picos.

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Figura 1: Preparación de la mosca para el registro de la base. Una punta de pipeta recortada que contiene una mosca hembra con el labelo colocado de forma segura en un cubreobjetos de vidrio. (A) Tanto la punta de la pipeta como el cubreobjetos se sujetan de forma segura sobre montículos de arcilla. (B) Mayor aumento del labelo que descansa sobre un cubreobjetos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Configuración del equipo de electrofisiología. (A) Una descripción general que muestra las posiciones de un micromanipulador manual para el electrodo de referencia, un micromanipulador motorizado para el capilar de estímulo de vidrio y un micromanipulador motorizado para el electrodo de registro. (B) Vista general que muestra los soportes para el electrodo de referencia, el capilar de estímulo de vidrio y el electrodo de registro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: El labelo y la sensilla. (A) El labelo bajo un microscopio invertido. Primer plano del labelo que muestra la sensibilidad gustativa de un lóbulo del labelo. También muestra el capilar de vidrio estímulo cerca de uno de los grandes sensillos conocido como L2 (Large type 2) y un electrodo de registro en la base de este sensillum. (B) Accesibilidad de la sensilla labelar. El labelo muestra sensillas que son fácilmente accesibles para la base de grabación y sensillas que son menos accesibles debido a su posición en la preparación que generalmente utilizamos. Abreviaturas: A = anterior; M = medial; P = posterior; L = lateral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Ejemplo de rastros de picos espontáneos, respuestas de neuronas amargas y registro subóptimo. (A) Ejemplo de rastro de picos espontáneos. Los picos provienen de una neurona sensible al amargo (puntos rojos) y una neurona sensible al azúcar (puntos verdes) en un sensilum I1. En el dibujo del sensillum, las neuronas amargas, azucaradas y mecanosensoriales están coloreadas de rojo, verde y negro, respectivamente. (B) Ejemplo de traza de la respuesta de la neurona amarga (puntos rojos) en un sensillum S5 al vapor de 1 mM de DEET. Tenga en cuenta que los pequeños picos de amplitud son de la neurona de azúcar y las neuronas mecanosensoriales, que en este ejemplo son difíciles de distinguir por su amplitud. Abreviatura: DEET = N,N-dietil-meta-toluamida. (C) Ejemplo de rastro de respuestas ON y OFF de una neurona amarga en I1 sensilla a 1 mM de benzoato de denatonio. Los picos se observan antes (disparo espontáneo), durante (respuesta ON) y después (respuesta OFF) del contacto con el estímulo. Abreviatura: DEN = benzoato de denatonio. (D) Ejemplo de traza de respuestas ON y OFF de una neurona amarga en la sensilla I1 de D. virilis a 0,5 mM de cloruro de berberina. Los picos se observan antes, durante y después del contacto. Abreviatura: BER = cloruro de berberina. (E) Ejemplo de rastro de una grabación subóptima. El contacto se perdió en medio del experimento debido al movimiento del labelo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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En las grabaciones de algunos tipos de sensilla, puede ser difícil diferenciar los picos de las diferentes neuronas. Por ejemplo, las neuronas de azúcar y las neuronas mecanosensoriales de las sensillas S e I producen picos de amplitudes similares, lo que dificulta su distinción 4,14. Encontramos que el uso de un electrodo registrador de tungsteno muy afilado reduce la activación de la neurona mecanosensorial, al igual que la colocación juiciosa del electrodo registrador. La inserción del electrodo de registro en el collar de la cavidad del sensillum (es decir, en la base pero no profundamente) a menudo resulta en una reducción de la estimulación mecanosensorial. Además, encontramos que si una grabación tiene un alto nivel de disparo de la neurona mecanosensorial, retirar el electrodo de registro y colocarlo en una posición diferente en relación con el sensillo a menudo conduce a un nivel más bajo de disparo.

Garantizar la estabilidad del electrodo de registro a lo largo de los experimentos es otra cuestión crítica (véase la Figura 4E). Las perturbaciones mecánicas o los cambios en la posición del electrodo pueden afectar negativamente a la calidad de las grabaciones. Invertir tiempo y esfuerzo en una preparación minuciosa, como se especifica en el protocolo descrito anteriormente, es clave para prevenir la frustración que puede resultar del movimiento del labelo.

Observamos otro problema que hemos observado con ciertos compuestos que producen respuestas ON y OFF de I sensilla de la clase I-a14. A veces, una segunda entrega de un estímulo provoca la respuesta OFF, pero no la respuesta ON. Se desconoce la razón de esta reducción en la respuesta de ON.

Otro desafío encontrado en la grabación base es que no todas las sensillas son fácilmente accesibles para la grabación debido a su posición en el labelo. De las 31 sensillas labelares, solo 26 son convenientes para registrar, lo que presenta una limitación para la técnica, como se ilustra en la Figura 3B. Sin embargo, en principio, estos sensores (I8, I9, I10, L9 y S10) pueden hacerse accesibles mediante la rotación de la platina mecánica XY del microscopio Olympus.

Por último, hacemos hincapié en la importancia de invertir esfuerzo en la preparación de las moscas. Es mucho más probable que una mosca bien preparada produzca grabaciones fiables y de alta calidad a lo largo del transcurso del experimento. Además, la sacarosa se puede utilizar como control positivo para garantizar la calidad del registro; Provoca una respuesta de todos los Labellar Sensilla.

Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

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Agradecemos a Zina Berman por su apoyo, a Lisa Baik por sus comentarios sobre el manuscrito y a otros miembros del laboratorio Carlson por su discusión. Este trabajo fue apoyado por la subvención K01 de los NIH DC020145 a H.K.M.D; y los NIH otorgan R01 DC02174, R01 DC04729 y R01 DC011697 a J.R.C.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
MicroscopioOlympusBX51WIequipado con un objetivo 50X (LMPLFLN 50X, Olympus) y oculares 10X.
Mesa antivibratoriaTMC63-7590E
Micromanipuladores motorizadosHarvard Apparatus y Mä rzhä usuarioMicromanipuladores Micromanipulador PM 10 Micromanipulador
manual MicromanipuladoresMä rzhä usuario MicromanipuladoresMM33 Micromanipulador
Soportes magnéticosENCOModelo #625-0930
Referencia  y registro PortaelectrodosOckenfels Syntech GmbH
Soporte capilar de vidrio de estímuloOckenfels Syntech GmbH
Sonda universal de un solo extremoOckenfels Syntech GmbH
CONTROLADOR DE ADQUISICIÓN USB DE 4 CANALES, IDAC-4Ockenfels Syntech GmbH
Controladores de estímuloOckenfels Syntech GmbHControlador de estímulo CS 55
Computadora personalDellVostroVerifique la compatibilidad con el sistema de adquisición digital y el software
Tungsten RodA-M SystemsCat#716000
Papel de aluminio y/o jaula de FaradayBlindaje contra el ruido electromagnético
Capilares de vidrio de borosilicatoWorld Precision Instruments1B100F-4
Extractor de pipetasSutter Instrument CompanyModelo P-97 Tirador de micropipetas Flaming/Brown
Puntas de microcargadores EppendorfE5242956003
1 ml JeringaGenérica
Pinzas
Transformadores de potenciaPRODUCTOS DE ENERGÍA STACOSTACO 3PN221BEnsamblado a partir de puntas de pipeta P1000, tubos de plástico flexibles y malla
Arcilla
Genéricas Genérico
Tubo de plásticoSaint GobainTygon S3™ E-3603
Viales de cultivo estándar ArchonScientificVails estrechos de poliestireno de 1 oz, cada uno con 10 mL de medio de glucosa, precargados con tapones de acetato de celulosa
Cloruro de berberina (BER)Sigma-AldrichCat# Y0001149
Benzoato de denatonio (DEN)Sigma-AldrichCat# D5765
N,N-Dietil-m-toluamida (DEET)Sigma-AldrichCat# 36542
piezoeléctrico Microscopio estereoscópico Olympus VMZ 1x-4x Para la preparación de moscas p200 Puntas de pipeta Genérico de cocodrilo para modelar Pinzas

Referencias

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