Un método de registro electrofisiológico poco utilizado, el registro de base, permite el análisis de las características de la codificación del gusto que no pueden ser examinadas por los métodos convencionales de registro. El registro de la base también permite el análisis de las respuestas gustativas a estímulos hidrofóbicos que no pueden estudiarse con los métodos electrofisiológicos tradicionales.
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Artículo de método
Registro de bases: una técnica para analizar las respuestas de las neuronas gustativas en Drosophila
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Resumen
Resumen
Los insectos saborean el mundo exterior a través de pelos gustativos, o sensilla, que tienen poros en sus puntas. Cuando un sensillum entra en contacto con una fuente potencial de alimento, los compuestos de la fuente de alimento entran a través del poro y activan las neuronas internas. Durante más de 50 años, estas respuestas se han registrado utilizando una técnica llamada registro de propinas. Sin embargo, este método tiene limitaciones importantes, incluida la incapacidad de medir la actividad neuronal antes o después del contacto con el estímulo y el requisito de que los saborantes sean solubles en soluciones acuosas. Describimos aquí una técnica que denominamos grabación base, que supera estas limitaciones. El registro de bases permite medir la actividad de las neuronas gustativas antes, durante y después del estímulo. Por lo tanto, permite un análisis exhaustivo de las respuestas OFF que ocurren después de un estímulo gustativo. Se puede utilizar para estudiar compuestos hidrofóbicos como las feromonas de cadena larga que tienen una solubilidad muy baja en agua. En resumen, el registro de bases ofrece las ventajas de la electrofisiología de un solo sensillum como medio para medir la actividad neuronal (alta resolución espacial y temporal, sin necesidad de herramientas genéticas) y supera las limitaciones clave de la técnica tradicional de registro de puntas.
Introducción
Los insectos, incluidas las moscas drosófilas, están dotados de un sofisticado sistema de sabor que les permite extraer información química compleja de su entorno. Este sistema les permite discernir la composición química de diversas sustancias, distinguiendo entre las que son nutritivas y las que son dañinas 1,2.
En el núcleo de este sistema se encuentran estructuras especializadas conocidas como pelos gustativos o sensilla, ubicadas estratégicamente en varias partes del cuerpo. En las moscas drosófilas, estas sensilas se encuentran en el labelo, que es el principal órgano gustativ....
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Protocolo
El siguiente protocolo cumple con todas las pautas de cuidado animal de la Universidad de Yale.
1. Moscas
- Colocar de 10 a 15 moscas recién emergidas en viales de cultivo estándar frescos a 25 °C y 60% de humedad relativa en un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h.
- Use moscas cuando tenga de 3 a 7 días de edad.
2. Estímulos quimiosensoriales
- Obtener estímulos quimiosensoriales de la más alta pureza disponible. Guárdelos según lo recomendado por el proveedor hasta su uso.
- Disuelva los estímulos quimiosensoriales y diluya hasta las concentr....
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Resultados
La figura 4A muestra picos espontáneos que surgen de un sensillum. Se dividen en dos clases según la amplitud, con los picos más grandes que se derivan de la neurona que es sensible a los compuestos amargos y los picos más pequeños de la neurona que responde a los azúcares. La relación entre la amplitud de la espícula y la especificidad funcional ha sido corroborada por experimentos genéticos 4,14,37,38,39 .
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Discusión
En las grabaciones de algunos tipos de sensilla, puede ser difícil diferenciar los picos de las diferentes neuronas. Por ejemplo, las neuronas de azúcar y las neuronas mecanosensoriales de las sensillas S e I producen picos de amplitudes similares, lo que dificulta su distinción 4,14. Encontramos que el uso de un electrodo registrador de tungsteno muy afilado reduce la activación de la neurona mecanosensorial, al igual que la colocación juiciosa del electrodo reg.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Zina Berman por su apoyo, a Lisa Baik por sus comentarios sobre el manuscrito y a otros miembros del laboratorio Carlson por su discusión. Este trabajo fue apoyado por la subvención K01 de los NIH DC020145 a H.K.M.D; y los NIH otorgan R01 DC02174, R01 DC04729 y R01 DC011697 a J.R.C.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microscopio | Olympus | BX51WI | equipado con un objetivo 50X (LMPLFLN 50X, Olympus) y oculares 10X. |
| Mesa antivibratoria | TMC | 63-7590E | |
| Micromanipuladores motorizados | Harvard Apparatus y Mä rzhä usuario | Micromanipuladores Micromanipulador PM 10 Micromanipulador | |
| manual Micromanipuladores | Mä rzhä usuario Micromanipuladores | MM33 Micromanipulador | |
| Soportes magnéticos | ENCO | Modelo #625-0930 | |
| Referencia y registro Portaelectrodos | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Soporte capilar de vidrio de estímulo | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Sonda universal de un solo extremo | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| CONTROLADOR DE ADQUISICIÓN USB DE 4 CANALES, IDAC-4 | Ockenfels Syntech GmbH | ||
| Controladores de estímulo | Ockenfels Syntech GmbH | Controlador de estímulo CS 55 | |
| Computadora personal | Dell | Vostro | Verifique la compatibilidad con el sistema de adquisición digital y el software |
| Tungsten Rod | A-M Systems | Cat#716000 | |
| Papel de aluminio y/o jaula de Faraday | Blindaje contra el ruido electromagnético | ||
| Capilares de vidrio de borosilicato | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Extractor de pipetas | Sutter Instrument Company | Modelo P-97 Tirador de micropipetas Flaming/Brown | |
| Puntas de microcargadores | Eppendorf | E5242956003 | |
| 1 ml Jeringa | Genérica | ||
| Pinzas | |||
| Transformadores de potencia | PRODUCTOS DE ENERGÍA STACO | STACO 3PN221B | Ensamblado a partir de puntas de pipeta P1000, tubos de plástico flexibles y malla |
| Arcilla | |||
| Genéricas Genérico | |||
| Tubo de plástico | Saint Gobain | Tygon S3™ E-3603 | |
| Viales de cultivo estándar Archon | Scientific | Vails estrechos de poliestireno de 1 oz, cada uno con 10 mL de medio de glucosa, precargados con tapones de acetato de celulosa | |
| Cloruro de berberina (BER) | Sigma-Aldrich | Cat# Y0001149 | |
| Benzoato de denatonio (DEN) | Sigma-Aldrich | Cat# D5765 | |
| N,N-Dietil-m-toluamida (DEET) | Sigma-Aldrich | Cat# 36542 |
Referencias
- Joseph, R. M., Carlson, J. R. Drosophila chemoreceptors: a molecular interface between the chemical world and the brain. Trends Genet. 31 (12), 683-695 (2015).
- Montell, C. Drosophila sensory receptors-a set of molecular Swiss Army Knives. Genetics.
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Reimpresiones y permisos
