El protocolo demuestra un método para recolectar sangre de las venas portas y la vena cava inferior de ratones secuencialmente para evaluar la producción y absorción de metabolitos microbianos intestinales.
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Artículo de método
Extracción secuencial de sangre de la vena cava inferior seguida de la vena porta para evaluar los metabolitos microbianos intestinales en ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
Se sabe que los productos microbianos intestinales actúan tanto localmente dentro del intestino como se absorben en la circulación, donde sus efectos pueden extenderse a numerosos sistemas de órganos distantes. Los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) son una clase de metabolitos producidos por los microbios intestinales durante la fermentación de la fibra dietética no digerible. Ahora se reconoce que contribuyen de manera importante a la forma en que el microbioma intestinal influye en los sistemas de órganos extraintestinales a través del intestino-pulmón, el intestino-cerebro y otros ejes de órganos intestinales en todo el huésped. Los AGCC se absorben desde el colon, a través del tejido intestinal, hasta la vena porta (PV). Luego pasan a través del hígado y se consumen en varios órganos como el cerebro, los músculos, el tejido adiposo y los pulmones. Los AGCC se miden más fácilmente en el material fecal expulsado, sin embargo, se han obtenido mediciones más precisas a partir del contenido fecal intracolónico. Aquí proponemos que el muestreo de PV y plasma circulante sistémico de un solo sujeto puede ser preferible para estudiar la absorción, el transporte y los niveles sistémicos de AGCC en ratones. Presentamos una nueva técnica para la toma eficiente de muestras de sangre de la VP y la vena cava inferior (VCI) que permite la recolección de volúmenes relativamente grandes de sangre de las circulaciones portal y sistémica. Esto se logra mediante la ligadura de la VP, lo que permite la dilatación o el agrandamiento de la VP a medida que se rellena desde las venas mesentéricas que drenan hacia ella. Con este método, pudimos mejorar la tasa de recolección exitosa, así como la cantidad total de sangre recolectada (hasta 0,3 mL de VCI y 0,5 mL de PV).
Introducción
Los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) son una clase importante de metabolitos producidos por la microbiota intestinal. Su papel fundamental en la interacción entre el microbioma intestinal y otros órganos distantes1 ha sido respaldado por investigaciones que describen cómo modulan la inflamación, señalizan a través de receptores dedicados y sirven como sustratos en el metabolismo celular 2,3,4,5. Un trabajo reciente de nuestro grupo ha propuesto que los AGCC son reguladores inflamatorios clave in vivo del tono inmune pulmonar in vivo a través del eje intestino-pulmón 6,7. Informes adicionales han descrito su influencia funcional en el metabolismo a través del eje intestino-cerebro 8,9. En general, la influencia de los AGCC en la fisiología y patología del huésped está siendo objeto de una investigación activa e intensa por parte de numerosos grupos de investigación que abarcan una amplia gama de procesos patológicos.
El acetato (C2), el propionato (C3) y el butirato (C4) son los principales AGCC y son generados por la microbiota intestinal a través de la fermentación de la fibra dietética ingerible en el ciego y el intestino grueso. Los tres AGCC también se pueden obtener directamente de la dieta, y solo el acetato también puede ser producido por células de mamíferos. Los AGCC se absorben en el colon y son parcialmente utilizados por las células epiteliales intestinales (como fuente de energía, para la modulación inmunitaria de los tejidos locales y para apoyar el mantenimiento de la barrera intestinal). También son transportados a la vena porta a través del sistema venoso mesentérico10. El butirato es consumido principalmente por el epitelio intestinal, el propionato por el hígado11,12 y el acetato ha actuado sobre los tejidos musculares y adiposos después de entrar en la circulación periférica13,14.
Una evaluación completa de la producción, absorción y actividad funcional de los AGCC requiere el conocimiento de los niveles de AGCC dentro de la luz colónica, en la circulación portal y en la sangre periférica. Esto se puede lograr mediante la extracción de sangre de la vena porta (VP) y la circulación sistémica simultánea o secuencialmente en el mismo animal. Dado que los AGCC son volátiles15, es posible que la medición de sus niveles en los gránulos fecales expulsados no refleje con precisión los niveles dentro del colon. Además, en comparación con las mediciones del contenido colónico, el nivel de AGCC presentes en el PV puede reflejar con mayor precisión la suma neta de los niveles de estado estacionario absorbidos por el huésped frente a los niveles desiguales producidos por el microbioma intestinal a lo largo del colon11. Por lo tanto, estos niveles de AGCC PV pueden ser más relevantes y apropiados para estudiar los efectos de los AGCC en la fisiología y la patología del huésped más allá de los efectos locales dentro del intestino.
Para realizar la recolección coordinada y casi simultánea de sangre circulante VP y sistémica, el diafragma debe permanecer intacto para mantener la circulación sanguínea normal y permitir la respiración espontánea. Por lo tanto, la vena cava inferior (VCI) presenta un sitio ideal para obtener sangre de circulación sistémica mientras se recolecta sangre PV. Esta sangre IVC también se puede utilizar para otros fines, como la medición de las citocinas circulantes para evaluar la inflamación sistémica.
En la actualidad, solo se han descrito unos pocos métodos para recolectar sangre tanto de la circulación sistémica como de la PV en roedores más grandes16,17. Los métodos convencionales, que requieren la canulación de vasos en ratas, son técnicamente difíciles de realizar en ratones. Además, la cantidad máxima de sangre recolectada por estos métodos no suele ser superior a 0,3 mL18.
En este artículo, presentamos un método novedoso que simplifica el proceso de recolección de sangre dual de VCI de ratón seguida de PV en el mismo animal. La característica única del método es la ligadura del PV cerca del hilio hepático justo antes de la toma de muestras de sangre PV. Este enfoque puede ampliar las dimensiones de la PV, mejorando así significativamente la tasa de éxito, así como aumentar el volumen máximo de sangre recolectable hasta 0,5 mL.
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Protocolo
Todos los pasos de este procedimiento de no supervivencia fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de California en San Francisco. El sexo y la cepa de ratones utilizados fueron ratones machos C57BL/6J (de 25-35 g de peso y 12-15 semanas de edad). También se pueden utilizar hembras y/u otras cepas de ratón estándar.
1. Anestesia
- Limpie la mitad inferior del abdomen del ratón con hisopos de etanol al 70%. Administrar la anestesia mediante una inyección intraperitoneal de tribromoetanol (250-400 mg/kg). También se puede utilizar anestesia con ketamina/xilacina o isoflurano. Aplique ungüento oftálmico en los ojos para prevenir el daño de la córnea.
- Inyectar buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) por vía intraperitoneal para la analgesia.
NOTA: Se requiere buprenorfina debido al dolor asociado con el procedimiento de laparotomía.
2. Laparotomía
- Coloque el ratón anestesiado sobre la superficie quirúrgica (con una almohadilla térmica debajo) en posición supina. Sujete todas las extremidades del ratón en la tabla quirúrgica con cinta adhesiva. Confirme que se ha logrado la profundidad adecuada de la anestesia mediante el pellizco de los dedos del pie sin reflejo de retirada del pedal.
- Levante la piel y haga una incisión longitudinal con tijeras de disección a lo largo de la línea media desde el ombligo hasta la apófisis xifoides y caudalmente hacia la base del abdomen (órgano genital externo).
- Haga una incisión similar en el peritoneo con tijeras de disección sin perforar ni dañar los intestinos, el diafragma o el hígado.
- Amplíe el campo quirúrgico haciendo una incisión transversal de longitud completa (que se extienda el ancho del abdomen) con tijeras a ambos lados del ombligo.
- Mueva los intestinos grueso y delgado hacia el lado derecho del cirujano con una gasa limpia empapada en PBS tibio para exponer la VCI que se encuentra debajo.
3. Preparación de la ligadura para PV
- Manipule suavemente los segmentos intestinales dentro del campo quirúrgico con un hisopo de algodón para ubicar el PV en la raíz del mesenterio.
- Utilizando un microscopio de disección para visualizar los vasos y otras estructuras abdominales, pase cuidadosamente una sutura de prolene 7-0 detrás de la VP cerca del hilio hepático (entre la vena duodenal y la vena esplénica)19 para que esté lista para la ligadura en el paso 5 (Figura 1).
NOTA: El uso de un microscopio a partir de este paso no es obligatorio, pero mejora significativamente la tasa de éxito general del procedimiento.
4. Toma de muestras de sangre de la VCI
- Inserte la aguja de 28G 1/2 pulgada de una jeringa de insulina heparinizada de 1 cc en la VCI. Recoja 0,2-0,3 ml de muestra de sangre.
NOTA: Si se extrae demasiada sangre en este paso, se obtendrán volúmenes más bajos de sangre PV recolectada en el paso 5. - Deje la aguja dentro de la VCI para evitar el sangrado que se produciría con la extracción.
5. Toma de muestras de sangre del PV
- Ate suavemente la ligadura de prolene 7-0 alrededor del PV; el PV debe expandirse y dilatarse a medida que se rellena. Inserte la aguja de 28G 1/2 pulgada de otra jeringa de insulina heparinizada de 1cc en el PV.
- Aspire lentamente para recoger hasta 0,3-0,5 mL de sangre del PV. La VP puede colapsar, pero debe volver a expandirse gradualmente con el rellenado de sangre del sistema venoso mesentérico.
6. Almacenamiento de muestras
- Retire las agujas de la VCI y la VP después de la extracción de sangre.
- Transfiera las muestras de sangre de las jeringas a tubos eppendorf heparinizados de 1,5 mL y colóquelos en hielo para su posterior procesamiento en plasma para su almacenamiento y análisis, según sea necesario.
- Eutanasia al ratón mediante una sobredosis de anestésico seguida de una dislocación cervical (según las directrices aprobadas por la IACUC de la UCSF).
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Resultados
Utilizando el método descrito anteriormente, podemos recolectar muestras de sangre de la VCI y la VP secuencialmente en el mismo ratón con una tasa de éxito de más del 95%. Los volúmenes medios de las muestras de sangre recogidas son de 0,25 mL para la VCI y de 0,35 mL para la VP.
Mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), medimos la concentración de AGCC en heces, sangre PV y sangre IVC y, por lo tanto, pudimos rastrear la absorción y el tránsito de acetato (C2), propion...
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Discusión
Este artículo describe un método innovador in vivo para la recolección casi simultánea de muestras de sangre secuencialmente de la VCI y la VP en el mismo ratón experimental. Este método es útil para medir los niveles de productos generados por la microbiota intestinal, como los AGCC, que transitan por la circulación portal. El volumen máximo medio de sangre que se puede recoger durante un procedimiento terminal en ratones (con un peso de 25-30 g) es de aproximadamente 1 mL/rató...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
AP está financiado por una beca R01 de los NIH/NHLBI (1R01HL146753). DM está financiado por una beca T32 de los Institutos Nacionales de la Salud (NIH, por sus siglas en inglés) y por un premio Trainee/Staff Pilot Awards del Centro Benioff de Medicina del Microbioma de la UCSF.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2,2,2 Tribromoetanol, 97% (Avertin) | Sigma Aldrich | T48402-25G | Agente anestésico |
| Clorhidrato de buprenorfina inyectable 0,3 mg/mL | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | Agente analgésico |
| Pinza de apósito | Miltex | 6-100 | Disección |
| Pinzas Graefe | Roboz | RS-5136 | Disección |
| Hepatin sódico 1000 USP unidades/mL | Hikma | NDC 0641-0391-12 Muestras de | sangre jeringas/tubos heparinización |
| Prolene 7-0 | Ethicon | 8696G | Ligadura de vena porta |
| Tijeras | F.S.T | 14058-11 | Disección |
| Estudiante Halsted-Mosquito Hemostáticos | F.S.T | 91308-12 | Disección |
| Cinta quirúrgica | 3M Transpore | 1527-1 | Fijación de extremidades de ratón |
| U-100 Jeringa de insulina 28G1/2 | EXEL | 26027 | Recogida de muestras de sangre |
Referencias
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