Artículo de método

Imágenes en vivo para cuantificar la radiosensibilidad celular en organoides tumorales derivados de pacientes

DOI:

10.3791/66680

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5 de abril de 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, Weill Cornell Medical College, 2Sandra and Edward Meyer Cancer Center, 3Department of Medicine, Weill Cornell Medical College, 4Caryl and Israel Englander Institute for Precision Medicine, 5Department of Pathology and Laboratory Medicine, Weill Cornell Medical College

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, detallamos un enfoque sencillo de imágenes en vivo para cuantificar la sensibilidad de los organoides tumorales derivados del paciente a la radiación ionizante.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La radioterapia (RT) es uno de los pilares del tratamiento clínico moderno del cáncer. Sin embargo, no todos los tipos de cáncer son igualmente sensibles a la irradiación, a menudo (pero no siempre) debido a las diferencias en la capacidad de las células malignas para reparar el daño oxidativo del ADN provocado por los rayos ionizantes. Los ensayos clonogénicos se han empleado durante décadas para evaluar la sensibilidad de las células cancerosas cultivadas a la irradiación ionizante, en gran parte porque las células cancerosas irradiadas a menudo mueren de una manera tardía que es difícil de cuantificar con técnicas asistidas por citometría de flujo o microscopía a corto plazo. Desafortunadamente, los ensayos clonogénicos no se pueden emplear como tales para modelos tumorales más complejos, como los organoides tumorales derivados del paciente (PDTO). De hecho, la irradiación de PDTOs establecidas no necesariamente puede abrogar su crecimiento como unidades multicelulares, a menos que su compartimento en forma de tallo sea completamente erradicado. Además, es posible que la irradiación de suspensiones unicelulares derivadas de PDTO no recapitule adecuadamente la sensibilidad de las células malignas a la RT en el contexto de las PDTO establecidas. Aquí, detallamos una adaptación de los ensayos clonogénicos convencionales que implica la exposición de PDTOs establecidas a radiación ionizante, seguida de disociación de una sola célula, replateado en condiciones de cultivo adecuadas e imágenes en vivo. Las células madre no irradiadas (control) derivadas de la PDTO reforman las PDTO en crecimiento con una eficiencia específica de la PDTO, que se ve influenciada negativamente por la irradiación en función de la dosis. En estas condiciones, la eficiencia de formación de PDTO y la tasa de crecimiento se pueden cuantificar como una medida de radiosensibilidad en imágenes de lapso de tiempo recopiladas hasta que las PDTO de control alcanzan una ocupación de espacio predefinida.

Introducción

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La radioterapia (RT) de haz externo es uno de los pilares de la oncología moderna, ya que refleja no solo una pronunciada actividad anticancerosa asociada a un espectro bien definido de efectos secundarios generalmente manejables1, sino también una disponibilidad clínica excepcionalmente amplia (la mayoría de los centros oncológicos de los países desarrollados están equipados con modernos aceleradores lineales para la RT de haz externo)2. De acuerdo con esta noción, la RT se emplea globalmente con éxito tanto con fines curativos, generalmente en el contexto dela enfermedad en etapa temprana 3,4, como para aplicaciones paliativas, para contener los síntomas (por ejemplo, dolor) de los tumores metastásicos5. Dicho esto, no todas las neoplasias malignas son igualmente sensibles a la RT, lo que refleja una serie de características intrínsecas y microambientales de las células cancerosas 6,7,8,9. Como ejemplo independiente, varias alteraciones genéticas y epigenéticas asociadas al cáncer que influyen en la reparación del ADN y la homeostasis redox se han asociado con un aumento o disminución de la radiosensibilidad intrínseca, lo que refleja en gran medida la capacidad de la RT para matar células cancerosas al causar daño directo y dependiente de las especies reactivas de oxígeno (ROS) en el ADN y otras macromoléculas 10,11,12,13.

En las últimas décadas, los ensayos clonogénicos se han empleado de forma rutinaria para evaluar la radiosensibilidad de las células cancerosas humanas y murinas cultivadas 14,15,16. De hecho, mientras que los quimioterapéuticos y otros factores estresantes a menudo matan las células malignas de una manera bastante rápida, la RT empleada en dosis clínicamente relevantes con mayor frecuencia provoca una forma tardía de muerte celular que no se puede cuantificar simplemente con técnicas asistidas por citometría de flujo o microscopía a corto plazo, como la medición de la absorción celular de colorantes vitales (que tiñen selectivamente las células muertas) 24-72 h después de la exposición a un estímulo citotóxico17. Además de ser sencillos y depender de reactivos bastante baratos, los ensayos clonogénicos han sido particularmente convenientes, ya que permiten la implementación del llamado modelo "cuadrático lineal", que es una herramienta matemática bastante simple para el análisis cuantitativo de la respuesta a la dosis de RT18,19. De manera similar, las células cancerosas cultivadas (incluidas las líneas celulares establecidas, así como las células primarias derivadas del paciente) han proporcionado una plataforma conveniente para probar varios aspectos de la biología del cáncer, incluida (pero no limitada a) la sensibilidad al tratamiento de una manera bastante directa pero simplificada, siendo una limitación importante la ausencia de un microambiente tumoral estructurado (TME)20, Artículo 21. De hecho, los cultivos bidimensionales de células cancerosas son intrínsecamente incapaces de recapitular las comunicaciones e interacciones célula-célula con la matriz extracelular y tal como ocurren en el cáncer22,23. Los organoides tumorales derivados de pacientes (PDTOs) han surgido como modelos tumorales que, al menos en parte, eluden dicha limitación 24,25,26.

Desafortunadamente, los ensayos clonogénicos convencionales no se pueden emplear para evaluar la radiosensibilidad de las PDTO. Por un lado, la irradiación de PDTOs establecidas no necesariamente compromete su crecimiento como unidad multicelular, a menos que su compartimento en forma de tallo, que es responsable de la formación y maduración de PDTOs, pero exhibe una mayor resistencia al daño del ADN en comparación con las células más diferenciadas que componen PDTOs27, sea completamente erradicado. Por otro lado, es posible que la irradiación de suspensiones unicelulares derivadas de PDTO no recapitule adecuadamente la radiosensibilidad de las células que componen PDTO (incluidas las similares a las madre) tal como se exhibe en el contexto de las PDTO formadas. Aquí, detallamos una técnica que aprovecha las imágenes en vivo de las PDTO del cáncer de mama para monitorear la eficacia de la formación de PDTO y la tasa de crecimiento de las células derivadas de la PDTO previamente expuestas a la irradiación ionizante en comparación con sus contrapartes no irradiadas. Dado que las variaciones requeridas reflejan en gran medida la biología diferencial de los PDTOs individuales (por ejemplo, requisitos de medios de cultivo, tasa de crecimiento), esperamos que este protocolo sea adecuado para el estudio de la radiosensibilidad en un amplio panel de PTDOs de origen mamario y no mamario.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los reactivos y equipos utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Cultivo de organoides

NOTA: Las PDTOs TNBC#1 se establecieron en nuestro laboratorio a partir de tejido tumoral extirpado quirúrgicamente de una paciente con cáncer de mama triple negativo (TNBC) que dio su consentimiento informado para participar en un protocolo de biobanco (IRB21-06023682). Después de la validación por histología y secuenciación de ARN (RNAseq), las PDTOs TNBC#1 se cultivan en gotas de matrigel al 66% (las llamadas 'domos') en un medio de cultivo DMEM/F12 enriquecido (Tabla 1) y se pasan cada 2-3 semanas en una proporción 1:2-1:1028.

  1. Siembre PDTOs en una proporción de 1:2-1:10 aproximadamente 2 semanas antes de la irradiación en placas separadas de 6 pocillos no adherentes, una por cada dosis de radiación probada (más controles negativos, que serán proporcionados por PDTOs no expuestas a radiación ionizante).
  2. Añada 3 mL de medio de cultivo DMEM/F12 fresco y enriquecido a los PDTO cada 3-4 días.
    NOTA: Las condiciones de siembra y cultivo pueden requerir cierta adaptación para evitar que las PDTO adquieran una apariencia muy reconocible, en forma de anillo, que es indicativa de necrosis central bajo el microscopio y para garantizar una viabilidad óptima en la irradiación.

2. Radiación

  1. Las PDTO están listas para la irradiación una vez que alcanzan el tamaño promedio (aproximadamente 100 μm, según se determinó preliminarmente bajo microscopía de campo claro con una escala de referencia) y la ocupación del domo (aproximadamente 80%). Aprobar las PDTO en esta etapa para evitar el hacinamiento.
  2. Irradiar los domos que contienen PDTO utilizando el irradiador de la Plataforma de Radiación de Investigación en Animales Pequeños (SARRP) (o un irradiador alternativo para aplicaciones in vitro o in vivo ) en modo de campo abierto (sin colimador), administrando dosis individuales de 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy y 10 Gy. Los PDTO no irradiados proporcionan condiciones de control negativo adecuadas.
    NOTA: La calibración de las pruebas de dosimetría debe realizarse antes de cada experimento para garantizar que las PDTO encerradas en Matrigel reciban la dosis de radiación planificada. Estas dosis se eligieron sobre la base de evaluaciones preliminares de la radiosensibilidad de las PDTOs TNBC#1 y, por lo tanto, pueden requerir ajustes para otras PDTOs.

3. Disociación

  1. Inmediatamente después de la irradiación, lavar cada cúpula de matrigel que contenga PDTO con 2 mL de medio de cultivo DMEM/F12 enriquecido y volver a suspenderlas en 1-3 mL de TrypL-E utilizando una micropipeta p1000. Repita unas 30 veces para cada pocillo.
  2. Recoja la suspensión celular en un tubo de centrífuga de 50 ml e incube durante ~5 min en un baño de agua a 37 °C.
  3. Granular las células centrifugarlas a 800 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
  4. Retire el exceso de TrypL-E para dejar ~ 1 mL en el tubo y agregue 3 veces el volumen original de la enzima (consulte el paso 3.1) de medio DMEM / F12 enriquecido para lavar las células.
  5. Filtre la suspensión celular con un filtro de malla de 40 μm. Este paso garantiza que no queden grupos de células en la placa y que cada nuevo PDTO se origine en una sola celda.
  6. Cuente las células en un contador de células automatizado después de la tinción con azul de tripán al 10% en PBS y vuelva a suspenderlas para obtener 800 células en 50 μL de medio DMEM/F12 enriquecido más matrigel al 66% a 4 °C (condiciones para 1 domo).
  7. Coloque cada cúpula en un pozo individual a partir de una placa de cultivo de 48 pocillos compatible con imágenes en vivo, evitando la formación de burbujas. Se recomiendan triplicados técnicos para cada dosis de radiación.
  8. Coloque las placas en una incubadora de cultivo celular (37 °C, 5% CO2) durante 30 min para solidificar el matrigel.
  9. Agregue 0,5-1 mL de medio DMEM/F12 enriquecido, elimine las posibles burbujas y coloque las placas en el sistema de imágenes en vivo dentro de una incubadora de cultivo celular. Deje que la placa se equilibre a la temperatura establecida durante unos 30 minutos antes de tomar imágenes.
    NOTA: Matrigel se solidifica a temperaturas >4 °C, lo que implica que esta temperatura debe conservarse hasta que se requiera la solidificación.

4. Imágenes en vivo

  1. En el software Incucyte, seleccione Programar para adquirir.
  2. Haga clic en el signo más en la esquina superior izquierda de Launch Add Vessel.
  3. Para escanear repetidamente o una vez, seleccione Escanear programado y luego haga clic en Siguiente.
  4. Para crear o restaurar embarcación, seleccione Crear embarcación nueva y, a continuación, haga clic en Siguiente.
  5. Para seleccionar el tipo de escaneo, seleccione Organoide y luego haga clic en Siguiente.
  6. Configuración de escaneo: Elija QC < ' Phase + Brightfield Image Channels. '4x Objetivo' se selecciona automáticamente. A continuación, haga clic en Siguiente.
  7. Selección de embarcaciones: Elija la placa validada por software adecuada de acuerdo con el número de catálogo.
  8. Ubicación del buque: Seleccione la ubicación de la placa en el instrumento de acuerdo con el diseño y luego haga clic en Siguiente.
  9. Patrón de escaneo: Seleccione los pozos de acuerdo con el diseño de la placa, luego haga clic en Siguiente.
  10. Cuaderno de la embarcación: Placa de identificación (Opcional: nombre Tipo de celda y Pasaje). Cree un mapa de placas haciendo clic en el signo más en la esquina superior derecha del diseño de la placa, 'Crear mapa de placas'.
  11. En el Editor de mapas de placas, indique el tipo de celda haciendo clic en el icono Crear nueva celda en la sección Celdas , aplique a los pozos apropiados haciendo clic en el icono más y seleccione los pozos apropiados. Opcional: Se puede indicar el número de celdas y pasajes sembrados. Repita para cada línea celular.
  12. Indique el tratamiento haciendo clic en el icono Crear Nueva Celda en la sección Condiciones de Crecimiento , aplique a los pozos apropiados haciendo clic en el icono más y seleccione los pozos apropiados. Repita para cada condición experimental. A continuación, haga clic en Aceptar > Siguiente.
  13. Configuración de análisis: 'Aplazar análisis hasta más tarde' se selecciona automáticamente; haga clic en Siguiente.
  14. Horario de escaneo: Elija escanear dos veces al día, indefinidamente. Haga clic en Siguiente. Supervise la oscuridad de las PDTO de control para obtener el punto de conexión ideal, ya que tienden a colapsar cuando están demasiado crecidos.
  15. Resumen: Consulte el resumen y haga clic en Agregar a la programación.
    NOTA: Las propiedades de escaneo se pueden visualizar y el horario se puede editar si es necesario haciendo clic con el botón derecho en la línea de tiempo de escaneo.

5. Análisis

  1. En el software compatible, seleccione Ver. Esto también se puede operar desde una computadora conectada al sistema a través de intranet.
  2. Seleccione el experimento deseado haciendo doble clic en él.
  3. Seleccione el icono Iniciar análisis .
  4. Seleccione Crear nueva definición de análisis y, a continuación, haga clic en Siguiente.
  5. Tipo de análisis: Seleccione Organoide y haga clic en Siguiente.
  6. Canales de imagen: 'Fase + Campo claro' está seleccionado de forma predeterminada, haga clic en 'Siguiente'.
  7. Seleccione un conjunto de imágenes representativas para el análisis. Haga clic en Siguiente. Se recomienda elegir puntos de tiempo tempranos y tardíos y diferentes condiciones de tratamiento, por ejemplo, control y diferentes dosis de radiación.
  8. Realice la definición de análisis para TNBC#1 siguiendo los pasos que se indican a continuación:
    1. En la imagen: seleccione Vista previa actual o "Vista previa de todo" para visualizar la máscara predeterminada de las imágenes actuales o seleccionadas. Repita el procedimiento a medida que se cambien los parámetros de análisis para actualizar la máscara.
    2. Segmentación: establezca el radio en 300, el fondo de sensibilidad en 80, la división de bordes en ON y la sensibilidad de borde en 70.
    3. Limpieza: Establezca el Relleno del agujero en 5E+05 μm2 y Ajuste el Tamaño a 0 píxeles.
    4. Filtros: No establezca ningún área mínima o máxima, Excentricidad mínima establecida en 0,19 y ninguna excentricidad máxima. Haga clic en Siguiente.
  9. Tiempos de escaneo y pozos: Seleccione todos los puntos de tiempo y pozos de escaneo que deseen. Haga clic en Siguiente. Opcional: Seleccione Analizar exámenes futuros.
  10. Guardar y aplicar definición de análisis: Introduzca el nombre de la definición y haga clic en Siguiente.
  11. Visualice el Resumen y haga clic en Finalizar.
  12. Aparecerá una ventana emergente para informar al usuario de que el análisis ha entrado en la cola de análisis. Haga clic en Aceptar. Una vez que se abre la ventana Cola de análisis, se pueden visualizar las tareas restantes.
  13. Si es necesario, recupere el análisis completado en Vista seleccionando la flecha azul en la columna Análisis , junto al Nombre del recipiente, y haciendo clic con el botón derecho en el Nombre de la definición de análisis. A continuación, visualice los datos sin procesar en el software haciendo clic en Métricas de análisis de gráficos, o exporte para un análisis más detallado seleccionando Definición de análisis de exportación.
    NOTA: La exportación de datos sin procesar se puede personalizar en la ventana Métricas de análisis de gráficos . El recuento de organoides, el área total, la excentricidad promedio y la oscuridad se pueden exportar por separado, y los datos se pueden organizar en el menú desplegable Seleccionar agrupación haciendo clic en Ninguno, Columnas, Filas o Réplicas de mapa de placas. Para TNBC#1, para la exportación de datos sin procesar, Métricas de análisis de gráficos y para la opción desplegable Seleccionar agrupación , se eligió la opción Ninguno . Estos parámetros de importación se eligieron con base en evaluaciones preliminares con PDTOs TNBC#1. Por lo tanto, pueden requerir ajustes para otros PDTO, lo cual es posible en el software basado en las funciones de "Vista previa". Recomendamos adaptar los parámetros de importación en (1) imágenes tempranas que en su mayoría contienen células individuales o PDTO pequeñas, y (2) imágenes recopiladas en puntos de tiempo tardíos para garantizar que las PDTO grandes también se adquieran tanto en condiciones de control como tratadas.

Resultados

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Las PDTOs TNBC#1 se expusieron a una dosis única de radiación de 0 (controles no irradiados), 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy o 10 Gy en el día 0. Inmediatamente después, se disociaron las PDTOs para obtener una suspensión unicelular para cada condición experimental. Las células derivadas de PDTO se sembraron en placas de 48 pocillos dentro de domos de matrigel al 66% (50 μL cada uno) depositados en el centro de los pocillos, en 3 réplicas técnicas por condición. Las placas se colocaron en un sistema de imágenes en vivo y se tomaron imágenes cada 6 h utilizando el objetivo 4X del módulo de organoides durante un total de 30 días. La irradiación de las PDTOs TNBC#1 con RT en una dosis única de 2 Gy retrasó significativamente el recrecimiento de la PDTO, mientras que las dosis de radiación ≥4 Gy (hasta 10 Gy) completadas impidieron la regeneración de las PDTOs en crecimiento (Figura 1).

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Figura 1: Imágenes en vivo de organoides tumorales derivados del paciente (PDTO). Los organoides tumorales derivados del paciente (PDTO) TNBC#1 del cáncer de mama no se trataron o se expusieron a la dosis de radiación indicada, seguida poco después de la disociación, la replaca y la obtención de imágenes con un sistema de imágenes de células vivas. Se presentan imágenes representativas tras el ajuste de contraste (A) y las evaluaciones cuantitativas (B, media ± SEM). Escala de la imagen: 1,19 x 1,16 mm (1,38 mm2). Barra de escala: 400 μm; recuadros: 200 μm. ****p < 0,001 (ANOVA de dos vías, en comparación con 0 Gy); ####p < 0,001 (ANOVA de dos vías, en comparación con 2 Gy). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

ComponenteConcentración
DMEM F/121X
GlutaMax1X
Hepes10 mM
PenStrep100 U/mL
B271X
Nac1,25 mM
Nicotinamida10 mM
Inhibidor del receptor TGFbeta A83-010,5 μM
Inhibidor de p38 MAP p38i SB2021901 μM
Cabeza10%
Rspondin Media10%
FGF1020 ng/mL
FGF75 ng/mL
NR (heregulina)5 nM
Primocina100 μg/mL
Y-27632 (RhoKi)5 μM
Factor de crecimiento epidérmico hEGF5 ng/mL

Tabla 1: Composición del medio de cultivo PDTO.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, describimos una adaptación de los ensayos clonogénicos convencionales que aprovechan las PDTO del cáncer de mama y las imágenes en vivo para cuantificar la radiosensibilidad de la PDTO en función de (1) la persistencia de las células madre formadoras de PTDO tras la irradiación de PDTO in vitro, y (2) la tasa de crecimiento de las PDTO que estas células (pueden) generar. Los pasos críticos de este protocolo incluyen (1) el establecimiento de PDTO para una ocupación del domo que permita una buena viabilidad, (2) la exposición de PDTO a la irradiación ionizante a diferentes dosis, incluidas las condiciones de control de irradiación simulada; (3) Disociación de PDTO en células individuales; (4) rechapado de células individuales derivadas de PDTO; y (5) imágenes en vivo hasta una ocupación predefinida del domo en condiciones de control.

Con modificaciones mínimas, en su mayoría relacionadas con la eficiencia de formación de PDTO y la tasa de crecimiento de PDTO en condiciones de control (que probablemente varien considerablemente entre los diferentes PDTO), esperamos que este protocolo sea adaptable a múltiples plataformas de imágenes en vivo disponibles comercialmente, así como a numerosas PDTO, tanto de derivación mamaria como no mamaria. Por un lado, se espera que la eficiencia basal de la formación de PDTO en la dispersión de una sola célula influya en el número de células individuales que se resembrarán para obtener nuevas PDTO a una densidad que permita no solo la cuantificación de PDTO basada en imágenes, sino también el crecimiento normal de PDTO no tratadas. Por otro lado, se espera que la tasa de crecimiento de la PDTO afecte a la duración del ensayo, ya que debe evitarse la fusión de PDTO adyacentes para preservar las capacidades analíticas óptimas. Por lo tanto, determinar la eficiencia de formación de PDTO y la tasa de crecimiento de PDTO en condiciones de control para cada PDTO individual es fundamental para la correcta implementación de este protocolo.

Si bien este método es bastante sencillo, tiene algunas limitaciones. En primer lugar, un número excesivamente bajo de células formadoras de PDTO puede perjudicar la regeneración de las PDTO que crecen normalmente tras la disociación de una sola célula. De hecho, mientras que el paso rutinario de PDTO se puede lograr mediante una disociación incompleta, las evaluaciones cuantitativas, como las que ofrece este protocolo, se basan en la generación de una suspensión de una sola célula (que se puede confirmar visualmente durante el recuento). En segundo lugar, una tasa de crecimiento excesivamente lenta puede prolongar considerablemente la duración del ensayo y dar lugar a una estimación imprecisa de la radiosensibilidad. De hecho, es concebible que un tiempo de cultivo prolongado, como el requerido para que las PDTO de crecimiento lento alcancen un tamaño compatible con el punto final, pueda ofrecer oportunidades adicionales para que las células formadoras de PDTO irradiadas subletalmente se recuperen del estrés y restauren las PDTO detectables (aunque de crecimiento lento). Por último, se espera que la disociación de las PDTO poco después de la irradiación imponga un estrés adicional a las células formadoras de PDTO, lo que podría aumentar la radiosensibilidad como resultado de la alteración de las comunicaciones entre células en las primeras fases de la recuperación. El retraso de la disociación de 24-72 h puede proporcionar información sobre la contribución relativa de las comunicaciones entre células preservadas a la capacidad de las células formadoras de PDTO para recuperarse del daño macromolecular impuesto por la RT.

Si bien las plataformas de imágenes en vivo ofrecen un método conveniente para monitorear la formación y el crecimiento de PDTO longitudinalmente, las imágenes de punto final único también se pueden usar para el mismo objetivo. En este caso, se debe prestar atención para garantizar que las PDTO adyacentes no se fusionen antes de la obtención de imágenes, y la tasa de crecimiento se puede evaluar como una función del tamaño de la PDTO normalizada a la duración del ensayo.

En la era de la medicina oncológica personalizada, la evaluación de la sensibilidad de los tumores individuales al tratamiento es de suma importancia, ya que proporciona algunas pistas para el diseño de estrategias terapéuticas individualizadas con mayor eficacia29. El protocolo descrito en este documento se ajusta a este esfuerzo al proporcionar un enfoque conveniente para estimar la sensibilidad celular de las PDTO individuales a la radiación ionizante (sola o combinada con otras modalidades terapéuticas). Dicho esto, aún no se ha demostrado si la medición de la radiosensibilidad de las células cancerosas a partir de PDTOs predice con precisión la respuesta de los pacientes individuales con cáncer a la RT focal. La correlación de la radiosensibilidad de las distintas PDTOs a la irradiación con la respuesta clínica a la RT de sus respectivos donantes proporcionará información importante sobre esta posibilidad.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sin relación con este trabajo, SCF tiene contratos de investigación con Merck, Varian, Bristol Myers Squibb, Celldex, Regeneron, Eisai y Eli-Lilly, y ha recibido honorarios de consultoría/asesoramiento de Bayer, Bristol Myers Squibb, Varian, Elekta, Regeneron, Eisai, AstraZeneca, MedImmune, Merck US, EMD Serono, Accuray, Boehringer Ingelheim, Roche, Genentech, AstraZeneca, View Ray y Nanobiotix. Sin relación con este trabajo, SD ha recibido honorarios de consultoría/asesoramiento de Lytix Biopharma, EMD Serono, Ono Pharmaceutical, Genentech y Johnson & Johnson Enterprise Innovation Inc., y tiene contratos de investigación con Lytix Biopharma, Nanobiotix y Boehringer-Ingelheim. Sin relación con este trabajo, LG tiene contratos de investigación con Lytix Biopharma, Promontory y Onxeo, ha recibido honorarios de consultoría/asesoramiento de Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, OmniSEQ, Onxeo, The Longevity Labs, Inzen, Imvax, Sotio, Promontory, Noxopharm, EduCom y la Fundación Luke Heller TECPR2, y posee opciones sobre acciones de Promontory.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Raymond Briones y Wen H. Shen (Weill Cornell Medical College, Nueva York, NY, EE.UU.) por su ayuda en el desarrollo de este protocolo. Este trabajo ha sido apoyado por una subvención del Consorcio Transformador de Cáncer de Mama del Departamento de Defensa de los Estados Unidos BCRP (#W81XWH2120034, PI: Formenti).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
40 y micro; filtro de malla mThomas Scientific1164H35
B27Invitrogen17504-044
Celómetro Auto T4 Contador de celdas de campo brillanteNexcelom
DMEM F/12Corning 12634-010
Factor de crecimiento epidérmico hEGFPeprotechAF-100-15
EVOS FL Microscopio digital de fluorescencia invertida Thermo Fisher Scientific12-563-460
FGF10Peprotech100-26
FGF7Peprotech 100-19
GlutaMaxInvitrogen 
HepesInvitrogen 15630-080
Software IncuCyte 2021ASartorius: 2021A
Incucyte SX1Sartoriusmodelo SX1
Placa de 48 pocillos validada por IncucyteCorning 3548
laboratorio de descubrimientoMatrigel354230
nAcSigma Aldrich A9165-5G
NicotinamidaSigma-AldrichN0636
Noggin Comprado enel Instituto Englander de Medicina de Precisión, Weill Cornell, NY, EE. UU
. Placa de 6 pocillos no tratadaCellstar657 185
NR (Heregulin)Peprotech100-03
p38 Inhibidor de MAP p38i SB202190Sigma Aldrich S7067
PBSCorning 21-040-CV
PenStrepInvitrogen15140-122
PrimocinInvivogenant-pm-1
Rspondin MediaComprado al Instituto Englander de Medicina de Precisión, Weill Cornell, NY, EE. UU
. Plataforma de Investigación de Radiación para Pequeños Animales (SARRP) Xstrahl Ltd
Inhibidor del receptor TGFbeta A83-01Tocris2939
Tinción azul de tripán (0.4%)Gibco15250-61
TrypLEGibco112605-028
Y-27632 (RhoKi)SelleckS1049
35050061 Versión Material de

Referencias

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