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Toma de muestras de sangre y medición hormonal para determinar la etapa del ciclo ovárico en titíes

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DOI:

10.3791/66691

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5 de julio de 2024

 , 
1National Center for Child Health and Development

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe la toma de muestras de sangre y orina para medir los niveles de progesterona/estradiol y gonadotropina coriónica para determinar la etapa del ciclo ovárico. Los niveles hormonales se utilizan para predecir y determinar el momento de la ovulación y se inyectan hormonas para regular el ciclo ovárico y el crecimiento de los ovocitos.

Resumen

Los titíes comunes son pequeños monos del Nuevo Mundo. Dado que muchos de sus mecanismos biológicos son similares a los de los humanos, los titíes son potencialmente útiles para la investigación médica y de biología humana en una variedad de campos, como la neurociencia, la medicina regenerativa y el desarrollo. Sin embargo, hay una falta de literatura que describa los métodos para muchos experimentos y procedimientos básicos. Aquí se describen métodos detallados para determinar los niveles de hormonas sexuales (progesterona, estradiol y gonadotropina coriónica) en titíes. La medición de estas hormonas permite predecir el estadio del ciclo ovárico, que suele ser de 26 a 30 días en los titíes; La determinación precisa es esencial para la recolección de ovocitos/cigotos en el momento correcto y para la preparación de las hembras hospedadoras para la generación de titíes modificados genéticamente.

Además, la medición de los niveles de hormonas sexuales es útil para estudios de endocrinología, etología, desarrollo temprano y biología reproductiva. Este protocolo proporciona una descripción detallada de los métodos para la toma de muestras de sangre de la vena femoral, la separación del plasma para la medición de hormonas, la medición de los niveles de gonadotropina coriónica utilizando orina y plasma, el restablecimiento del ciclo ovárico mediante inyecciones de un análogo de prostaglandina F2α para acortar y sincronizar el ciclo, y la promoción del crecimiento folicular y la ovulación mediante la inyección de hormona foliculoestimulante y gonadotropina coriónica. Utilizando estos protocolos, se pueden determinar las etapas del ciclo ovárico para la recolección oportuna de ovocitos/cigotos.

Introducción

El tití común (Callithrix jacchus) es un pequeño mono del Nuevo Mundo con muchas características similares a las de los humanos, y la duración de su ciclo ovárico es de 26-30 días 1,2. Los estudios sobre el desarrollo temprano y la generación de titíes modificados genéticamente requieren la recolección de ovocitos y cigotos en etapas específicas del ciclo ovárico. Por lo tanto, la determinación precisa del estadio es crucial y puede estimarse midiendo los niveles sanguíneos de las hormonas progesterona (P4) y estradiol (E2)2,3. Estas hormonas promueven el crecimiento del endometrio, que es necesario para la implantación. La P4 se produce a partir del cuerpo lúteo, que se forma en los ovarios inmediatamente después de la ovulación. El E2 es secretado por los folículos ováricos en respuesta a la hormona foliculoestimulante (FSH) del complejo hipotálamo-hipófisis en el cerebro. Los niveles de E2 aumentan a medida que el folículo madura, alcanzando su punto máximo antes de la ovulación3. Los niveles altos de E2 causan la liberación pulsada de la hormona luteinizante (LH) a través del complejo hipotálamo-hipófisis en los seres humanos; este aumento de LH induce la ovulación. Sin embargo, en los titíes, el gen LH sufrió degeneración durante la evolución, y la ovulación es inducida por la liberación de gonadotropina coriónica (CG), que tiene una estructura similar a la de LH, de la glándula pituitaria 4,5.

El ciclo ovárico se puede controlar mediante inyecciones de hormonas. Las inyecciones de FSH, en humanos, actúan sobre los receptores ováricos de FSH y se utilizan para promover la síntesis de estrógenos y el crecimiento defolículos. La inyección de CG humana (hCG) como sustituto de la LH al final de la fase folicular se utiliza para estimular la ovulación en humanos7. Las inyecciones de CG también se usan para tratar la infertilidad humana porque CG estimula el cuerpo lúteo al principio del embarazo, lo que resulta en una mayor producción de P4. Las inyecciones de prostaglandina F2α (PGF2α) restablecen el ciclo ovárico8. En el ganado doméstico, la inyección de PGF2α se utiliza para acortar la fase lútea y sincronizar el ciclo estral para el manejo reproductivo.

Aunque los titíes y los seres humanos tienen mecanismos biológicos similares, lo que los convierte en animales modelo ideales, hay una falta de literatura que describa los métodos básicos para muchas técnicas de uso frecuente. La toma de muestras de sangre es una de las técnicas más utilizadas 9,10,11,12. Sin embargo, los principiantes a veces tienen problemas para encontrar la vena. Por lo tanto, este estudio realizó análisis anatómicos de la región de la vena femoral. Con base en observaciones anatómicas, este protocolo presenta la región proximal del triángulo femoral como un sitio fácil para la venopunción.

Protocolo

Todos los métodos que involucran titíes utilizan altos estándares éticos y de bienestar y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Nacional para la Salud y el Desarrollo Infantil. Los animales utilizados en este lugar fueron de un solo alojamiento o de parejas (una hembra y un macho) con 12 h de luz al día.

1. Toma de muestras de sangre de la vena femoral

  1. Prepare una jeringa de 1 ml (el tipo corto es fácil de usar) con una aguja de 25 g con la hoja hacia arriba. Para evitar la obstrucción de la sangre, heparinice la jeringa extrayendo 200 μL de solución de heparina sódica sin diluir en la jeringa. Cubra el interior de la jeringa de manera uniforme tirando de ella hacia arriba y hacia abajo varias veces; Luego, expulse la solución de heparina de la jeringa.
    NOTA: Dado que a menudo es necesario cambiar a una jeringa nueva, prepare algunas jeringas heparinizadas adicionales.
  2. Prepare hisopos absorbentes de algodón y alcohol. Encienda una lámpara ajustable para iluminar el área donde se colocará el tití para la toma de muestras de sangre.
  3. Prepare el dispositivo de sujeción (420 x 85 x 85 mm, Figura 1A), que está disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles). Para colocar un tití en el dispositivo, abra la parte de retención con el cinturón de esponja, que asegura los titíes. Inserte el tití en el dispositivo de retención boca arriba.
    NOTA: Los titíes suelen estar tranquilos con dispositivos de sujeción, lo que puede negar la necesidad de aclimatación o entrenamiento de restricción.
  4. Captura al tití; inserte el tití en la parte cilíndrica; y asegúrelo presionando hacia abajo el cinturón de esponja. Coloque la pierna de la que se va a recoger la sangre encima de la otra (Figura 1A). Sostenga las piernas con la mano no dominante; Coloque los dedos medio y anular dentro de cada pierna para sujetarlos y los otros dedos fuera de cada pierna para fijarlos.
    NOTA: Se recomiendan guantes de mordida cuando se capturan titíes. Si no hay un dispositivo de sujeción, realice la recolección de sangre bajo anestesia o con otra persona que sujete al tití.
  5. Compruebe si la vena femoral es visible cerca de la base del muslo. Si no es así, palpa para encontrar la arteria pulsante y utilízala como punto de referencia para comprobar que la vena pasa por su interior (Figura 1B-D).
    NOTA: Se recomienda la iluminación del escritorio y el afeitado del cabello para mejorar la visibilidad. La visibilidad también se puede mejorar frotando con hisopos con alcohol. Los ganglios linfáticos en el triángulo a menudo se encuentran cerca de la vena y muestran un color azul oscuro como una vena. La forma de distinguirlos se describe en la sección Resultados representativos.
  6. Desinfecte el sitio de la punción con un hisopo con alcohol. Inserte la aguja con la hoja hacia arriba en un ángulo de 15°-20°. Para evitar que la aguja se salga del vaso sanguíneo durante la extracción de sangre, estabilice la mano que sostiene la jeringa, por ejemplo, apoyándola en la otra mano.
  7. Tire suavemente hacia atrás del émbolo para aplicar presión negativa (Figura 1E). Empuje la punta de la aguja hacia adelante. Una vez que la sangre entra en la jeringa, mantenga la posición de la punta de la aguja hasta que se haya recogido el volumen requerido (500-700 μL).
    1. Cuando la sangre no entra en la jeringa, cambie el sitio de la punción. Si la sangre sale al sacar la aguja, detenga el sangrado aplicando presión en el sitio de la punción durante 3 minutos. Después de detener el sangrado, reinicie la venopunción.
    2. Si la sangre que se extrae en la jeringa deja de fluir durante el proceso de extracción, empuje lentamente la punta de la aguja hacia adelante y luego tire de ella hacia atrás para encontrar el vaso sanguíneo. Esto puede restaurar el flujo de sangre hacia la jeringa. De lo contrario, saque la aguja y realice la venopunción con una jeringa nueva.
      NOTA: Use el muslo de la otra pierna cuando sea difícil recolectar sangre del mismo lado.
  8. Tire con cuidado de la aguja mientras presiona ligeramente el sitio de la punción con el dedo meñique. Luego, con un hisopo de algodón absorbente, aplique presión inmediatamente en el sitio de punción durante 3 minutos para detener el sangrado. Invierta la jeringa para mezclar la sangre y la heparina.
    NOTA: Aplique presión durante más tiempo (5 min) mientras se enfría cuando se extraiga sangre arterial, y confirme cuidadosamente el cese del sangrado para prevenir la formación de hematoma, que a veces puede resultar en un resultado fatal.
  9. Después de confirmar que el sangrado ha cesado, retire el cinturón de esponja, sostenga la cintura del animal con una mano y gírelo para que uno pueda sostener la axila del animal con la otra mano desde la parte trasera.
  10. Regresa el tití a su jaula. Para reducir el estrés y facilitar la toma repetida de muestras de sangre, proporcione al tití su comida favorita (por ejemplo, galletas, malvaviscos o bizcocho). Comprobar la aparición de hematomas de vez en cuando.
    NOTA: Cuando el hematoma se encuentra en la etapa temprana, aplique un vendaje de presión para prevenir la progresión del hematoma. Cuando se encuentra después de mucho tiempo, puede ser necesaria la extirpación quirúrgica del hematoma con ligadura de la arteria femoral y transfusión de sangre 9,13.
  11. Separe la aguja de la jeringa para prevenir la hemólisis. A continuación, expulse lentamente la sangre recogida a lo largo de la pared interior de un microtubo de 1,5 ml.
    NOTA: La sangre recolectada puede almacenarse a 4 oC durante un máximo de 24 horas antes de la separación del plasma para medir los niveles de P4/E2.

2. Separación del plasma y determinación de los niveles hormonales

  1. Centrifugar la sangre en un tubo de 1,5 mL a 1.100 × g durante 5 min a 4 oC.
  2. Transfiera el plasma separado (sobrenadante) del tubo de 1,5 mL a un nuevo tubo/taza, evitando cuidadosamente la inclusión de células sanguíneas (sedimento).
  3. Mida los niveles de P4 y E2 utilizando un kit ELISA o un analizador automático. Si la cantidad de plasma no es suficiente para el analizador automático, utilice una solución de dilución de muestra.
    NOTA: Para la medición con un analizador automático, se requieren >175 μL de plasma para determinar solo un nivel de P4, y >250 μL de plasma para determinar tanto P4 como E2.

3. Medición de CG en orina para detectar la ovulación y el embarazo

NOTA: Los niveles de CG en los titíes se pueden medir utilizando una prueba de kit inmunocromatográfico tanto para la ovulación como para el embarazo. En el caso de la ovulación, se puede obtener un resultado positivo 0-2 días antes de la ovulación. En el caso del embarazo, se detecta un resultado positivo desde los días 15-20 hasta aproximadamente el día 100 de embarazo. La prueba requiere una pequeña cantidad (90 μL) de orina (una gota de orina es ~30 μL).

  1. Método de la bandeja: Si hay más de dos animales en la misma jaula, mueva el tití objetivo (o los otros animales) a otra jaula el día anterior. Coloque una bandeja limpia en el fondo de la jaula la noche anterior o anterior al encendido. La orina no se drena de la vejiga durante la noche. Por lo tanto, la orina generalmente se libera de la vejiga poco después de la iluminación.
    NOTA: Entrar en la habitación por la mañana antes de la iluminación puede interrumpir el ciclo de sueño de la cohorte. Por lo general, la orina se puede recolectar aproximadamente 30 minutos después de la iluminación.
  2. Método de exprimido: Prepare las bandejas lavadas para la recolección de orina. Después de ubicar la vejiga del tití, apriétela con cuidado desde el frente y ambos lados usando toda la longitud de los dedos (Figura 1F). Recoja la orina justo antes de iluminar la habitación por la mañana.
    NOTA: Si la recolección de orina no tiene éxito debido a la ausencia de orina en la vejiga, espere un momento y vuelva a intentarlo. Tenga cuidado de no usar fuerza excesiva porque esto lastimará al animal.
  3. Inmediatamente después de la recolección, coloque la muestra de orina en el pocillo del kit de prueba inmunocromatográfica. Lea el resultado después de 10 minutos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

4. Control y determinación de la etapa del ciclo ovárico para la recolección de ovocitos, cigotos y embriones

  1. Recolección de ovocitos de vesículas germinales (GV) de los ovarios
    1. Administrar una inyección intramuscular de 3 μL de 0,263 mg/mL de cloprostenol (un análogo sintético de PGF2α) diluido en 150 μL de solución salina14 (Figura 2) para restablecer el ciclo ovárico al final de la fase lútea (es decir, ≥10 días después del inicio de la fase lútea).
      NOTA: Puede ser conveniente preparar la solución diluida en un volumen mayor, ya que el cloprostenol diluido se mantiene estable durante, al menos, varias semanas a +4 °C.
    2. Al día siguiente (día 1), confirme el inicio de la fase folicular comprobando que el nivel de P4 ha bajado.
      NOTA: Se ha reportado que la inyección de cloprostenol disminuye drásticamente los niveles de P4 (generalmente <10 ng/mL) dentro de las 24 h3.
    3. A partir del día 1, inyecte FSH (25 UI, intramuscular) una vez cada 2 días durante un total de 5 veces (días 1, 3, 5, 7 y 9). El día 10, inyecte hCG (75 UI, intramuscular) por la tarde.
    4. Recoger los GVs de los ovarios en el día 11 por aspiración folicular bajo anestesia según la literatura15,16.
      NOTA: A veces, la ovulación ocurre antes de lo esperado. Por lo tanto, se recomienda controlar los niveles de CG a partir del día 8. Si la prueba de GC es positiva, realice la recolección de GV ese día.
  2. Recolección de ovocitos de metafase II (MII), cigotos y embriones tempranos
    1. Restablezca el ciclo ovárico con cloprostenol como se describe en el paso 4.1.1.
    2. Al día siguiente (día 1), confirme el inicio de la fase folicular comprobando que el nivel de P4 ha bajado.
    3. Para la recolección de cigotos y embriones, aloje a los titíes hembra junto con los titíes machos para el apareamiento a partir del día 6.
    4. A partir del día 7, controle los niveles de P4/E2 en sangre y los niveles de CG en orina de las hembras. La detección de CG es una indicación de ovulación dentro de unos pocos días (generalmente al día siguiente). El día en que los niveles de P4 aumentan y los niveles de E2 disminuyen en comparación con el día anterior, se recogen ovocitos MII o cigotos embrionarios de día 0 (E0) de los oviductos17,18.
    5. Para la recolección de embriones, tal como se describe en la literatura, se debe realizar el lavado desde los oviductos (E1-E3, 1-8 células)17,18 o desde el útero (E5-E10, 8 células-blastocisto)19,20,21,22 en el momento adecuado, dependiendo de la etapa objetivo.

Resultados

Los detalles relacionados con los animales utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 1.

Análisis anatómicos de la vena femoral
Se realizaron análisis anatómicos de la vena femoral con un tití común macho de 2 años de edad (I 7713M) sometido a eutanasia. Las venas y arterias femorales se encuentran en el triángulo femoral. El triángulo femoral se forma en los límites entre la pared abdominal y los músculos del muslo (Figura 1B-D). En la base del muslo, una vena grande atraviesa el centro del triángulo invertido y una arteria corre en paralelo fuera de la vena. En la región inferior, las venas y las arterias se vuelven más delgadas y se superponen, con las arterias colocadas encima de las venas (Figura 1D).

Para la toma de muestras de sangre, se debe apuntar a la vena porque una lesión arterial puede causar hematoma en la arteria femoral, que puede conducir a un shock cardiovascular cuando la hemorragia es grave13. Aunque se puede extraer sangre de cualquier parte de la vena en el triángulo y su área distal, se recomienda la venopunción del sitio proximal del triángulo femoral debido al gran tamaño de la vena y su aparente poca superposición con la arteria. Además, la vena en el sitio proximal es superficial, lo que permite una fácil localización con una aguja. Debido a que pulsa, la arteria en el triángulo femoral a veces se identifica visualmente o por palpación, y la vena corre justo medial a ella. Por lo tanto, la observación de la pulsación arterial ayuda a predecir la ubicación de la vena.

Además, generalmente se observa una coloración azul indicativa de la vena debajo de la piel en la parte superior del triángulo (Figura 1B, C). Sin embargo, los ganglios linfáticos del triángulo a menudo se encuentran cerca de la vena y muestran un color azul oscuro, por lo que su apariencia es similar. Afortunadamente, se pueden distinguir por su movilidad: la vena es estacionaria y los ganglios linfáticos son móviles. Así, la pulsación de la arteria y el color azul de la vena son dos pistas importantes que se utilizan para localizar la vena, aunque puede ser necesario rasurar el vello para visualizarlas.

Determinación de la etapa del ciclo ovárico
Se monitorizaron los niveles de P4 y E2 en seis titíes hembra (de 1 a 3 años de edad) para investigar la duración de las fases folicular y lútea. Los resultados mostraron una duración promedio de 11,58 días (n = 6 de cuatro titíes) y 16,8 días (n = 5 de tres titíes) para las fases folicular y lútea, respectivamente (Tabla 2). A continuación, se describe en detalle la dinámica P4 y E2 de uno (I6751F, de 3 años) de los seis titíes. Las muestras de sangre y las mediciones hormonales en este animal se realizaron cada pocos días durante 38 días (Tabla 3).

Fase lútea (días 1-10)
El día de inicio de la medición se estableció como el día 1. Según el nivel de P4 (21 ng/mL), es probable que el animal se encontrara en la fase lútea. Se observó un nivel alto de P4 de los días 1 a 10 (≥21 ng/mL), lo que sugiere la fase lútea. El día 12, bajó bruscamente a 4 ng/mL. Esta disminución significativa indicó la transición de la fase lútea a la folicular. Una disminución en el nivel de E2 desde el día 10 (241 ng/mL) hasta el día 12 (189 ng/mL) también apoyó esta transición.

Fase folicular (días 12-22)
Después de la transición a la fase folicular, el nivel de P4 permaneció bajo (4-6 ng/mL) hasta el día 19 y luego aumentó ligeramente del día 19 al 24 (día 19, 6 ng/mL; día 22, 8 ng/mL; día 24, 9 ng/mL). Por el contrario, el nivel de E2 aumentó significativamente desde el día 19 (94 ng/mL) hasta el 22 (322 ng/mL) y luego disminuyó desde el día 22 hasta el día 24 (158 ng/mL). Sobre la base del aumento de P4 y la disminución de los niveles de E2, se predijo que la ovulación ocurrió entre los días 22 y 24, pasando de la fase folicular a la lútea.

Fase lútea (días 24-36)
Después de la ovulación, el nivel de P4 se mantuvo alto hasta el día 36 y luego bajó a 3 ng/mL el día 38. Por lo tanto, es probable que la transición de la fase lútea a la folicular ocurriera entre los días 36-38. De acuerdo con esta transición, el nivel de E2 disminuyó durante este período (día 36, 2517 ng/mL; día 38, 73 ng/mL).

Predicción y determinación del momento de la ovulación

Para examinar la relación entre el nivel de CG en orina y la fecha de ovulación, se prepararon siete titíes (Nº 1-7). Se inyectó cloprostenol para restablecer el ciclo ovulatorio (día 0). A continuación, se realizó una monitorización de los niveles de P4/E2 en sangre y de CG en orina a partir del día 7. La orina se recogió inmediatamente después del encendido. La toma de muestras de sangre se realizó fundamentalmente por la mañana. Se asumió que la ovulación ocurre cuando el nivel de E2 disminuyó en gran medida en comparación con el día anterior, según lo informado17. Ese día se observó efectivamente la rotura folicular en la superficie de los ovarios, y la presencia de cigotos/ovocitos en los oviductos (Tabla 4).

El GC se detectó por primera vez durante los días 7 a 11 (día 7, N = 1; día 8, N = 2; día 9, N = 1; día 10, N = 2; día 11, N = 1) (Tabla 4). La gran caída en los niveles de E2 (indicación de la ovulación) se observó 0-3 días después de la primera señal de GC. La duración desde la primera detección de CG hasta la disminución de E2 pareció ser grande cuando la primera detección de CG fue anterior (Figura 3A). Por ejemplo, un animal (Nº 1) mostró una caída en la señal E2 3 días después de la primera detección de CG el día 7 (Tabla 4). Por el contrario, la co-ocurrencia de la primera detección de CG y la caída de la señal E2 se observó en un animal (Nº 2) el día 10. Así, aunque la primera detección de GC y la ovulación se observaron el mismo día en uno de los cinco animales, la ovulación se produjo a los pocos días de la primera detección de CG.

El kit de prueba inmunocromatográfica para tití CG está diseñado para utilizar orina para las pruebas. El examen del nivel de GC suele acompañar a la determinación de los niveles de P4/E2 utilizando plasma sanguíneo. Será útil si se puede usar plasma sanguíneo, en lugar de orina, para la prueba de GC. Para probar esto, se examinó el plasma sanguíneo que quedó después de la medición del nivel de P4/E2 en los experimentos anteriores. Se recolectó plasma sanguíneo y orina de los cuatro animales en cualquiera de los días de los experimentos anteriores (los días de examen se indicaron con asteriscos dobles [**] en la Tabla 4). Utilizando orina, dos de los cuatro animales mostraron resultados positivos (puntuaciones 5 y 3), y los otros dos mostraron resultados negativos (puntuación 1). El plasma sanguíneo mostró esencialmente los mismos resultados que la orina (Figura 3B). La señal más fuerte se obtuvo mediante el uso de plasma sanguíneo. Por lo tanto, cuando se usa plasma sanguíneo, el juicio debe hacerse antes de los 10 minutos, que se establece para la orina.

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Figura 1: Extracción de sangre de titíes. (A) Se utiliza un retenedor para la recolección de sangre. (B) Parte superior del muslo de tití. (C) Triángulo femoral y vasos sanguíneos. La arteria femoral en el triángulo a menudo es visible y muestra pulsación. El color azul de la vena femoral a veces es visible en el área proximal del triángulo (indicado como el sitio de la flebotomía). Los ganglios linfáticos también muestran un color azul. Sin embargo, los ganglios linfáticos son móviles, ya que los ganglios linfáticos se adhieren a la piel. (D) Vista anatómica del muslo del animal sacrificado. Se indican la arteria, la vena y el sitio de la flebotomía. El mismo animal se muestra en B-D. (E) Extracción de sangre usando un retenedor. Se muestra la posición de sujeción de las patas del tití y la sangre que se extrae. (F) Recolección de orina de un tití. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Patrones típicos de los niveles de P4, E2 y CG durante el ciclo ovárico en titíes. Se indican los puntos temporales de las inyecciones de FSH, hCG y PGF2α. Las líneas discontinuas muestran el patrón hormonal esperado después de la inyección de PGF2α. Abreviaturas: P4 = progesterona; E2 = estradiol; CG = gonadotropina coriónica; FSH = hormona estimulante del folículo; hCG = gonadotropina coriónica humana; PGF2α = prostaglandina F2α. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Determinación del nivel de GC para predecir la aparición de la ovulación. (A) La posible relación entre el primer día de detección de CG (puntuación > 1) y la duración hasta la ovulación (caída E2). (B) El plasma sanguíneo se puede utilizar para pruebas inmunocromatográficas de CG. Un resultado representativo de cada puntuación (top). La puntuación se determinó 10 min después de la carga de la muestra. La puntuación 2 no representa ninguna banda en un plazo de 5 minutos, sino la aparición de una banda en un plazo de 10 minutos. La extracción de sangre se realizó poco después de la recolección de orina. Se examinaron cuatro titíes (Nº 1, 2, 3 y 5 en la Tabla S4). Las muestras utilizadas aquí se indican como asteriscos dobles en la Tabla 4. El plasma sanguíneo se diluyó al 50% mediante tampón de dilución utilizado para la medición de E2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Animales utilizados en este estudio. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Duración de las fases folicular y lútea. La fase se determinó a partir del nivel de P4 (fase folicular P4 ≤ 8, fase lútea P4 > 8). Cuando se observó un cambio de fase entre las mediciones, se determinó que el punto medio entre las fechas de medición era el punto de cambio. La duración entre los dos puntos de cambio se consideró como fases foliculares o lúteas. Para garantizar la medición de la duración de una sola fase, no se utilizaron para los análisis los datos con un intervalo largo (≥7 días) o dos veces de intervalos de ≥6 días en la misma fase, incluso cuando abarcaban las dos fases. Solo cuando se realizaron dos mediciones en la misma fase, se emplearon los datos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Resultados de las mediciones de P4 y E2 durante 38 días en un tití.Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 4: Determinación y predicción de días ovulatorios. Se consideró que los rastros de ovulación estaban presentes si se observaban sitios de sangrado o rupturas en los ovarios. Ovocito/cigoto indica las etapas del ovocito/cigoto obtenido de los oviductos el día de la caída de E2. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

La localización de la vena es el paso más crítico en la recolección de sangre. Sobre la base de las observaciones anatómicas, este protocolo presenta el área proximal en el triángulo femoral como un sitio fácil para la recolección de sangre en titíes. Usando esta área, se puede realizar fácilmente una muestra de sangre de una vena grande. Sin embargo, incluso usando este protocolo, a veces se producen lesiones en una arteria. Cuando se lesiona una arteria, se sugiere detener completamente el sangrado aplicando presión durante >5 minutos para prevenir el hematoma. Además, mientras se aplica presión, también es efectivo enfriar el sitio puntiagudo con un cubito de hielo. Los hematomas se pueden tratar con heparina (p. ej., Tensolvet 5.000 I.E. gel). La mayoría de los hematomas desaparecen después de 3-4 días consecutivos de tratamiento con heparina y 0,05 mL de meloxicam (0,5 mg/mL, p.o.). La arteria va lateralmente a la vena en la zona proximal del muslo. En el área distal, la vena y la arteria parecían estar más cerca entre sí y se superponían en mayor medida, con la arteria ubicada ventral a la vena. Sobre la base de esta relación posicional, es probable que la toma de muestras de sangre de la zona proximal del muslo tenga un menor riesgo de lesión arterial.

Además, la vena femoral en la región proximal es gruesa y está localizada superficialmente, lo que permite una fácil localización con una aguja. Sin embargo, la toma de muestras de sangre de la zona distal tiene la ventaja de dejar intactos los sitios proximales, lo que permite la repetición inmediata de la venopunción desde la zona proximal de la misma pierna, incluso si la vena se daña durante la toma de muestras de sangre. Esto se debe a que el área distal del sitio dañado generalmente no está disponible para la venopunción inmediata. Sin embargo, cuando la extracción de sangre no tiene éxito, se puede repetir la toma de muestras desde el sitio proximal de la otra pierna.

El volumen de sangre circulante en los titíes es de ~25 mL (70 mL/kg)23. Un tití de 350 g requiere 1 semana para recuperarse de una muestra de sangre de 2 mL, lo que equivale al 7,5% del volumen total de sangre6. De las venas femorales se pueden extraer sin dificultad 500-700 μL de sangre. Cuando se necesita un muestreo repetido, se recomienda recolectar cantidades más pequeñas de sangre y usar un tampón de dilución para el analizador automático.

Aunque la anestesia generalmente no se usa para la toma de muestras de sangre, para los principiantes, la muestra de sangre de animales anestesiados puede ser mucho más fácil que la de animales despiertos. Sin embargo, se debe tener precaución al usar anestesia para la toma de muestras de sangre, ya que la anestesia puede afectar los valores medidos de los componentes sanguíneos. En relación con las mediciones hormonales para determinar la etapa del ciclo ovárico, se informó que el alfaxalona resultó en niveles inesperadamente más altos de P424. Esto fue causado por la reactividad cruzada del anticuerpo anti-P4 a la alfaxalona, que es un derivado de P4.

Las estructuras de P4 y E2 (hormonas esteroides) son idénticas entre los humanos y los titíes. Por lo tanto, los kits comerciales de ELISA para humanos P4 y E2 están disponibles para los titíes P4 y E2. También se ofrecen servicios de externalización para la medición de hormonas en sangre humana. Por el contrario, existen ligeras diferencias en las secuencias de aminoácidos de las hormonas polipeptídicas, como FSH, CG e inhibina. Para estas hormonas polipeptídicas, si un kit se puede usar tanto para humanos como para otras especies evolutivamente distantes, como ratones, también funcionará para titíes. Para la medición de la inhibina B, se puede utilizar un kit de inmunoensayo enzimático de inhibina B (subunidad Beta B) para humanos/ratones/ratas.

Un aumento en el nivel de P4 es un sello distintivo de la ovulación (transición de la fase folicular a la lútea). Aunque las variaciones entre los individuos hacen que sea difícil determinar la fecha de la ovulación solo a partir del nivel de P4, un nivel de P4 de >8 ng/mL se puede utilizar como un indicador aproximado de la ocurrencia de la ovulación. Un indicador más fiable de la fecha de ovulación es una disminución en el nivel E2 3,17. De hecho, se observaron ovocitos/cigotos ovulados en los oviductos el día de la disminución de E2 (Tabla 4). Por lo tanto, la medición de E2 nos permite determinar la fecha exacta de ovulación. Además de los niveles hormonales, la información sobre el número de días después de la administración de PGF2α es un predictor del día de la ovulación (Tabla 4). De manera similar, el uso combinado de los niveles de P4 y E2 ayuda a identificar el momento de la transición a la fase folicular, cuando los niveles de P4 disminuyen drásticamente y los niveles de E2 están en su punto más bajo.

En los titíes, la CG, en lugar de la LH, se libera de la glándula pituitaria para inducir la ovulación. Además, el CG se excreta de las células del trofoblasto cuando los embriones se adhieren y se implantan en el endometrio. Debido a que los titíes carecen de un gen LH funcional, el CG, en lugar de LH, se libera de la glándula pituitaria para estimular la ovulación5. Un estudio informó que los picos E2 y CG, indicativos de ovulación, se observan el mismo día12. Otro estudio reportó que, en promedio, los picos de E2 (8,6 días después de la administración de PGF2α) preceden a los picos de GC (9,3 días después de la administración de PGF2α)25, lo que indica que la ovulación puede ocurrir antes de alcanzar los picos de GC. El CG, a diferencia del E2, se libera por pulso justo antes de su pico. La liberación del pulso de CG comienza, en promedio, ~ 1 día antes de su pico. Sin embargo, se observó una gran variación en la duración desde la primera detección del nivel de CG hasta la caída del nivel de E2 (Figura 3A y Tabla 4). Además, se ha reportado que el CG se detectó por primera vez en muestras tanto por la mañana como por la tarde25.

Hasta donde sabemos, no hay ningún reporte de ovulación en titíes que ocurra en un momento particular del día. Además, los titíes suelen liberar dos o tres ovocitos a la vez, por lo que puede haber un cierto período durante el cual se liberan todos los ovocitos. Dado que el aumento de los niveles de GC se produce antes de la ovulación, la medición del GC permite predecir la fecha de ovulación con antelación. Esta información es especialmente útil para la recogida de ovocitos MII o embriones de día 0 el día de la ovulación. Por lo tanto, es útil una medición combinada de los niveles sanguíneos de P4/E2 y los niveles de CG (Figura 3B). En la mayoría de las especies de primates, incluidos los humanos, la ovulación no ocurre durante un tiempo después del parto. Sin embargo, la ovulación posparto ocurre en los titíes ~ 10 días después del parto. En consecuencia, la próxima entrega a menudo se observa ~ 155 días después de la entrega anterior. Este embarazo secuencial, junto con el parto de gemelos, da como resultado un alto nivel de fecundidad en los titíes.

Las fluctuaciones hormonales varían entre los individuos, y algunos no tienen un ciclo constante. Algunos titíes hembra muestran niveles bajos constantes de P4/E2, lo que indica una falta de ovulación. La falta de un ciclo ovulatorio puede atribuirse a la inmadurez, problemas de salud, estrés o inhibición de la ovulación por parte de las hembras reproductoras dominantes26,27. Tres de los 21 titíes (de >2 años) que midieron los niveles hormonales mostraron la falta de un ciclo ovulatorio regular en las instalaciones de la autora. La comprensión de las causas y el desarrollo de tratamientos adecuados permitirán un uso más eficaz de los animales en los experimentos. Se observaron individuos con una fase lútea prolongada de ~1 mes y un alto nivel de P4 asociado2. En la instalación del autor, se repite una fase lútea prolongada en los mismos individuos. Dos de los 21 titíes mostraron esta anormalidad. Uno de los dos animales era de una sola casa, excluyendo la posibilidad de que el animal estuviera preñado durante la fase lútea prolongada. La otra está emparejada con un hombre presumiblemente infértil mediante tratamiento de radiación y, por lo tanto, es poco probable que esté embarazada durante la fase lútea prolongada. Incluso en una fase lútea prolongada, la administración de PGF2α disminuye el nivel de P4 y restablece el ciclo ovárico. La medición de las hormonas sexuales y la comprensión del estado del ciclo de ovulación ayudan al uso eficaz de los animales en experimentos y cría.

Las muestras de sangre de las personas se utilizan no solo para la estimación de la fecha de ovulación, sino también para las pruebas serológicas con fines diagnósticos. Del mismo modo, la medición de los niveles hormonales se utiliza no solo para estimar el día de la ovulación, sino también para estudiar la interacción social, el desarrollo infantil y las enfermedades. En el futuro, para la fabricación de titíes modificados genéticamente, se espera el desarrollo de ovarios y testículos a partir de células iPS. Los niveles hormonales adecuados deben ser importantes para el desarrollo normal. El protocolo descrito aquí será útil para la medición y el control de las hormonas sexuales para la producción de gónadas derivadas de células iPS en titíes.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a Chunshen Shen, Hiroko Akutsu, Fumiyo Sugiki, Yuuna Hashimoto, Hina Naritomi, Yuuki Sakamoto y Mikiko Horigome por su apoyo en el establecimiento de este protocolo y en el cuidado diario de los titíes; Takayuki Mineshige por sus comentarios sobre el manuscrito; Yukiko Abe y los miembros del laboratorio Aiba por compartir técnicas de recolección de cigotos; CIEA por compartir la información sobre el alojamiento de los titíes y los experimentos que han cultivado durante 40 años. Esta investigación fue apoyada por AMED, JST y KAKENHI bajo las subvenciones Nos. JP19gm6310010, JP20gm6310010, JP21gm6310010 y JP22gm6310010 (AMED), JPMJPR228B (JST), 20H05764, 20H03177 y 22K18356 (KAKENHI).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AIA-360Tosoh Corporation0019945Medición de hormonas (P4/E2)
AIA-PACK DILUYENTECONCENTRADO Tosoh Corporation0020956Medición de hormonas (P4/E2)
AIA-PACK SUBSTRATE SET IITosoh Corporation0020968Medición de hormonas (P4/E2)
AIA-PACK WASH CONCENTRATETosoh Corporation 0020955Medición de hormonas (P4/ E2)
CMS-1CLEA JapónAlimento para tití
EstrumateMSD Salud AnimalAnálogo PGF2alpha (cloprostenol)
Gonal-f Inyección subcutánea 150Merck Biopharma Co., Ltd.FSH
Gonatropina para inyección intramuscular 1000ASKA Pharmaceutical Co., Ltd.872413
solución inyectable de heparina sódica hCG 5.000 unidades/5 mLMochida Pharmaceutical Co., Ltd.224122458Kit
de prueba inmunocromatográfica de extracción de sangre para la detección de gonadotropina coriónica de tití común (doble comprobador)CLEA Japan, Inc.Determinación del nivel
de CG Iluminación de microscopio de doble brazo de perfil bajo LPF-SDSHIOKAZE GIKENLámpara de escritorio para la extracción de sangre
Dispositivo de retención de sangre titíJIC JapónJM-1006Extracción de sangre
http://www.jic-japan.jp/prd/marmoset/prd016.html
correo electrónico: vi@jic-japan.jp
Metacam 0.05%Boehringer Ingelheim Animal Health Japan Co., Ltd.Vaso de muestra para el tratamiento del hematoma
, 3 mL, PS, para Tosoh 360 y AIA-600 II, 1000/bolsaGlobe Scientific110913Medición de hormonas (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2Tosoh Corporation0025224Medición de hormonas (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 CALIBRADOR TosohCorporation0025324Medición de hormonas (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 SAMPLE DILUTING SOLUTIONTosoh Corporation0025524Medición de hormonas (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIIITosoh Corporation0025240 Medición de hormonas (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII CALIBRADORTosoh Corporation0025340 Medición de hormonas (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII SAMPLE DILUTING SOLUTIONTosoh Corporation  0025540Medición de hormonas (P4/E2)
Jeringa con aguja de 25 G (0,50 x 25 mm)TERUMOSS-01T2525Extracción de sangre
Tensolvet 5.000 I.E. gel.Dechra Pharmaceuticals14033492Tratamiento del hematoma
TOSOH MULTI-CONTROL SET TosohCorporation0015965Medición de hormonas (P4/E2)

Referencias

  1. Kholkute, S. D. Plasma progesterone levels throughout the ovarian cycle of the common marmoset (Callithrix jacchus). Primates. 25 (1), 123-126 (1984).
  2. Harding, R. D., Hulme, M. J., Lunn, S. F., Henderson, C., Aitken, R. J. Plasma progesterone levels throughout the ovarian cycle of the common marmoset (Callithrix jacchus). J Med Primatol. 11 (1), 43-51 (1982).
  3. Gilchrist, R. B., Wicherek, M., Heistermann, M., Nayudu, P. L., Hodges, J. K. Changes in follicle-stimulating hormone and follicle populations during the ovarian cycle of the common marmoset. Biol Reprod. 64 (1), 127-135 (2001).
  4. Gromoll, J., et al. A new subclass of the luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor lacking exon 10 messenger RNA in the New World monkey (Platyrrhini) lineage. Biol Reprod. 69 (1), 75-80 (2003).
  5. Müller, T., et al. Chorionic gonadotrophin beta subunit mRNA but not luteinising hormone beta subunit mRNA is expressed in the pituitary of the common marmoset (Callithrix jacchus). J Mol Endocrinol. 32 (1), 115-128 (2004).
  6. Pacchiarotti, A., et al. Ovarian stimulation protocol in IVF: an up-to-date review of the literature. Curr Pharm Biotechnol. 17 (4), 303-315 (2016).
  7. Ezcurra, D., Humaidan, P. A review of luteinising hormone and human chorionic gonadotropin when used in assisted reproductive technology. Reprod Biol Endocrinol. 12, 95(2014).
  8. Lopez-Gatius, F. Ovarian response to prostaglandin F(2alpha) in lactating dairy cows: A clinical update. J Reprod Dev. 68 (2), 104-109 (2022).
  9. Marini, R. P., Wachtman, L. M., Tardif, S. D., Mansfield, K., Fox, J. G. The Common Marmoset in Captivity and Biomedical Research. , Elsevier Science. (2018).
  10. Schultz-Darken, N. J. Sample collection and restraint techniques used for common marmosets (Callithrix jacchus). Comp Med. 53 (4), 360-363 (2003).
  11. Hopper, J. Common marmosets. Handbook of Exotic Pet. Kubik, M. , 27-42 (2020).
  12. Harlow, C. R., Hearn, J. P., Hodges, J. K. Ovulation in the marmoset monkey: endocrinology, prediction and detection. J Endocrinol. 103 (1), 17-24 (1984).
  13. Ludlage, E., Mansfield, K. Clinical care and diseases of the common marmoset (Callithrix jacchus). Comp Med. 53 (4), 369-382 (2003).
  14. Summers, P. M., Wennink, C. J., Hodges, J. K. Cloprostenol-induced luteolysis in the marmoset monkey (Callithrix jacchus). J Reprod Fertil. 73 (1), 133-138 (1985).
  15. Takahashi, T., et al. Birth of healthy offspring following ICSI in in vitro-matured common marmoset (Callithrix jacchus) oocytes. PLoS One. 9 (4), e95560(2014).
  16. Tomioka, I., Takahashi, T., Shimada, A., Yoshioka, K., Sasaki, E. Birth of common marmoset (Callithrix jacchus) offspring derived from in vitro-matured oocytes in chemically defined medium. Theriogenology. 78 (7), 1487-1493 (2012).
  17. Abe, Y., et al. Efficient marmoset genome engineering by autologous embryo transfer and CRISPR/Cas9 technology. Sci Rep. 11 (1), 20234(2021).
  18. Summers, P. M., Shephard, A. M., Taylor, C. T., Hearn, J. P. The effects of cryopreservation and transfer on embryonic development in the common marmoset monkey, Callithrix jacchus. J Reprod Fertil. 79 (1), 241-250 (1987).
  19. Thomson, J. A., Kalishman, J., Hearn, J. P. Nonsurgical uterine stage preimplantation embryo collection from the common marmoset. J Med Primatol. 23 (6), 333-336 (1994).
  20. Hanazawa, K., et al. Minimally invasive transabdominal collection of preimplantation embryos from the common marmoset monkey (Callithrix jacchus). Theriogenology. 78 (4), 811-816 (2012).
  21. Ishibashi, H., et al. Efficient embryo transfer in the common marmoset monkey (Callithrix jacchus) with a reduced transfer volume: a non-surgical approach with cryopreserved late-stage embryos. Biol Reprod. 88 (5), 115(2013).
  22. Kishimoto, K., et al. Establishment of novel common marmoset embryonic stem cell lines under various conditions. Stem Cell Res. 53, 102252(2021).
  23. Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Appl Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
  24. Daskalaki, M., Drummer, C., Behr, R., Heistermann, M. The use of alfaxalone for short-term anesthesia can confound serum progesterone measurements in the common marmoset: a case report. Primate Biol. 9 (2), 23-28 (2022).
  25. Hodges, J. K., Cottingham, P. G., Summers, P. M., Liang, Y. N. Controlled ovulation in the marmoset monkey (Callithrix jacchus) with human chorionic gonadotropin following prostaglandin-induced luteal regression. Fertil Steril. 48 (2), 299-305 (1987).
  26. Barrett, J., Abbott, D. H., George, L. M. Extension of reproductive suppression by pheromonal cues in subordinate female marmoset monkeys, Callithrix jacchus. J Reprod Fertil. 90 (2), 411-418 (1990).
  27. Barrett, J., Abbott, D. H., George, L. M. Sensory cues and the suppression of reproduction in subordinate female marmoset monkeys, Callithrix jacchus. J Reprod Fertil. 97 (1), 301-310 (1993).

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