Generación y verificación funcional de células T receptoras de antígenos quiméricos sensibles a la hipoxia

Summary

En este trabajo se presenta un protocolo para la generación y verificación funcional de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) sensibles a la hipoxia. Este protocolo presenta la generación de células CAR-T sensibles a la hipoxia basada en lentivirus y su caracterización, incluida la validación de la expresión de CAR dependiente de la hipoxia y la citotoxicidad selectiva.

Abstract

Numerosos estudios han demostrado la promesa de la terapia celular con receptores de antígenos quiméricos T (CAR-T) en el tratamiento de neoplasias hematológicas. Sin embargo, el tratamiento de los tumores sólidos sigue siendo un reto, como lo demuestran los problemas de seguridad que surgen cuando las células CAR-T atacan a las células normales que expresan los antígenos diana. Los investigadores han explorado varios enfoques para mejorar la selectividad tumoral de la terapia con células CAR-T. Una estrategia representativa en esta línea es la construcción de células CAR-T sensibles a la hipoxia, que se diseñan mediante la fusión de un dominio de degradación dependiente del oxígeno con la fracción de CAR y se diseñan estratégicamente para lograr una alta expresión de CAR solo en un entorno hipóxico: el microambiente tumoral (TME). En este artículo se presenta un protocolo para la generación de dichas células CAR-T y su caracterización funcional, incluyendo métodos para analizar los cambios en la expresión de CAR y la capacidad de matanza en respuesta a diferentes niveles de oxígeno establecidos por una cámara de incubación móvil. Se prevé que las células CAR-T construidas demuestren la expresión y la citotoxicidad de CAR de una manera sensible al oxígeno, lo que respalda su capacidad para distinguir entre TME hipóxico y tejidos normales normóxicos para la activación selectiva.

Introduction

La terapia de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR-T) ha representado un avance significativo en el tratamiento del cáncer. Desde que la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA, por sus siglas en inglés) aprobó la primera terapia CAR-T para tratar el linfoma avanzado/resistente y la leucemia linfoblástica aguda en 2017, ^1,2,3, 10 terapias CAR-T dirigidas a CD19 o antígeno de maduración de células B (BCMA) han recibido aprobación a nivel mundial^. Sin embargo, a pesar de la extensa investigación, replicar la notable eficacia de la terapia CAR-T en el tratamiento de neoplasias hematológicas malignas sigue siendo un desafío para su aplicación a tumores sólidos 5,6,7,8.

El microambiente tumoral inmunosupresor (TME, por sus siglas en inglés) es uno de los principales contribuyentes a la escasa eficacia de las CAR-T en el entorno de los tumores sólidos. La TME impide la actividad y la supervivencia de las células CAR-T debido a la insuficiencia de nutrientes, la hipoxia, un pH ácido y la acumulación de residuos metabólicos 9,10,11,12. La hostilidad adicional proviene de la infiltración de células inmunosupresoras como las células T reguladoras (Tregs), las células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) y los macrófagos asociados al tumor (TAM), que, junto con las células tumorales, secretan citocinas inmunosupresoras que causan una inhibición adicional de las células CAR-T una vez que ingresan al tumor^13,14.

Además de la insatisfactoria eficacia terapéutica, los problemas de seguridad son otro talón de Aquiles de las células CAR-T cuando se trata de tumores sólidos^15,16. El problema de seguridad surge del hecho de que ninguno de los antígenos específicos del tumor (TSA) identificados hasta ahora está estrictamente restringido a las células tumorales. En otras palabras, los antígenos asociados al tumor (TAA) elegidos como diana de la CAR, aunque muestran una mayor expresión en las células tumorales, a menudo también se expresan en los tejidos normales¹⁷. Por lo tanto, podrían producirse efectos en el objetivo y fuera del tumor a partir de la activación inesperada de las células CAR-T al reconocer eficientemente los tejidos normales, lo que llevaría al síndrome de liberación de citocinas (CRS), al síndrome de encefalopatía relacionada con CAR-T (CRES)¹⁸ y otros resultados adversos¹⁹.

Se han explorado muchas estrategias para evitar estos efectos, incluida la disminución de la afinidad de CAR para permitir que las células CAR-T distingan las células tumorales de las células normales en función de los niveles de expresión del TAA objetivo; equipar a las células CAR-T con un interruptor de apagado, como un gen suicida o un marcador de eliminación, para promover su eliminación tras una activación inesperada; la partición de las señales CD3ζ y coestimuladoras en dos fracciones de CAR, cuya participación simultánea es necesaria para la activación efectiva de las células CAR-T; utilizando un circuito sintético basado en Notch (synNotch) que restringe la actividad de las células CAR-T a las células objetivo que coexpresan dos TAA diferentes; y la ingeniería de células CAR-T para lograr la sensibilidad TME mediante la implementación de un mecanismo para ajustar la expresión de CAR a las señales ambientales cambiantes 20,21,22,23,24,25,26.

Una consideración clave en la opción de sensibilidad a la EMT descrita anteriormente es el bajo nivel de oxígeno en la EMT debido a la rápida proliferación de células tumorales. La adaptación de las células tumorales a la hipoxia depende de la activación del factor-1 inducible por hipoxia (HIF-1), un factor transcripcional heterodimérico que consta de una subunidad inducible, HIF-1α, y una subunidad expresada constitutivamente, HIF-1β²⁷. En condiciones normóxicas, la proteína HIF-1α experimenta ubiquitinación y rápida degradación proteasómica, dependiente de su dominio de degradación dependiente de oxígeno (ODD)²⁸. Cuando el suministro celular de oxígeno se limita, HIF-1 se estabiliza y activa la transcripción de sus genes diana aguas abajo mediante la unión a elementos de respuesta a hipoxia (HRE)²⁹. Dada la naturaleza de ODD y HRE como elementos sensibles al oxígeno, se han explorado para realizar la expresión condicional de CARs dentro del TME³⁰ hipóxico. En este trabajo se presenta un protocolo centrado en los métodos de caracterización fenotípica y funcional de las células CAR-T sensibles a la hipoxia, precedido de una breve descripción del diseño de la CAR y de los procedimientos de preparación de estas células. Este protocolo pretende proporcionar una guía útil para explotar el CAR sensible a la hipoxia para generar células CAR-T con toxicidad fuera del tumor restringida.

Protocol

En este estudio, se comparó HER2-BBz-ODD, un CAR sensible a la hipoxia dirigido a HER2 (Gene ID: 2064) con su contraparte regular, HER2-BBz. Los esquemas de los dos CAR se ilustran en la Figura 1A, que muestra que HER2-BBz-ODD se deriva de HER2-BBz agregando la secuencia ODD al C-terminal de CD3ξ. La construcción de vectores lentivirales que expresan los dos CARs y la generación del lentivirus correspondiente por transfección de células 293T ha sido descrita previamente³¹.

1. Generación de células CAR-T sensibles a la hipoxia por infección lentiviral

1. Descongele rápidamente las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) criopreservadas a 37 °C en un baño de agua. Transfiera las PBMC descongeladas a un tubo de 15 mL que contenga 9 mL de medio de cultivo de linfocitos libre de suero suplementado con 400 UI de IL-2, 5 ng/mL de IL-7 y 10 ng/mL de IL-15 (medio de crecimiento de células T humanas, denominado TGM a partir de entonces).
2. Después de tomar una alícuota para el recuento de células, centrifugar el tubo a 300 × g durante 5 min. Vuelva a suspender las PBMC peletizadas con TGM a una densidad de 4 × 10⁶ células/mL y transfiera la suspensión a una placa de 6 pocillos.
3. Prepare inmunoperlas recubiertas anti-hCD3/hCD28.
   1. Transfiera 100 μL de perlas magnéticas de IgG de ratón a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y lávelas 2 veces con un soporte magnético con PBS.
   2. Vuelva a suspender las perlas en 100 μL de PBS y añada 0,2 μg de anticuerpo anti-CD3 humano de ratón y 2 μg de anticuerpo anti-CD28 humano de ratón. Mezcle suavemente la mezcla con una pipeta y recoja durante la noche a 4 °C.
   3. Lave las perlas 2 veces con un soporte magnético con PBS y vuelva a suspenderlas en 100 μL de PBS.
4. En el paso 1.2, añada inmunoperlas recubiertas con anti-hCD3/hCD28 a la placa en una proporción de perlas por célula de 1:1. Coloque la placa en una incubadora humidificada con 5% de CO₂ a 37 °C.
5. Después de 48 h de incubación, transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 ml después de mezclar suavemente las células con una pipeta. Coloque el tubo en un soporte magnético durante 3 minutos, luego transfiera con cuidado el sobrenadante a un nuevo tubo de 15 mL para eliminar las inmunoperlas de los PBMC.
6. Tome una alícuota para el conteo de células, luego siembre las PBMC a 5 × 10⁵ células/pocillo en 300 μL de TGM en una placa plana de 48 pocillos. Añadir 200 μL de caldo lentiviral en los pocillos correspondientes y añadir sulfato de protamina hasta una concentración final de 10 μg/mL.
7. Centrifugar la placa a 1.000 × g a 32 °C durante 1,5 h y retirar y desechar con cuidado 300 μL de sobrenadante de cada pocillo con una pipeta. A continuación, añada 1 mL de TGM fresco con una pipeta y coloque la placa en una incubadora humidificada con 5% de_CO2 a 37 °C.
8. Agregue TGM fresco para ajustar la densidad celular a 0.5-2 × 10⁶ células/mL cada 2-3 días. Comience transfiriendo las células primero a una placa de 12 pocillos y luego a una placa de 6 pocillos. Continúe cultivando las células hasta que el número total alcance 6 × 10⁶ en un volumen de 4 ml.
   NOTA: Paralelamente, realice la transducción CAR de las células T Jurkat siguiendo los mismos procedimientos descritos anteriormente, excepto que el TGM se reemplaza con RPMI1640 medio que contiene un 10% de suero fetal bovino (FBS).

2. Evaluación de la expresión de CAR dependiente de oxígeno en células CAR-T mediante citometría de flujo

1. Coloque las células T transducidas por CAR del paso 1,8 en dos placas de 12 pocillos a una densidad de 2,5 × 10⁶ células/pocillo en 2 ml de TGM. Coloque una placa directamente en una incubadora humidificada con 5% de CO₂ a 37 °C (condición normóxica, ya que la condición estándar para las células de cultivo tiene 21% de O₂) y coloque la otra placa en una cámara de incubación móvil de CO₂/O₂/N₂ con el nivel de O₂ preestablecido al 1% (condición hipóxica) y luego mantenga la cámara en un lugar humidificado, Incubadora 5% CO₂/94% N₂ a 37 °C.
2. Cada 24 h, recoja 5 × 10⁵ células de las placas en condiciones hipóxicas o normóxicas en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugar los tubos a 500 × g durante 5 min, retirar el sobrenadante y resuspender suavemente las células en 1 mL de PBS mediante pipeteo. Repita el lavado de PBS una vez más.
3. Vuelva a suspender las células peletizadas en 50 μL de tampón FACS (PBS suplementado con 2% de FBS) en cada tubo. Añadir 50 μL de una dilución 1:100 de anticuerpo anti-Flag conjugado con PE (0,2 μg/mL) y mezclar bien mediante pipeteo. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 min.
4. Al final de la incubación, agregue 1 mL de tampón FACS a cada tubo. Mezclar bien pipeteando, luego centrifugar a 500 × g durante 5 min.
5. Retire y deseche con cuidado el sobrenadante con una pipeta y repita el paso 2.4 una vez más.
6. Retire y deseche con cuidado el sobrenadante con una pipeta. Vuelva a suspender las células en 200 μL de tampón FACS, luego transfiera la suspensión celular resultante a tubos de flujo de 5 mL.
7. Realice la citometría de flujo en la suspensión de la célula en el paso 2.6 para determinar la expresión de CAR en la superficie. Incluir linfocitos T no transfectados como control negativo.
   1. Utilice las puertas FSC/SSC y FSC-A/FSC-H para examinar células individuales vivas. Recopila 1 × 10^{4 eventos} individuales en vivo para cada muestra. Conecte las células positivas para EGFP (un marcador constitutivo transportado en el vector lentiviral como indicador de células T transducidas con éxito) y luego, las células positivas para ficoeritrina (PE) (células que expresan CAR) para medir la positividad de PE y la intensidad media de fluorescencia (MFI).

3. Análisis de la dependencia del oxígeno de la expresión de CAR en células Jurkat T modificadas con CAR mediante Western blot

1. Coloque las células Jurkat T transducidas por CAR de la sección 1 en dos placas de 48 pocillos a una densidad de 5 × 10⁵ células por pocillo (volumen de cultivo de 500 μL) en medio RPMI1640 con 10 % de FBS.
2. Para una placa, agregue CoCl₂ a los pocillos experimentales hasta una concentración final de 0 μM, 50 μM o 200 μM. A continuación, coloque la placa en una incubadora humidificada con 5% de_CO2 a 37 °C (condición normóxica). Para la otra placa, no agregue CoCl₂ y colóquela en una cámara de incubadora móvil de CO₂/O₂/N₂ con el nivel de O₂ preestablecido al 1% (condición hipóxica) antes de transferirla a la misma incubadora.
3. Después de 24 h de incubación, transfiera las suspensiones celulares a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugar los tubos a 500 × g durante 5 min. Retire y deseche completamente los sobrenadantes primero con una pipeta de 1 mL, luego con una pipeta de 100 μL y vuelva a suspender los gránulos celulares en 50 μL de tampón de muestra SDS-PAGE 1x.
4. Calentar las muestras en un baño de agua hirviendo durante 10 min. Coloque inmediatamente el tubo en hielo durante 30 s, luego centrifugue a 16.000 × g durante 30 s.
5. Cargue 30 μL de las muestras aclaradas en cada ranura de un gel SDS PAGE de 10 pocillos al 10% con un grosor de 1,5 mm. Haga funcionar el gel a 80 V durante 30 minutos, luego aumente el voltaje a 100 V y deje funcionar durante 1,5 h.
6. Al final de la electroforesis, transfiera las proteínas del gel a una membrana de PVDF utilizando el método de transferencia húmeda estándar, con la corriente y la duración establecidas en 400 mA y 1 h, respectivamente.
7. Bloquee la membrana en el tampón de bloqueo (5% de leche (p/v) en PBST (PBS+0,05% Tween-20)) durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, corte la pieza entre 30 kD y 40 kD para la detección del control de carga GAPDH y la pieza entre 50 kD y 70k D para la detección de las moléculas CAR.
8. Incubar las piezas de 30-40 kD y 50-70 kD con un anticuerpo anti-GAPDH de ratón (dilución 1:2.000) y un anticuerpo anti-Flag de ratón (dilución 1:2.000), respectivamente, en 3 mL de tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante 2 h o a 4 °C durante la noche.
9. Lave las membranas con PBST a temperatura ambiente en un balancín de plataforma durante 3 x 5 min.
10. Incubar las membranas con anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con HRP (dilución 1:5.000) en 3 mL de tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 h; luego lave la membrana con PBST durante 5 x 10 min.
11. Desarrolle las membranas mediante la incubación de las mismas con un sustrato HRP y, a continuación, visualice las bandas de proteínas detectadas mediante un analizador de imágenes luminiscentes.

4. Evaluación in vitro de la dependencia de oxígeno de la citotoxicidad mediada por células CAR-T sensibles a la hipoxia

1. En el día 0, siembra 1 × 10⁴ células diana (células SKOV3-Luc) por pocillo experimental en 200 μL de DMEM que contenían 10% de FBS en dos placas de cultivo de tejidos negras de fondo plano de 96 pocillos.
2. El día 1, retire con cuidado 100 μL del sobrenadante de la parte superior de cada pocillo. Agregue células CAR-T o células T no transducidas en proporciones efectora-objetivo de 1:1, 2:1 y 4:1 en 100 μL de medio DMEM que contenga 10% de FBS.
3. Coloque una placa en una atmósfera de 21% de O₂ y la otra en una atmósfera de 1% de O₂ utilizando una cámara de incubación móvil de CO₂/O₂/N₂ , como se describe en el paso 2.1.
   NOTA: Si no se dispone de una cámara incubadora móvil de CO₂/O₂/N₂ , se puede utilizar la adición de CoCl2_{al medio} de cultivo para imitar una condición hipóxica.
4. El día 2, después de 24 h de co-cultivo, transfiera cuidadosamente todo el sobrenadante (aproximadamente 150-200 μL) a una nueva placa de 96 pocillos con fondo en U utilizando una pipeta. Almacenar a -20 °C para su posterior detección de citocinas, siguiendo los procedimientos descritos en la sección 5.
5. Agregue 60 μL de tampón de lisis pasiva 1x a cada pocillo experimental de las placas negras de fondo plano de 96 pocillos del paso 4.4. A continuación, coloque las placas en un agitador y agite durante 30 minutos para garantizar una lisis celular eficaz.
6. Agregue 60 μL de sustrato de luciferasa de luciferasa de luciérnaga a cada pocillo experimental y mida la actividad de luciferasa inmediatamente usando un lector de microplacas.
7. Calcule la citotoxicidad normalizada (%) utilizando la ecuación (1):
   Citotoxicidad normalizada (%) = 100 - ×100 (1)

5. Detección de la secreción de IL-2 e IFN-γ por células CAR-T sensibles a la hipoxia

1. El día 0, prepare una dilución 1:250 de IL-2 o IFN-γ anticuerpo de captura en Coating Buffer. Agregue 100 μL del anticuerpo diluido a cada pocillo de una placa ELISA de 96 pocillos e incube la placa a 4 °C durante la noche.
   NOTA: El tampón de recubrimiento se fabrica disolviendo 7,13 g de NaHCO₃ y 1,59 g de Na₂CO₃ en 1 L de agua destilada y ajustando el pH a 9,5.
2. El día 1, retire el anticuerpo de captura no adsorbido volteando vigorosamente la placa boca abajo, luego lave los pocillos 3 veces con 200 μL de tampón de lavado (PBS que contiene 0.05% Tween 20).
3. Añada 200 μL de diluyente de ensayo (PBS que contenga un 10% de FBS) a cada pocillo e incube a temperatura ambiente durante 1 h.
4. Deseche la solución volteando vigorosamente el plato boca abajo; luego, lave los pocillos 3 veces con 200 μL de tampón de lavado.
5. Descongele las muestras/placas de sobrenadante congeladas del paso 4.4 a temperatura ambiente. Una vez que estén completamente descongelados, diluya las muestras y los patrones con el diluyente de ensayo. Añada 100 μL de muestras diluidas o patrones a cada pocillo de la placa ELISA recubierta e incube a temperatura ambiente durante 2 h.
   NOTA: Para la detección de IL-2, se recomienda una dilución de 10 veces, mientras que para la detección de IFN-γ, se prefiere una dilución de 50 veces.
6. Retire las muestras y los patrones volteando vigorosamente la placa al revés, luego lave los pocillos 5 veces con 200 μL de tampón de lavado por pocillo.
7. Prepare una solución de detección funcional diluyendo el anticuerpo de detección de IL-2 o el anticuerpo de detección de IFN-γ/estreptavidina-HRP (SAv-HRP) en una proporción de 1:250 en el diluyente de ensayo. Añada 100 μL de la solución de detección de trabajo a cada pocillo e incube la placa a temperatura ambiente durante 1 h agitando suavemente.
8. Deseche la solución y lave los pocillos 7 veces con 200 μL de tampón de lavado.
9. Agregue 100 μL de reactivo de sustrato a cada pocillo e incube la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad.
10. Añada 50 μL de solución de parada (1 M H₂SO₄) a cada pocillo. Lea inmediatamente la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas.

Results

La fusión del dominio ODD de HIF-1α con la fracción CAR representa una estrategia primaria para generar un CAR sensible a la hipoxia. El CAR sensible a la hipoxia dirigido a HER2 analizado en este estudio, denominado HER2-BBz-ODD, se construyó utilizando esta estrategia mediante la integración de la secuencia ODD en su HER2-BBz convencional (Figura 1A). En este estudio, utilizamos la transducción lentiviral para expresar HER2-BBz-ODD CAR o HER2-BBz CAR y, posteriormente, examinamos su sensibilidad al oxígeno en dos tipos de células: PBMC humanas y células T Jurkat.

El primer examen es la expresión de CAR en condiciones hipóxicas frente a condiciones normóxicas, que se llevó a cabo tanto en células T derivadas de PBMC transducidas con CAR por citometría de flujo como en células T Jurkat transducidas por CAR mediante Western blot. En el contexto de las células T derivadas de PBMC transducidas por CAR, observamos que CAR2-BBz-ODD CAR tenía una expresión significativamente mayor por debajo del 1% de_O2 que por debajo del 21% de_O2 en términos del porcentaje de células CAR positivas y la intensidad de fluorescencia media (MFI) (Figura 1B). El análisis de inmunotransferencia de las células T Jurkat transducidas por CAR también confirmó la inducción dependiente de la hipoxia de HER2-BBz-ODD.

Vale la pena señalar que, en este contexto, la condición hipóxica se puede imitar convenientemente agregando CoCl₂, un inductor químico de la hipoxia, al medio de cultivo. Como se ilustra en la Figura 1C, los resultados de la inmunotransferencia demostraron que la exposición a 50 o 200 μM de_CoCl2 recapituló el efecto de la exposición al 1% de_O2, induciendo marcadamente la expresión del CAR HER2-BBz-ODD, pero no la del CAR HER2-BBz. La caracterización funcional de la CAR sensible a la hipoxia se llevó a cabo con células CAR-T derivadas de PBMC. En el estudio, se utilizó una línea celular SKOV-3 portadora de luciferasa de luciferasa de luciérnaga como línea celular objetivo. Esta configuración nos permitió medir la actividad de la luciferasa asociada a las células diana como un proxy para evaluar la citotoxicidad mediada por células CAR-T cocultivadas.

Como se muestra en la Figura 1D, las mediciones indicaron que las células CAR-T HER2-BBz matan eficazmente a las células objetivo, independientemente de si la atmósfera era normóxica o hipóxica. Por el contrario, las células CAR-T HER2-BBz-ODD mostraron una citotoxicidad significativamente más débil en condiciones normóxicas para las tres relaciones E:T examinadas. Sin embargo, su citotoxicidad aumentó significativamente cuando se expusieron a condiciones hipóxicas. Los niveles sobrenadantes de IL-2 e IFN-γ también se midieron mediante ELISA después de cocultivar células CAR-T con células diana durante 24 h. Para ambas citocinas, se observó una mayor secreción por debajo del 1% de_O2 en comparación con el 21% de_O2 para las células CAR-T HER2-BBz-ODD, lo que es consistente con los datos de citotoxicidad. Por el contrario, las células CAR-T HER2-BBz mostraron una menor secreción de las dos citocinas por debajo del 1% de_O2 en comparación con el 21% de_O2, lo que indica un impacto adverso de la hipoxia en la actividad celular (Figura 1E). Tomados en conjunto, estos resultados validaron de manera convincente la naturaleza sensible a la hipoxia de HER2-BBz-ODD CAR.

Figura 1: Construcción y caracterización de células CAR-T sensibles a la hipoxia. (A) Representación esquemática de los diseños de un CAR sensible a la hipoxia, HER2-BBz-ODD, y su contraparte convencional, HER2-BBz. Ambos CAR constan de un péptido señal CD8α N-terminal, una etiqueta FLAG, un scFv humano dirigido a HER2, un dominio transmembrana y bisagra CD8, y una porción intracelular compuesta por un dominio coestimulador de 4-1BB, un dominio de señalización CD3ξ, un IRES y un EGFP. HER2-BBz-ODD difiere de HER2-BBz en la fusión de un dominio ODD con el C-terminal del dominio de señalización CD3ξ, lo que permite su expresión hipóxica dependiente al promover su degradación dependiente de ubiquitina en condiciones normóxicas. (B,C) Evaluaciones de la expresión dependiente de oxígeno de HER2-BBz-ODD CAR. (B) Se realizó una evaluación con células CAR-T derivadas de PBMC humanas después de cultivar por debajo del 1% o 21% de_O2 durante 24, 48 o 72 h mediante citometría de flujo. (C) La otra evaluación fue con células Jurkat T transducidas por CAR, donde los lisados celulares se recolectaron 24 h después de cultivar por debajo del 21% de O₂, 50 o 200 μM de CoCl₂, o 1% de O₂ y se analizó la expresión de CAR mediante Western blot, con células transducidas por CAR HER2-BBz incluidas como control. (D,E) Citotoxicidad in vitro y secreción de citocinas de células CAR-T en diferentes condiciones de oxígeno. (D) Las células CAR-T se cocultivaron con células SKOV3 que expresan luciferasa de luciferasa de luciérnaga en proporciones E:T indicadas por debajo del 1% o 21% de_O2. Después de 24 h de co-cultivo, la eficiencia de la eliminación de células diana se determinó midiendo el cambio en la actividad de luciferasa de luciérnaga asociada a la célula en relación con la de las células T no transducidas. (E) Los sobrenadantes se recolectaron para la detección de IL-2 e IFN-γ secretados. Los resultados se muestran como la media ± SEM (n = 3 donantes sanos) (****p < 0,0001). Abreviaturas: scFv = variable de fragmento de cadena simple; CAR = receptor quimérico de antígenos. Los paneles C y D son una adaptación de Liao et ^al.31. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Los problemas de seguridad son cuestiones importantes que deben abordarse para que cualquier terapia de células CAR-T avance hacia el uso clínico. La utilización de las propiedades únicas de las células tumorales o el TME se ha convertido en una dirección de investigación principal que se centra en el desarrollo de células CAR-T que se dirigen a los tejidos tumorales de forma selectiva. El diseño de un CAR-T sensible a la hipoxia es una estrategia atractiva en esta dirección, con varios enfoques que se están explorando, incluido el que se presenta en este estudio: fusionar la fracción de CAR con el dominio de la proteína ODD sensible a la hipoxia que ocurre naturalmente. Un enfoque alternativo consiste en sustituir un promotor constitutivo comúnmente utilizado para impulsar la expresión de CAR con un elemento de respuesta a la hipoxia (HRE), que se ha mostrado prometedor en estudios anteriores. Se cree que la combinación de elementos HRE y ODD (versiones de tipo salvaje o de ingeniería que ofrecen un control más estricto de la expresión) representa un diseño óptimo para un CAR inducible por hipoxia.

Este protocolo describe los procedimientos experimentales para generar y validar células CAR-T sensibles a la hipoxia. La implementación de este protocolo implica varias consideraciones clave. Una consideración primordial es la creación de condiciones hipóxicas. Entre los dos enfoques, la adición de CoCl₂ al medio de cultivo ha sido frecuentemente utilizada en estudios previos relacionados con la hipoxia, en gran medida gracias a su conveniencia^32,33. Sin embargo, es imposible medir el grado de hipoxia imitado por este enfoque. Por el contrario, el uso de una cámara de incubación móvil de CO₂/O₂/N₂ es ventajoso porque los niveles de_O2 se pueden ajustar con precisión y, por lo tanto, es adecuado para un análisis fino de la sensibilidad a la hipoxia de las células CAR-T. En este sentido, el nivel de hipoxia dentro de los tumores varía entre los diferentes tipos de tumores sólidos y los diferentes períodos de progresión tumoral³⁴, mientras que solo el 1% de_O2 se ejemplifica en el protocolo. Es una práctica óptima para los investigadores ajustar el nivel de oxígeno de acuerdo con la demanda real. Si el método de CoCl₂ es el único enfoque disponible, recomendamos incluir un rango de concentraciones de CoCl₂ en el ensayo para simular varios niveles de oxígeno.

La elección de un método apropiado para examinar la expresión de CAR dependiente de la hipoxia es otra consideración clave. Si bien el análisis de inmunotransferencia de las células T Jurkat transducidas con CAR es una opción conveniente durante la optimización de la construcción de CAR, el análisis del efecto de los niveles de oxígeno en la expresión de CAR de superficie en PBMC humanas transducidas por CAR mediante citometría de flujo sirve como la validación definitiva. Es óptimo examinar la dinámica de la expresión de CAR en respuesta a la transición de condiciones hipóxicas a normóxicas, como hicimos anteriormente con una versión mejorada de CAR sensible a la hipoxia, a saber, HiTA-CAR³⁵. Esto demostraría aún más la expresión de CAR restringida por hipoxia.

Para la verificación funcional de las células CAR-T sensibles a la hipoxia, el ensayo de citotoxicidad descrito en el protocolo implica el uso de células diana portadoras de luciferasa de luciferasa de luciérnaga. Este ensayo basado en reporteros puede ser reemplazado por otros métodos de evaluación de la muerte, como el método CCK8 y el método de análisis celular en tiempo real (RTCA), donde se pueden usar células tumorales no modificadas. El análisis RTCA también es ventajoso para medir la cinética de eliminación en tiempo real de las células CAR-T. Para medir la citotoxicidad específica causada por las células CAR-T, se deben incluir PBMC no transducidas como control. Es deseable una alta eficiencia de transducción de las PBMC para evitar preocupaciones de que las diferencias en la citotoxicidad detectada entre los grupos experimental y de control surjan de una muerte inespecífica mediada por cantidades variables de células efectoras añadidas.

Hay varias limitaciones en este protocolo. Las condiciones hipóxicas pueden afectar la viabilidad tanto de las células diana como de las células T^36,37, lo que introduce la preocupación de que la muerte celular no relacionada con la citotoxicidad mediada por células CAR-T pueda confundir la interpretación de los resultados de los ensayos. Se sugiere asegurarse de que tanto las células CAR-T como las células diana tengan una excelente viabilidad inmediatamente antes del ensayo para evitar o minimizar tales preocupaciones. También hay que tener en cuenta que la validación in vitro no garantiza el éxito de la traducción in vivo. Siempre se necesitan evaluaciones in vivo para confirmar si el candidato a CAR-T sensible a la hipoxia podría evitar dirigirse a los tejidos normales que expresan el antígeno objetivo

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo de centrífuga de 1,5 mL	QSP	509-GRD-Q	Supernadantes y células Protocolo Cellection Paso 2,3,4
10% ExpressCast PAGE	NCM biotech	P2012	Protocolo Immunoblotting Paso 3
10x PBS	NCM biotech	20220812	Protocolo de cultivo celular Paso 4
Pipeta de 10 mL	Yueyibio	YB-25H	Pipetting Protocolo Paso 1
Tampón de electroforesis 10xTRIS-Glycine-SDS	Epizyme	3673020	Immunoblotting Protocolo Paso 3
15 mL Tubo de centrífuga	Thermo Scientific	339650	Supernadantes y células cellection Protocol Paso 1
25 cm2 EasYFlask	Thermo Scientific	156367	Protocolo de cultivo celular Paso 3,4
4x Protein SDS PAGE Tampón de carga	Takara	9173	Protocolo Immunoblotting Paso 3
Placas de cultivo de tejidos de fondo plano de 6 pocillos	Protocolo de cultivo de células T	Thermo Scientific	140675
Placas de cultivo de tejidos negras de fondo plano de 96 pocillos	Greiner	655090	Protocolo de ensayo de citotoxicidad Paso 4
Placas ELISA de 96 pocillos	Corning	3590	Protocolo ELISA Paso 5
Agitador de placas de 96 pocillos	QILINBEIER	MH-2	Protocolo Shake Paso 4
Placas de cultivo de tejidos con fondo en U de 96 pocillos Thermo	Scientific	268200	Supernadantes Protocolo cellection Paso 4,5
anticuerpo anti-FLAG	Sigma	F1804-50UG	Protocolo Immunoblotting Paso 3
Carbinol	Sinopharm	10010061	Protocolo Immunoblotting Paso 3
Incubadora de dióxido de carbono	Thermo Scientific	360	Protocolo de cultivo celular Paso 1,2,3,4
Placa de recuento de células	Hausser scientific	1492	Protocolo de recuento de células Paso 1,3,4
CELLection Pan Mouse IgG Kit	Thermo Scientific	11531D	Mouse IgG perlas magnéticas Protocolo Paso 1
Centrífuga	Thermo Scientific	75002432	Cultivo celular Protocolo Paso 1,3,4
Sistema de imagen en gel de quimioluminiscencia	BIO-RAD	12003154	Protocolo Immunoblotting Paso 3
Solución de cloruro de cobalto (0,5 M)	bioleaper	BR4000203	Condición hipóxica Protocolo Paso 2,3,4
DMEM	Corning	10-103- Protocolo de	cultivo de células CV Paso 4
Balanza electrónica	Sartorius	PRACTUM612-1CN	Protocolo de peso Paso 5
FBS	BI	04-001-1ACS	Protocolo de cultivo celular Paso 3,4
GAPDH Ratón mAb	ABclonal	AC002	Protocolo Immunoblotting Paso 3
Aparato de electroforesis en gel	BIO-RAD	1645070	Protocolo Immunoblotting Paso 3
Lectores de microplacas GloMax	Promega	GM3000	Medición de la actividad de la luciferasa Protocolo Paso 4
IgG (H+L) anti-ratón	cabra Yeasen	P1126151	Protocolo Immunoblotting Paso 3
Centrífuga de microcongelación de alta velocidad	eppendorf	5810  R	Protocolo de cultivo de células Paso 1
IFN-& Conjunto de ELISA	BD	555142	protocolo ELISA paso 5 Artículos: IFN-y gamma humano recombinante; Estándar liofilizado, anticuerpo de detección biotina anti-IFN-humano y gamma; , Captura de anticuerpos anti-humanos purificados IFN-γ, Reactivo enzimático Estreptavidina-rábano picante peroxidasa conjugado (SAv-HRP)
Conjunto de ELISA IL-2 humano	BD	555190	ELISA Protocolo Paso 5 Artículos: Estándar liofilizado de IL-2 humano recombinante, Anticuerpo de detección Biotina anti-IL-2 humana , Anticuerpo de captura Anti-IL-2 humano purificado, Reactivo enzimático Conjugado de peroxidasa estreptavidina-rábano picante (SAv-HRP)
IL-15	R& D systems	P40933	Protocolo de cultivo de células T Paso 1
IL-21	Novoproteína	GMP-CC45	Protocolo de cultivo Paso 1
IL-7	R& Sistemas	D P13232	Protocolo de cultivo de células T Paso 1
Microscopio invertido	Olympus	CKX41	Protocolo de cultivo celular Paso 1,3,4
Jurkat	ATCC	TIB-152	Protocolo de construcción CAR-Jurkat Paso 3
LSRFortessa	BD	Protocolo de citometría de flujo	LSRFortessa
Sistema	de ensayo de luciferasaEnsayo indicador de	E1501	Protocolo Paso 4 Artículos: Tampón de lisis pasiva, sustrato de luciferasa luciferasa de luciérnaga
Lector de microplacas	BioTek	HTX	ELISA Protocolo Paso 5
móvil CO2/O2/N2 Cámara de incubadora	Innovation Instrument Co., Ltd.	Smartor118	Protocolo de condición hipóxica Paso 2, 3, 4
Ratón Anti-Hexa Etiqueta de histidina	Sigma	SAB2702218	Protocolo Immunoblotting Paso 3
Tampón de transferencia rápida NcmBlot	NCM biotech	WB4600	Immunoblotting
NcmECL Ultra	NCM biotech	P10300	Protocolo Immunoblotting Paso 3 Artículos: NcmECL Ultra Luminol/Reactivo Potenciador (A) ,NcmECL Reactivo de Peróxido Ultra Estabilizado (B)
Placas planas de 48 pocillos recubiertas de NovoNectin	Construcción	de células CAR-T GMP-CH38	Paso 1
Juego de comprimidos OPD (diclorhidrato de o-fenilendiamina)	Sigma	P9187	Protocolo de reactivo de sustrato Paso 5 Artículos: Tableta de OPD (lámina de plata),Tableta de peróxido de hidrógeno urea (lámina de oro)
Conjugado con PE anti-DYKDDDDK	Biolegend	637310	Protocolo de citometría de flujo Paso 2
Sulfato de protamina	Sigma	P3369-1OG	Protocolo de infección por lentivirus Paso 1 Marcador
proteína 10 Kda-250 KDa	Epizyme	WJ102	Protocolo Immunoblotting Paso 3
Cultivo de células T 566685 CD3 BD de ratón humano <[> de ratón NA/LE purificadas			Paso 1
T 555725 CD28 BD BD de ratón NA/LE purificadas			Paso 1 Protocolo de cultivo de células
membrana de PVDF	Millipore	168627	Protocolo Immunoblotting Paso 3
Protocolo RPMI 1640	Corning	10-040-CVRC	Cell culture Paso 3
Leche desnatada en polvo	Yeasen	S9129060	Protocolo Immunoblotting Paso 3
SKOV3-Luc	ATCC	HTB-77	Ensayo de citotoxicidad Protocolo Paso 4
Tripsina-EDTA	NCM biotech	C125C1	Protocolo de cultivo celular Paso 4
Tween 20	Sinopharm	30189328	Protocolo Immunoblotting Paso 3
Baño de agua	keelrein	NB014467	Heating Protocol Paso 1
X-VIVO 15	LONZA	04-418Q	Medio de cultivo de linfocitos sin suero Protocolo Paso 1