Artículo de método

Un modelo de dolor inflamatorio modificado para estudiar el efecto analgésico en ratones

DOI:

10.3791/66701

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15 de noviembre de 2024

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1School of Pharmacy, Key Laboratory of Molecular Pharmacology and Drug Evaluation, Ministry of Education, Collaborative Innovation Center of Advanced Drug Delivery System and Biotech Drugs in Universities of Shandong, Yantai University, 2Department of Neurosurgery, The Third Hospital of Hebei Medical University

En este artículo

Resumen

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Aquí, presentamos un modelo de dolor inflamatorio modificado con la inyección de carragenina en ambas patas traseras para evaluar el efecto analgésico.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La prueba de la placa caliente es ampliamente utilizada para evaluar los efectos analgésicos sobre el dolor inflamatorio en ratones. Un modelo de dolor inflamatorio comúnmente utilizado fue inducido con una inyección intraplantar de carragenina en una pata trasera. Sin embargo, los hallazgos de nuestro laboratorio mostraron que los ratones con una sola inyección de carragenina en la pata trasera levantaron las patas para evitar la nocicepción térmica durante la prueba de la placa caliente. Debido a esta respuesta, el método de inyección anterior no puede reflejar con precisión el umbral de dolor térmico. Por lo tanto, investigamos un nuevo método para evitar este problema. En el presente estudio, modificamos el método anterior inyectando carragenina en ambas patas traseras para establecer el modelo de dolor inflamatorio. Los resultados demostraron que la inyección de carragenina en ambas patas traseras fue sensible y un mejor método para inducir dolor inflamatorio cuando se utilizó la prueba de la placa caliente que la inyección de una sola pata trasera. Sobre la base de estos hallazgos, diseñamos nuevos experimentos en los que los ratones con inyección de carragenina en ambas patas traseras o en una sola pata trasera fueron tratados por vía intragástrica con celecoxib (30 mg/kg). Los resultados de la prueba de la placa caliente mostraron que celecoxib aumentó el umbral de dolor térmico en ratones con inyección de carragenina en ambas patas traseras, pero no en ratones con inyección de carragenina en una sola pata trasera. En resumen, desarrollamos un método superior para inducir un modelo de dolor inflamatorio para evaluar el efecto analgésico.

Introducción

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El dolor es un problema de salud pública en todo el mundo. Se desencadena por estimulación térmica, mecánica o química nociva. Es difícil realizar estudios del dolor en humanos debido a preocupaciones éticas. Por lo tanto, el uso de modelos animales de dolor es un enfoque clave para comprender los mecanismos del dolor y los tratamientos de investigación1. La prueba de la placa caliente ha sido ampliamente utilizada para la evaluación de la nocicepción térmica y la hiperalgesia2. Actualmente, el modelo de dolor inflamatorio utilizado para la prueba de la placa caliente se induce con una inyección intraplantar de carragenina en una pata trasera. Por ejemplo, para investigar el efecto antinociceptivo de las microesferas cargadas de rotigotina, se preparó un modelo animal de dolor inflamatorio mediante una inyección en una sola pata trasera3. Para evaluar los efectos de los inhibidores de la catecol-o-metiltransferasa sobre la nocicepción térmica en ratones, se administró carragenina en la región plantar de la pata trasera derecha4. Para investigar el papel analgésico del extracto de Posidonia oceanica (L.) Delile, se preparó un modelo de dolor inflamatorio en ratones mediante inyección intraplantar de carragenina en la pata trasera derecha5. Sin embargo, los hallazgos de nuestro laboratorio mostraron que un ratón con la inyección de carragenina en una sola pata trasera levantaría su pata para evitar la nocicepción térmica, lo que extiende incorrectamente la respuesta del animal a un estímulo térmico en la prueba de la placa caliente. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que el modelo de dolor inflamatorio con la inyección de carragenina en una sola pata trasera no podía reflejar con precisión el umbral de dolor térmico. Por lo tanto, optimizamos el método inyectando carragenina en ambas patas traseras para establecer un modelo de dolor inflamatorio modificado.

Los ratones sometidos a la inyección de carragenina en ambas patas traseras no tenían forma de evitar el estímulo térmico de ambas patas traseras al mismo tiempo. El umbral del dolor se definió como el tiempo que transcurre desde que el ratón coloca el ratón en la placa caliente hasta que el ratón lame cualquiera de las patas traseras. Los resultados confirmaron que el modelo de dolor inflamatorio modificado es más adecuado para evaluar el umbral de temperatura nociceptivo. Esto puede mejorar la eficacia de la prueba de la placa caliente para la investigación y el desarrollo de fármacos analgésicos.

Protocolo

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El protocolo experimental fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yantai (No. YTDX20220425). Los procedimientos siguieron las Pautas de los Institutos Nacionales de Salud para el Uso de Animales de Laboratorio.

1. Animales

  1. Utilice ratones hembra ICR que pesen entre 20 y 25 g para los experimentos.
  2. Permita que los animales se aclimaten al entorno de la sala experimental durante 3 días antes de comenzar los experimentos.
  3. Mantenga la sala experimental con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas y proporcione a los ratones acceso libre al agua y la comida.

2. Preparación de la solución de carragenina

  1. Pesa 0,1 g de carragenina. Agregue 10 mL de solución salina normal esterilizada a un tubo.
  2. Añadir 0,1 g de carragenina al tubo y agitar el tubo durante 30 s.
  3. Recoja la solución de carragenina esterilizada al 1%.
  4. Prepare la solución de carragenina antes de los experimentos.

3. Inyección intraplantar de carragenina

  1. Use una jeringa (0,05 ml, 29 g x 1/2 pulgada, 0,33 mm × 12,7 mm) para inyectar la solución de carragenina al 1%.
  2. Agite la solución de carragenina antes de introducirla en la jeringa. Asegúrese de que no haya burbujas en la jeringa.
  3. Desinfecte el lugar de la inyección (pata trasera) con alcohol al 75%.
  4. Inyectar 30μL 6,7 de solución de carragenina al 1% por vía subcutánea en la superficie plantar de la pata trasera. Para los ratones del grupo de control, inyectar 30 μL de solución salina normal.
    1. Inserte la aguja en diagonal hacia arriba en la almohadilla del pie de la pata trasera. Mantener la estabilidad de la jeringa.
    2. Después de la inyección, retire la jeringa lentamente y presione el lugar de la inyección durante 2 segundos para evitar fugas.

4. Prueba de placa caliente

  1. Realice la prueba de la placa caliente 3 h después de la inyección intraplantar.
  2. Limpie y desinfecte la superficie de la placa calefactora.
  3. Encienda el aparato de placa calefactora. Haga clic en el botón Modo de temperatura . Haga clic en CONSTANTE para ajustar la temperatura a 55 ± 0,2 °C.
  4. Haga clic en el botón Iniciar experimento y haga clic en REACH. Tome un ratón del contenedor de alojamiento. Agarra suavemente su tronco. Coloque el mouse en el centro de la placa calefactora. Haga clic en INICIO.
  5. Observe y registre el tiempo para lamer la pata trasera izquierda (para ratones con inyección de una sola pata trasera) o la pata trasera (para ratones con inyección de ambas patas traseras) en respuesta a la estimulación del calor. Presione el pedal de la placa calefactora para ver la hora en la pantalla de la placa calefactora. Defina el umbral de dolor como el tiempo que transcurre desde que se coloca el ratón en la placa caliente hasta que se lame la pata trasera.
  6. Establezca un límite de 60 s para la prueba de la placa caliente 4,8,9. Registre un umbral de dolor de 60 s si se alcanza el límite.
    NOTA: Limpie el aparato de placa caliente con alcohol al 75% antes de colocar el siguiente mouse para evitar posibles sesgos debido al olor residual del mouse anterior.

5. Preparación de 1,5 mg/mL de suspensión de celecoxib

  1. Tomar 1 cápsula que contiene 200 mg de celecoxib. Obtén el contenido de la cápsula y muélela hasta convertirla en polvo.
  2. Añadir carboximetilcelulosa sódica al 0,5%. El volumen final es de 13,3 mL. Esta es la suspensión de celecoxib.
  3. Tome 1 mL de la suspensión de celecoxib de la tienda. Añadir 9,0 mL de carboximetilcelulosa sódica al 0,5% para obtener 1,5 mg/mL de suspensión de celecoxib.
  4. Administrar 0,2 mL/10 g de la suspensión de celecoxib por vía intragástrica a los ratones.
    NOTA: Seleccione una aguja de sonda nasogástrica de 4,0-4,5 cm de longitud para ratones que pesen entre 20 y 25 g.

6. Evaluación del modelo de dolor inflamatorio modificado

  1. Divida aleatoriamente ratones hembra ICR en tres grupos: grupos de control, modelo y celecoxib.
  2. Inyectar 30 μL de solución de carragenina al 1% por vía subcutánea en la superficie plantar de la pata trasera (pata trasera simple o pata trasera ambas). Para los ratones del grupo de control, inyectar 30 μL de solución salina normal.
  3. Después de la inyección de carragenina o solución salina normal, realice el tratamiento inmediatamente. Administración intragástrica de celecoxib a una dosis de 30 mg/kg para los ratones del grupo de celecoxib. Para los ratones de los grupos control y modelo, administrar por vía intragástrica carboximetilcelulosa sódica al 0,5%.
  4. Realice la prueba de la placa caliente (sección 2) a las 3 h después de la inyección de carragenina.

7. Métodos estadísticos

  1. Presentar los resultados experimentales como media ± desviación estándar. Realice una prueba de distribución de normalidad con la prueba estadística de bondad de ajuste de Kolmogorov-Smirnov.
  2. Analice la comparación entre los dos grupos utilizando una prueba t no apareada. Realice comparaciones de múltiples grupos utilizando un análisis de varianza unidireccional seguido de la prueba de Dunnett. Considere que el valor de p < 0,05 es estadísticamente significativo.

Resultados

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El umbral del dolor en los modelos de dolor inflamatorio
El umbral de dolor del modelo de dolor inflamatorio con inyección de carragenina en una sola pata trasera fue de 32,23 ± 11,11 s, mientras que el umbral de dolor del grupo control fue de 27,73 ± 7,08 s. En comparación con el grupo control, el umbral de dolor del modelo de inyección de una sola pata trasera no mostró una reducción significativa (p > 0,05, Figura 1A). El umbral de dolor del modelo de dolor inflamatorio con inyección de carragenina en ambas patas traseras fue de 21,84 ± 5,63 s, mientras que el umbral de dolor del grupo control fue de 28,21 ± 8,61 s. En comparación con el del grupo control, el umbral de dolor del modelo de inyección de ambas patas traseras disminuyó significativamente (p < 0,05, Figura 1B).

El efecto analgésico del celecoxib en diferentes modelos de dolor inflamatorio
En el modelo de dolor inflamatorio con una sola inyección de carragenina en la pata trasera, el umbral de dolor del grupo de celecoxib (27,01 ± 10,98 s) no mostró un aumento significativo en comparación con el del grupo modelo (29,77 ± 13,97 s, p > 0,05). De acuerdo con los resultados anteriores, el umbral de dolor del grupo modelo no mostró una reducción significativa en comparación con el del grupo control (30,94 ± 14,54 s), lo que indicó que la inyección de carragenina en una sola pata trasera no indujo un modelo de dolor inflamatorio (Figura 2A). En el modelo de dolor inflamatorio con inyección de carragenina en ambas patas traseras, el umbral de dolor del grupo modelo (15,61 ± 4,85 s) disminuyó significativamente en comparación con el del grupo control (23,55 ± 3,96 s, p < 0,05). En comparación con el grupo modelo, el umbral de dolor del grupo de celecoxib (20,29 ± 3,10 s) disminuyó significativamente (Figura 2B).

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Figura 1: Los umbrales de dolor en los modelos de dolor inflamatorio (Media ± desviación estándar, n = 15). (A) El umbral del dolor del modelo de dolor inflamatorio con la inyección de carragenina en una sola pata trasera. (B) El umbral de dolor del modelo de dolor inflamatorio con inyección de carragenina en ambas patas traseras, (#P<0.05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Efecto analgésico del celecoxib en diferentes modelos de dolor inflamatorio (Media ± desviación estándar, n = 14). (A) El efecto analgésico de celecoxib en el modelo de dolor inflamatorio con la inyección de carragenina en una sola pata trasera. (B) El efecto analgésico de celecoxib en el modelo de dolor inflamatorio con inyección de carragenina en ambas patas traseras, ( #P<0.05, *P<0.05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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El dolor es una respuesta protectora desencadenada por un daño o lesión en los tejidos. Sin embargo, también tiene un impacto negativo en la calidad de vida10. Por lo tanto, el desarrollo de analgésicos efectivos y la exploración de los mecanismos del dolor siguen siendo áreas activas de investigación. Los métodos de evaluación del dolor desempeñan un papel clave en el desarrollo de fármacos analgésicos. La inyección de carragenina en una sola pata trasera es un método clásico para la prueba de la placa caliente. El modelo modificado inducido por la inyección de carragenina en ambas patas traseras que presentamos aquí proporciona una forma fiable de investigar la eficacia de posibles agentes terapéuticos para aliviar el dolor.

En el presente estudio, encontramos que los ratones con la inyección de carragenina en una sola pata trasera no mostraron una disminución en el umbral del dolor. Sin embargo, en otros estudios, este método condujo a reducciones significativas en el umbral del dolor en la prueba de la placa caliente11,12. La discrepancia en los resultados entre los estudios previos y este estudio puede explicarse por las diferentes especies animales utilizadas en los experimentos 13,14,15,16. Otra posible explicación es que observamos que los ratones con la inyección de carragenina en una sola pata trasera a menudo levantaban la pata inyectada o pisaban ligeramente el plato para evitar el estímulo térmico. La evaluación del umbral del dolor requiere observar la respuesta nociceptiva típica de lamer o sacudir la pata inyectada. Por lo tanto, obtuvimos un resultado negativo, lo que indica que el umbral de dolor del modelo con la inyección de carragenina en una sola pata trasera no disminuyó significativamente. Los ratones con inyección de carragenina en ambas patas traseras no pudieron evitar el estímulo térmico levantando la pata o pisando ligeramente el plato. El umbral de dolor se consideró como lamer o sacudir cualquiera de las patas traseras, lo que refleja la respuesta nociceptiva real de los ratones.

Para verificar la superioridad del modelo de dolor inflamatorio modificado, los ratones con inyecciones de carragenina en una sola pata trasera o en ambas patas traseras fueron tratados con la administración intragástrica de celecoxib. De acuerdo con la hipótesis de este estudio, celecoxib ejerció un efecto analgésico en el modelo de dolor inflamatorio modificado, pero no mostró ningún efecto en el modelo con inyección de carragenina en una sola pata trasera. Este hallazgo demostró que el modelo de dolor inflamatorio modificado es fiable para el cribado de posibles analgésicos.

Este estudio tiene limitaciones. Se han utilizado muchas cepas diferentes de ratones en las pruebas de placa caliente. Diferentes cepas de ratones pueden mostrar diferentes respuestas a los estímulos térmicos. El presente experimento utilizó solo ratones ICR para probar la hipótesis. Por lo tanto, queda por determinar si el método modificado detecta de manera precisa y consistente los umbrales de dolor en las otras cepas de ratón en la prueba de la placa caliente. Además, no diseñamos un experimento piloto para evaluar el umbral de dolor de los ratones y, por lo tanto, no excluimos a ningún animal con un umbral de dolor alto. Sin embargo, esta limitación también puede considerarse como una ventaja del método modificado actual. No solo simplifica el proceso de la prueba analgésica, sino que también refleja el rango de respuestas de los ratones en la prueba de placa caliente. Además, la medición del volumen de las patas traseras ayudará a confirmar la inducción de la inflamación y a verificar el efecto analgésico de los antiinflamatorios no esteroideos (AINE). Sin embargo, nuestra experiencia demostró que no es fácil medir el volumen de la pata de los ratones. La pata del ratón es demasiado pequeña para obtener un valor exacto. Por lo tanto, el presente estudio no fue diseñado para investigar el cambio en el volumen de la pata después de la inflamación.

En conclusión, siguiendo los pasos descritos anteriormente, el modelo de dolor inflamatorio con inyección de carragenina en ambas patas traseras permite determinar los umbrales termonociceptivos de ratones de forma fiable. Además, tras la administración de analgésicos, se detectó estadísticamente un aumento del umbral del dolor. El modelo de dolor inflamatorio modificado es útil para el cribado de posibles analgésicos. Además, este método se puede utilizar para la investigación de la biología del dolor, el desarrollo de nuevos fármacos y el tratamiento clínico, así como para proporcionar nuevas ideas y soluciones para el tratamiento del dolor.

Divulgaciones

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Los autores no tienen ningún posible conflicto de intereses que revelar.

Agradecimientos

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Agradecemos a Lesley McCollum, PhD, de Liwen Bianji (Edanz) (www.liwenbianji.cn), por editar el texto en inglés de un borrador de este manuscrito.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Balanza electrónica AL204Yuheng Battery Co., Ltd YH-400A
CarboximetilcelulosaTianjin Chemical Co., Ltd 
CarrageenanSigma, MO, USA29H0715
CelecoxibPfizer Inc.
Placa calefactora UGO Ltd. Co., ItaliaPB-200 
Ratones hembra ICRJinan Pengyue  Co., Ltd.
solución salina normalKelun Pharmaceutical Co., Ltd 
202103268142838SCXK20220007H51021157

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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