Diagnóstico basado en CRISPR en el punto de atención con reactivos premezclados y liofilizados

Resumen

Aquí, presentamos la preparación paso a paso de la amplificación isotérmica premezclada basada en recombinasa liofilizada y reacciones basadas en repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR), que se pueden utilizar para la detección de biomarcadores de ácidos nucleicos de patógenos de enfermedades infecciosas u otros marcadores genéticos de interés.

Resumen

El diagnóstico molecular mediante la detección basada en repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR) tiene una alta precisión diagnóstica y atributos adecuados para su uso en entornos de punto de atención, como tiempos de respuesta rápidos para los resultados, lecturas simples y convenientes y sin necesidad de instrumentos complicados. Sin embargo, las reacciones pueden ser engorrosas de realizar en el punto de atención debido a sus numerosos componentes y pasos de manipulación manual. En este artículo, proporcionamos un protocolo optimizado paso a paso para la detección robusta de patógenos de enfermedades y marcadores genéticos con amplificación isotérmica basada en recombinasa y reactivos basados en CRISPR, que se premezclan y luego se liofilizan en formatos fáciles de almacenar y listos para usar. Los reactivos premezclados liofilizados se pueden rehidratar para su uso inmediato y conservan una alta eficiencia de amplificación y detección. También proporcionamos una guía de solución de problemas comunes al preparar y usar reactivos premezclados y liofilizados para diagnósticos basados en CRISPR, para que la plataforma de detección sea más accesible para las comunidades más amplias de pruebas genéticas y de diagnóstico.

Introducción

Los diagnósticos basados en CRISPR para la detección de biomarcadores de ácidos nucleicos se informaron por primera vez en 2017 1,2,3,4 y, desde entonces, se han demostrado como diagnósticos de próxima generación con pruebas aprobadas por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA), particularmente para la detección del ARN del coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo 2 (SARS-CoV-2), en varios países ^5,6,7,8. Más allá de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), se ha demostrado que las tecnologías son efectivas para detectar diversos virus y bacterias 9,10,11,12,13, mutaciones y deleciones de enfermedades genéticas, y pueden diseñarse para detectar biomarcadores de proteínas y moléculas pequeñas ^2,12. Los diagnósticos basados en CRISPR a menudo combinan métodos de amplificación isotérmica, como la amplificación de la polimerasa recombinasa (RPA) o la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP)^14,15, con la detección basada en CRISPR utilizando enzimas asociadas a CRISPR (Cas) guiadas por ARN con actividad endonucleasa "colateral" después del reconocimiento de objetivos³. El doble uso de la amplificación isotérmica y la detección basada en CRISPR confiere varios atributos deseables a las tecnologías, en particular una alta precisión diagnóstica cercana a la de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de referencia, y la capacidad de multiplexar y detectar pequeñas diferencias de secuencia, incluidos los polimorfismos de un solo nucleótido ^1,9.

Sin embargo, las versiones más precisas de los diagnósticos basados en CRISPR contienen múltiples componentes y pasos, y pueden ser complicadas de realizar con personas no expertas o en el punto de atención (POC). Para abordar este desafío de extender el uso de diagnósticos basados en CRISPR de alta precisión a entornos POC, hemos desarrollado protocolos para preparar reacciones de detección basadas en CRISPR y amplificación isotérmica premezcladas, liofilizadas, basadas en recombinasa y CRISPR, que son fáciles de usar y almacenar⁷. Estos protocolos deben complementar los excelentes protocolos existentes sobre diagnósticos basados en CRISPR¹⁴, que contienen información adicional sobre la producción de componentes bioquímicos necesarios para el diagnóstico basado en CRISPR⁷, las directrices de diseño¹ y las formulaciones que utilizan técnicas alternativas de amplificación isotérmica ^2,14,15,16 y enzimas Cas¹². En última instancia, esperamos que los diagnósticos basados en CRISPR puedan ayudar a realizar una detección nucleica rápida, económica y sensible en entornos donde se requieren análisis portátiles y sin instrumentos ^1,9,17.

Utilizamos principalmente la combinación de RPA y detección basada en Cas13 en nuestros protocolos. RPA funciona a temperaturas cercanas a la temperatura ambiente (37-42 °C) y, por lo tanto, tiene bajos requisitos de energía y equipo. Otras reacciones de amplificación isotérmica requieren temperaturas más altas (LAMP, 60-65 °C; amplificación por desplazamiento de hebra (SDA), 60 °C; reacción de amplificación exponencial (EXPAR), 55 °C; y amplificación dependiente de helicasa (HDA), 65 °C)². El diseño de los cebadores RPA tampoco es complejo, a diferencia de los cebadores LAMP, y puede extenderse a la amplificación multiplexada ^7,9,14. A pesar de que la multiplexación más allá de dos objetivos con RPA es difícil en la práctica, existen directrices claras sobre cómo diseñar cebadores de RPA multiplexados para minimizar la interferencia¹⁸.

Si bien la contaminación de arrastre sigue siendo un gran problema en el flujo de trabajo de dos pasos, los amplicones generados de RPA son de tamaño pequeño y es menos probable que causen contaminación de arrastre en comparación con los amplicones concateméricos grandes de LAMP¹⁴. Los cebadores RPA se pueden diseñar de acuerdo con las pautas estándar¹⁴: generalmente tienen una longitud de 25-35 nucleótidos con temperaturas de fusión de 54 a 67 °C. El tamaño del amplicón debe ser inferior a 200 pares de bases. La enzima de transcriptasa inversa (RT) se puede agregar a RPA para permitir la amplificación a partir de ARN, y en la transcripción inversa-RPA (RT-RPA), otra enzima, la ribonucleasa H (RNasa H), generalmente se agrega en pequeñas cantidades para ayudar a resolver el híbrido de ARN: ADN resultante y promover la reacción de amplificación ^5,19. Para permitir la transcripción de T7 para la detección basada en Cas13, el promotor de la ARN polimerasa T7 se puede colocar en el extremo 5' del cebador RPA directo.

Una vez que se generan amplicones a partir de RPA, se pueden detectar con enzimas Cas programadas con crRNA. Entre las diversas enzimas Cas que se pueden utilizar para la detección de amplicones, preferimos las variantes de Cas13 dirigidas al ARN debido a su alta actividad de escisión¹ y a sus preferencias de escisión de polinucleótidos bien caracterizadas ^7,9, la última de las cuales puede utilizarse para la detección multiplexada. La secuencia de crRNA para Cas13 está diseñada para ser complementaria (complemento inverso) al sitio diana en el ARN producido con secuencias espaciadoras y de repetición directa (DR). La secuencia de crRNA y los cebadores de RPA no deben superponerse, para evitar la detección no deseada basada en Cas de productos de amplificación fuera del objetivo, lo que aumenta los falsos positivos y de fondo¹⁴.

La detección basada en Cas se basa en diferentes modalidades de detección para monitorear la escisión de las moléculas de ácido nucleico indicador (reporteros de ARN para reacciones basadas en Cas13)^1,2,14. Las diferentes modalidades de detección incluyen colorimetría, lecturas electroquímicas, fluorescencia, lecturas de secuenciación y tiras de flujo lateral². Nos centramos en la lectura de fluorescencia dada una variedad de fluoróforos y reporteros como la cianina 5 (Cy5), la rodamina X (ROX) y la carboxifluoresceína (FAM), que pueden excitarse eficazmente utilizando una sola fuente de luz LED azul, y su fluorescencia analizada por un lector de microplacas o un termociclador en tiempo real ^7,14. Además, la lectura de fluorescencia es fácil de configurar y permite un monitoreo continuo, lo que permite la cuantificación en tiempo real. La preamplificación multiplexada de RPA y la detección multiplexada basada en Cas13 utilizando enzimas Cas pueden combinarse con lecturas de fluorescencia multicolor para la detección simultánea de múltiples objetivos genéticos ^2,7.

En nuestros protocolos, primero amplificamos isotérmicamente el ARN con RT-RPA añadiendo la muestra de ARN a la forma liofilizada del reactivo RT-RPA (Figura 1). Durante la RT-RPA, el promotor T7 se añade al amplicón de ADN bicatenario generado. A partir de entonces, los productos de RPA se transfieren a la detección basada en Cas13 liofilizada, que también contiene ARN polimerasa T7. Esta reacción de detección convertirá los amplicones de ADN en ARN (a través de la ARN polimerasa T7), que se puede detectar fácilmente con Cas13 programado con crRNA. El Cas13 activado por el objetivo escindirá las moléculas reporteras para producir una señal de fluorescencia detectable ^2,7,14. Si bien los protocolos aquí se refieren a la detección por Leptotrichia wadei (LwaCas13a), pueden extenderse a la detección simultánea y multiplexada de hasta cuatro objetivos utilizando enzimas ortogonales Cas13 y Cas12 ^7,9. Las reacciones de detección basadas en RPA y Cas también pueden combinarse en un solo tubo, aunque con una pérdida de sensibilidad¹⁴.

Figura 1: Flujo de trabajo de detección basado en CRISPR. El flujo de trabajo ilustra la detección de dos genes diana. En primer lugar, las regiones de interés dentro del objetivo de ADN se amplifican isotérmicamente con RPA; la reacción se puede realizar con transcripción inversa (RT-RPA) al detectar dianas de ARN. A partir de entonces, la transcripción de T7 convierte los amplicones de dsDNA en ARN, que a su vez son reconocidos por complejos Cas13-crRNA capaces de provocar actividad de ARNasa colateral tras la unión al objetivo. La escisión de los reporteros de fluorescencia apagados produce señales de fluorescencia que se pueden monitorear con un lector de microplacas, visualizar mediante un transiluminador LED o usar con un termociclador en tiempo real. Abreviaturas: CRISPR = repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas; RT = transcripción inversa; RPA = amplificación de la polimerasa recombinasa; Cas = proteína asociada a CRISPR; LED = diodo emisor de luz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las características clave de los protocolos presentados aquí son las formulaciones de premezcla para la liofilización. La premezcla simplifica el uso de la reacción y mejora la reproducibilidad, pero muchos componentes dentro de la detección basada en RPA y Cas, particularmente la transcripción inversa y algunos cofactores lábiles como el ATP, no son estables en la solución. Por lo tanto, formulamos las soluciones premezcladas de manera que puedan liofilizarse para su almacenamiento a largo plazo y facilitar su transporte e implementación ^1,9,20. Los reactivos premezclados liofilizados también ayudan a mejorar la sensibilidad de detección, ya que se puede añadir un mayor volumen de muestra (y, por tanto, una mayor entrada de ADN/ARN) para reconstituir la reacción¹⁰. En nuestras formulaciones, utilizamos principalmente trehalosa²¹ como crioprotector en reacciones de detección basadas en RPA liofilizado y Cas⁷. Además de la conservación de reactivos, la trehalosa también promueve las reacciones a través del aumento de la estabilización de la enzima 16,22,23,24 y la disminución de las temperaturas de fusión del dsDNA²³. Las exploraciones de otros estabilizadores 5,7,21,25,26 más allá de la trehalosa pueden producir formulaciones aún más óptimas para diferentes escenarios de uso.

Protocolo

1. Preparación de reactivos premezclados RT-RPA liofilizados

1. Preparación de equipos
   1. Prepare un dewar o bandeja de nitrógeno líquido para la congelación instantánea de las reacciones. Llene el dewar o la bandeja con nitrógeno líquido.
   2. Liofilizador
      1. Compruebe si hay agua condensada en los tubos de drenaje y en el interior de la cámara; Retire el agua si es necesario.
      2. Limpie el interior de la cámara y la gradilla metálica del tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con una solución de descontaminación de RNasa, seguida de etanol al 70%.
      3. Cierre la puerta de la cámara y la válvula de liberación de vacío.
      4. Enciende la liofilizadora.
      5. Ajuste manualmente la temperatura del estante a -30 °C.
   3. Equipos de biología molecular
      1. Limpie lo siguiente con la solución de descontaminación RNase: pipetas, gradillas de puntas de pipeta, un mezclador de vórtice, una minicentrífuga giratoria y un marcador permanente.
      2. Limpie lo siguiente con agua del grifo, luego limpie con papel de limpieza: rejillas de plástico para tubos de microcentrífuga y una caja de espuma para hielo.
      3. Prepare un bloque calefactor (utilizado para disolver/resolubilizar la solución de triglicina) limpiándolo con una solución de descontaminación de RNasa y etanol al 70%. A continuación, enciéndalo y ajuste la temperatura a 60 °C.
2. Preparación de reacciones RPA premezcladas
   NOTA: Esta formulación es para 10 reacciones (utilizando tres gránulos de RPA).
   1. Compruebe si hay algún precipitado en la solución de triglicina antes de usarla. Si hay precipitados, disuélvalos incubando a 60 °C y mezclando bien antes de usar. Enfríe la solución de triglicina antes de agregar otros reactivos sensibles al calor.
      NOTA: Los precipitados pueden formarse fácilmente si el tubo se deja a temperatura ambiente durante un período prolongado.
   2. Retire tres tubos de tiras de pellets RPA del congelador; Golpee los tubos de tira golpeándolos suavemente contra la mesa del laboratorio para desalojar los gránulos blancos.
   3. Transfiera los tres gránulos a un tubo de microcentrífuga A de 1,5 mL.
   4. Pipetear 25 μL de agua sin nucleasas para enjuagar cualquier resto de polvo de RPA en los tubos de tiras y transferir la solución de enjuague a un nuevo tubo de microcentrífuga B de 1,5 mL.
   5. Añada 10 μL de la solución de triglicina 0,57 M y 10 μL de mezcla de cebador (10 μM cada uno) al tubo de mezcla maestra B.
   6. Tubo de mezcla de vórtice B; Luego gire hacia abajo y coloque el tubo sobre hielo.
   7. Agregue 28,4 μL del tampón RPA 5x (preparado a partir de 500 μL de 50% (p/v) de PEG20000, 250 μL de 1 M de Tris pH 7,4 y 100 μL de 100 mM de ditiotreitol (DTT)) al tubo de mezcla maestra B y mezcle bien dando golpecitos fuertes o agitando varias veces.
      NOTA: Fabricamos la solución de esta manera para ayudar a diluir/disminuir la viscosidad del PEG en el tubo de mezcla maestra, antes de agregar todo para solubilizar los gránulos de RPA.
   8. Transfiera los gránulos recogidos en el tubo A del paso 1.2.3 al tubo de mezcla maestra B y luego invierta el tubo de mezcla maestra varias veces para mezclar. Observe si la solución parece homogénea y monofásica (también se verá ligeramente opaca) y luego, coloque el tubo sobre hielo.
      NOTA: Si la mezcla no es completa, el PEG puede hacer que la solución/suspensión se separe en fase.
   9. Añada 0,71 μL de RT de 200 Unit/μL y 2,84 μL de RNasa H de 5 Unit/μL al tubo de mezcla maestra. Golpee suavemente o invierta el tubo mastermix hacia arriba y hacia abajo muchas veces. Gire hacia abajo y coloque el tubo sobre hielo.
      NOTA: Añadimos estas enzimas después de una mezcla intensa de los pasos anteriores, ya que la RT y la RNasa H son sensibles al cizallamiento debido a la mezcla; no más vórtices después de la adición de RT/RNasa H.
   10. Aliquot 8,4 μL de la solución de mezcla maestra a 10 tubos preenfriados de 1,5 mL y coloque los tubos en hielo. Para ello, sumerja la punta de la pipeta en la solución de mezcla maestra y extraiga la solución de mezcla maestra en la punta de forma lenta y constante para evitar que se formen burbujas de aire y garantizar una medición precisa del volumen. Dispense la solución de mezcla maestra en un tubo preenfriado de 1,5 ml.
       NOTA: Con 8,4 μL alícuotas, en nuestra experiencia, quedará una suspensión de ~1-2 μL en el tubo de mezcla maestra. El experimentador puede ajustar ligeramente el volumen de la alícuota para garantizar que haya suficientes reactivos para las 10 reacciones. Utilice técnicas de pipeteo adecuadas cuando manipule soluciones viscosas.
   11. Una vez completada la alícuota, coloque los tubos en una rejilla de metal sumergida en nitrógeno líquido para prepararlos para la liofilización. Deje que los tubos se sumerjan en nitrógeno líquido durante 5 minutos.
       NOTA: A medida que la liofilización elimina el exceso de solución, nos permite agregar más entrada de ADN/ARN, lo que ayuda a aumentar la sensibilidad. Las reacciones de RPA premezcladas liofilizadas pueden almacenarse a -20 °C durante 8 meses. La liofilización ayuda a la reproducibilidad si un experimento determinado se realiza utilizando mezclas maestras de RPA preparadas en el mismo lote, por lo que hacer un lote más grande también ayuda.
3. Liofilización
   1. En el liofilizador, verifique las temperaturas del colector y del estante. Si es necesario, espere hasta que la temperatura del colector alcance los -75 ± 5 °C y la temperatura del estante alcance los -30 ± 1 °C.
   2. Cubra los tubos abiertos en la rejilla de metal con una hoja de papel de limpieza, coloque la rejilla de metal junto con los tubos abiertos en el estante del liofilizador y cierre la puerta del estante.
   3. Seleccione el programa que se muestra en la Tabla 1 y presione inicio. Después de 30 minutos de la etapa de secado secundaria (20 °C, <0,1 mbar; la temperatura se mantiene de forma continua ajustando el tiempo de la etapa a "infinito"), presione detener el programa.
      NOTA: Dejamos que los tubos se calienten en el liofilizador para evitar la condensación de agua.
   4. Libere la presión abriendo la válvula de liberación de vacío, luego retire la rejilla del estante. Tapar los tubos inmediatamente y almacenar las reacciones liofilizadas a -20 °C.
      NOTA: Las reacciones premezcladas de RPA liofilizado y CRISPR-Cas13a pueden almacenarse a -20 °C durante 8 meses.

2. Preparación de reactivos de detección premezclados CRISPR-Cas13a liofilizados

NOTA: Siga el paso 1.1 para la preparación del equipo.

1. Preparación de reacciones premezcladas CRISPR-Cas13a (10 reacciones)
   1. Retire los siguientes elementos del almacenamiento y colóquelos en hielo: 10 μL de LwaCas13a (producido internamente ^7,8,14) (2 mg/mL), tampón de almacenamiento Cas, 10 ng/μL (225 nM) de crRNA, 25 mM rNTP, 50 Unit/μL de ARN polimerasa T7, 2 μM de reportero de fluorescencia FAM.
   2. Prepare una solución de trabajo de LwaCas13a a 126 μg/mL (900 nM) añadiendo 148,8 μL de tampón de almacenamiento de Cas (50 mM de Tris-HCl pH 7,4, 0,6 M de NaCl, 5% de glicerol, 2 mM de DTT) a 10 μL de 2 mg/mL de LwaCas13a.
   3. Prepare la reacción de mezcla maestra CRISPR-Cas13a de la siguiente manera: 71 μL de agua libre de RNasa, 20 μL de 400 mM de Tris pH 7.4, 20 μL de trehalosa al 60% (p/v), 10 μL de crRNA de 10 ng/μL (225 nM) (aquí, dirigido a los genes s y n del SARS-CoV-2), 8 μL de mezcla rNTP de 100 mM (25 mM cada uno), 6 μL de 50 Unit/μL de ARN polimerasa T7, 25 μL de 2 μM de reportero de fluorescencia FAM y 10 μL de LwaCas13a de 126 μg/mL (900 nM). Mezclar bien invirtiendo el tubo de mastermix; Luego, gira hacia abajo.
   4. Alícuota 17 μL de la mezcla maestra en 10 tubos de 1,5 mL colocados en hielo. Coloque los tubos en una rejilla sumergida en nitrógeno líquido y deje que los tubos se sumerjan en nitrógeno líquido durante 5 minutos.
2. Liofilización
   1. En el liofilizador, compruebe la temperatura del colector y de la estantería y espere hasta que la temperatura del colector alcance los -75 ± 5 °C y la temperatura de la estantería alcance los -30 ± 1 °C.
   2. Coloque los tubos en la liofilizadora. Seleccione el programa que se muestra en la Tabla 1 y presione inicio. Después de 30 minutos de la etapa de secado secundaria (25 °C, <0,1 mbar; la temperatura se mantiene de forma continua ajustando el tiempo de la etapa a "infinito"), detenga el programa.
   3. Libere la presión abriendo la válvula de liberación de vacío y retire la rejilla del estante. Tapar los tubos inmediatamente y almacenar las reacciones liofilizadas a -20 °C.
      NOTA: Los reactivos premezclados RPA liofilizados y CRISPR-Cas13a pueden almacenarse a -20 °C durante 8 meses.

3. Amplificación de ácidos nucleicos RT-RPA

NOTA: Para evitar la contaminación cruzada, las áreas de trabajo y las pipetas deben estar separadas para la preamplificación, la adición de muestras y la posamplificación. Recomendamos utilizar puntas de pipeta filtradas.

1. Precalentar una incubadora de agitación térmica a 42 °C.
2. Añada 1 μL de acetato de magnesio (Mg(OAc)₂) y de la mezcla en solución de acetato de potasio (KOAc) (compuesta por 196 mM de Mg(OAc)₂ y 1,5 M de KOAc) en el lado del tubo que contiene el pellet de RT-RPA liofilizado y premezclado (de la sección 1).
   NOTA: Un truco para añadir la mezcla de Mg(OAc)₂ y KOAc: la gota debe colocarse alrededor de la marca de volumen de 1 mL del tubo. Aquí, la gota será claramente visible y no es probable que se pierda por el cierre del tubo u otras acciones. La amplificación comenzará después de girar hacia abajo para recoger la gota en el fondo del tubo. Cuando se procesa más de una reacción a la vez, la amplificación se puede iniciar simultáneamente.
3. Vuelva a suspender el pellet de RT-RPA añadiendo 12,4 μL de la muestra de ARN (o de las muestras de control).
   NOTA: La secuencia de adición es muestra negativa/control negativo, ARN/ADN a analizar, muestra positiva/control positivo.
4. Para iniciar la reacción RT-RPA, reduzca brevemente la solución añadida de los pasos 3.2 y 3.3 utilizando una minicentrífuga de centrifugación a temperatura ambiente durante 3 s.
5. Mezcle golpeando con cuidado el tubo y luego haga otro breve giro hacia abajo durante 3 s.
6. Incubar la reacción a 42 °C durante 60 min colocándola en un bloque calefactor precalentado o en una incubadora de agitación térmica.
7. Una vez finalizada la reacción, extraiga los tubos de reacción y colóquelos en hielo antes de continuar con el paso de detección de CRISPR-Cas (sección 4).
   NOTA: El producto amplificado por RPA se puede utilizar en la reacción de detección inmediatamente o se puede almacenar a 4 °C durante varios días o a -20 °C durante varios meses.

4. Detección de ácidos nucleicos CRISPR-Cas13

1. Encienda un lector de microplacas de fluorescencia, ajuste y precaliente la temperatura de calentamiento a 37 °C y seleccione el programa que se muestra en la Tabla 2.
2. Coloque un plato de 384 pocillos sobre hielo.
3. Vuelva a suspender la reacción de detección premezclada CRISPR-Cas liofilizada (de la sección 2) añadiendo 17 μL de solución de cloruro de magnesio de 8 mM. Mezcle golpeando con cuidado el tubo; A continuación, gire brevemente durante 3 segundos y coloque el tubo en hielo.
4. Transfiera 18 μL de la mezcla de reacción resuspendida a cada pocillo de la placa preenfriada de 384 pocillos en hielo.
5. Añadir 2 μL del producto RPA preparado en la sección 3 a cada pocillo de reacción.
6. Retire la placa del hielo, colóquela rápidamente en un lector de microplacas de fluorescencia precalentado y presione inicio.
   NOTA: Se colocó una placa de 384 pocillos sobre hielo para permitir la sincronización del inicio de la reacción cuando la placa de 384 pocillos se transfiere a un lector de microplacas de fluorescencia precalentado.

Resultados

Destacamos la cinética de la generación de señales de fluorescencia FAM a partir de la detección combinada de los genes s y n del SARS-CoV-2, y cómo se utilizó la información para determinar las condiciones óptimas para las formulaciones de reacción liofilizadas y premezcladas. En todos los casos, incluimos muestras con valores de C_t dentro del límite de detección determinado (LoD) (C_t ~31-33), así como aquellas con C_t en el LoD (C_t ~35-37)⁷, para permitir la diferenciación de protocolos con mejor sensibilidad.

En el caso de la RT-RPA liofilizada y premezclada, encontramos que la inclusión de KOAc en la reacción premezclada afectó negativamente a la sensibilidad de la reacción (Figura 2A). Por lo tanto, omitimos KOAc de la reacción premezclada y lo añadimos con el iniciador de la reacción, Mg(OAc)₂, una vez que se había agregado la muestra de ARN. También utilizamos ensayos similares para determinar la concentración óptima de trehalosa crioprotectora (Figura 2B) y los efectos de la triglicina⁷ en la reacción RT-RPA liofilizada (Figura 2C). Por lo tanto, se prepararon reacciones óptimas de RT-RPA premezcladas y liofilizadas con trehalosa al 6%, sin KOAc (pero se añadió posteriormente después de la muestra de ARN) y se suplementaron con triglicina, como se describe en la sección 1 del protocolo.

Figura 2: Optimización de reacciones RT-RPA liofilizadas y premezcladas. La reacción RT-RPA se preparó utilizando cebadores dirigidos al gen n del SAR-CoV-2. El Mg(OAc)₂ se excluyó de todas las reacciones premezcladas. Se evaluaron los efectos de (A) KOAc, (B) trehalosa y (C) triglicina añadidos a las reacciones premezcladas. El monitoreo de la reacción a través de la fluorescencia FAM generada se llevó a cabo utilizando un termociclador en tiempo real o un lector de microplacas de fluorescencia. Se muestran los datos individuales de las mediciones por triplicado. Abreviaturas: RT = transcripción inversa; RPA = amplificación de la polimerasa recombinasa; CRISPR = repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas; Cas = proteína asociada a CRISPR; SAR-CoV-2 = Coronavirus 2 del Síndrome Respiratorio Agudo Severo; C_t = umbral de ciclo; FAM = carboxifluoresceína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En el caso de las reacciones liofilizadas y premezcladas basadas en Cas13a, verificamos la importancia de contar con el crioprotector correcto: la trehalosa al 6% o la sacarosa¹⁹ al 2% funcionó bien, mientras que la sacarosa más baja al 1% o al 5% p/v PEG20000 no preservó la eficiencia de la reacción después de la liofilización (Figura 3). El MgCl₂ se omitió en todas las reacciones y se añadió en la etapa de rehidratación. La reacción óptima de detección basada en Cas13 liofilizado se preparó con trehalosa al 6%, como se muestra en la sección 2 del protocolo.

Figura 3: Optimización de reacciones de detección basadas en Cas13 liofilizadas y premezcladas. La reacción de detección se realizó a 37 °C utilizando el producto RPA del gen n del SARS-CoV-2. Las pruebas se realizaron antes y después de la liofilización. El MgCl₂ se excluyó de todas las reacciones premezcladas. Se evaluaron las capacidades de (A) trehalosa, (B) PEG20000 y (C) sacarosa para preservar la eficiencia de la reacción después de la liofilización. El monitoreo de la reacción a través de la fluorescencia FAM generada se llevó a cabo utilizando un termociclador en tiempo real. Se muestran los datos individuales de las mediciones por triplicado para las condiciones "después de la liofilización" y una réplica de las condiciones "antes de la liofilización". La figura 3A,B fue tomada de Patchsung et ^al.7. Abreviaturas: RPA = amplificación de la polimerasa recombinasa; SAR-CoV-2 = coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo; FAM = carboxifluoresceína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los reactivos liofilizados y premezclados para reacciones basadas en RT-RPA y Cas13 son estables a -20 °C durante al menos 8 meses [Figura 4].

Figura 4: Ensayos de estabilidad de reactivos RPA y CRISPR-Cas13a liofilizados, premezclados a -20 °C. Prueba de estabilidad a los (A) 30 días, (B) 45 días, (C) 3 meses, (D) 5 meses, (E) 8 meses. Se muestran los datos individuales de las mediciones por triplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En la Figura 5 se muestra el LoD de las reacciones basadas en RT-RPA y Cas13 liofilizadas para la detección de los genes s y n del SARS-CoV-2. La cinética de la generación de señales se puede mejorar con la detección de genes duales en comparación con cuando solo se detecta un gen.

Figura 5: Sensibilidad analítica de la detección de un solo gen frente a la detección de dos genes. (A) El LoD de RT-RPA singleplex liofilizado y la detección basada en Cas dirigida al gen s de SAR-CoV-2. (B) El LoD de RT-RPA singleplex liofilizado y detección basada en Cas dirigida al gen n de SAR-CoV-2. (C) El LoD de RT-RPA multiplexado liofilizado y la detección dual basada en Cas dirigida a los genes s y n . La LoD se determinó utilizando ARN del SARS-CoV-2 diluido en serie, cuyos valores de C_t se determinaron mediante un ensayo RT-qPCR dirigido al gen n . Se muestran los datos individuales de 3-6 mediciones repetidas. Abreviaturas: LoD = límite de detección; RT = transcripción inversa; RPA = amplificación de la polimerasa recombinasa; CRISPR = repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas; Cas = proteína asociada a CRISPR; SAR-CoV-2 = Coronavirus 2 del Síndrome Respiratorio Agudo Severo; C_t = umbral de ciclo; qPCR = reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Más allá de la detección de virus, presentamos un prototipo de una herramienta de genotipado POC basada en el diagnóstico CRISPR, para ayudar a identificar especies de serpientes venenosas endémicas de Tailandia (Figura 6). La identificación más rápida y precisa de las especies de serpientes a través de muestras de ADN recogidas de heridas por mordeduras puede ayudar en la administración rápida de antídotos, mejorando las posibilidades de supervivencia del paciente. Nos enfocamos en regiones dentro del gen del citocromo b mitocondrial (cytb) de ocho especies de serpientes, incluida Ophiophagus hannah (cobra real) (Figura 6A), y demostramos que la detección de sustitutos de ADN sintético del gen O. hannah cytb puede alcanzar el nivel attomolar de sensibilidad (Figura 6B, C).

Figura 6: Un prototipo de detección basada en CRISPR para identificar especies de serpientes a partir del envenenamiento por mordeduras de serpiente. (A) Diseño de cebadores RPA y lwaCas13a crRNA para la detección del gen cytb de Ophiophagus hannah. El promotor T7 (voladizo T7) se colocó en el extremo de 5' del cebador RPA delantero. (B) Cinética de la generación de señales FAM durante 60 minutos y (C) fluorescencia FAM de punto final a partir de la detección mediada por LwaCas13a de entradas sintéticas de dsDNA correspondientes a los segmentos del gen cytb de O. hannah. Se utilizaron diferentes concentraciones de entrada (0, ^10-9, ^10-12, ^10-15 y ^10-18 M). Los datos son la media ± s.d. a partir de mediciones triplicadas. Abreviaturas: RPA = amplificación de la polimerasa recombinasa; CRISPR = repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas; Cas = proteína asociada a CRISPR; FAM = carboxifluoresceína. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Liofilización de reactivos de detección premezclados CRISPR-Cas13a
Paso	Tasa de rampa	Temperatura del estante	Tiempo (hh:mm)	Vacío
	(°C/min)	(°C)		(mbar)
Congelar 1	3	-30	apagado	-
Seco 1	3	-30	apagado	0
Seco 2	3	4	01:00	0
Seco 3	3	20	∞	0

Tabla 1: Configuración del liofilizador de los reactivos de detección RT-RPA y CRISPR-Cas13a premezclados. Abreviaturas: RT = transcripción inversa; RPA = amplificación de la polimerasa recombinasa; CRISPR = repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas; Cas = proteína asociada a CRISPR.

Parámetro		Ajuste
Temperatura		37 °C
Ciclo cinético	Tiempo de duración	02:00 (mm:ss)
	Tiempo de intervalo	02:30 (mm:ss)
Tembloroso	Tiempo de duración	1 seg
	Modo	Lineal
	Amplitud	1 milímetro
Intensidad de fluorescencia	Longitud de onda de excitación	488 nm
	Longitud de onda de emisión	520 nm
	Modo	Arriba
	Posición Z	24470
	Ganar	71
	Tiempo de integración	20 μs
	Número de destellos	25

Tabla 2: Programa lector de microplacas de fluorescencia para la detección de ácidos nucleicos.

Discusión

Hay pasos críticos en este protocolo. Para la segregación de área, se recomienda utilizar espacios separados para la extracción de ácidos nucleicos, la preparación de la mezcla maestra (área de preamplificación), la adición de muestras y la detección de amplicones (área de posamplificación). Cada área debe establecerse mediante el uso de un conjunto separado de herramientas y equipos. No lleve herramientas de un área a otra, especialmente desde el área de postamplificación hacia el área de preamplificación. La limpieza de las áreas de trabajo es necesaria: se deben limpiar las áreas de trabajo, las pipetas, los vórtices y los marcadores permanentes con solución de descontaminación de RNasa/DNasa/Clorox al 3% seguido de etanol al 70% o agua desionizada esterilizada en autoclave. Es necesario lavar el material de laboratorio básico y las piezas extraíbles de los instrumentos, como los tubos de 1,5 ml, las gradillas de plástico y el adaptador de rotor de una minicentrífuga. El agua libre de nucleasas se utiliza como control negativo y componente de reacción, por lo que es un reactivo sensible que puede contaminarse si no se manipula con cuidado. Por lo tanto, recomendamos hacer pequeñas alícuotas de agua para usar solo una vez.

Ejecute siempre una reacción de control negativo utilizando los cebadores de ensayo para comprobar si hay contaminación. Además, para evitar problemas de contaminación, recomendamos preparar la reacción de control negativo añadiendo agua libre de nucleasas en la zona de preamplificación en lugar de en la sala de adición de muestras. La mezcla de acetato de magnesio y acetato de potasio debe alícuota en pequeños volúmenes (~20 μL/tubo) que solo se utilicen una vez para evitar la contaminación del reactivo con amplicones de arrastre. Al añadir la mezcla de acetato de magnesio y potasio a las reacciones de RPA de premezcla liofilizada, recomendamos cambiar la punta de la pipeta cada vez. Para el flujo de trabajo de los experimentos, mantenga el flujo de trabajo unidireccional, desde los experimentos de preamplificación hasta los experimentos de posamplificación. Pasar de espacios de trabajo "más limpios" (preamplificación) a espacios de trabajo "más sucios" (postamplificación).

Para las modificaciones y la resolución de problemas del método para evitar la contaminación de arrastre de amplicones, recomendamos separar espacialmente los tres pasos principales del experimento: preparación de la reacción RPA; adición de muestras; y los pasos de amplificación y detección. La mezcla maestra debe prepararse en un área del laboratorio sin plantillas. Al cambiarse de habitación, cambie también los guantes y las batas de laboratorio. Trabaja unidireccionalmente desde la pre hasta la post amplificación. Evite utilizar la misma pipeta para diferentes pasos. Lo mejor es que se dispongan diferentes juegos de pipetas para estos pasos: preparación de las mezclas maestras; adición de la plantilla de ADN/ARN; y la transferencia del producto amplificado. Use puntas filtradas, trate de evitar la formación de aerosoles tanto como sea posible y evite tocar el interior del tubo al abrirlo. Si los experimentos de amplificación muestran contaminación, se deben cambiar todos los reactivos. Si es posible, vaya a otro laboratorio con reactivos frescos y verifique si la contaminación persiste. Aparte de los reactivos, no traiga nada más, incluidas las pipetas. Pruebe las pipetas esterilizadas en autoclave si se pueden esterilizar en autoclave.

Para mejorar la tasa de amplificación (optimización del ensayo), primero consulte las instrucciones del fabricante, como el manual de RPA de TwistDx, para garantizar diseños óptimos. A continuación, pruebe optimizaciones empíricas de las reacciones, como la adición de aditivos de reacción que se sabe que impulsan las reacciones RPA y CRISPR⁷; aumentar los tiempos de reacción (por ejemplo, tiempo de reacción de RPA de hasta 60 min); o variando las secuencias y concentraciones de cebadores. También recomendamos agregar la mayor cantidad de volumen de muestra posible; El uso de reactivos liofilizados permite añadir más volumen de muestra. Para reducir la fluorescencia de fondo, se puede hacer un paso de inactivación de calor (75 °C durante 5 minutos) una vez finalizado el RPA, antes de pasar a la detección, u optimizar la concentración del reportero. Demasiado reportero dará un trasfondo más alto. Además, la adición de inhibidores de la RNasa ayuda a prevenir la degradación independiente de Cas del reportero.

Más allá de optimizar las condiciones de reacción basadas en (RT)-RPA y CRISPR y sus procedimientos de manipulación, se debe garantizar que los reactivos utilizados sean de buena calidad y que el paso de extracción de ácido nucleico que precede a todas las reacciones sea exitoso. Los reactivos liofilizados proporcionan una alta sensibilidad de detección, son portátiles, permiten realizar pruebas POC y se pueden aplicar a diversas muestras clínicas. Además, el RPA liofilizado (RT) se puede rehidratar instantáneamente añadiendo el extracto de ácido nucleico de muestras clínicas. Un estudio anterior mostró una mayor sensibilidad al poner un mayor volumen de entrada de ácido nucleico sin volumen restringido, aumentando efectivamente la cantidad total de ácido nucleico objetivo.

Los diagnósticos basados en CRISPR se han adaptado para detectar patógenos mediante la recolección de muestras clínicas como hisopos nasofaríngeos y faríngeos, orina y suero ^7,8,11. También se ha aplicado para distinguir variantes de un solo nucleótido, identificar genes de resistencia a los antibióticos en organismos resistentes a los antimicrobianos y detectar mutaciones asociadas al cáncer. La utilidad de la tecnología puede ser mayor en aplicaciones de campo donde las reacciones bioquímicas diseñadas para la amplificación isotérmica y la detección basada en CRISPR se pueden combinar con dispositivos y lecturas listos para el campo, como un fluorómetro de mano o tiras de flujo lateral.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
MaterialSolución de
betaína	Sigma-Aldrich	B0300-1VL
Agua tratada con DEPC	Invitrogen	AM9915G
Dithiothreitol (DTT)	Merck	3870-25GM
EpiScript transcriptasa inversa	Lucigen ERT12925K
Gly-Gly-Gly& nbsp;	Sigma-Aldrich	SIA-50239-1G
LwaCas13a	Producción interna		cepa:Leptotrichia wadei, Abreviatura: Lwa, Nombre de la proteína: LwaCas13a
Solución de cloruro de magnesio, 1M	Sigma-Aldrich	M1028-10X1ML
NxGenT7 ARN polimerasa	Lucigen	30223-2
Poli(etilenglicol)	Sigma-Aldrich	81300-1KG
Solución de acetato de potasio, 5M	Sigma-Aldrich	95843-100ML-F
Mezcla de solución de riobnucleótidos	NEB	N0466L
RNasa H	NEB	M0297L
Sacarosa	TCI	TCI-S0111-500G
Trehalosa Dihidratada	Sigma-Aldrich	SIA-90210-50G
Solución de clorhidrato de Trizma, 1M, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194-100ML
TwistAmp Kit básico	TwistDx	TABAS03KIT
Equipment
luz Azul/Blanco LED Dual	Bio-Helix	BP001CU
Baño Seco Doble Bloque	ELITE	4-2-EL-02-220	Modelo: EL-02
Microplaca de fluorescencia Lector	Tecan		30050303 Modelo: Infinite 200 Pro
Liofilizador	LABCONCO	794001030	FreeZone Triad Liofilizador de sobremesa
Greiner	GDE0784076	de 384 pocillos	, pequeño volumen, Hibase, encuadernación médica, negro
Termociclador en tiempo real (sistema de PCR en tiempo real CFX Connect)	Bio-Rad	185-5201	Modelo: Módulo
óptico CFX Connectfuerte
avance RPA cebador	IDT		GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA
s-gene RPA inverso cebador	IDT		TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG
n-gen forward RPA	primer IDT		GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG
n-gen RPA inverso cebador	IDT		CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC
LwaCas13a-crRNA para el gen s	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAAC GAAGGGGACUAAAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG
LwaCas13a-crRNA para el gen n	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAACG AAGGGGACUAAAACAAAGCAAGAGAGAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC
FAM-polyU-IABkFQ reportero	IDT		56-FAM/rUrUrUrU/3IABkFQ
O-hannah_cytb_F RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG
O-hannah_cytb_R RPA primer	IDT		AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA
synT7crRNA13a_ O_hannah	IDT		GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC