Aquí, presentamos un protocolo que combina la electroporación in vivo y la denervación del músculo elevador del auris largo craneal (LAL). Este procedimiento permite estudiar el papel potencial de las proteínas derivadas del músculo en la regeneración de la sinapsis neuromuscular.
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Artículo de método
Electroporación in vivo combinada y reinervación a corto plazo del músculo esquelético elevador del auris largo craneal
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La unión neuromuscular (NMJ) es la sinapsis periférica que controla la contracción de las fibras del músculo esquelético para permitir el movimiento coordinado de muchos organismos. En la NMJ, un terminal axónico motor presináptico contacta con un dominio postsináptico muscular y está cubierto por células de Schwann terminales. La integridad y la función de la NMJ se ven comprometidas en varias condiciones, como el envejecimiento, las enfermedades neuromusculares y las lesiones traumáticas. Para analizar la posible contribución de las proteínas derivadas del músculo al mantenimiento y la regeneración de la NMJ, se ha combinado una estrategia de transferencia génica in vivo con la denervación del músculo elevador del auris largo craneal (LAL) tras una lesión nerviosa mecánica. Los hallazgos previos mostraron que la expresión forzada de proteínas fluorescentes de control no altera la organización de NMJ ni la neurotransmisión. Este procedimiento tiene como objetivo describir un método detallado de electroporación in vivo del músculo LAL seguido de la transección o aplastamiento de la rama específica del nervio facial que inerva los músculos craneales, lo que conduce a la denervación y reinervación de NMJ, respectivamente. La combinación de estas estrategias experimentales en el conveniente músculo LAL constituye un método eficiente para estudiar la contribución potencial de la sobreexpresión o silenciamiento de proteínas musculares en el contexto de la reinervación de NMJ a corto plazo.
Introducción
La unión neuromuscular (NMJ) es la sinapsis periférica que controla la contracción muscular e, indirectamente, el movimiento coordinado de los organismos1. Está formado por un axón terminal motor presináptico, un dominio postsináptico muscular enriquecido en receptores de acetilcolina (AChRs) y células de Schwann terminales no mielínicas que cubren el terminal del axón 2,3,4. Tras la denervación de la NMJ debido a una lesión traumática de un nervio periférico, una enfermedad o una intervención farmacológica, se pierde ....
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Protocolo
Todos los procedimientos experimentales son aprobados por el Comité de Bioética de la Universidad Austral de Chile, Chile (protocolo Nº 503/2023), y siguen las normas impuestas por el Comité de Bioética de la Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo de Chile (ANID), así como los lineamientos de la Directiva del Consejo Europeo para el Cuidado de los Animales de Laboratorio. En el presente estudio se utilizaron ratones CF-1 adultos (3-6 meses de edad) de ambos sexos (30-45 g). La eutanasia se llevó a cabo mediante sobredosis de anestésico inhalante seguida de exanguinación. Los reactivos y equipos utilizados en el estudio se enum....
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Resultados
El alto rendimiento cuántico de fluorescencia de la proteína tdTomato20 la convierte en un trazador apropiado para la eficiencia de la electroporación. Por lo tanto, se evaluó la expresión de la proteína tdTomato en músculos LAL por electroporación in vivo (Figura 1). Los músculos LAL se diseccionaron 21 días después de la electroporación. Las preparaciones de montaje completo muestran la banda caudal delgada (cLAL, polígono cian) del músculo LAL con sus dos .......
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Discusión
La combinación de electroporación y denervación muscular in vivo es un enfoque experimental valioso para investigar un nicho regenerativo en el NMJ4. Dado que el músculo LAL está expuesto superficialmente, estos procedimientos combinados pueden complementarse fácilmente con la administración de sondas o fármacos que podrían afectar la expresión o la actividad de las proteínas12. Además, la electroporación de genes reporteros en el .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos el ambiente altamente colaborativo y estimulante de los miembros de NeSt Lab por la útil discusión y comentarios sobre este trabajo. Actualmente, el trabajo en el NeSt Lab es financiado por FONDECYT 1221213. El esquema de la Figura 1A se creó con BioRender.com.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| #5/45 Pinzas Dumont | Herramientas de Bellas Ciencias | 11251-35 | Esterilizar antes de usar |
| anti 2H3 | DSHB | Diluido 1 : 300 | |
| anti S100 Listo para usar | Dako | IR504 | Diluido 1 : 5 |
| anti SV2 | DSHB | Diluido 1 : 50 | |
| Gluconato de clorhexidina 2% | DifenPharma | ||
| Microscopio estereoscópico de disección con luz fría | Motic | Modelo SMZ-171 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Diluido 1 : 100 |
| Pinzas de #5SF Dumont | Fine Science Tools | 11252-00 | Esterilizar antes de usar |
| Dumont Mini Pinzas – Estilo 5 | Herramientas de Ciencia Fina | 11200-14 | Esterilizar antes de usar |
| Electroporador ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | ||
| Electrodos tipo aguja de oro | Genetrodes, BTX | 45-0114 | |
| jeringa Hamilton recta de 10 mm | Hamilton | 80400 | |
| Hialuronidasa | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| Máquina de anestesia inhalatoria | SciVerma Scientific | M3000 | |
| Baxter | 218-082 | ||
| Ratones | Instituto de Salud Pública - Chile | Ratones CF-1 adultos (3-6 meses de edad), de ambos sexos (30-45 g) | |
| Cuchillas de afeitar | Schick | ||
| Suture Glicosorb 5/0 | TAGUM | GS0812. J | Hilo de ácido poliglicólico absorbible |
| tdPlásmido de tomate | Addgene | 54642 | tdPlásmido de tomate bajo el control del promotor de CMV |
| Clorhidrato de tramadol al 5% (Triamcol) | Drag Pharma | ||
| Vannas Tijeras de resorte | Fine Science Tools | 91500-09 | Esterilizar antes de usar |
| WGA Alexa Fluor 488 | Invitrogen | W7024 | Diluir |
| α-BTX Alexa Fluor 488 | Invitrogen | B13422 | Diluido 1 : 500 |
Referencias
- Slater, C. R. The functional organization of motor nerve terminals. Prog Neurobiol. 134, 55-103 (2015).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robi....
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Reimpresiones y permisos
