Aquí, presentamos un protocolo que combina la electroporación in vivo y la denervación del músculo elevador del auris largo craneal (LAL). Este procedimiento permite estudiar el papel potencial de las proteínas derivadas del músculo en la regeneración de la sinapsis neuromuscular.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Electroporación in vivo combinada y reinervación a corto plazo del músculo esquelético elevador del auris largo craneal
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La unión neuromuscular (NMJ) es la sinapsis periférica que controla la contracción de las fibras del músculo esquelético para permitir el movimiento coordinado de muchos organismos. En la NMJ, un terminal axónico motor presináptico contacta con un dominio postsináptico muscular y está cubierto por células de Schwann terminales. La integridad y la función de la NMJ se ven comprometidas en varias condiciones, como el envejecimiento, las enfermedades neuromusculares y las lesiones traumáticas. Para analizar la posible contribución de las proteínas derivadas del músculo al mantenimiento y la regeneración de la NMJ, se ha combinado una estrategia de transferencia génica in vivo con la denervación del músculo elevador del auris largo craneal (LAL) tras una lesión nerviosa mecánica. Los hallazgos previos mostraron que la expresión forzada de proteínas fluorescentes de control no altera la organización de NMJ ni la neurotransmisión. Este procedimiento tiene como objetivo describir un método detallado de electroporación in vivo del músculo LAL seguido de la transección o aplastamiento de la rama específica del nervio facial que inerva los músculos craneales, lo que conduce a la denervación y reinervación de NMJ, respectivamente. La combinación de estas estrategias experimentales en el conveniente músculo LAL constituye un método eficiente para estudiar la contribución potencial de la sobreexpresión o silenciamiento de proteínas musculares en el contexto de la reinervación de NMJ a corto plazo.
Introducción
La unión neuromuscular (NMJ) es la sinapsis periférica que controla la contracción muscular e, indirectamente, el movimiento coordinado de los organismos1. Está formado por un axón terminal motor presináptico, un dominio postsináptico muscular enriquecido en receptores de acetilcolina (AChRs) y células de Schwann terminales no mielínicas que cubren el terminal del axón 2,3,4. Tras la denervación de la NMJ debido a una lesión traumática de un nervio periférico, una enfermedad o una intervención farmacológica, se pierde la actividad del músculo contráctil 5,6. Dado que ciertos microambientes permisivos permiten una recuperación funcional oportuna y eficiente, la búsqueda de proteínas que puedan ayudar al proceso de regeneración es una necesidad permanente. Aquí, se han combinado dos procedimientos para evaluar específicamente el papel potencial de la manipulación de la expresión de proteínas musculares en la regeneración a corto plazo de la NMJ después de una lesión nerviosa.
El músculo elevador del auris largo (LAL), ubicado en la superficie dorsal del cráneo, es un músculo delgado y plano que controla el movimiento del pabellón auricular. El músculo LAL consta de bandas rostral y caudal, cada una de las cuales contiene dos o tres capas de fibras musculares 7,8. La rama auricular posterior del nervio facial inerva el músculo LAL, generando un patrón de inervación bien descrito que consta de cinco regiones de inervación rostral (R1-R5) y dos caudales (C1-C2) 8,9,10. El LAL es un músculo expuesto superficialmente y de fácil acceso, por lo que su uso requiere procedimientos mínimamente invasivos. Esto permite la visualización de la NMJ utilizando microscopía en tiempo real, la administración de fármacos, así como la intervención de preparaciones musculares completas tanto in vivo como ex vivo11,12. En conjunto, estas características hacen del músculo LAL un excelente modelo para estudiar el comportamiento y la función de la NMJ10,13.
La electroporación in vivo es una técnica de transferencia génica que permite la incorporación de ADN exógeno al tejido a través de la permeabilización transitoria de las membranas celulares y la movilidad del ADN dentro de las células, ambas generadas tras inducir un campo eléctrico14,15. Este procedimiento es local y se puede realizar en cualquier etapa del desarrollo del animal. Considerando las características únicas del músculo LAL, su electroporación in vivo representa un procedimiento mínimamente invasivo, altamente eficiente y rápido16, permitiendo observar una expresión robusta de la proteína dos o tres días después de la electroporación.
El procedimiento de aplastamiento del nervio facial ha sido ampliamente empleado en la investigación, ya que ofrece varias ventajas 5,17,18. Este protocolo ha sido modificado previamente para dirigirse específicamente a la rama auricular posterior del nervio facial que inerva los músculos craneales, incluido el músculo LAL, para evitar la parálisis facial; En consecuencia, los ratones no requieren cuidados especiales después de la cirugía (por ejemplo, ungüento lubricante para los ojos para la pérdida del reflejo de parpadeo). Dado que la reinervación de la NMJ en el músculo LAL comienza entre 7 y 9 días después de la lesión6, es un buen modelo de reinervación a corto plazo en comparación con el modelo de lesión por aplastamiento del nervio ciático comúnmente utilizado para denervar los músculos de las extremidades posteriores, donde la reinervación ocurre alrededor de tres semanas después de la lesión nerviosa18.
La combinación de la electroporación in vivo y la lesión del nervio facial en el músculo LAL permitirá a los investigadores evaluar el comportamiento de los componentes sinápticos frente a la modulación de proteínas derivadas del músculo en diferentes momentos de la regeneración de NMJ, incluidos los efectos morfológicos a corto y largo plazo 6,16, a través de una amplia variedad de técnicas que incluyen ensayos inmunohistoquímicos, histológicos y funcionales.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los procedimientos experimentales son aprobados por el Comité de Bioética de la Universidad Austral de Chile, Chile (protocolo Nº 503/2023), y siguen las normas impuestas por el Comité de Bioética de la Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo de Chile (ANID), así como los lineamientos de la Directiva del Consejo Europeo para el Cuidado de los Animales de Laboratorio. En el presente estudio se utilizaron ratones CF-1 adultos (3-6 meses de edad) de ambos sexos (30-45 g). La eutanasia se llevó a cabo mediante sobredosis de anestésico inhalante seguida de exanguinación. Los reactivos y equipos utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Electroporación muscular LAL in vivo
- Preparación
- Sedar suavemente al ratón en una cámara de inducción acrílica bajo inhalación de isofluorano al 2,5% con 0,8 L/min de oxígeno (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente). Después de eso, mantenga la sedación del ratón usando una máscara de tubo nasal conectada a una máquina de anestesia inhalatoria bajo un microscopio estereoscópico de disección.
NOTA: Asegúrese de que el mouse esté dormido antes de comenzar el procedimiento; Pruebe el reflejo táctil del ratón apretando suavemente un pie con una pinza (realice este paso cada vez después de inducir la anestesia). - Desinfectar la zona cervical a nivel de la sutura sagital del cráneo con el antiséptico gluconato de clorhexidina al 2% e inyectar por vía subcutánea 20 μL de 2 mg/mL de hialuronidasa en PBS utilizando una jeringa Hamilton para facilitar el acceso del plásmido de ADN a la superficie muscular.
- Apague el flujo de isofluorano y permita que el ratón respire oxígeno puro durante 1 minuto.
- Pesar el ratón para calcular la dosis adecuada de Meloxicam (ver paso 1.3.2.).
- Coloque al animal en una jaula vacía (sin ropa de cama) para recuperarse de la anestesia.
- Regrese al animal a su alojamiento normal durante 30 min16.
- Sedar suavemente al ratón en una cámara de inducción acrílica bajo inhalación de isofluorano al 2,5% con 0,8 L/min de oxígeno (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente). Después de eso, mantenga la sedación del ratón usando una máscara de tubo nasal conectada a una máquina de anestesia inhalatoria bajo un microscopio estereoscópico de disección.
- Procedimiento quirúrgico
- Reanestesiar al ratón mediante la inhalación de isofluorano al 2,5% con una mezcla de oxígeno de 0,8 L/min (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente) y mantenerlo sedado durante todo el procedimiento quirúrgico utilizando una máquina de anestesia inhalatoria, bajo un estereomicroscopio de disección.
- Afeitar la zona cervical con una cuchilla de afeitar de doble filo y desinfectar con clorhexidina y etanol al 70% 3 veces.
- Realice una incisión de 8 mm sobre la sutura sagital del cráneo y exponga el músculo LAL retirando suavemente la grasa y el tejido conectivo ubicado justo debajo de la piel con tijeras/pinzas.
NOTA: El músculo LAL es el músculo más superficial de la región craneal después de la incisión en la piel. Es fácilmente reconocible por la orientación de las fibras musculares que corren en diagonal desde el cráneo medio hacia cada pabellón auricular 8,16. - Con una jeringa Hamilton, inyecte 10 μL del ADN obtenido comercialmente (0,8-1 μg/μL) en PBS en la fascia que se distribuye por todo el músculo, formando una burbuja.
- Coloque dos electrodos de aguja de oro a 5 mm de distancia, paralelos y sobre las fibras musculares, ocupando toda la longitud del músculo LAL (Figura 1A).
- Utilizando un electroporador, genere cinco pulsos de 100 V/cm de 20 ms de duración cada uno, a una frecuencia de 1 Hz.
- Repita el procedimiento en el músculo LAL contralateral (repitiendo los pasos 1.2.4-1.2.6).
- Sutura y recuperación
- Sutura (tamaño de deformación 5/0, aguja HR15) la piel con hilo de ácido poliglicólico reabsorbible.
- Inyectar por vía subcutánea el analgésico Meloxicam en dosis de 1-2 mg/kg de peso para reducir el dolor postoperatorio.
- Apague el flujo de isofluorano y permita que el ratón respire oxígeno puro durante 1 minuto.
- Coloque al animal en una jaula vacía (sin ropa de cama) para recuperarse de la anestesia.
- Devolver al animal a su alojamiento habitual y vigilarlo durante 2 días después de la cirugía o hasta su recuperación. Monitorizar los signos de dolor o estrés, asignando puntuaciones para cada uno de los diferentes parámetros considerando los criterios de valoración humana descritos anteriormente19.
NOTA: Coloque el mouse en una almohadilla térmica cubierta con una almohadilla quirúrgica para evitar que su temperatura corporal baje durante la cirugía. Trate de no tomar más de 30 minutos para el procedimiento quirúrgico, evitando así que el ratón muera debido al exceso de anestesia. Si la proteína expresada produce bajos niveles de fluorescencia, se recomienda coelectroporar con un trazador (por ejemplo, tdTomato o GFP) en una proporción de 1:5 (trazador: ADN de interés).
2. Denervación inducida por lesión nerviosa por aplastamiento
NOTA: Este protocolo es una modificación de un protocolo17 descrito anteriormente. Realizar este procedimiento con una diferencia de al menos 3 días desde la electroporación. Dependiendo de las preguntas de investigación, este procedimiento se puede realizar antes o después de la electroporación.
- Anestesia y posicionamiento de los animales
- Realizar la sedación animal en una cámara de inducción acrílica bajo inhalación de isofluorano al 2,5% con 0,8 L/min de oxígeno (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente).
- Pesar el ratón para calcular la dosis de Meloxicam (ver paso 2.3.2.).
- Mantenga la sedación del ratón con una máscara de tubo nasal conectada a una máquina de anestesia inhalatoria bajo un microscopio estereoscópico de disección.
- Coloque el ratón en su lado izquierdo (para denervar el músculo LAL derecho). Pega la oreja derecha con cinta adhesiva hacia la nariz para exponer el área posterior del pabellón auricular.
- Procedimiento quirúrgico
- Afeitar la zona posterior del pabellón auricular con una cuchilla de afeitar de doble filo y desinfectar con clorhexidina y etanol al 70% 3 veces.
- Localice la vena auricular posterior y haga una incisión en la piel, a 2 mm de distancia caudal de la misma, de aproximadamente 5 mm con unas tijeras de resorte. Evite cortar los vasos sanguíneos y/o el tejido muscular.
- Corta la grasa y los tejidos conectivos con pinzas y tijeras. Encontrar el nervio accesorio espinal; continuar hasta encontrar el vientre del músculo digástrico y el conducto auditivo cartilaginoso (tejido blanquecino semitransparente) (Figura 2A).
- Localiza el comienzo del nervio facial que se ramifica justo debajo del músculo digástrico.
- Siga la rama auricular posterior (la rama más dorsal del nervio facial) y retire suavemente el tejido conectivo que la rodea, evitando cuidadosamente la manipulación directa del nervio.
- Triturar la rama auricular posterior del nervio facial durante 30 s, aplicando una presión constante sobre el nervio con una pinza con una punta en ángulo de 45°.
- Sutura y recuperación
- Sutura (tamaño de deformación 5/0, aguja HR15) la piel con hilo de ácido poliglicólico reabsorbible.
- Inyectar por vía subcutánea el analgésico Meloxicam en dosis de 1-2 mg/kg de peso para reducir el dolor postoperatorio.
- Retire la cinta de la oreja, cierre el flujo de isofluorano y permita que el ratón respire oxígeno puro durante 1 minuto.
- Coloque al animal en una jaula vacía (sin ropa de cama) para recuperarse de la anestesia.
- Regrese el ratón a su alojamiento habitual y manténgalo durante 2 días después de la cirugía o hasta su recuperación.
- Después de la recuperación, examine el ratón en busca de fallas en el movimiento de la oreja afectada como signo de denervación eficiente.
NOTA: En los animales de control simulados, se realiza una incisión en la piel, se expone el nervio facial sin tocarlo directamente, y posteriormente se sutura.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
El alto rendimiento cuántico de fluorescencia de la proteína tdTomato20 la convierte en un trazador apropiado para la eficiencia de la electroporación. Por lo tanto, se evaluó la expresión de la proteína tdTomato en músculos LAL por electroporación in vivo (Figura 1). Los músculos LAL se diseccionaron 21 días después de la electroporación. Las preparaciones de montaje completo muestran la banda caudal delgada (cLAL, polígono cian) del músculo LAL con sus dos ...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
La combinación de electroporación y denervación muscular in vivo es un enfoque experimental valioso para investigar un nicho regenerativo en el NMJ4. Dado que el músculo LAL está expuesto superficialmente, estos procedimientos combinados pueden complementarse fácilmente con la administración de sondas o fármacos que podrían afectar la expresión o la actividad de las proteínas12. Además, la electroporación de genes reporteros en el ...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos el ambiente altamente colaborativo y estimulante de los miembros de NeSt Lab por la útil discusión y comentarios sobre este trabajo. Actualmente, el trabajo en el NeSt Lab es financiado por FONDECYT 1221213. El esquema de la Figura 1A se creó con BioRender.com.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| #5/45 Pinzas Dumont | Herramientas de Bellas Ciencias | 11251-35 | Esterilizar antes de usar |
| anti 2H3 | DSHB | Diluido 1 : 300 | |
| anti S100 Listo para usar | Dako | IR504 | Diluido 1 : 5 |
| anti SV2 | DSHB | Diluido 1 : 50 | |
| Gluconato de clorhexidina 2% | DifenPharma | ||
| Microscopio estereoscópico de disección con luz fría | Motic | Modelo SMZ-171 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Diluido 1 : 100 |
| Pinzas de #5SF Dumont | Fine Science Tools | 11252-00 | Esterilizar antes de usar |
| Dumont Mini Pinzas – Estilo 5 | Herramientas de Ciencia Fina | 11200-14 | Esterilizar antes de usar |
| Electroporador ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | ||
| Electrodos tipo aguja de oro | Genetrodes, BTX | 45-0114 | |
| jeringa Hamilton recta de 10 mm | Hamilton | 80400 | |
| Hialuronidasa | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| Máquina de anestesia inhalatoria | SciVerma Scientific | M3000 | |
| Baxter | 218-082 | ||
| Ratones | Instituto de Salud Pública - Chile | Ratones CF-1 adultos (3-6 meses de edad), de ambos sexos (30-45 g) | |
| Cuchillas de afeitar | Schick | ||
| Suture Glicosorb 5/0 | TAGUM | GS0812. J | Hilo de ácido poliglicólico absorbible |
| tdPlásmido de tomate | Addgene | 54642 | tdPlásmido de tomate bajo el control del promotor de CMV |
| Clorhidrato de tramadol al 5% (Triamcol) | Drag Pharma | ||
| Vannas Tijeras de resorte | Fine Science Tools | 91500-09 | Esterilizar antes de usar |
| WGA Alexa Fluor 488 | Invitrogen | W7024 | Diluir |
| α-BTX Alexa Fluor 488 | Invitrogen | B13422 | Diluido 1 : 500 |
Referencias
- Slater, C. R. The functional organization of motor nerve terminals. Prog Neurobiol. 134, 55-103 (2015).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: Coordinating partners with multiple functions. Nat Rev Neurosci. 15 (11), 703-718 (2014).
- Zelada, D., Bermedo-Garcia, F., Collao, N., Henriquez, J. P. Motor function recovery: Deciphering a regenerative niche at the neuromuscular synapse. Biol Rev Camb Philos Soc. 96 (2), 752-766 (2021).
- Kobayashi, J., et al. The effect of duration of muscle denervation on functional recovery in the rat model. Muscle Nerve. 20 (7), 858-866 (1997).
- Bermedo-Garcia, F., Zelada, D., Martinez, E., Tabares, L., Henriquez, J. P. Functional regeneration of the murine neuromuscular synapse relies on long-lasting morphological adaptations. BMC Biol. 20 (1), 158(2022).
- Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: A convenient preparation to study muscle and nerve plasticity. J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul Disord. 20 (11), 740-743 (2010).
- Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Review: Neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: Amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy. Neuropathol Appl Neurobiol. 36 (2), 133-156 (2010).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre-and postsynaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).
- Wright, M., Kim, A., Son, Y. J. Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice. J Vis Exp. (55), e3124(2011).
- Zelada, D., Barrantes, F. J., Henríquez, J. P. Lithium causes differential effects on postsynaptic stability in normal and denervated neuromuscular synapses. Sci Rep. 11 (1), 17285(2021).
- Klooster, R., et al. Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice. Brain. 135, Pt 4 1081-1101 (2012).
- Mcmahon, J. M., Signori, E., Wells, K. E., Fazio, V. M., Wells, D. J. Optimisation of electrotransfer of plasmid into skeletal muscle by pretreatment with hyaluronidase: Increased expression with reduced muscle damage. Gene Ther. 8 (16), 1264-1270 (2001).
- Difranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. J Vis Exp. (32), e1520(2009).
- Ojeda, J., et al. The mouse levator auris longus muscle: An amenable model system to study the role of postsynaptic proteins to the maintenance and regeneration of the neuromuscular synapse. Front Cell Neurosci. 14, 225(2020).
- Olmstead, D. N., et al. Facial nerve axotomy in mice: A model to study motoneuron response to injury. J Vis Exp. (96), e52382(2015).
- Magill, C. K., et al. Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: A confocal microscopic study in transgenic mice. Exp Neurol. 207 (1), 64-74 (2007).
- Lloyd, M., Wolfensohn, S. Practical use of distress scoring systems in the application of humane endpoints. Humane Endpoints in Animal Experiments for Biomedical Research. , 48-53 (1999).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. Red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Perez, V., et al. The p75(ntr) neurotrophin receptor is required to organize the mature neuromuscular synapse by regulating synaptic vesicle availability. Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 147(2019).
- Boehm, I., et al. Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction. J Anat. 237 (5), 827-836 (2020).
- Jones, R. A., et al. Cellular and molecular anatomy of the human neuromuscular junction. Cell Rep. 21 (9), 2348-2356 (2017).
- Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biol. 6 (12), 160240(2016).
- Ma, C. H., et al. Accelerating axonal growth promotes motor recovery after peripheral nerve injury in mice. J Clin Invest. 121 (11), 4332-4347 (2011).
- Sakuma, M., et al. Lack of motor recovery after prolonged denervation of the neuromuscular junction is not due to regenerative failure. Eur J Neurosci. 43 (3), 451-462 (2016).
- Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (8), 4262-4267 (1999).
- Kleeman, B., et al. A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap. Cytometry A. 93 (5), 556-562 (2018).
- Morris, L. M., Klanke, C. A., Lang, S. A., Lim, F. Y., Crombleholme, T. M. Tdtomato and EGFP identification in histological sections: Insight and alternatives. Biotech Histochem. 85 (6), 379-387 (2010).
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: A convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
- Sokołowska, E., Błachnio-Zabielska, A. U. A critical review of electroporation as a plasmid delivery system in mouse skeletal muscle. Int J Mol Sci. 20 (11), 2776(2019).
- Pérez-García, M. J., Burden, S. J. Increasing musk activity delays denervation and improves motor function in ALS mice. Cell Rep. 2 (3), 497-502 (2012).
- Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14863-14868 (2010).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
