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Artículo de método

Preparación de nanopartículas de óxido de zinc y evaluación de sus efectos antibacterianos

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DOI:

10.3791/66725

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27 de septiembre de 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Integrative Engineering, Chung-Ang University, 2Feynman Institute of Technology, Nanomedicine Corporation, 3Department of Chemical Science and Engineering, Tokyo Institute of Technology, 4Department of Chemical Engineering, Kumoh National Institute of Technology

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

En este estudio, se sintetizaron nanopartículas de óxido de zinc utilizando un método de precipitación. El efecto antibacteriano de las partículas sintetizadas se probó contra cepas bacterianas de Staphylococcus aureus (SARM) y Pseudomonas aeruginosa resistentes a múltiples fármacos.

Resumen

Las infecciones bacterianas nosocomiales se han vuelto cada vez más desafiantes debido a su resistencia inherente a los antibióticos. La aparición de cepas bacterianas multirresistentes en los hospitales se ha atribuido al uso extensivo y variado de antibióticos, lo que agrava aún más el problema de la resistencia a los antibióticos. Los nanomateriales metálicos han sido ampliamente estudiados como una solución alternativa para erradicar las células bacterianas resistentes a los antibióticos. Las nanopartículas metálicas atacan a las células bacterianas a través de diversos mecanismos, como la liberación de iones antibacterianos, la generación de especies reactivas de oxígeno o la disrupción física, contra la cual las bacterias no pueden desarrollar resistencia. Entre las nanopartículas metálicas antimicrobianas investigadas activamente, las nanopartículas de óxido de zinc, aprobadas por la FDA, son conocidas por su biocompatibilidad y propiedades antibacterianas. En este estudio, nos centramos en desarrollar con éxito un método de precipitación para sintetizar nanopartículas de óxido de zinc, analizar las propiedades de estas nanopartículas y realizar pruebas antimicrobianas. Las nanopartículas de óxido de zinc se caracterizaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM), dispersión dinámica de luz (DLS), espectroscopia ultravioleta/visible y difracción de rayos X (XRD). Las pruebas antibacterianas se realizaron mediante la prueba de microdilución de caldo con las cepas multirresistentes de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) y Pseudomonas aeruginosa. Este estudio demostró el potencial de las nanopartículas de óxido de zinc para inhibir la proliferación de bacterias resistentes a los antibióticos.

Introducción

Las infecciones bacterianas multirresistentes (MDR) suponen una importante amenaza mundial para la salud humana1. Dado que estas infecciones pueden ser mortales en pacientes con afecciones subyacentes, la investigación activa está tratando de abordar este problema2. Las bacterias han evolucionado para evadir la acción de diversos fármacos. La penicilina, ampliamente conocida y a la que se le atribuye haber salvado millones de vidas en todo el mundo, es un antibiótico β-lactámico que inhibe la síntesis de la pared celular bacteriana3. Sin embargo, las bacterias han evolucionado para neutralizar la eficacia de los fármacos a través de diversos mecanismos como bombas de eflujo, alteraciones de la transpeptidasa o disminución de la permeabilidad4. Además, las células bacterianas pueden transmitir estos genes de resistencia a la siguiente generación, aumentando las tasas de supervivencia de la generación siguiente y reforzando el problema de las cepas resistentes5.

El aumento de bacterias resistentes a los antibióticos ha llevado a la aparición de bacterias MDR, que comúnmente exhiben resistencia a múltiples antibióticos. Las cepas MDR se encuentran con mayor frecuencia en entornos hospitalarios, donde múltiples cepas bacterianas están expuestas a diferentes antibióticos y, en consecuencia, desarrollan resistencia a ellos6. Staphylococcus aureus, particularmente S. aureus resistente a la meticilina (SARM), es una bacteria comensal grampositiva que forma grupos en la piel de aproximadamente el 30% de los seres humanos7,8. El SARM, que se identificó por primera vez en la década de 1960, exhibe una sensibilidad reducida a los antibióticos β-lactámicos, lo que resulta en un fuerte aumento en lastasas de infección desde la década de 1990. Entre las bacterias gramnegativas, la Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) es una de las cepas más prevalentes adquiridas en los hospitales. Esta especie, una bacteria facultativa en forma de bastón, causa infecciones oportunistas en humanos10. En particular, las cepas MDR que afectan directamente a la salud humana son responsables de más del 50 % de las infecciones asociadas a la asistencia sanitaria11. En este estudio, se utilizaron las cepas multirresistentes más comúnmente encontradas en los hospitales, MRSA y P. aeruginosa.

El uso de nanopartículas (NP) con fines antimicrobianos se ha investigado ampliamente para abordar el problema de la resistencia a los antibióticos. Las NP metálicas, en particular, inducen la muerte de las células bacterianas a través de varios mecanismos, lo que ofrece una posible solución al problema de la resistencia a los medicamentos. Las NP metálicas ejercen actividad antimicrobiana a través de múltiples mecanismos, incluyendo la liberación de iones antimicrobianos, la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la disrupción física de las células, entre otros medios12. Las NP compuestas de plata, cobre, óxido de zinc (ZnO) y óxido de titanio poseen una alta eficacia antimicrobiana y, por lo tanto, están siendo investigadas activamente13.

Las NP de ZnO han sido aprobadas por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) para su uso en humanos. Por el contrario, a pesar de su alta eficacia antimicrobiana, el uso de NP de plata y cobre en humanos está limitado por su alta citotoxicidad. Sin embargo, las NP de ZnO se encuentran comúnmente en la vida cotidiana e incluso están presentes en formulaciones de protectores solares ampliamente utilizadas14. Cabe destacar que los iones Zn2+ liberados por las NP de ZnO son altamente efectivos en el tratamiento bacteriano, induciendo la muerte celular bacteriana a través de la generación de ROS y otros mecanismos de daño físico15.

Este estudio describe el protocolo para sintetizar nanopartículas de ZnO (NP) utilizando un método de precipitación e introduce un enfoque de prueba antimicrobiana utilizando un método de dilución de microcaldo con muestras clínicas de MRSA y P. aeruginosa. El método de precipitación para las NPs de ZnO consiste en sintetizar NPs sólidas insolubles de ZnO ajustando el pH y la temperatura utilizando precursores solubles como el acetato de zinc o el nitrato de zinc16. Junto con una producción relativamente fácil y rápida, este método garantiza la repetibilidad en la síntesis y facilita el control sobre el tamaño y la morfología de las partículas17. En este protocolo de síntesis, se utilizó hidróxido de sodio (NaOH), uno de los agentes de precipitación más utilizados, para precipitar acetato de zinc, y se empleó una pequeña cantidad de bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) para inhibir la síntesis incontrolada de las nanopartículas18. Entre varias pruebas antimicrobianas, se evaluó la actividad antibacteriana de las nanopartículas de ZnO utilizando el método de dilución de microcaldo, que evita la interferencia óptica de las nanopartículas de óxido metálico y permite la medición directa de colonias para determinar MIC19.

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Protocolo

Los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de nanopartículas de óxido de zinc

  1. Mida 200 ml de alcohol etílico absoluto y viértalo en un matraz de vidrio de fondo redondo.
  2. Coloque el matraz de fondo redondo sobre una manta calefactora y mantenga la agitación a 25-40 °C.
  3. Mida 500 mg de CTAB en un vial de 50 ml y añádalo al alcohol etílico del matraz. Revuelva hasta que CTAB se disuelva por completo.
  4. Agregue 1,4 g de acetato de zinc a la solución y revuelva hasta que se disuelva por completo.
  5. Eleve la temperatura de la solución ajustando la temperatura del manto calefactor a 70 °C.
  6. Agregue 25 mL de solución de NaOH 0.5 M a la mezcla y déjela reaccionar durante 1 h hasta que la solución transparente se vuelva de color blanco.
  7. Aliquotar la solución en tubos cónicos de 50 mL, centrifugar a 15000 × g durante 15 min a temperatura ambiente y luego desechar el sobrenadante.
  8. Añadir 10 mL de agua destilada a uno de los tubos cónicos y volver a suspender las nanopartículas sonicando la solución. Transfiera la solución suspendida a un tubo cónico diferente que contenga la pastilla de ZnO y repita hasta que todas las soluciones de ZnO se recojan en un tubo cónico.
  9. Lavar las nanopartículas mediante centrifugación a 15000 × g durante 15 min (temperatura ambiente), retirar el sobrenadante y volver a suspender en agua destilada. Verifique el pH de la solución sobrenadante con papel de prueba de pH y repita hasta que el pH de la solución se vuelva neutro.
    NOTA: Cuando el pH de la solución sobrenadante se vuelva neutro (pH = 7), deseche la solución sobrenadante y no vuelva a suspender con agua destilada.
  10. Seque al vacío el palet de muestras a 60 °C durante 24 h y obtenga el polvo de ZnO NP.

2. Pruebas antibacterianas con SARM y P. aeruginosa

  1. Cultivo bacteriano
    NOTA: Las cepas bacterianas MDR clínicas se obtuvieron del Hospital Universitario Chung-Ang, Seúl, Corea del Sur.
    1. Saque las cepas bacterianas de MRSA y P. aeruginosa almacenadas en el caldo de soja tríptico (TSB) del congelador.
    2. Después de descongelar las soluciones bacterianas, escurra la solución en una placa de agar de soja tríptico (TSA) usando un asa de inoculación desechable. Coloque las placas de agar rayadas en la incubadora e incube durante 24 h.
      NOTA: Se añadió una sola colonia seleccionada de la placa TSA a 10 mL de medio TSB en un tubo cónico de 50 mL utilizando un circuito de inoculación bacteriana. Las bacterias se cultivaron durante 24 h. Las bacterias se cultivaron en condiciones de cultivo aeróbico a 37 °C.
    3. Para medir la concentración de la solución de bacterias, diluya la solución cultivada con una dilución en serie de 10 veces a 10-6 con agua destilada. A continuación, coloque 50 μL de la solución diluida en placas TSA y extienda la solución con un esparcidor en forma de L.
    4. Incubar las placas en la incubadora durante 24 h.
      NOTA: Las colonias se contaron ópticamente y la concentración de la solución cultivada se calculó multiplicando los factores de dilución por el número de colonias contadas.
  2. Toma de muestras bacterianas
    1. Para probar una amplia gama de concentraciones de ZnO, prepare una solución de 2 mg/mL de ZnO NPs utilizando la solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco y realice una dilución en serie de 2 veces para obtener diferentes concentraciones.
      NOTA: Se analizaron 1000 μg/mL, 500 μg/mL, 250 μg/mL, 125 μg/mL y 62,5 μg/mL.
    2. Agregue 100 μL para cada una de las concentraciones probadas de NnO NP en una placa de 96 pocillos.
      NOTA: Utilice el doble (2x) de la concentración final deseada de NPs de ZnO, ya que cada muestra en el pocillo se diluirá con la adición de 100 μL de cultivo de bacterias. Utilice una solución de antibióticos y antimicóticos (A/A) al 2% como control positivo y DPBS como control negativo. A/A es un complejo antibiótico de penicilina y estreptomicina, que es eficaz contra bacterias grampositivas y gramnegativas, respectivamente.
    3. Diluir el cultivo bacteriano a 1 × 106 UFC/mL utilizando medios TSB y añadir 100 μL a cada pocillo que contenga diferentes concentraciones de NPs de ZnO.
      NOTA: Las concentraciones iniciales de SARM y de la solución de cultivo de P. aeruginosa fueron de 3 x 109 UFC/mL. La concentración de cultivo de bacterias 1 x 106 UFC/mL se realizó mediante dilución 1/20 y 1/150 de la solución de cultivo. Después de mezclar con 100 μL de NPs de ZnO, la concentración final de bacterias será de 5 × 105 UFC/mL.
    4. Coloque la placa de 96 pocillos en una incubadora a 37 °C e incube durante 24 h.
  3. Propagación bacteriana
    1. Pipetear 100 μL de cada pocillo y preparar varias diluciones en serie 10 veces hasta 10-6.
      NOTA: Agregue 100 μL de NPs de ZnO que contengan solución bacteriana en 900 μL de agua destilada esterilizada y repita 6 veces.
    2. Pipetear 50 μL a partir de cuatro soluciones diluidas y añadirlas a las placas de medios TSA. Utilice un esparcidor de células en forma de L para esparcir la suspensión bacteriana sobre la placa de agar.
      NOTA: Utilice las diluciones 100, 10-2, 10-4 y 10-6 . Realizar todos los experimentos por triplicado. Extienda hasta que toda la solución bacteriana se absorba en la placa de agar.
    3. Coloque las placas de agar en una incubadora a 37 °C e incube durante 24 h.
  4. Recuento de UFC bacterianas
    1. Seleccione un factor de dilución que sea contable para cada grupo. Marque todas las colonias en la placa de dilución contable y vuelva a calcular para que la concentración se convierta en # de UFC/mL.
      NOTA: El factor de dilución contable indica platos que tienen 20-100 UFC en un plato individual. Resultados de concentración contada inicialmente # de UFC contadas/50 μL. Usando la placa extendida con la solución bacteriana sin diluir, determine la concentración bactericida mínima potencial.
    2. Utilice los datos obtenidos para representar el porcentaje de bacterias vivas en relación con las del control negativo.
      NOTA: Porcentaje de bacterias vivas (%) =figure-protocol-1

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Resultados

La síntesis exitosa de NPs de ZnO se confirmó utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM), como se muestra en la Figura 1A. Se observó que las NPs de ZnO obtenidas tenían forma redonda, con un tamaño de partícula promedio de 35,35 nm y una desviación estándar de 6,81 nm. La precipitación de estas nanopartículas se observó a través de una reacción de doble desplazamiento mediante la adición de una solución de NaOH al acetato de zinc, donde los iones Zn2+ se sometieron a...

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Discusión

La síntesis de NPs de ZnO a través de la precipitación es relativamente sencilla y directa. Para sintetizar con éxito las NP de ZnO utilizando este método, la agitación es crucial para garantizar que el precursor (acetato de zinc) se disuelva completamente en el disolvente. Además, el aumento de la temperatura ayuda a inducir una reacción exitosa de doble desplazamiento. En la síntesis de NP de ZnO, hay muchos factores que determinan el tamaño y la forma, incluido el agente de p...

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Divulgaciones

El Dr. Jonghoon Choi es el director ejecutivo y fundador, y el Dr. Yonghyun Choi es el director de tecnología del Instituto de Tecnología Feynman de Nanomedicine Corporation.

Agradecimientos

Esta investigación contó con el apoyo de la Beca de Investigación de Posgrado de la Universidad Chung-Ang en 2022 (Sra. Gahyun Lee). Este trabajo también contó con el apoyo de la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno coreano (MSIT) (No. 2020R1A5A1018052) y por el Programa de Desarrollo Tecnológico (RS202300261938) financiado por el Ministerio de Pymes y Startups (MSS, Corea).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DLSZetasizer Pro
Alcohol etílico, absolutoDAEJUNG4023-2304
Lector de microplacas Hidróxido de sodio BioTeck
Sigma-Aldrich221465
TEMJEOL JEM-F200
TSADB difco236950
TSBDB difco211825
XRDNUEVO D8-Advance
Acetato de zincSigma-Aldrich383317

Referencias

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