Artículo de método

Imágenes de microscopía de lámina de luz y estrategias de montaje para embriones tempranos de pez cebra

DOI:

10.3791/66735

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19 de julio de 2024

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se describe una estrategia de preparación de muestras para obtener imágenes de embriones tempranos de pez cebra dentro de un corion intacto utilizando un microscopio de lámina de luz. Analiza las diferentes orientaciones que adquieren los embriones dentro del corion en las etapas de epibolia y yema del 70% y detalla estrategias de imagen para obtener una resolución a escala celular en todo el embrión utilizando el sistema de lámina de luz.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopía de lámina de luz se ha convertido en la metodología de elección para obtener imágenes en vivo de embriones de pez cebra en escalas de tiempo largas con una fototoxicidad mínima. En particular, un sistema multivista, que permite la rotación de la muestra, permite obtener imágenes de embriones completos desde diferentes ángulos. Sin embargo, en la mayoría de las sesiones de imágenes con un sistema multivista, el montaje de muestras es un proceso problemático, ya que las muestras generalmente se preparan en un tubo de polímero. Para ayudar en este proceso, este protocolo describe estrategias básicas de montaje para obtener imágenes del desarrollo temprano del pez cebra entre las etapas epiboly del 70% y somita temprana. En concreto, el estudio proporciona estadísticas sobre las distintas posiciones en las que se encuentran los embriones en las etapas de epíboly y yema del 70% dentro del corion. Además, discute el número óptimo de ángulos y el intervalo entre ángulos requerido para obtener imágenes de embriones enteros de pez cebra en las primeras etapas de desarrollo, de modo que la información a escala celular se pueda extraer fusionando las diferentes vistas. Finalmente, dado que el embrión cubre todo el campo de visión de la cámara, que es necesario para obtener una resolución a escala celular, este protocolo detalla el proceso de utilizar la información de las cuentas desde arriba o por debajo del embrión para el registro de las diferentes vistas.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Garantizar una fototoxicidad mínima es un requisito importante para obtener imágenes de embriones vivos con alta resolución espacio-temporal durante largos períodos. Durante la última década, la microscopía de lámina ligera se ha convertido en la metodología de elección para cumplir con este requisito 1,2,3,4,5,6,7. Brevemente, en esta técnica que se utilizó por primera vez en 2004 para capturar los procesos de desarrollo8, dos láminas delgadas de láser alineadas atraviesan el embrión desde extremos opuestos, iluminando solo el plano de interés. Se coloca un objetivo de detección ortogonalmente y, a continuación, se recoge simultáneamente la luz fluorescente emitida desde todos los puntos iluminados de la muestra. A continuación, se obtiene una imagen en 3D moviendo secuencialmente el embrión a través de la lámina de luz estática.

Además, en una forma específica de esta metodología, denominada microscopía de lámina de luz multivista, las muestras pueden suspenderse en un tubo de polímero que se puede girar mediante un rotor, lo que permite obtener imágenes del mismo embrión desde múltiples ángulos 9,10,11. Después de la toma de imágenes, las imágenes desde múltiples ángulos se fusionan en función de los marcadores de registro, que suelen ser marcadores fluorescentes globulares dentro del embrión (por ejemplo, núcleos) o en el tubo (por ejemplo, perlas fluorescentes). Las imágenes multivista y la fusión mejoran significativamente la resolución axial, proporcionando una resolución isotrópica en las tres dimensiones12. Si bien esta es una gran ventaja, un desafío importante de la metodología de vista múltiple es el montaje de muestras, donde los embriones deben montarse y mantenerse en su lugar en los tubos durante todo el curso de tiempo de la imagen.

Para la realización de imágenes multivista, para mantener los embriones en su lugar y evitar el movimiento durante la obtención de imágenes, los embriones se pueden incrustar en agarosa. Sin embargo, esto a menudo conduce a un crecimiento y desarrollo perjudiciales, particularmente para los embriones de pez cebra en etapa temprana13, el sistema modelo que se discute aquí. Una segunda estrategia de montaje es utilizar un tubo delgado que es solo un poco más grande que el diámetro del embrión, donde el embrión puede ser arrastrado hacia el tubo junto con el medio embrionario, seguido de cerrar la parte inferior del tubo con un tapón de agarosa14. En este método, debido a que el tubo está lleno de medio embrionario, los marcadores de registro, como las perlas fluorescentes, no se pueden usar para la fusión de las diferentes vistas y, por lo tanto, el registro depende de los marcadores dentro del embrión. En general, las perlas actúan como mejores marcadores de registro, ya que la señal de los marcadores dentro del embrión se degrada al adentrarse más en la muestra debido a las limitaciones de iluminación y detección de cualquier microscopio.

Por lo tanto, un tercer enfoque, que se detallará aquí y que se utilizó anteriormente 5,13,14,15,16, es obtener imágenes tempranas de embriones de pez cebra con un corion intacto y llenar el tubo con un porcentaje mínimo de agarosa, que contiene perlas como marcadores de registro. En este escenario, debido a que la intervención manual para posicionar los embriones dentro de un corion no es posible, este estudio proporciona estadísticas sobre la orientación predeterminada en la que caen los embriones tempranos de pez cebra, centrándose particularmente en las etapas de epíboly y yema del 70%. A continuación, se analiza el número óptimo de vistas necesarias para obtener imágenes de embriones en fase temprana con una resolución a escala celular y se detalla el proceso de fusión utilizando BigStitcher, un complemento basado en FIJI 10,17,18. En conjunto, este protocolo, que utiliza un objetivo NA 20x/1, tiene como objetivo facilitar a los embriólogos de pez cebra el uso de sistemas de láminas de luz multivista para obtener imágenes de embriones con núcleos y marcadores de membrana desde la gastrulación hasta las primeras etapas de somita.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los procedimientos experimentales y de mantenimiento del pez cebra utilizados en este estudio fueron aprobados por el comité institucional de ética animal, vide Referencia TIFR/IAEC/2023-1 y TIFR/IAEC/2023-5. Los embriones obtenidos por cruzamiento de peces heterocigotos que expresan Tg(actb2:GFP-Hsa.UTRN)19 fueron inyectados con ARNm H2A-mCherry (30 pg) en la etapa unicelular. El ARNm de H2A-mCherry se sintetizó utilizando el plásmido pCS2+ H2A-mCherry (un regalo del laboratorio de Oates, EPFL) mediante transcripción in vitro . Los embriones que expresaban ambos marcadores, denominados Utr-GFP y H2A-mCherry, respectivamente, en el resto del protocolo, se fotografiaron en las etapas de epíboly y yema al 70%. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de muestras para imágenes multivista

  1. Preparación de tubos FEP/PTFE
    1. Limpie los tubos de FEP/PTFE siguiendo los procedimientos descritos anteriormente14.
    2. Después de la limpieza, corte los tubos en longitudes de 2-2,5 cm según sea necesario y guárdelos en tubos de microcentrífuga de 2 ml que contengan agua destilada doble. Los tubos se pueden almacenar de esta manera durante aproximadamente un mes.
    3. Antes de preparar la muestra, caliente los tubos a 70-75 °C durante aproximadamente 25 minutos para enderezar los tubos. Evite el apiñamiento en cada tubo de microcentrífuga para evitar la aglomeración, asegurando suficiente espacio para un enderezamiento eficaz del tubo.
      NOTA: Use guantes durante todo el procedimiento de manipulación de los tubos, ya que cualquier huella dactilar/partícula de polvo que quede en los tubos puede interferir con la toma de imágenes.
  2. Preparación de agarosa
    1. Prepare las soluciones madre del tampón E3 50x de la siguiente manera:
      1. Stock 1 - 3,252 g de Na2HPO4, 0,285 g de KH2PO4, 11,933 g de NaCl, 0,477 g de KCl en 1 L de agua desionizada
      2. Stock 2 - 2.426 g de CaCl2, 4.067 g de MgSO4 en 1 L de agua desionizada.
    2. Para hacer 1x tampón E3, agregue 20 mL de cada una de las soluciones stock 1 y 2 en 960 mL de agua desionizada.
      NOTA: No agregue azul de metileno en el tampón E3 utilizado para la toma de imágenes, ya que provoca la dispersión de la luz.
    3. Disuelva la agarosa de bajo punto de fusión en 1x E3 calentándola a 70-75 °C en un bloque de calor con agitación hasta que la solución se vuelva clara sin grumos ni cristales.
    4. Para la obtención de imágenes multivista, agregue perlas fluorescentes disponibles comercialmente (consulte la Tabla de materiales) a la solución de agarosa, lo que permite el registro de imágenes durante el análisis. Sonicar las perlas a temperatura ambiente con una frecuencia de 40 kHz durante 20-30 min en un ultrasonido en baño de agua para desagregar las perlas.
    5. Después de la sonicación, añadir 1 μL de perlas a 10 mL de solución de agarosa en un tubo de 15 mL y vórtear bien el tubo para asegurar una dispersión uniforme de las perlas.
      NOTA: El volumen de solución de perlas que se debe agregar a la agarosa depende de la solución madre y del fabricante. Pruebe una gama de volúmenes y elija una concentración en la que las cuentas parezcan bien dispersas cuando se visualicen en el sistema de láminas ligeras. Demasiadas cuentas pueden agregarse a pesar de la sonicación y el vórtice, mientras que muy pocas cuentas pueden afectar al registro de la imagen.
    6. Mantener el tubo de agarosa con perlas añadidas en un baño de agua cerrado mantenido a 37 °C durante al menos 30 minutos antes de la preparación de la muestra. Esto asegura que la temperatura de la agarosa baje de 70 °C a 37 °C.
  3. Preparación de la muestra
    1. Coloque los peces en parejas con divisores por la noche antes del día de la toma de imágenes. Retire los divisores durante unos 15 minutos y recoja los embriones utilizando el procedimiento estándar20.
    2. Una vez que los embriones alcancen la etapa de interés para la preparación de la muestra, vierta los 10 ml enteros de agarosa (con perlas) que se mantienen a 37 °C en una placa de Petri de 6 cm.
    3. Espere unos 2-3 minutos para que la temperatura baje de 33 °C antes de transferir de 10 a 15 embriones a la solución de agarosa.
      NOTA: Este es un paso importante para prevenir cualquier posible choque térmico en los embriones transferidos a la agarosa.
    4. Asegúrese de que se agregue la menor cantidad posible de tampón E3 a la solución de agarosa mientras se transfieren los embriones. Agite la placa de Petri para que el pequeño tampón que se habría transferido se disperse bien.
    5. Use guantes para el resto del procedimiento de preparación de la muestra.
    6. Tome una micropipeta de 200 μL con una punta de pipeta adecuada e inserte un tubo recto limpio extraído del tubo de microcentrífuga hasta la punta de la pipeta como se muestra en la figura 1A,B.
    7. Aspirar un poco de agarosa en el tubo, seguido de 2-3 embriones utilizando la micropipeta (Figura 1C,D). Asegúrese de que los embriones estén cerca de la parte inferior del tubo (Figura 1E), lo que será importante al preparar las imágenes. Además, asegúrese de que haya un poco de agarosa entre los diferentes embriones (Figura 1E) para que las cuentas de esta región puedan usarse como marcadores de registro.
    8. Sin liberar la presión de la pipeta, separe el tubo de la punta de la pipeta y colóquelo en la tapa de la placa de Petri llena de E3 para que la agarosa se solidifique (Figura 1F).
    9. Repita los pasos 1.3.6 a 1.3.8 hasta que todos los embriones de la placa de Petri se transfieran a los tubos.
    10. Una vez que la agarosa se haya solidificado (lo que puede tardar de 5 a 10 minutos y se puede confirmar revisando la agarosa en la placa de Petri), transfiera los tubos a un tubo de microcentrífuga de 2 mL lleno de E3 (Figura 1G).
    11. Guarde los tubos con los embriones en una incubadora a 28 °C o 33 °C, según sea necesario, antes de proceder a la obtención de imágenes multivista.

2. Imágenes multivista

NOTA: Este paso presenta un procedimiento general para la obtención de imágenes multivista de embriones de pez cebra en sus primeras etapas de desarrollo. El método que se detalla a continuación se puede adaptar fácilmente a cualquier sistema de microscopía de lámina de luz multivista.

  1. Localización del embrión
    NOTA: Llene la cámara de muestras del microscopio con el medio embrionario20 y ajuste la temperatura de la cámara de muestras a la temperatura de interés al menos 10 minutos antes de la toma de imágenes.
    1. Ensamble el portamuestras como se describió anteriormente21, sin embargo, con una modificación. Dado que las imágenes se realizarán a través del tubo, inserte el tubo con embriones directamente en un capilar del diámetro correcto, de modo que se mantenga en su lugar sin empujar la agarosa hacia afuera y perturbar los embriones en la parte inferior (Figura 1H).
      NOTA: Dado que la cámara de muestras tiene una altura definida, asegurarse de que los embriones estén ubicados hacia el fondo del tubo durante la preparación de la muestra (como se mencionó en el paso 1.3.7) permitiría colocar el embrión en el campo de visión sin golpear el suelo de la cámara.
    2. Inserte el portamuestras en el sistema multivista y utilice los controles x e y para llevar el embrión al centro del campo de visión.
    3. Utilice el control z del navegador de muestras para enfocar el embrión.
    4. En este punto, la orientación del embrión dentro del corion será claramente visible, y si no es satisfactoria, inserte un nuevo tubo y elija el embrión con una orientación de interés.
  2. Alineación de las láminas de luz
    1. Una vez que el embrión esté en posición, configure todos los ajustes experimentales: láseres, trayectoria de luz, filtro, divisor de haz y cámara.
    2. Al configurar los parámetros de adquisición, si el software ofrece una opción para el escaneo de pivote, selecciónela. Un escaneo pivotante reducirá el efecto de sombreado que emerge de la hoja de luz a medida que encuentra cualquier estructura o región opaca en la muestra.
    3. Inicie el escaneo en vivo de la muestra. Configure el tamaño de la broca, la potencia del láser y el zoom deseado, lo que determinará el grosor de la lámina de luz y, por lo tanto, la resolución axial.
    4. Para alinear las hojas de luz, primero cambie a la iluminación de un solo lado y cambie la configuración de las dos hojas de luz (izquierda y derecha) secuencialmente. Acérquese digitalmente a una región de la muestra donde se vean estructuras claras de interés.
      NOTA: En este estudio, se utilizó un marcador nuclear (H2A-mCherry) o un marcador de membrana (Utr-GFP) para alinear las láminas. Se recomienda cambiar la configuración de la hoja de luz en el software para que se logre el contraste más nítido de la señal en la región de interés.
    5. Una vez que las dos hojas de luz estén optimizadas individualmente para lograr la mejor señal, encienda ambas hojas de luz. Realice una segunda ronda de alineación y asegúrese de que el parpadeo sea mínimo, lo que indica una alineación bastante buena de las dos hojas.
    6. Una vez realizada la alineación, active la opción de fusionar automáticamente las imágenes generadas por las dos hojas, si el software lo permite. Alternativamente, primero se pueden alinear de manera gruesa las láminas de luz enfocándose en las cuentas alrededor de la muestra y luego ajustar la alineación utilizando la información de la muestra.
      NOTA: Al obtener imágenes con dos fluoróforos (como marcadores nucleares y de membrana), la alineación óptima suele ser marginalmente diferente para las dos estructuras. En este escenario, elija una configuración basada en las restricciones del procesamiento posterior. Por ejemplo, si se van a segmentar los límites de las celdas, lo que requiere un procesamiento relativamente más intensivo, alinee las láminas de luz en función del marcador de membrana.
  3. Configuración de imágenes multivista
    1. Después de alinear las hojas de luz, active las opciones para realizar una pila z, así como imágenes multivista.
    2. Inicie el escaneo en vivo y navegue con el navegador de muestras para seleccionar la primera vista. En esta vista, configure el intervalo de segmentos, seguido del primer y el último segmento de la pila z. Agregue esta posición en el cuadro de diálogo multivista, que toma nota de la posición y la información de la pila z para esta vista.
    3. Desplácese a la siguiente vista cambiando el ángulo en el navegador de muestras. Configure la pila z para la segunda vista y agregue la información en el cuadro de diálogo multivista.
    4. Repita lo mismo para vistas adicionales.
      NOTA: Asegúrese de que se muestre un cierto número mínimo de sectores en cada vista para que haya suficiente superposición entre las diferentes vistas, lo que eventualmente ayudará a registrar las vistas durante el procesamiento. El número mínimo de cortes dependerá del factor de zoom, así como del número de ángulos elegidos para la imagen.
    5. Después de configurar todas las vistas, guarde esta información en un archivo de texto (llamado 'posiciones de embriones', por ejemplo), que contendrá información de la pila z, coordenadas (x, y, z) del tubo, así como especificaciones del ángulo para cada vista. Después de guardar, borre todas las posiciones del cuadro de diálogo multivista.
    6. Dado que las imágenes se realizan con un corion intacto, que es relativamente grande, no es posible ver las perlas en el tubo con los mismos ajustes. Por lo tanto, la información del cordón debe adquirirse desde una posición diferente en el tubo. Para hacer esto, traduzca a una coordenada 'y' diferente lejos del embrión donde las cuentas son visibles. Añada esta posición al cuadro de diálogo multivista y guárdela en un archivo de texto (llamado 'beads-y', por ejemplo).
      NOTA: Tome una imagen de las perlas lo más cerca posible de la muestra del embrión para minimizar los efectos de las posibles diferencias en la curvatura del tubo en las dos posiciones. Por lo tanto, si se montan varios embriones en el tubo, es importante dejar un poco de agarosa entre los tubos para obtener imágenes de las cuentas (como se mencionó en el paso 1.3.7).
    7. Vaya a la carpeta donde se guardan los archivos de texto y duplique el archivo 'embryo-positions' en un nuevo archivo llamado 'beads-positions'. Reemplace la coordenada y para todas las vistas en el archivo 'beads-positions' por la coordenada y del archivo 'beads-y'. Esto asegurará que las cuentas se visualicen con el mismo número de vistas, pilas z y coordenadas x, pero en una posición y diferente en el tubo.
    8. Regrese al software de imágenes y cargue el archivo 'bead-positions' en el software. Si la opción de serie temporal está activada, seleccione un ciclo e inicie el experimento. Guarde las imágenes de cuentas como 'cuentas', que se utilizarán para registrar las diferentes vistas durante el procesamiento de la imagen.
    9. Después de tomar las imágenes de las cuentas, borre las posiciones y cargue el archivo inicial de "posiciones de embriones" en el software. Establezca el número deseable de ciclos con un intervalo de tiempo adecuado e inicie el experimento.

3. Análisis de imágenes multivista

NOTA: Para fusionar las imágenes multivista, se utiliza un complemento FIJI, BigStitcher, que es la última versión del complemento Multiview Reconstruction, 10,17,18. El complemento se puede instalar agregando el complemento BigStitcher en la función 'Administrar sitios de actualización', a la que se puede acceder en la opción 'Actualizar' en el menú 'Ayuda'. Una vez instalado, el plugin aparecerá en el menú 'Plugins'. Los pasos generales involucrados en la fusión son los siguientes: (1) Definir pares de archivos .xml/.h5 tanto para las cuentas como para los embriones; (2) Registre todas las vistas con el archivo de cuentas; (3) Función de dispersión de punto de extracción (PSF) para las cuentas, que se puede utilizar para la deconvolución (Figura 2A); (4) Transfiera el registro y la información de PSF del archivo de cuentas al archivo de embriones y comience la deconvolución multivista. La mayoría de estos pasos se han descrito previamente en detalle21, y aquí se describen los pasos que se procesan de manera diferente.

  1. Definición de un conjunto de datos .xml
    1. Defina un nuevo conjunto de datos para las cuentas y el embrión como 'beads.xml' y 'embryo.xml', respectivamente, como se describió anteriormente21.
  2. Detección y registro mediante puntos de interés
    1. Después de la exportación exitosa del archivo beads.xml, seleccione las vistas necesarias para el registro en el cuadro de diálogo 'Explorador multivista' (Figura 2B). Haga clic con el botón derecho y elija Detectar puntos de interés. Continúe con los pasos descritos21.
    2. Después de detectar los puntos de interés, seleccione todas las vistas, haga clic con el botón derecho y elija Registrar con puntos de interés. Siga el protocolo descrito21.
    3. Compruebe cuidadosamente si el registro de la cuenta ha funcionado correctamente. Tras el registro exitoso, se superponen cuentas superpuestas de diferentes vistas (Figura 2C). Para comprobar la precisión con la que ha funcionado el registro, seleccione dos vistas consecutivas, vaya a la región superpuesta y alterne entre las dos vistas para observar si las cuentas visualizadas desde diferentes ángulos están superpuestas. Repita esto para cada vista consecutiva.
    4. Si la superposición no es precisa, vuelva a intentar el registro relajando la significación requerida para el registro y/o el error aceptable de superposición (denominado "error RANSAC" en el cuadro de diálogo "Registro").
    5. Después de un registro exitoso, haga clic en Guardar en la ventana 'Explorador multivista' para guardar el archivo de .xml actualizado.
      NOTA: Guarde también el archivo de registro, ya que contiene información más detallada sobre la eficiencia del registro. Para traducir la información de registro de las cuentas al embrión, siga los pasos que se describen a continuación.
    6. Abra el archivo bead.xml en el editor de texto de su elección y copie todo el bloque en "ViewRegistrations".
    7. Abra el embryo.xml y reemplace el bloque "ViewRegistrations" con el bloque copiado del archivo de cuentas. Si hay varios canales, reemplace la información de registro para cada canal como se indicó anteriormente. La información de registro se puede transferir manualmente o mediante el código de MATLAB escrito a medida que se puede descargar aquí: https://github.com/sundar07/Multiview_analysis
    8. Abra el archivo embryo.xml en "BigStitcher" y compruebe cuidadosamente si el registro ha funcionado correctamente para el embrión. Repita lo mismo que se hizo para las cuentas, comprobando la superposición de estructuras de interés en cada dos vistas consecutivas.
      NOTA: Ocasionalmente, el registro de embriones puede no ser tan deseable a pesar de que las cuentas se registran perfectamente. Esto es posible si hay ligeros cambios en la curvatura del tubo desde la posición en la que se obtienen las perlas hasta la posición del embrión. Además, podría haber movimientos sutiles del embrión entre las vistas, ya que flota libremente dentro del corion. En este caso, se realiza una segunda ronda de registro utilizando un marcador nuclear en el embrión.
    9. Para ello, abra el archivo embryo.xml en "BigStitcher", haga clic con el botón derecho del ratón en todas las vistas que tengan el marcador nuclear y elija Detectar puntos de interés.
    10. Cambie el nombre de los puntos de interés a "núcleos" y continúe con los pasos tal como se realizaron para las cuentas.
    11. Al establecer los parámetros de 'Diferencia de gaussianos', asegúrese de que la mayoría de los núcleos, si no todos, se detecten y que no haya detección nuclear ectópica. A continuación, haga clic en Listo.
    12. A continuación, registre estas vistas seleccionando Registrar con puntos de interés y opte por la opción Basado en descriptor preciso (invariante de traducción). Asegúrese de que la opción "comparar todas las vistas y puntos de interés" esté seleccionada y utilice los "núcleos" como puntos de interés. Utilice la opción para fijar la primera vista y no volver a asignarla.
    13. Para el registro, utilice un modelo afín con regularización rígida y los parámetros predeterminados en el complemento.
    14. Vuelva a comprobar el éxito del registro comparando cada dos vistas consecutivas.
    15. Después de un registro exitoso, haga clic en Guardar en la ventana 'Explorador multivista' para guardar el archivo de .xml actualizado.
    16. Abra el archivo embryo.xml en el editor de texto de su elección y copie la información de registro de los marcadores nucleares a los otros canales.
  3. Extracción y asignación de la función de dispersión de puntos
    1. Para realizar la deconvolución multivista, extraiga la PSF del sistema de imágenes del conjunto de datos de cuentas registradas y aplíquela al archivo de embriones.
    2. Para obtener esta información, seleccione todas las vistas del archivo de cuentas y, a continuación, haga clic con el botón derecho y elija Funciones de dispersión de puntos y Opciones de extracción .
    3. En el cuadro de diálogo que aparece, asegúrese de que las proyecciones Usar puntos de interés correspondientes y Eliminar intensidad mínima de PSF estén marcadas, proceda con los tamaños de PSF predeterminados y haga clic en Aceptar.
      NOTA: Si la extracción de PSF se realiza correctamente para todas las vistas, el archivo de registro mostrará 'Extraídas n/n PSF'
    4. Después de esto, vuelva a guardar el archivo .xml. Aparecerá una casilla de verificación marcada en la columna PSF del cuadro de diálogo 'Explorador multivista', y se generará una carpeta 'psf' en la carpeta respectiva con todos los PSF extraídos.
    5. Abra el archivo embryo.xml y asigne el PSF para cada vista por separado. Haga clic con el botón derecho en "una vista" → haga clic en Funciones de dispersión de puntos → elija Asignar → seleccione Avanzado, seguido de Asignar nuevo PSF a todas las vistas seleccionadas. Haga clic en Examinar, vaya a la ruta del archivo .xml y abra la carpeta psf .
    6. Elija el PSF correspondiente con el ID correspondiente en la vista seleccionada y haga clic en Aceptar, después de lo cual aparecerá la casilla de verificación PSF marcada en la ventana 'Explorador multivista'.
    7. Repita el proceso para todas las demás vistas.
  4. Fusión y deconvolución multivista
    1. Una vez asignada la función de dispersión de puntos para todas las vistas, haga clic con el botón derecho y elija Deconvolución multivista.
    2. Seleccione el cuadro delimitador como vistas seleccionadas actualmente. Para este trabajo, la aceleración predeterminada de OSEM y el número de iteraciones funcionan bien.
    3. Reduzca la resolución de las imágenes según sea necesario si se desea un cálculo más rápido o si la memoria de la CPU es limitante.
      NOTA: Si la RAM requerida excede la memoria existente, aparecerá un mensaje de error de advertencia en color rojo en la parte inferior de la ventana. No inicie la deconvolución si aparece esta advertencia, ya que el complemento se detendrá y dejará de responder en algún momento durante el procesamiento.
    4. Para evaluar el progreso de la deconvolución, compruebe el archivo de registro, que mostrará los resultados cada 5 iteraciones.
    5. Para aumentar la velocidad de cálculo, realice la deconvolución multivista en la GPU si está instalada anteriormente.
      NOTA: Al final de este proceso, aparecerá una ventana de imagen fusionada, que se puede guardar como un archivo tiff.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Orientar la muestra de manera precisa es una parte vital del uso eficiente de una configuración de microscopía. Sin embargo, la orientación manual de las muestras a menudo no es posible cuando se utiliza un sistema de láminas ligeras multivista, dado el requisito de preparar las muestras en un tubo. Por lo tanto, para comprobar si existen posiciones estereotipadas que adoptan los embriones dentro del corion, se tomaron imágenes de embriones de pez cebra al 70% de la epíbolia (aproximadamente 7 h después de la fertilización (hpf)), ya que las imágenes de lapso de tiempo desde la gastrulación hasta las primeras etapas de somita fueron el foco de este estudio. Cuando las muestras se prepararon inmediatamente antes de la obtención de imágenes al 70% de epibolia, los embriones no mostraron la orientación específica que se observa con frecuencia en todas las muestras. Dado que esto a menudo no es deseable, las muestras se prepararon mucho antes de la gastrulación y se almacenaron en tubos de microcentrífuga a la temperatura adecuada hasta el inicio de la toma de imágenes. En estas condiciones, al 70% de epibolia (N = 3; n = 87 embriones), las orientaciones embrionarias podrían clasificarse en (1) Horizontal, cuando el eje animal-vegetal (AV) del embrión era ortogonal al eje largo del tubo de polímero, (2) Vertical, cuando el eje AV era paralelo al eje largo del tubo de polímero, y, (3) Oblicuo, cuando el eje AV estaba en un ángulo agudo (Figura 3A). La posición horizontal fue la menos representada, mientras que las verticales y oblicuas se observaron por igual (Figura 4).

Cuando los embriones se dejaron en las trompas, los embriones se mantuvieron estables en estas posiciones respectivas hasta el 90% de epiboly, después de lo cual la mayoría de los embriones cambiaron sus orientaciones. Por lo tanto, se requirió una segunda ronda de documentación de las orientaciones en la etapa de yema de la embriogénesis (alrededor de 10 hpf) para dar cuenta de los cambios de orientación. Esto se realizó para muestras preparadas de forma independiente. Para la obtención de imágenes de las primeras etapas de los somitos, se informó previamente que un embrión con su notocorda ortogonal al eje largo del tubo de polímero era la orientación ideal, ya que permite la visualización de múltiples somitas bilaterales formándose a lo largo del eje15. Cuando se prepararon las muestras antes de la gastrulación (N = 3, n = 93 embriones), alrededor del 25% de los embriones exhibieron esta orientación (Figura 4) y estos embriones permanecieron estables en esta orientación hasta al menos la etapa de 8-somitas, lo que concuerda con informes previos15. El resto de los embriones exhibieron otras orientaciones en la etapa de brotación (clasificados en la Figura 3B y la Figura 4); sin embargo, muchos de ellos se reorientaron a la posición horizontal durante la formación temprana de somitas. Curiosamente, un porcentaje similar de embriones presentó una orientación horizontal en la etapa de brote, independientemente de si la muestra se preparó antes de la gastrulación, al 70% de epibolia, o inmediatamente antes de la etapa de brote. Por lo tanto, el tiempo de preparación de la muestra parece menos crítico para la orientación horizontal de interés para las etapas de somita de imagen, a diferencia de lo que se observó para la obtención de imágenes al 70% de epibolia.

La ventaja de un sistema multivista es la capacidad de ver la misma muestra desde múltiples ángulos. Sin embargo, para los embriones de pez cebra en las etapas mencionadas, no está claro el número de vistas necesarias para obtener la resolución celular en todo el embrión. Para caracterizar esto, se obtuvieron imágenes de embriones de pez cebra utilizando un objetivo NA 20x/1 en el brazo de detección con un factor de zoom de 1, que correspondió a un espesor de lámina ligera de 4,57 μm. Bajo esta configuración, el embrión cubrió todo el campo de visión de una cámara sCMOS con un tamaño de píxel de 6,5 μm y un área de 1920 por 1920 píxeles. La microinyección de ARNm para un fluoróforo marcado con histonas (H2A-mCherry) en embriones en estadio de 1 célula obtenidos de una línea transgénica que marcan filamentos de actina (Utr-GFP) permitió la visualización tanto de núcleos como de membranas celulares en el embrión. Para llevar a cabo la fusión multivista de embriones con diferentes intervalos angulares, se realizó una adquisición de 360° de los embriones transgénicos dobles, así como de las perlas en el tubo, a intervalos de 30° (n = 3 embriones al 70% epibolia; n = 3 embriones en la etapa de brotación) o 45° (n = 3 embriones al 70% epibolia; n = 3 embriones en la etapa de brotación) con aproximadamente 100 cortes en cada ángulo y un intervalo de corte de 2 μm. Al omitir ángulos alternativos durante el procesamiento de imágenes, las adquisiciones de 30° y 45° proporcionaron adicionalmente los conjuntos de datos de 60° y 90°.

A continuación, las imágenes adquiridas se registraron utilizando la información de las cuentas, y los detalles del registro se transfirieron al conjunto de datos del embrión como se describe en la sección de protocolo. El registro exitoso utilizando el complemento BigStitcher se logró para las diferentes adquisiciones, excepto para el conjunto de datos de 90°, lo que probablemente se deba a una menor cobertura de la muestra desde cada ángulo. Para superar esto, se tomaron imágenes de los embriones cada 90° con aproximadamente 400 cortes en cada ángulo y un intervalo de corte de 2 μm, tanto en la etapa de epibolía como en la de yema al 70%, que se registraron con éxito (n = 3 embriones para cada etapa).

El siguiente paso fue realizar la fusión multivista y la deconvolución de los conjuntos de datos registrados. Esto se hizo con un submuestreo de 4x para acelerar el cálculo. Como se ve en la representación de los núcleos a partir de vistas individuales y de un embrión reconstruido con múltiples vistas (Figura 5), las vistas individuales cubren un campo de visión más pequeño, que, al fusionarse, produce una imagen de todo el embrión. Para la representación, los núcleos se detectaron utilizando Mastodon (https://github.com/mastodon-sc/mastodon), un complemento basado en FIJI, que se puede agregar en la sección "Administrar sitios de actualización" del menú "Ayuda" en FIJI y acceder a él en el menú de complementos una vez agregado. Para la detección, las imágenes respectivas se convirtieron primero al formato XML/hdf5, y luego se realizó la detección nuclear utilizando el plugin 'Detección' de Mastodon con un detector DoG (diámetro 6 μm y umbral de calidad 80).

Entre las diferentes imágenes fusionadas, el conjunto de datos de 90° mostró un fondo muy alto en la profundidad de la muestra, lo que la hacía inadecuada para realizar cualquier cuantificación. Por lo tanto, a diferencia de las muestras más pequeñas, como los embriones de Drosophila, que con frecuencia se han fotografiado con un intervalo de 90° en otros estudios 9,22, no se recomienda lo mismo para obtener imágenes tempranas de embriones de pez cebra utilizando un objetivo de NA 20x/1. Entre los conjuntos de datos fusionados de 30°, 45° y 60°, cualitativamente, no hubo diferencias sustanciales en la información de los núcleos (Figura 6B, fila superior); sin embargo, las estructuras más finas, como los límites de las celdas, parecían mucho mejor resueltas con el conjunto de datos fusionados de 30° en comparación con el resto (Figura 6C, fila superior).

Para confirmar esta observación, se utilizó Mastodon para detectar núcleos en las imágenes fusionadas obtenidas de imágenes cada 30°, 45° y 60°. Se eligieron tres regiones en las imágenes fusionadas, una a una profundidad de 20 μm (Figura 6A), otra a 50 μm y otra a 100 μm de la superficie del embrión. Para comparar la eficiencia de la detección de núcleos en imágenes, la detección se realizó como se describió anteriormente, con parámetros idénticos en imágenes fusionadas de diferentes intervalos angulares. En todas las regiones analizadas, se detectaron todos los núcleos, independientemente de las imágenes fusionadas obtenidas a partir de imágenes cada 30°, 45° o 60° (Figura 6B, fila inferior). Por lo tanto, las estructuras globulares como los núcleos se pueden obtener imágenes en cualquiera de los intervalos angulares anteriores sin pérdida de información.

Para analizar los límites de las células, se utilizó Tissue Analyzer23, un complemento de FIJI utilizado habitualmente para segmentar las células 24,25,26. Al igual que Mastodon, el complemento Tissue Analyzer se puede agregar en la sección "Administrar sitios de actualización" del menú "Ayuda" en FIJI y se puede acceder a él en el menú de complementos una vez agregado. Los límites de las celdas se segmentaron utilizando el algoritmo de cuenca hidrográfica con parámetros predeterminados y un desenfoque fuerte que oscilaba entre 1,5 y 2 dependiendo de la profundidad del tejido y un desenfoque débil de 1. Estos parámetros se mantuvieron constantes en todos los análisis, lo que facilitó una comparación sencilla. Cuando las imágenes segmentadas se compararon manualmente con las imágenes de entrada originales, se observaron errores, en los que el software no pudo detectar un límite de celda o dibujó límites de celda inexistentes (Figura 6C, fila inferior). El número de errores cometidos por el complemento del analizador de tejidos se normalizó al número total de enlaces detectados en la región y se calculó como 'Error de segmentación de límites'. Si bien estos errores estuvieron presentes en todas las regiones analizadas, el número de errores aumentó drásticamente en las imágenes fusionadas obtenidas a partir de imágenes a intervalos angulares de 45° y 60°, en comparación con 30° (Figura 6D). Esto indicaba que la resolución en las imágenes fusionadas era cada vez peor cuando se aumentaba el intervalo angular. Por lo tanto, para segmentar estructuras más finas, como los límites de las celdas, un intervalo angular más estrecho permite un procesamiento posterior más fácil.

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Figura 1: Preparación de la muestra mediante tubos de polímero. (A) Un tubo de polímero de los tubos de microcentrífuga almacenados se toma con pinzas. (B) Fijación del tubo a la punta de una micropipeta de 200 μL. (C) Aspirar embriones con la ayuda de una pipeta en el tubo. (D,E) Un tubo de polímero con embriones en etapa de yema visibles hacia la parte inferior del tubo. (F) Los tubos de polímero se colocan en una placa de Petri con E3 para solidificar la agarosa. (G) Almacenamiento de los tubos de polímero en un tubo de microcentrífuga lleno de E3. (H) Portamuestras ensamblado con el tubo de polímero montado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Flujo de trabajo de análisis de imágenes multivista y registro mediante cuentas. (A) La canalización de análisis de imágenes multivista. (B) La imagen muestra la ventana "Multiview Explorer" en BigStitcher, un complemento de FIJI, donde cada vista aparece como una sola fila y contiene información sobre el ángulo, el canal, el registro, los puntos de interés y PSF. Todos los comandos discutidos en el protocolo aparecen cuando se selecciona una vista y se hace clic con el botón derecho, como se muestra en el menú emergente. Las vistas seleccionadas se pueden visualizar en la ventana de BigDataViewer, como se muestra. (C) Una imagen representativa de la cuenta antes (izquierda) y después del registro (derecha) obtenida a partir de imágenes a intervalos angulares de 30°. Se han seleccionado y visualizado todas las vistas angulares. Barras de escala: 75 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Resumen de las orientaciones embrionarias predeterminadas. Imágenes representativas de las orientaciones en las que caen los embriones dentro del corion al 70% de las etapas de epibolia (A) y yema (B). La fila superior de cada panel muestra imágenes de campo claro obtenidas del sistema de láminas de luz, y la fila inferior representa dibujos animados representativos. Las flechas en (B) indican la posición de la notocorda, que se utilizó para identificar la orientación. Ap: poste animal; Vp, polo vegetal; A, anterior; P: posterior. Barras de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Estadísticas de las diferentes orientaciones embrionarias. (A) La columna apilada indica los porcentajes de embriones que caen en las orientaciones indicadas al 70% de epíbolidad cuando las muestras se preparan antes de la gastrulación. (B) Las columnas apiladas indican los porcentajes de embriones que caen en las orientaciones indicadas en las etapas de yema cuando las muestras se preparan antes de la gastrulación (izquierda), al 70% de epíboly (centro) y en las etapas de yema (derecha). N, el número de nidadas independientes de las que se obtuvieron los embriones; n, el número total de embriones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Representación de los núcleos de un embrión reconstruido en múltiples vistas. (A)El diagrama de dispersión 3D representa los núcleos detectados en un embrión reconstruido en múltiples vistas con imágenes a un intervalo angular de 30'°. Cada círculo representa un núcleo y se traza el centroide de las posiciones de los núcleos. Las coordenadas nucleares se obtuvieron utilizando Mastodon, un complemento de FIJI. (B) Diagramas de dispersión 3D de núcleos de tres vistas representativas del mismo embrión, las representaciones separadas por 60°. Los colores de cada núcleo se asignaron aleatoriamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Comparación de la información a escala celular en imágenes fusionadas. (A) La imagen de la izquierda muestra una instantánea de un embrión reconstruido con múltiples vistas a una profundidad de 20 μm desde la superficie. El círculo amarillo representa la región utilizada para un análisis posterior. Barras de escala: 50 μm (en todos los paneles). (B) Imágenes representativas en bruto de núcleos a 20 μm de profundidad desde la superficie del embrión de tres conjuntos de datos tomados cada 30°, 45° y 60° respectivamente (arriba). Núcleos detectados (en verde) en las mismas imágenes por Mastodon, un plugin de FIJI (abajo). (C) Imágenes crudas representativas a 20 μm de profundidad desde la superficie del embrión de tres conjuntos de datos tomados cada 30°, 45° y 60° respectivamente, utilizando el marcador de actina, Utr-GFP (arriba). Los límites segmentados por Tissue Analyzer, un complemento de FIJI, se muestran para las mismas imágenes (abajo). Las flechas indican los errores cometidos por el Analizador de tejidos en la segmentación de límites, donde la flecha amarilla representa un límite faltante y la flecha blanca representa los límites detectados incorrectamente cuando visualmente no parecen existir límites. (D) El diagrama de caja muestra el porcentaje de errores que cometió el analizador de tejidos entre embriones reconstruidos con múltiples vistas de los que se obtuvieron imágenes cada 30°, 45° y 60° a diferentes profundidades. Las barras de error indican 1,5 veces el rango intercuartílico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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Posicionar un embrión en la orientación correcta para obtener imágenes de la región de interés es uno de los pasos limitantes de la velocidad que a menudo resulta en una sesión de microscopía fallida para un usuario. Esto es más cierto en un microscopio de lámina de luz multivista donde la manipulación manual de la orientación es difícil ya que las muestras están incrustadas dentro de un tubo. Para ayudar en este proceso, este estudio reporta las estadísticas de varias posiciones que ocupa un embrión de pez cebra entre el 70% de las etapas epibolial y las primeras de somita dentro de un corion cuando el tubo de polímero con embriones se mantiene en posición vertical en un tubo de microcentrífuga.

Al 70% de los embriones epiboly, orientados vertical u horizontalmente, proporcionan información complementaria de los eventos en todo el embrión. Mientras que la orientación horizontal permite la visualización de la dinámica celular en el polo animal, así como la dinámica de las células que experimentan epíboly vista desde el polo vegetal, la orientación vertical permite la visualización de los lados dorsal y ventral del embrión, incluida la dinámica celular en el organizador dorsal, la internalización de las células durante la gastrulación y los flujos de convergencia-extensión. Este estudio demuestra que existe una alta probabilidad de obtener un embrión en la orientación vertical por pura casualidad si las muestras se preparan unas horas antes de la toma de imágenes; Sin embargo, la orientación horizontal parece ser mucho menos frecuente en estas etapas. Para las etapas anteriores al 70% de epibolia, se recomienda que los usuarios documenten estadísticas similares de la orientación del embrión dentro del corion antes de proceder con las imágenes de lapso de tiempo, ya que tener esta información de antemano ahorra tiempo a largo plazo.

Desde la etapa de brote, la mejor orientación para la obtención de imágenes es un embrión posicionado horizontalmente, ya que esto permite seguir la dinámica celular a lo largo de todo el eje anteroposterior del cuerpo de los embriones15. Obtener un embrión en esta orientación es relativamente sencillo, ya que alrededor del 25% de los embriones caen en esta posición estable independientemente de cuándo se prepare la muestra. En general, para obtener imágenes de cualquier etapa de interés, se recomienda preparar unos 15 tubos con dos o tres embriones en cada tubo, lo que asegurará una alta probabilidad de obtener embriones en la orientación deseada y, por lo tanto, una sesión de microscopía exitosa en un día determinado. Además, se recomienda clasificar los tubos aproximadamente una hora antes de la etapa de interés para elegir un embrión con la orientación correcta para la obtención de imágenes de lapso de tiempo.

Después de obtener un embrión en la orientación correcta, es importante tener en cuenta el número de vistas y el intervalo de ángulo entre las vistas para la obtención de imágenes. Esto depende de la resolución espacial y temporal mínima requerida. Cuantos más ángulos desde los que se obtiene una imagen de una estructura o región particular del embrión, mejor es la resolución espacial (como se muestra en la Figura 6), pero esto conduce a un compromiso en la resolución temporal. En este protocolo, con un sistema que tiene dos brazos de iluminación y uno de detección, se obtienen imágenes de dos canales en 360° con un intervalo angular de 30° y alrededor de 100 cortes z en cada ángulo con un espaciado de corte de 2 μm, se tomó aproximadamente 3 minutos para un punto de una sola vez. Si bien esto es suficiente para rastrear células en etapas embrionarias tempranas, si se van a capturar eventos con una dinámica más rápida, se debe adquirir un número menor de ángulos, lo que garantiza una mejor resolución temporal pero con un compromiso en la resolución espacial, especialmente si se deben segmentar estructuras más finas, como los límites de las celdas. Una segunda opción a considerar para mejorar la resolución temporal es utilizar un sistema multivista con dos brazos de detección, lo que aumentará sustancialmente la velocidad de adquisición utilizada recientemente para el seguimiento de los movimientos celulares durante la gastrulación en embriones de pez cebra16. Además, aunque solo se probó el objetivo 20x/1 NA en este protocolo, dependiendo de la muestra que se esté fotografiando, la resolución espacial requerida y el campo de visión, se debe considerar el objetivo correcto. En conjunto, sobre la base del procesamiento y la cuantificación posteriores requeridos para una muestra y un campo de visión determinados, el número de vistas y el intervalo de ángulo deben elegirse cuidadosamente. Sin embargo, para obtener imágenes de embriones tempranos completos de pez cebra, particularmente con resolución a escala celular desde múltiples ángulos, un objetivo de NA de 20x/1 parece ser óptimo, ya que un objetivo con un aumento y NA más bajos (por ejemplo, un objetivo de 10x/0.5 NA) tendrá una resolución mucho más baja, lo que probablemente conduzca a más errores de segmentación, mientras que un objetivo con mayor aumento y NA no será factible para cubrir todo el embrión en el campo de visión de la cámara.

En este estudio, para discutir las estrategias de montaje e imagen, se utilizó un marcador de actina, que se puede utilizar como proxy para el trazado de los límites celulares, y un marcador de histonas, para la detección y el seguimiento de los núcleos. De hecho, la mayoría de los estudios publicados anteriormente que han utilizado un sistema de lámina de luz multivista han utilizado preferentemente marcadores similares 5,7,15,16,27. La razón principal para elegir estos marcadores es que la microscopía de lámina de luz multivista se utiliza principalmente para seguir la dinámica a escala celular (por ejemplo, la forma de la célula y el reordenamiento de la célula), ya sea a escala de tejido o en todo el embrión durante largos períodos de tiempo que abarcan de varias horas a días. Por otro lado, si existe la necesidad de obtener una resolución subcelular, se podría utilizar una línea transgénica diferente que marque la región de interés, pero en este escenario, un microscopio de lámina de luz multivista puede no ser la mejor opción de instrumento, y más bien un confocal, un sistema de superresolución o incluso un microscopio de lámina de luz reticular28, 29 puede adaptarse mejor al problema que se está investigando.

El protocolo discutido funciona bien desde la gastrulación hasta la etapa de 15 somitas embriones de pez cebra30 (alrededor de 17 hpf) sin ninguna modificación, y aunque no se ha probado aquí, es probable que también funcione para embriones anteriores antes de la etapa de gastrulación. Más allá de la etapa de 15 somitas, comienzan las contracciones musculares espontáneas30,31, que pueden suprimirse mediante la adición de tricaína, un anestésico, tanto en el tubo como en la cámara de muestras. Además, a unos 18 hpf, la eversión de la cola lejos de la yema comienza a los30, lo que aleja al embrión del campo de visión. Para solucionar esto, es necesario emplear un algoritmo de seguimiento que rastree el extremo alargado para mantener el embrión enfocado32. Además, para obtener imágenes de embriones en etapas posteriores cuando están desprovistos de un corion, como para seguir el desarrollo neuronal, es necesario emplear una estrategia de montaje alternativa como la realizada recientemente33.

Para obtener imágenes de embriones de pez cebra con un corion intacto, no es posible capturar tanto las cuentas, que actúan como marcadores de registro, como el embrión en el mismo campo de visión utilizando un objetivo de NA 20x/1. Este estudio proporciona una alternativa simple al registrar las diferentes vistas con información de las cuentas que están presentes por encima o por debajo de la muestra, seguido de cambiar el registro de las cuentas al embrión durante el procesamiento. Una vez que la muestra embrionaria se registra de esta manera, se puede realizar una segunda ronda de registro utilizando núcleos como marcadores de registro, que están presentes dentro de la muestra, para afinar aún más el registro inicial. Al realizar imágenes de lapso de tiempo, la información de los núcleos, a su vez, se puede utilizar para el registro de puntos de tiempo consecutivos como se ha informado anteriormente21. Una alternativa a este protocolo es renunciar a las cuentas y, en su lugar, utilizar la información de los núcleos para el registro inicial. Pero el registro a menudo fallaba (no se muestra aquí) en el complemento BigStitcher, posiblemente debido a una combinación de muchos núcleos que no se detectan más profundamente en el embrión durante el procesamiento y también debido a un número relativamente menor de núcleos que están presentes en el embrión cuando se ven desde ciertos ángulos (por ejemplo, cuando se ven ventralmente en etapas epibolias tardías).

En este protocolo, debido a que la información de las cuentas desde arriba o desde abajo de la muestra se utiliza para el registro y no hay necesidad de obtener imágenes de las cuentas en la misma vista que la imagen de la muestra, se puede usar este protocolo para obtener imágenes solo de regiones específicas de interés, pero con un gran aumento desde diferentes ángulos en lugar de todo el embrión. Además, es fácil adaptar este protocolo para obtener imágenes de múltiples muestras apiladas verticalmente en el tubo mediante el uso de información de cuentas entre las muestras para su registro.

Divulgaciones

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Los autores declaran no tener ningún interés contrapuesto.

Agradecimientos

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Agradecemos al Dr. Kalidas Kohale y a su equipo por el mantenimiento de las instalaciones de peces y a KV Boby por el mantenimiento del microscopio de lámina de luz. SRN agradece el apoyo financiero del Departamento de Energía Atómica (DAE) del Gobierno de la India (Identificación del Proyecto no. RTI4003, DAE OM n.º 1303/2/2019/R\&D-II/DAE/2079 de 11.02.2020), el programa del Grupo de Socios de la Sociedad Max Planck (M.PG. A MOZG0010) y la Beca de Investigación para Start-ups de la Junta de Investigación en Ciencia e Ingeniería (SRG/2023/001716).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Agarosa, baja temperatura de gelificaciónSigma-AldrichA9414
Cloruro de calcio dihidratadoSigma-Aldrich12022
FIJIVersión: ImageJ 1.54f
Perlas de látex, poliestireno modificado con carboxilato, rojo fluorescente, 0,5 μ m tamaño medio de partícula, suspensión acuosaSigma-AldrichL3280
Sulfato de magnesio heptahidratadoSigma-AldrichM2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcripciónThermoFischer ScientificAM1340Para la transscripción in vitro de H2A-mPlásmido de cereza
Chhlorida de potasioSigma-AldrichP9541
Fosfato de potasio monobásicoSigma-AldrichP0662
Funda de PTFE AWG 15L - 1.58 mm ID x 0.15 mm Pared +/-0.05 Innovaciones tecnológicas en fluoroplásticosSTW15Tubos de PTFE
Cloruro de sodioSigma-AldrichS3014
Fosfato de sodio dibásicoSigma-Aldrich71640
Limpiador ultrasónicoLabmanLMUC3
Zeiss Sistema LightSheet 7Zeiss

Referencias

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  1. Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Annu Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
  2. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
  3. Keller, P. J., et al. high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat Methods. 7 (8), 637-642 (2010).
  4. Keller, P. J. Imaging morphogenesis: Technological advances and biological insights. Science. 340 (6137), 1234168(2013).
  5. Schmid, B., et al. High-speed panoramic Light sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4 (1), 2207(2013).
  6. Strnad, P., et al. Inverted Light sheet microscope for imaging mouse pre-implantation development. Nat Methods. 13 (2), 139-142 (2016).
  7. McDole, K., et al. In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level. Cell. 175 (3), 859-876 (2018).
  8. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  9. Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. Multiview Light sheet microscope for rapid in toto imaging. Nat Methods. 9 (7), 730-733 (2012).
  10. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat Methods. 7 (6), 418-419 (2010).
  11. Swoger, J., Verveer, P., Greger, K., Huisken, J., Stelzer, E. H. K. Multiview image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy. Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).
  12. Swoger, J., Huisken, J., Stelzer, E. H. Multiple imaging axis microscopy improves resolution for thick-sample applications. Opt Lett. 28 (18), 1654-1656 (2003).
  13. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
  14. Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish. J Vis Exp. (84), e51119(2014).
  15. Naganathan, S. R., Popović, M., Oates, A. C. Left-right symmetry of zebrafish embryos requires somite surface tension. Nature. 605 (7910), 516-521 (2022).
  16. Shah, G., et al. Multi-scale imaging and analysis identify pan-embryo cell dynamics of germlayer formation in zebrafish. Nat Commun. 10 (1), 5753(2019).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Hörl, D., et al. BigStitcher: Reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nat Methods. 16 (9), 870-874 (2019).
  19. Behrndt, M., et al. Forces driving epithelial spreading in zebrafish gastrulation. Science. 338 (6104), 257-260 (2012).
  20. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2000).
  21. Icha, J., et al. Using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development. J Vis Exp. (110), e53966(2016).
  22. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview Light sheet microscopy. Nat Methods. 9 (7), 755-763 (2012).
  23. Aigouy, B., Prud'homme, B. Segmentation and quantitative analysis of epithelial tissues. Methods Mol Biol. 2540, 387-399 (2022).
  24. Mancini, L., et al. Apical size and deltaA expression predict adult neural stem cell decisions along lineage progression. Science Adv. 9, 7519(2023).
  25. Piscitello-Gomez, R., Mahmoud, A., Dye, N., Eaton, S. Sensitivity of the timing of Drosophila pupal wing morphogenesis to external perturbations. bioRxiv. , (2023).
  26. Tsuboi, A., Fujimoto, K., Kondo, T. Spatiotemporal remodeling of extracellular matrix orients epithelial sheet folding. Science Adv. 9, 2154(2023).
  27. Fu, Q., Martin, B. L., Matus, D. Q., Gao, L. Imaging multicellular specimens with real-time optimized tiling Light sheet selective plane illumination microscopy. Nat Commun. 7 (1), 11088(2016).
  28. Chen, B. C., et al. Lattice Light sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998(2014).
  29. York, H. M., et al. Deterministic early endosomal maturations emerge from a stochastic trigger-and-convert mechanism. Nat Commun. 14 (1), 4652(2023).
  30. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  31. Melançon, E., Liu, D. W. C., Westerfield, M., Eisen, J. S. Pathfinding by identified zebrafish motoneurons in the absence of muscle pioneers. J Neurosci. 17 (20), 7796(1997).
  32. Rohde, L. A., et al. Cell-autonomous timing drives the vertebrate segmentation clock's wave pattern. eLife. , 13:RP93764 (2024).
  33. Haynes, E. M., et al. KLC4 shapes axon arbors during development and mediates adult behavior. eLife. 11, e74270(2022).

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