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Uso de organoides intestinales humanos para comprender el epitelio del intestino delgado a nivel transcripcional de una sola célula

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DOI:

10.3791/66749

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28 de junio de 2024

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1Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

En este artículo

Resumen

El protocolo combina la tecnología de organoides intestinales humanos con el análisis transcriptómico de células individuales para proporcionar información significativa sobre la biología intestinal previamente inexplorada.

Resumen

La transcriptómica de células individuales ha revolucionado nuestra comprensión de la biología celular del cuerpo humano. Los cultivos de organoides del intestino delgado humano de última generación proporcionan sistemas modelo ex vivo que cierran la brecha entre los modelos animales y los estudios clínicos. La aplicación de la transcriptómica de células individuales a modelos de organoides intestinales humanos (HIO) está revelando la biología celular, la bioquímica y la fisiología del tracto gastrointestinal no reconocidas anteriormente. Las plataformas avanzadas de transcriptómica de células individuales utilizan particiones microfluídicas y códigos de barras para generar bibliotecas de ADNc. Estos ADNc con códigos de barras pueden ser fácilmente secuenciados por plataformas de secuenciación de próxima generación y utilizados por varias herramientas de visualización para generar mapas. Aquí, describimos métodos para cultivar y diferenciar HIOs de intestino delgado humano en diferentes formatos y procedimientos para aislar células viables de estos formatos que son adecuados para su uso en plataformas de perfiles transcripcionales de una sola célula. Estos protocolos y procedimientos facilitan el uso de HIOs del intestino delgado para obtener una mayor comprensión de la respuesta celular del epitelio intestinal humano a nivel transcripcional en el contexto de una variedad de entornos diferentes.

Introducción

El epitelio del intestino delgado tiene dos zonas distintas: la cripta que alberga la célula madre intestinal (ISC) y las vellosidades, que está compuesta por células diferenciadas de los linajes secretor y absorbente. A esta complejidad se suma la especificidad regional del epitelio que proporciona propiedades funcionales únicas entre las regiones del intestino delgado. Un trabajo pionero estableció las condiciones de cultivo en las que tanto la cripta del intestino delgado humano como las zonas de vellosidades pueden generarse ex vivo a partir de tejidos quirúrgicos o biopsias de tejido1. Estos cultivos están cerrando la brecha entre los estudios en animales y los ensayos clínicos y están revelando la biología celular, la bioquímica y la fisiología del tracto gastrointestinal no reconocidas anteriormente. Las HIOs se propagan como estructuras esféricas 3D utilizando un medio con factores de crecimiento que promueven la viabilidad de las células madre y matrices de soporte extracelular. Estas condiciones dan como resultado un modelo de HIO similar a una cripta que consta principalmente de progenitores y células madre. La eliminación de los factores de crecimiento promueve la diferenciación de ISC (modelo similar a vellosidades) y la producción de células epiteliales intestinales maduras (cáliz, enteroendocrino, penacho, enterocito) en proporciones apropiadas junto con la proliferación y diferenciación celular, la polarización, la integridad de la barrera, las características específicas regionales y las respuestas fisiológicas apropiadas2. Los cultivos de HIO son genéticamente estables y pueden propagarse indefinidamente en su estado similar a una cripta. El fácil acceso a la superficie apical de estos cultivos es proporcionado por las condiciones de cultivo que permiten el crecimiento en un formato monocapa3. Las HIO también permiten incluir en los análisis biológicos consideraciones sobre la variabilidad individual del huésped, como la genética, la edad, el sexo, el origen étnico y el estado de la enfermedad. Las herramientas de evaluación analítica y funcional son idénticas a las utilizadas en los enfoques centrados en líneas celulares transformadas e incluyen una variedad de técnicas moleculares como la citometría de flujo, la microscopía, la transcriptómica, la proteómica y la metabolómica.

La transcriptómica de células individuales está revolucionando nuestra comprensión de la biología y la fisiología del intestino delgado al proporcionar información sobre las contribuciones individuales de cada tipo de célula a un proceso biológico. El trabajo pionero con esta tecnología ha proporcionado un panorama de los tipos de células presentes en el intestino humano nativo 4,5,6. Las plataformas de perfiles transcripcionales de células individuales permiten explorar el panorama transcripcional de células individuales, lo que permite que la heterogeneidad celular pase a primer plano en la exploración científica. En algunas plataformas de perfiles transcripcionales de una sola célula, la partición microfluídica y el código de barras se utilizan para generar bibliotecas de ADNc a partir de ARNm celulares poliadenilados obtenidos de hasta 10.000 células por muestra. En esta plataforma, las gotas que contienen células individuales, oligonucleótidos con código de barras, reactivos de transcripción inversa y aceite forman una vesícula de reacción que da como resultado que todos los ADNc de una sola célula tengan el mismo código de barras. A continuación, los ADNc con códigos de barras se pueden secuenciar de forma eficiente mediante la secuenciación de última generación. Los datos generados se pueden manejar a través de software y herramientas de visualización, que convierten las secuencias con códigos de barras en mapas de visualización y perfiles transcripcionales de una sola célula. Las poblaciones celulares pueden identificarse utilizando bases de datos disponibles públicamente del epitelio del intestino delgado humano 4,5,6. Aunque muchos estudios han utilizado esta plataforma para interrogar organoides intestinales murinos a nivel de una sola célula, el análisis de las respuestas transcripcionales de una sola célula de las HIO se ha quedado atrás 7,8,9,10,11,12.

Aquí, proporcionamos una guía paso a paso para aislar células viables de OHIO del intestino delgado para su procesamiento en plataformas de perfiles transcripcionales de células individuales (Figura 1). Proporcionamos pautas de cultivo y diferenciación junto con componentes de medios que se han optimizado para la diferenciación epitelial. Describimos métodos de recuperación celular para tres formatos de cultivo diferentes: cultivos tridimensionales (3D) y monocapa, ya sea en plástico o en insertos de cultivo celular de membrana. Proporcionamos datos de agrupamiento de muestras obtenidos mediante software de código abierto para derivar genes expresados diferencialmente en cada clúster.

Protocolo

Las líneas de organoides utilizadas aquí se obtuvieron del Centro de Enfermedades Digestivas GEMS Core del Centro Médico de Texas. Brevemente, para establecer inicialmente líneas de organoides, las muestras de tejido del donante se lavaron y se digierieron enzimáticamente para liberar las criptas intestinales. Las criptas se incrustaron en una membrana basal y se cultivaron en un medio. La Junta de Revisión Institucional de la Facultad de Medicina de Baylor aprobó el protocolo del estudio para obtener muestras de tejido a partir de las cuales se establecieron líneas de organoides, y se obtuvo el consentimiento informado de todos los donantes para establecer líneas de organoides a partir del tejido donado.

1. Aprobación de las OHIO 3D para expandirlas y diferenciarlas

  1. Retire y deseche el medio de los pocillos de organoides cultivados en placas de 24 pocillos (alrededor de la membrana basal sólida) con una pipeta P1000. Añada 300 μL de tripsina-EDTA al 0,05% al pocillo y rompa mecánicamente los organoides pipeteando con una pipeta P1000 hacia arriba y hacia abajo 5 veces.
  2. Incubar la placa a 37 °C durante 4 min. Agregue 500 μL de medio completo sin factores de crecimiento (medio CMGF) con 10% de FBS a cada pocillo (Tabla 1). Utilice una pipeta P1000 y una mezcla de medio CMGF y HIO, 10 veces hacia adelante y hacia atrás en el pocillo. Transfiera todo el volumen a un tubo de 15 ml. Combine el paso de varios pocillos en el mismo tubo de 15 ml. No combine más de 10 pocillos por tubo.
  3. Centrifugar las celdas a 4 °C con una centrífuga de rotor oscilante a 100 x g durante 5 min. Retire todo el medio, manteniendo el pellet en el fondo del tubo. Mantenga el tubo en hielo.
  4. Calcule la cantidad de membrana basal necesaria para el número de placas de HIO y vuelva a suspender el pellet de HIO en 30 μL/pocillo de membrana basal utilizando puntas de pipeta P200 frías. Pipetee la mezcla de membrana basal HIO como una gota en el centro de una placa de 24 pocillos con puntas de pipeta P200 frías.
  5. Transfiera la placa a una incubadora a 37 °C. Deje que la membrana basal se solidifique durante 5-10 minutos, luego agregue 500 μL de medio completo a temperatura ambiente que contenga WNT, R-espondina, noggin, EGF e inhibidor de ROCK (WRNE+Y; Tabla 1) a cada pocillo y cultivo en una incubadora a 37 °C. Actualice la cultura con WRNE+Y cada dos días durante 7 días.
    NOTA: Un HIO sano tendrá forma quística con un epitelio brillante en ciernes (Figura 2). Las células en el centro del quiste no se pueden visualizar. Un HIO poco saludable se verá opaco y tendrá un epitelio grueso con un centro sólido. La característica más importante es la apariencia brillante.

2. Diferenciación HIO: formato 3D

  1. Utilice un pocillo de HIOs 3D para 3 pocillos de HIOs diferenciados 3D 1 semana después del cultivo.
  2. Retire los medios de los pozos. Disperse la membrana basal y las OHIO con una pipeta P1000 y agregue 500 μL fríos de CMGF- por pocillo y pipete hacia arriba y hacia abajo al menos 5 veces. Centrifugar las HIO a 4 °C con una centrífuga de rotor oscilante a 100 x g durante 5 min. Retire todo el medio manteniendo el pellet en el fondo del tubo.
  3. Agregue 30 μL de membrana basal por pocillo de HIO que se esté plateando. Pipetear la gota de 30 μL de membrana basal con OHIO en un pocillo de una placa de 24 pocillos. Incubar a 37 °C durante 10 min. Añada 500 μL de medios WRNE+Y/Diff (50/50).
  4. Cambie el medio a medio de diferenciación después de 24 h durante 3 días adicionales, actualizando el medio cada dos días. Prepare 3 pocillos por muestra para agrupar para reducir la variabilidad técnica.

3. Diferenciación HIO: Formato monocapa

  1. Cubra los insertos o pocillos de cultivo celular de membrana de una placa de 96 pocillos con 100 μL/pocillo de colágeno placentario humano IV (1 mg/ml en ácido acético 100 mM) diluido en H2O frío (1:30). Incubar a 37 °C durante un mínimo de 1,5 h o un máximo durante la noche. Para el inserto de cultivo celular de membrana, agregue H2O estéril en el espacio de la placa para humidificar la placa; para la placa de 96 pocillos, agregue H2O estéril en los pocillos no utilizados.
  2. Recoja HIOs 3D cultivadas en WRNE durante 7 días retirando el medio y recuperando la membrana basal y las células añadiendo 500 μL/pocillo de EDTA 0,5 mM frío (EDTA 0,5 M diluido 1:1000 en PBS estéril). Utilice una pipeta P1000 para pipetear organoides y soluciones hacia arriba y hacia abajo 5 veces y transfiéralas a un tubo de microcentrífuga de 15 ml. No acumule más de 10 pocillos de organoides por tubo. Centrifugar durante 5 min a 300 x g en un rotor de cubo oscilante a 4 °C.
    NOTA: Para preparar 3 pocillos en una placa de 96 pocillos, use 1 pocillo de OHIO 3D. Para preparar 1 inserto de cultivo celular de membrana, use 1 pocillo de OHIO 3D (la densidad de siembra de células individuales es de aproximadamente 1-2 x 105 células/pocillo para placa de 96 pocillos, 2,5-3 x 105 células/pocillo para el inserto de cultivo celular de membrana).
  3. Retire 500 μL de medio, dejando el pellet en el fondo del tubo. Disociar las HIOs añadiendo 500 μL de tripsina al 0,05%/EDTA al 0,5 mM e incubar durante 4-5 min a 37 °C. Pipetea vigorosamente hacia arriba y hacia abajo durante ~50x con un P1000. Evite hacer burbujas pipeteando contra el costado del tubo.
  4. Inactive la tripsina añadiendo 1 mL de CMGF- que contiene un 10% de FBS. Filtre los grandes grupos de células no digeridas humedeciendo un filtro de células de 40 μm con 1 ml de CMGF que contiene un 10% de FBS y agregando las células a la parte superior del filtro de células. Use la gravedad para permitir que las células pasen a través del filtro y deseche el filtro de células que contiene grupos de células.
  5. Recoja las células por centrifugación durante 5 min a 400 x g en un rotor de cubo oscilante a temperatura ambiente.
  6. Retire el líquido del inserto de cultivo celular de membrana recubierto de colágeno o de la placa de 96 pocillos. Vuelva a suspender el pellet de HIO en 100 μL/pocillo de WRNE que contenga 10 μM de Y-27632 y, a continuación, pipetee en el compartimento superior del inserto de cultivo celular de membrana o en la placa de 96 pocillos. Para el inserto de cultivo celular de membrana, agregue 600 μL de WRNE que contenga 10 μM Y-27632 en el compartimiento inferior del pocillo.
  7. Retire el medio después de 24 h de la parte superior e inferior del inserto de cultivo celular de membrana o de la placa de 96 pocillos y reemplácelo con medio de diferenciación durante 5 días. Prepare 3 pocillos por muestra para agrupar para reducir la variabilidad técnica.

4. Preparación de suspensiones unicelulares a partir de HIOs 3D diferenciadas para transcriptómica unicelular

  1. Coloque el reactivo de digestión celular enzimática a 37 °C en una incubadora de CO2 para descongelar y calentar 30 minutos antes de iniciar la digestión HIO 3D. Verifique las OHIO con un microscopio de campo brillante a 10x para garantizar la salud celular.
  2. Retire los medios de los pocillos y agregue 500 μL de solución de recuperación de celda fría a los pocillos. Pipetea hacia arriba y hacia abajo varias veces para liberar las células de la membrana basal con una pipeta P1000 y puntas de pipeta estándar. Transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    NOTA: El uso de pocillos replicados garantiza un número adecuado de células y reduce la variación entre pocillos. No combine los pozos antes del paso 4.7 a continuación.
  3. Incube los tubos de células en hielo durante 10 minutos, pipeteando hacia arriba y hacia abajo cada 5 minutos. Recoja las células por centrifugación durante 3 min a 400 x g a 4 °C.
  4. Retire el líquido del tubo, teniendo cuidado de no alterar el pellet celular. Resuspender las células en 500 μL de reactivo de digestión celular enzimática precalentado. Pipetea hacia arriba y hacia abajo con un P1000 al menos 10x.
  5. Incubar las HIOs durante 30 min a 37 °C en una incubadora deCO2 . Cada 10 minutos, pipetee todo el volumen 10 veces con una pipeta P1000 para ayudar a disociar las células. Evite introducir burbujas de aire en la suspensión de la celda.
  6. Granular las células durante 3 min a 400 x g a 4 °C. Retire el sobrenadante, vuelva a suspender las células en 1 ml de medio de diferenciación y almacene en hielo.
    NOTA: A partir de este momento, las OHIO deben mantenerse siempre en hielo.
  7. Pipetea las células hacia arriba y hacia abajo 50 veces rápidamente con un P1000 para garantizar que las OHIO se disocien en células individuales. Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire en este paso, ya que provocará la pérdida de células.
  8. Filtre todo el volumen a través de un colador de punta de 70 μm con una punta de pipeta P1000. Utilice un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para recoger el eluido.
    NOTA: La punta del filtro no se obstruirá si el tiempo de digestión es suficiente. Utilice varias puntas de filtro si el filtro se obstruye; No fuerce el volumen a través del filtro.
  9. Repita el paso 4.8 con un colador de punta de 40 μm. Guarde las muestras en hielo.
  10. Cuente células individuales viables en una cámara de recuento de células utilizando la exclusión de azul de tripano añadiendo 5 μL de azul de tripano al 0,4% a 5 μL de suspensión celular. Diluya la muestra según sea necesario hasta 1000 células/μL. Si la densidad celular es inferior a 1000 células/μL, granule las células durante 2 min a 400 x g a 4 °C, retire el medio original y vuelva a suspenderlo en el medio de cultivo celular. Este protocolo suele producir 5 x 105-1 x 106 celdas.
    NOTA: La preparación de una suspensión de alta calidad (90% viable y 90% de células individuales) es esencial para obtener datos de una sola célula de alta calidad. Sin embargo, la experiencia indica que se puede aceptar una viabilidad tan baja como el 75% en los casos en que el tratamiento, como la infección o la aplicación de moléculas pequeñas, afecta la viabilidad.
  11. Prepare bibliotecas de ADN para plataformas de perfiles transcripcionales de células individuales de acuerdo con los protocolos del fabricante. Procesar los datos de acuerdo con los protocolos de mejores prácticas para el análisis de datos scRNAseq13,14.

5. Preparación de suspensiones unicelulares a partir de HIOs diferenciadas en un inserto de cultivo celular de membrana

  1. Coloque el reactivo de digestión celular enzimática a 37 °C en una incubadora de CO2 para descongelar y calentar 30 min antes de iniciar la digestión del inserto de cultivo celular de membrana HIO. Divida el reactivo de digestión celular enzimática precalentado en alícuotas de 200 μL en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, 1 tubo por inserto de cultivo celular de membrana. Mantenga los tubos en la incubadora a 37 °C hasta que estén listos para su uso.
  2. Prepare PBS-EDTA añadiendo 5 μL de EDTA 0,5 M a 5 mL de PBS. Alícuota 500 μL de PBS-EDTA en una placa de 24 pocillos, 1 pocillo por inserto de cultivo celular de membrana.
  3. Lavar las células con PBS-EDTA: transferir los insertos de cultivo celular de membrana de los pocillos que contienen medios de crecimiento a los pocillos que contienen PBS-EDTA. Retire el medio de cultivo celular del lado apical y reemplácelo con 100 μL de PBS-EDTA. Tenga cuidado de no alterar la capa celular.
  4. Deseche inmediatamente el PBS-EDTA añadido a la cara apical de los insertos de cultivo celular de membrana. Retire el inserto de cultivo celular de membrana del pocillo, séquelo tocando suavemente el borde con una toalla de papel y luego inviértalo en la mesa de trabajo. Utilice una hoja de bisturí afilada para quitar la membrana del inserto cortando alrededor de la circunferencia interior de la membrana. Trabaje rápidamente para evitar que se seque.
  5. Utilice pinzas para transferir la membrana al tubo de microcentrífuga precalentado de 1,5 ml lleno de reactivo de digestión celular enzimática y asegúrese de que la membrana esté completamente sumergida. Repita el procedimiento para todos los insertos adicionales de cultivo celular de membrana.
    NOTA: Aumentar el volumen del reactivo de digestión celular enzimática a 500 μL puede ayudar a disociar monocapas densas.
  6. Disociar las células incubando tubos con membranas a 37 °C en una incubadora de CO2 . Mezcle pipeteando suavemente todo el volumen 5x con una pipeta de 200 μL cada 10 minutos durante un total de 30 minutos. Evite las burbujas y la succión de la membrana para preservar la viabilidad.
  7. Transfiera una pequeña alícuota de células (1-2 μL) a un portaobjetos de vidrio cada 10 minutos para evaluar la disociación mediante la evaluación cualitativa del porcentaje de células individuales. Con un pipeteo adicional, puede llevar hasta 50 minutos lograr un 80%-90% de células individuales, dependiendo del tipo de HIO. Raspe suavemente la membrana con la punta de una pipeta durante los pasos de mezcla para fomentar la disociación, especialmente en el caso de las células difíciles de disociar, sin embargo, el raspado puede afectar la viabilidad.
  8. Combine 3 pocillos replicados por condición en un solo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (600 μL en total). Añadir 400 μL de medio de cultivo celular (diff) + 10 μM de ROCKi (1 mL de volumen total). Mezclar suavemente pipeteando.
    NOTA: El uso de pocillos replicados garantiza un número adecuado de células y reduce la variación entre pocillos. Los pozos deben agruparse en este paso.
  9. Filtre todo el volumen a través de un colador de punta de 70 μm con una punta de pipeta de 1 mL. Recoja el flujo en un tubo de microcentrífuga nuevo de 1,5 mL.
    NOTA: La punta del filtro no se obstruirá si el tiempo de digestión es suficiente. Utilice varias puntas de filtro si el filtro se obstruye; No fuerce el volumen.
  10. Repita el paso 5.9 con un colador de punta de 40 μm. Guarde las muestras en hielo.
  11. Cuente células individuales viables en una cámara de recuento de células utilizando la exclusión de azul de tripano añadiendo 5 μL de azul de tripano al 0,4% a 5 μL de suspensión celular. Diluya la muestra según sea necesario hasta 1000 células/μL. Si la densidad celular es inferior a 1000 células/μL, centrifugar 2 min a 400 x g a 4 °C para granular las células, retirar el medio original y volver a suspender en WRNE+Y a la densidad celular deseada. Este protocolo suele producir 4 x 105 - 6 x 105 celdas.
    NOTA: La preparación de una suspensión de alta calidad (90% de células viables y 90% de células individuales) es esencial para obtener datos de una sola célula de alta calidad. Sin embargo, la experiencia indica que se puede aceptar una viabilidad tan baja como el 75% en los casos en que el tratamiento, como la infección o la aplicación de moléculas pequeñas, afecta la viabilidad.
  12. Preparar bibliotecas de ADN para las plataformas de perfiles transcripcionales de células individuales de acuerdo con los protocolos del fabricante. Procesar los datos de acuerdo con los protocolos de mejores prácticas para el análisis de datos scRNAseq13,14.

6. Preparación de suspensiones unicelulares a partir de HIOs diferenciadas como monocapas de 96 pocillos

  1. Coloque el reactivo de digestión celular enzimática a 37 °C en una incubadora de CO2 para descongelar y calentar 30 minutos antes de iniciar la digestión de HIO monocapa.
  2. Prepare PBS-EDTA añadiendo 5 μL de EDTA 0,5 M a 5 mL de PBS. Deseche los medios de cultivo celular de la placa de 96 pocillos y reemplácelos con 100 μL de PBS-EDTA. Tenga cuidado de no alterar la capa celular.
  3. Disociar las células: Deseche el PBS-EDTA y agregue 100 μL de reactivo de digestión enzimática tibia a cada pocillo. Coloque la placa a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5% y mezcle pipeteando suavemente todo el volumen 5x con una punta de pipeta de 200 μL cada 10 min durante 20-30 min. Evite las burbujas para preservar la viabilidad.
    NOTA: Aumentar el volumen del reactivo de digestión celular enzimática a 500 μL puede ayudar a disociar monocapas densas.
  4. Transfiera una pequeña alícuota de células (1-2 μL) a un portaobjetos de vidrio cada 10 minutos para evaluar la disociación. Puede llevar hasta 50 minutos lograr un 80%-90% de células individuales, dependiendo del tipo de HIO. Raspe suavemente la placa con la punta de una pipeta durante los pasos de mezcla para estimular la disociación, especialmente para las células difíciles de disociar; Sin embargo, el raspado puede afectar la viabilidad.
  5. Combine 3 pocillos replicados por condición en un solo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (300 μL en total). Añadir 700 μL de medio de cultivo celular (diff) + 10 uM de ROCKi (1 mL de volumen total). Mezclar suavemente pipeteando.
    NOTA: El uso de pocillos cultivados replicados garantiza un número adecuado de células y reduce la variación de pocillo a pocillo.
  6. Filtre todo el volumen a través de un colador de punta de 70 μm con una punta de pipeta de 1 mL. Recoja el flujo en un tubo de microcentrífuga nuevo de 1,5 mL.
    NOTA: La punta del filtro no se obstruirá si el tiempo de digestión del reactivo de digestión de células enzimáticas es suficiente. Utilice varias puntas de filtro si el filtro se obstruye; No fuerce el volumen.
  7. Repita el paso 6.6 con un colador de punta de 40 μm. Guarde las muestras en hielo.
  8. Cuente células individuales viables en una cámara de recuento de células utilizando la exclusión de azul de tripano añadiendo 5 μL de azul de tripano al 0,4% a 5 μL de suspensión celular. Diluir según sea necesario hasta 1000 células/μL. Si la densidad celular es inferior a 1000 células/μL, centrifugar 2 min a 400 x g 4 °C para granular las células, retire el medio original y vuelva a suspender en el medio de cultivo celular + ROCKi a la densidad celular deseada. Este protocolo suele producir 2 x 105 - 6 x 105 celdas.
    NOTA: La preparación de una suspensión de alta calidad (90% de células viables y 90% de células individuales) es esencial para obtener datos de una sola célula de alta calidad. Sin embargo, la experiencia indica que se puede aceptar una viabilidad tan baja como el 75% en los casos en que el tratamiento, como la infección o la aplicación de moléculas pequeñas, afecta la viabilidad.
  9. Prepare bibliotecas de ADN de acuerdo con los protocolos del fabricante de la plataforma de perfiles transcripcionales de células individuales. Procesar los datos de acuerdo con los protocolos de mejores prácticas para el análisis de datos scRNAseq13,14.

Resultados

Las suspensiones unicelulares se agruparon a partir de 2-3 pocillos de inserto de cultivo celular de membrana, monocapa y OHIO 3D para garantizar un rendimiento celular suficiente y reducir la variación de pocillo a pocillo. Las bibliotecas de células individuales se prepararon utilizando reactivos específicos para la plataforma de perfiles transcripcionales de células individuales. y secuenciado con lecturas finales emparejadas en una plataforma de secuenciación de próxima generación, 30.000 lecturas/celda. Las lecturas se mapearon, contaron y analizaron utilizando herramientas analíticas para la genómica de células individuales. Las células de baja calidad con más del 20% de lectura mitocondrial, o menos de 200 genes contados, se excluyeron del análisis. Para evaluar la calidad de las células, trazamos el número de genes, los UMI y el porcentaje de lecturas mitocondriales por célula (Figura 3); Las células de alta calidad contienen aproximadamente 3500 genes, 15.000 UMI y un 10% de lecturas mitocondriales. Después del filtrado, obtuvimos de 4000 a 9500 células individuales dependiendo del formato de crecimiento de HIO. El agrupamiento no supervisado y la reducción de la dimensión UMAP identificaron distintos grupos que representan los tipos de células esperados, incluidos los enterocitos absorbentes y las células secretoras (Figura 4).

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Figura 1: Esquema de los pasos del protocolo. Esquemas que describen los pasos principales en el recubrimiento de OHIO en diferentes formatos para el flujo de trabajo de datos de una sola celda. Esta imagen fue creada usando Biorender. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Imágenes de campo claro. Las HIO listas para el procesamiento se obtuvieron con un microscopio de campo claro con un aumento de 5X. Izquierda, organoides 3D; medio, placa de 96 pocillos; Correcto, Transwell. Barras de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Control de calidad de los datos. Ejemplo de métricas de células individuales analizadas aisladas de HIOs yeyunales cultivadas como monocapas en placas de 96 pocillos. Los diagramas de violín muestran el número de genes (nFeature_RNA), UMI (nCount_RNA) y el porcentaje de lecturas mitocondriales (percent.mt) por célula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: UMAPs de células individuales analizadas. (A) Se aislaron un total de 9952 células individuales de HIOs yeyunales diferenciadas cultivadas en placas de 96 pocillos. (B) Se aislaron un total de 5623 células individuales a partir de HIOs yeyunales diferenciadas cultivadas en insertos de cultivo celular de membrana. (C) Se aislaron un total de 4402 células individuales de OHIO 3D ileales diferenciadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Medio de crecimiento WRNEMedio de diferenciación
ComponenteVolumenConcentración finalMedio WRNE sin medio acondicionado L-WRN, nicotinamida y SB202190
*Y-27632 (5 mM) opcional200 μL10 μM
A 83-01 (500 μM)100 μL500 nM
DMEM/F12 avanzado45 mL
B272 mL
FEAG (50 μg/mL)100 μL50 ng/mL
Gastrina (10 μM)100 μL10 nM
GlutaMax (100X)1 mL
HEPES 1 M1 mL
L-WRN Con- Media50 mL~50%
N21 mL
N-acetilcisteína (500 mM)100 μL500 μM
Nicotinamida 1 M1 mL10 mM
SB202190 (10 mM)100 μL10 μM
Volumen total100 mL
CMGF- Medio
DMEM/F12 avanzado500 mL
Glutamax5 mL100 veces
1 M Hepes5 mL

Tabla 1: Composición de los distintos medios utilizados.

Discusión

Mediante el uso de plataformas genómicas unicelulares, los sistemas biológicos complejos, como los cultivos de HIO derivados de tejidos que modelan el epitelio intestinal, se pueden descomponer para producir contribuciones celulares individuales a la respuesta biológica general 4,5,6. La heterogeneidad celular y las poblaciones de células raras también pueden ser identificadas e interrogadas. La entrada celular debe optimizarse para maximizar la salida utilizando plataformas basadas en transcriptómica de una sola célula. Aquí describimos los protocolos que producirán suspensiones de células individuales altamente viables y de buena calidad que aumentarán la probabilidad de obtener datos transcriptómicos de alta calidad aguas abajo. La familiaridad con el protocolo es de suma importancia, y se recomienda que se realicen varias prácticas antes de continuar con la preparación de la biblioteca. Se sugiere el logro reproducible de suspensiones viables de células individuales antes de utilizar las células para la preparación de la biblioteca. La rapidez con la que se implementa el protocolo es de suma importancia, ya que la velocidad es directamente proporcional a los resultados de viabilidad. En base a esto, se recomienda limitar el número de muestras manipuladas a la vez. Se recomienda interactuar con la entidad que preparará las bibliotecas antes de iniciar estos protocolos para obtener ayuda con la solución de problemas.

La viabilidad de HIO influye directamente en la biblioteca de ADN enviada para su secuenciación. La viabilidad celular de la HIO depende de varios pasos en la preparación de la suspensión de una sola celda, incluida la disociación, la centrifugación, los tampones, el pipeteo y la precisión del recuento. El objetivo de preparar las HIOs para la plataforma es equilibrar el mantenimiento de la viabilidad celular con la calidad de la muestra. Para obtener datos de alta calidad, es fundamental minimizar los agregados celulares, las células muertas, los ácidos nucleicos no celulares y los inhibidores bioquímicos de la transcripción inversa. Las células moribundas aumentan el ruido de los ácidos nucleicos y contribuyen a la aglomeración celular, lo que provoca fallos en los datos y en la plataforma 7,8,9,10,11,12. El filtrado con un tamaño de filtro adecuado puede ayudar a eliminar agregados grandes y mejorar la calidad de los datos.

Es necesario tener en cuenta varios factores para minimizar la muerte de las células HIO cuando se preparan suspensiones unicelulares. Es necesario obtener al menos un 80% de células viables, y una viabilidad del >90% es aún más deseable. Las muestras con un alto número de células no viables pueden mejorarse utilizando estrategias para eliminar las células muertas, como las microperlas basadas en columnas, aunque estas requieren más células iniciales y mayores volúmenes de muestra debido a la pérdida durante la manipulación. Las HIO son particularmente sensibles a los tampones y sufrirán la muerte celular si se dejan demasiado tiempo en RT en ciertos tampones. Los medios organoides dan como resultado la menor cantidad de pérdida de células y formación de agregados. El pipeteo también puede afectar a la viabilidad de la HIO durante la disociación. Las puntas de orificio regulares pueden cortar organoides, lo que ayuda a disociarse en suspensiones de una sola célula; sin embargo, el pipeteo demasiado rápido con una punta de orificio normal puede causar daños en la celda HIO debido a las fuerzas de cizallamiento. El pipeteo lento con puntas de diámetro ancho minimiza el estrés en las células HIO y mejora en gran medida el número de células viables aguas abajo. La centrifugación, el lavado y la resuspensión son otros factores que pueden influir en la calidad de las suspensiones unicelulares de HIO. La centrifugación de cubeta oscilante da como resultado una granulación más suave de las células HIO, lo que resulta en un menor número de células muertas y minimiza la pérdida de células. Por último, la precisión del recuento para determinar la concentración es esencial para garantizar que el número máximo de células llegue a la plataforma para la síntesis de bibliotecas. La atención a estos detalles dará como resultado la minimización del estrés en las células HIO durante el proceso de aislamiento y garantizará la mayor probabilidad de devolución de datos después del procesamiento.

Aunque la transcriptómica de una sola célula es una herramienta poderosa para diseccionar perfiles biológicos y respuestas a nivel de una sola célula 4,5,6, existen varias limitaciones que deben tenerse en cuenta al aplicar la tecnología para analizar cultivos de organoides intestinales humanos. En primer lugar, puede haber una variación transcripcional significativa debido a la variabilidad técnica introducida durante la preparación y secuenciación de la biblioteca o debido a los efectos de lote resultantes de la preparación de la muestra. Además, la secuenciación puede dar lugar a un sesgo de cobertura en el que hay una profundidad de secuenciación desigual entre genes o células. Esto provoca dificultades a la hora de detectar genes poco expresados o identificar poblaciones de células raras. En segundo lugar, la identificación de los tipos celulares puede ser difícil debido a la heterogeneidad celular y transcripcional de los cultivos de organoides y a un perfil celular menos diferenciado en comparación con el epitelio intestinal nativo. El acoplamiento de las respuestas transcripcionales a los fenotipos funcionales también es un desafío y requiere una validación adicional utilizando otros enfoques o ensayos. En tercer lugar, este enfoque no incluye la consideración del contexto espacial o la dinámica temporal de las células. El procedimiento de disociación elimina la capacidad de inferir interacciones célula-célula a partir de los datos transcripcionales. Solo proporciona una única instantánea en el tiempo del estado celular en lugar de un continuo biológico. Por último, los enfoques transcripcionales de una sola célula pueden ser costosos y requieren herramientas computacionales especializadas y conocimientos bioinformáticos. Sin embargo, este enfoque sigue siendo una herramienta dominante de última generación para comprender la heterogeneidad celular e identificar nuevos tipos de células.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

Los autores reconocen las subvenciones U19 AI157984, U01 DK103168, U19 AI144297, P30 DK56338, P01 AI057788, U19 AI116497 y el Aviso de Acuerdo de Cooperación de la NASA/TRISH NNX16AO69A.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
[Leu15]-Gastrin ISigma-AldrichG914510 nM
0.05% Trypsin-EDTAInvitrogen25300054
0.4% Trypan blueMillipore-SigmaT8154
0.5 M EDTACorning46-034-CI
1x PBS Ca- Mg-Corning21-040-CM
24 mm TranswellCostar3412
plato de cultivo de tejidos de superficie Nunclon delta de 24 pocillosThermo Scientific142475
40 y micro; m filtro de célulasFalcon352340
40 µ m Colador de punta FlowmiSP Bel-Art LabwareH13680-0040
70 µ m Filtro de punta FlowmiSP Bel-Art LabwareH13680-0070
Placa de 96 pocillosCorning3595
A-83-01Tocris2939500 nM
AccutaseStemCell Technologies7920
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634-028
B27 suplementoInvitrogen17504-0441X
Cromo Next GEM de una sola célula de 3' GEM, Biblioteca & Gel Bead Kit v3.110x GenomicsPN-1000128
Colágeno IVSigma-AldrichC5533-5MG33 µ g / mL
solución de recuperación de células de Corning  VWR354253
DPBS (Mg2-, Ca2-)Invitrogen14190-1361X
GlutaMAX-IInvitrogen35050-0612 mM
HEPES 1MInvitrogen15630-08010 mM
L-WRN medios acondicionadosATCCCRL-3276
Matrigel, GFR, sin fenolCorning356231
ratón EGF recombinanteInvitrogenPMG804350 ng/mL
N2 suplementoInvitrogen17502-0481X
N-AcetilcisteínaSigma-AldrichA9165-5G500 µ M
NicotinamidaSigma-AldrichN063610 mM
SB202190Sigma-AldrichS706710 µ M
TranswellCorning3413
Y27632Tecnologías de células madre7230810 µ M
de

Referencias

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