Artículo de método

Acceso a la diferenciación temprana de células T CD4+ auxiliares foliculares específicas del virus en ratones infectados con LCMV agudo

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DOI:

10.3791/66752

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26 de abril de 2024

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1Department of Urology, South China Hospital, Medical School, Shenzhen University, 2Guangdong Key Laboratory for Biomedical Measurements and Ultrasound Imaging, National-Regional Key Technology Engineering Laboratory for Medical Ultrasound, School of Biomedical Engineering, Shenzhen University Medical School, 3Cancer Center, Daping Hospital & Army Medical Center of PLA, Third Military Medical University, 4Guangdong Provincial Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 5Institute of Immunology, Third Military Medical University, 6Dermatology Hospital, Southern Medical University, 7Institute of Immunological Innovation and Translation, Chongqing Medical University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El estudio actual muestra protocolos para evaluar el compromiso del destino temprano de las células TFH específicas del virus y manipular la expresión génica en estas células.

Resumen

Las células T auxiliares foliculares (TFH) se perciben como un linaje independiente de células T CD4+ que ayuda a las células B afines a producir anticuerpos de alta afinidad, estableciendo así una inmunidad humoral a largo plazo. Durante la infección viral aguda, el compromiso del destino de las células TFH específicas del virus se determina en la fase temprana de infección, y las investigaciones de las células TFH diferenciadas tempranamente son cruciales para comprender la inmunidad humoral dependiente de las células T y optimizar el diseño de la vacuna. En el estudio, utilizando un modelo de ratón de infección por el virus de la coriomeningitis linfocítica aguda (LCMV) y el ratón transgénico TCR SMARTA (SM) con linfocitos T CD4+ que reconocen específicamente el epítopo de glicoproteína LCMVI-A bGP66-77, describimos procedimientos para acceder al compromiso del destino temprano de los linfocitos TFH específicos del virus basados en tinciones por citometría de flujo. Además, mediante la explotación de la transducción retroviral de células T SM CD4+ , también se proporcionan métodos para manipular la expresión génica en células TFH específicas del virus diferenciadas tempranamente. Por lo tanto, estos métodos ayudarán en los estudios que exploran los mecanismos que subyacen al compromiso temprano de las células TFH específicas del virus.

Introducción

Al encontrarse con diferentes patógenos o amenazas, las células T CD4+ ingenuas adaptan sus respuestas inmunitarias diferenciándose en varios subconjuntos de células T (TH) auxiliarescon funciones especializadas. En el escenario de infección viral aguda, una gran parte de las células T CD4+ vírgenes se diferencian en células T auxiliares foliculares (TFH) que proporcionan ayuda a las células B 2,3. A diferencia de otros subconjuntos de células TH CD4+ (por ejemplo, células TH1, TH2, TH9 y TH17), las células TFH expresan un nivel sustancial de CXCR5, que es el receptor de quimiocinas para la quimiocina CXCL13 de las células B, lo que permite que las células TFH migren a los folículos de las células B. En los folículos de las células B, las células TFH ayudan a las células B afines a iniciar y mantener las reacciones del centro germinal, lo que permite una rápida producción de anticuerpos de alta afinidad y una memoria humoral a largo plazo 2,3.

Tras la infección viral aguda, el compromiso temprano del destino de las células TFH específicas del virus ocurre dentro de las 72 h 4,5 y es controlado por el linfoma represor transcripcional de células B-6 (Bcl-6)5,6,7,8, que actúa como el "regulador maestro" que gobierna las decisiones de destino de las células TFH. La deficiencia de Bcl-6 reduce gravemente la diferenciación de las células TFH, mientras que la expresión ectópica de Bcl-6 promueve sustancialmente el compromiso con el destino de las células TFH. Además de Bcl-6, múltiples moléculas están involucradas en la instrucción del compromiso temprano del destino de las células TFH. Los factores de transcripción TCF-1 y LEF-1 inician la diferenciación de las células TFH a través de la inducción de Bcl-6 9,10,11. La inhibición de Blimp1, tanto por Bcl-6 como por TCF-1, es necesaria para el compromiso temprano del destino de las células TFH 11,12. STAT1 y STAT3 también son necesarios para la diferenciación temprana de las células TFH 13. Además, las modificaciones epigenéticas por la histona metiltransferasa EZH214,15 y la m6A metiltransferasa METTL316 ayudan a estabilizar los programas transcripcionales de las células TFH (especialmente Bcl6 y Tcf7) y, por lo tanto, a preparar el compromiso temprano del destino de las célulasT FH. Si bien se han logrado avances, incluidas las moléculas antes mencionadas y otras, resumidas en otra parte3, en la comprensión de las regulaciones transcripcionales y epigenéticas del compromiso temprano del destino de las células TFH, las moléculas previamente desconocidas aún no se han aprendido.

En el modelo murino de infección por el virus de la coriomeningitis linfocítica aguda (LCMV), las células T CD4+ transgénicas TCR-transgénicas TCR transferidas adoptivamente, que reconocen específicamente el epítopo de la glicoproteína LCMV I-ABGP66-77, experimentan una diferenciación de células TFH o TH1 durante la infección viral. Este patrón de diferenciación de bifurcación TFH/TH1 apoya el avance del modelo de infección por SM/LCMV aguda en el estudio de la biología de las células TFH específicas del virus. De hecho, el modelo de infección por SM/LCMV aguda se ha utilizado ampliamente en el campo de la investigación de células TFH y ha desempeñado un papel crucial en los descubrimientos de hitos en la biología de las células TFH. Esto incluye la identificación del mencionado Bcl-6 como el factor de transcripción que define el linaje de las células TFH 5,6, así como otros factores transcripcionales importantes (por ejemplo, Blimp-16, TCF-1/LEF 9,10,11, STAT1/STAT313, STAT517, KLF218 y Itch19) que guían la diferenciación de las células TFH, las regulaciones postranscripcionales ( por ejemplo, METTL316 y miR-17~9220) de la diferenciación de los linfocitos TFH, la memoria y plasticidad de los linfocitos TFH 21,22 y las estrategias racionales de vacunación dirigidas a los linfocitos TFH (p. ej., selenio23).

El estudio actual describe métodos reproducibles para acceder al compromiso de destino temprano de las células TFH específicas del virus, que incluyen (1) el establecimiento de un modelo de ratón de quimera SM infectado con LCMV agudo adecuado para acceder a las células TFH diferenciadas tempranamente, (2) la realización de tinciones por citometría de flujo de moléculas relacionadas con las células TFH diferenciadas tempranamente y (3) la realización de manipulación génica basada en vectores retrovirales en SM CD4+ Células T. Estos métodos serán útiles para los estudios que investigan el compromiso del destino temprano de las células TFH específicas del virus.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo siguiendo los procedimientos aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Tercera Universidad Médica Militar. En el presente estudio se utilizaron las siguientes cepas de ratón: ratón C57BL/6J (B6) (ambos sexos), de 6 a 8 semanas de edad, con un peso de 25-30 g; Ratón transgénico CD45.1+SM TCR (B6 CD45.1 × SM TCR transgénico), ambos sexos, de 6 a 8 semanas de edad, con un peso de 25-30 g; y ratón transgénico CXCR5-GFP CD45.1+SM TCR (transgénico B6 CD45.1 × SM TCR × CXCR5-GFP knock-in), ambos sexos, de 6 a 8 semanas de edad, con un peso de 25-30 g. Las especies transgénicas se generaron a partir de un informe publicado anteriormente24. Los detalles de los reactivos, tampones y equipos utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Recolección de linfocitos T CD45.1+ SM CD4+ para transferencia adoptiva

  1. Sacrificar (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente) el número requerido de ratones SM transgénicos CD45.1+ TCR de 6 a 8 semanas de edad24. Hacer una incisión de 1 pulgada a la izquierda de la pared peritoneal de los ratones sacrificados con una tijera quirúrgica, diseccionar el bazo del peritoneo y desgarrar el tejido conectivo detrás del bazo25,26.
  2. Coloque cada bazo en un colador de células de 70 μm dentro de una placa de Petri (60 mm × 15 mm) y triture el bazo con 3 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC) usando un émbolo de jeringa de 1 mL.
    NOTA: Use el lado redondo del émbolo de la jeringa para moler el bazo hasta que solo quede tejido conectivo.
  3. Agregue 6 mL de RPMI + 2% de FBS (RPMI 2%) en cada plato para diluir 3 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos. Pipetee las suspensiones celulares en un tubo cónico de 15 mL desde la placa. Enjuague el plato con 3 mL adicionales de RPMI al 2% y transfiéralo al mismo tubo cónico.
  4. Centrifugar las suspensiones celulares a 800 × g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante por decantación. Vuelva a suspender las células con un tampón de aislamiento y ajuste la densidad celular a ~ 1 × 108 células por ml. Coloque el tubo sobre hielo.
  5. Prepare un cóctel de anticuerpos biotinilados 1x contra CD8a, CD19, NK1.1, F4/80, CD11c y Ter119 en tampón de aislamiento para el enriquecimiento de células T CD4+ .
    NOTA: Agregue anticuerpos biotinilados en el tampón de aislamiento a la dilución indicada como se menciona en la Tabla de Materiales. Mantenga el volumen del cóctel de anticuerpos igual que el del tampón de aislamiento en el paso 1.4.
  6. Centrifugar las suspensiones celulares a 800 × g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante por decantación.
  7. Resuspenda el pellet celular con el cóctel de anticuerpos biotinilados indicado 1x en el tubo cónico.
  8. Coloque el tubo cónico sobre hielo en una coctelera durante 30 minutos a 45 rpm.
  9. Durante la incubación con anticuerpos biotinilados, prepare el volumen requerido de perlas recubiertas de estreptavidina de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    NOTA: Los esplenocitos totales de un ratón naïve necesitan 200 μL de perlas recubiertas de estreptavidina.
  10. Lavar las células centrifugando a 800 x g con 8-10 mL de tampón de aislamiento durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante. Repita este paso otras dos veces.
  11. Vuelva a suspender el pellet celular con perlas preparadas recubiertas de estreptavidina.
  12. Coloque el tubo sobre hielo en una coctelera durante 40 minutos a 45 rpm.
  13. Luego, coloque el tubo en un soporte magnético durante 3-4 minutos hasta que todas las cuentas estén ensambladas en el lado magnético.
  14. Recoja cuidadosamente el sobrenadante y transfiéralo a un nuevo tubo cónico de 15 mL.
  15. Centrifugar las suspensiones celulares a 800 × g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante por decantación.
    NOTA: Hay otros kits comerciales disponibles para el enriquecimiento de células T CD4+ , que se pueden utilizar como sustitutos del procedimiento de enriquecimiento de células T CD4+ descrito en los pasos 1.5-1.15.
  16. Resuspenda el pellet celular con 2-3 mL de 2% RPMI. Aspirado de 50 μL de suspensión celular para el análisis de citometría de flujo de la eficiencia del enriquecimiento de células T CD4+ (CD4 y Vα2) y la viabilidad celular.
  17. Centrifugar las suspensiones celulares a 800 × g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante por decantación. Vuelva a suspender el pellet de celda con RPMI y ajuste la densidad celular a 1 ×10 7 células CD4 + Vα2+ SM por ml. Coloque el tubo en hielo y avance a la transferencia de células adoptivas en el siguiente paso.

2. Establecimiento del modelo de ratón quimera SM infectado con LCMV agudo para acceder a células SM TFH diferenciadas tempranamente

  1. Calentar los ratones receptores C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad con una lámpara infrarroja para dilatar la vena de la cola y administrarla por inyección intravenosa.
  2. Aspirar 100 μL de suspensión celular que contiene 1 × 106 células SM preparadas en el paso 1.17 con una jeringa de insulina.
    NOTA: El volumen de inyección debe ser modificado por cada investigador y no debe exceder el volumen máximo de inyección permitido por la legislación institucional y local.
  3. Sostenga a los ratones en su lugar con un fijador de ratón, enderece la cola y limpie la cola con etanol al 75% usando una bola de algodón para hacer visible la vena de la cola.
  4. Inserte la aguja de la jeringa de insulina en la vena de la cola e inyecte las suspensiones celulares suave y lentamente. Luego, deje que los ratones receptores descansen durante la noche.
  5. Al día siguiente, diluya el stock de virus LCMV Armstrong con medio RPMI para lograr una concentración final de 1 × 107 unidades formadoras de placas/mL.
  6. Inyecte 100 μL de solución diluida de LCMV Armstrong (que contiene 1 × 106 unidades formadoras de placa) en la vena de cola de los ratones receptores.
    NOTA: Cada investigador debe tener cuidado con respecto a si el título infeccioso recomendado está permitido por la ley institucional y local.

3. Tinciones por citometría de flujo de células SM TFH tempranamente diferenciadas

  1. Sacrifique los ratones (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente) del paso 2.6 el día 3 después de la infección y procese los linfocitos del bazo como se describe en el paso 1. Ajuste la densidad celular a aproximadamente 2 × 107 celdas por ml.
  2. Cargue 50 μL de suspensiones de celdas (~1 × 106 celdas) en una placa de 96 pocillos de fondo redondo y rellene con 150 μL de tampón de tinción por pocillo. Mantenga el plato en hielo.
  3. Prepare el cóctel de anticuerpos CXCR5 anti-ratón de rata purificado (es decir, el anticuerpo primario CXCR5) en una dilución de 1:50 en 50 μL de tampón de tinción de células TFH para cada muestra en un tubo. Agite a fondo el tubo y centrifuérrelo a 15.000 × g durante 3 minutos a 4 °C para agregar las partículas. Mantenga el tubo en hielo.
  4. Centrifugar la placa de 96 pocillos a 800 × g durante 1 min a 4 °C, desechar el sobrenadante por decantación, vórtice brevemente la placa y añadir 200 μL de tampón de tinción por pocillo.
  5. Repita el paso 3.4 y vuelva a suspender las células con 50 μL del anticuerpo primario CXCR5 por pocillo. Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo e incubar en hielo durante 1 h.
  6. Prepare el cóctel de anticuerpos anti-ratas de cabra biotinilado (es decir, anticuerpo secundario CXCR5) en una dilución de 1:200 en 50 μL de tampón de tinción de células TFH para cada muestra en un tubo nuevo. Agite el tubo y centrifuérrelo a 15.000 × g durante 3 minutos a 4 °C para agregar las partículas. Mantenga el tubo en hielo.
  7. Centrifugar la placa a 800 × g durante 1 min a 4 °C, desechar el sobrenadante por decantación, vortear brevemente la placa y añadir 200 μL de tampón de tinción por pocillo.
  8. Repita el paso 3.7 dos veces y mantenga el plato en hielo.
  9. Añada 50 μL de anticuerpo secundario CXCR5 por pocillo a la placa. Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo e incubar en hielo durante 30 min.
  10. Prepare estreptavidina conjugada con fluorescencia (es decir, anticuerpo terciario CXCR5) en una dilución de 1:200 en 50 μL de tampón de tinción de células TFH para cada muestra. Mientras tanto, agregue otros anticuerpos contra marcadores de superficie (por ejemplo, CD45.1, CD4, PD-1, CD25 y otras moléculas interesadas) y la tinción de células muertas junto con el anticuerpo terciario CXCR5.
  11. Agite el tubo y centrifuérrelo a 15.000 × g durante 3 min a 4 °C para agregar las partículas. Mantenga el tubo en hielo.
  12. Centrifugar la placa a 800 × g durante 1 min a 4 °C, desechar el sobrenadante por decantación, vortear brevemente la placa y añadir 200 μL de tampón de tinción por pocillo.
  13. Repita el paso 3.12 dos veces y mantenga el plato en hielo.
  14. Añadir 50 μL de cóctel de anticuerpos terciarios CXCR5 por pocillo al plato. Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo e incubar en hielo durante 30 minutos en la oscuridad.
  15. Prepare 200 μL de tampón de fijación/permeabilización para cada pocillo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  16. Centrifugar la placa a 800 × g durante 1 min a 4 °C, desechar el sobrenadante por decantación, vortear brevemente la placa y añadir 200 μL de tampón de tinción por pocillo.
  17. Repita el paso 3.16 dos veces y mantenga el plato en hielo en la oscuridad.
  18. Agregue 200 μL de tampón de fijación/permeabilización en cada pocillo. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo e incubando a temperatura ambiente durante 30 minutos (en la oscuridad).
    NOTA: Prepare el tampón de permeabilización (1x) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  19. Prepare el cóctel de anticuerpos contra factores transcripcionales, incluidos Bcl-6, TCF-1, T-bet y otras moléculas interesadas, en 50 μL de tampón de permeabilización (1x) para cada pocillo en un tubo nuevo.
  20. Agite el tubo y centrifugue a 15.000 x g durante 3 min a 4 °C para agregar las partículas.
  21. Centrifugar la placa a 800 × g durante 1 min a 4 °C, desechar el sobrenadante por decantación, vorexear brevemente la placa y añadir 50 μL de cóctel de anticuerpos de factor transcripcional por pocillo. Mezclar bien e incubar en hielo durante 30 minutos en la oscuridad.
  22. Centrifugar la placa a 800 × g durante 1 min a 4 °C, desechar el sobrenadante, vorexear brevemente la placa por decantación y añadir 200 μL de tampón de permeabilización (1x) por pocillo.
  23. Repita el paso 3.22.
  24. Añadir 200 μL de tampón de tinción en cada pocillo, centrifugar la placa a 800 × g durante 1 min a 4 °C, desechar el sobrenadante por decantación y vorexear brevemente la placa.
  25. Vuelva a suspender el pellet celular en cada pocillo con 200 μL de tampón de tinción y transfiera las celdas a tubos de citometría de flujo para un análisis inmediato del citómetro de flujo.
    NOTA: Alternativamente, las muestras pueden detectarse en un plazo de 3 días en condiciones de añadir 200 μl de PFA al 2% en cada tubo y almacenarse a 4 °C en la oscuridad.

4. Producción de retrovirus

  1. Cultive las células 293T (con menos de diez pasos) con medio DMEM 10% en una placa de cultivo de 10 cm durante 2-3 pasos.
  2. Cuando las células alcancen el 90% de confluencia, deseche el medio viejo y lave suavemente las células con PBS dos veces, seguido de una breve tripsinización de las células 293T utilizando 1 mL de tripsina-EDTA al 0,25% a temperatura ambiente durante 1 min.
  3. Detenga el proceso de digestión resuspendiendo las células en 2 mL de medio DMEM precalentado al 10%, transfiriéndolas a un tubo cónico de 15 mL y centrifugando a 200 × g durante 5 min a 4 °C.
  4. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular pipeteando el medio de cultivo hacia arriba y hacia abajo con 2 mL de medio DMEM al 10% precalentado.
  5. Cuantifique el número de células y la placa 5 × 105 células en un medio DMEM al 10% de 2,5 mL por pocillo en una placa de 6 pocillos.
    NOTA: Gire el plato suavemente para permitir que las células 293T se extiendan uniformemente por todo el plato.
  6. Cuando la confluencia de células 293T supere el 80%, prepare los reactivos de transfección como se describe en los pasos 4.7 a 4.9.
  7. Para cada pocillo de una placa de 6 pocillos, agregue 250 μL de medio Opti-MEM precalentado en un tubo estéril de 1,5 mL. A continuación, añada 3 μg de ADN plasmídico (que contenga 2 μg de vector retroviral y 1 μg de pCL-Eco) al medio Opti-MEM, seguido de un pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo para garantizar una mezcla completa.
    NOTA: Los vectores retrovirales empleados como ejemplos en este estudio son el MigR1 y el vector MigR1 modificado con la región Bcl6 CDS en la fase inicial de IRES-GFP (MigR1-Bcl6).
  8. A continuación, añada 7,5 μL de reactivo de transfección precalentado (obtenido comercialmente) a la mezcla y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para garantizar una mezcla completa.
  9. Incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 20 min.
  10. Dispense la mezcla gota a gota en distintas regiones del pocillo de cultivo celular 293T, seguido de balancear suavemente el recipiente de cultivo con un movimiento de adelante hacia atrás y de lado a lado para garantizar una distribución uniforme de la mezcla.
  11. Incubar las células 293T durante 72 h en una incubadora a 37 °C que contenga un 5% deCO2.
  12. Detecte la etiqueta del vector retroviral como indicador de la eficacia de la transfección en las células 293T transfectadas mediante un microscopio de fluorescencia o citometría de flujo.
    NOTA: Por ejemplo, confirmamos la señal de fluorescencia GFP en una proporción significativa de células 293T transfectadas con vectores MigR1, lo que sugiere una transfección de alta calidad.
  13. Recoja el medio de cultivo celular y centrifugue a 2.500 × g durante 10 min a 4 °C para eliminar los desechos celulares. El sobrenadante resultante debe recogerse y almacenarse cuidadosamente para su conservación a largo plazo a -80 °C o mantenerse temporalmente a 4 °C.

5. Activación in vivo, transducción de retrovirus y transferencia adoptiva de células T SM CD4+

  1. Inyecte un ratón CD45.1+ SM (de 6 a 8 semanas de edad) por vía intravenosa con 200 μg de LCMV GP61-77 péptido11,14 en un volumen de 100 μL de medio RPMI.
    NOTA: El volumen de inyección debe ser modificado por cada investigador y no exceder el volumen máximo de inyección permitido por la institución y la ley local.
  2. Sacrificar al ratón SM a las 16-18 h después de la inyección de péptidos (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente). Adquiera los esplenocitos siguiendo los procedimientos antes mencionados en el paso 1.
    NOTA: Alternativamente, el método de estimulación in vitro anti-CD3/anti-CD2827,28 se puede utilizar para activar las células T SM CD4+ en lugar de la estimulación peptídica in vivo descrita en los pasos 5.1 y 5.2.
  3. Suspender los esplenocitos con RPMI al 2% y ajustar la densidad celular a aproximadamente 1 × 108 células por mL en un tubo cónico de 15 mL. Mantenga el tubo en hielo.
  4. Dispensar 50 μL de suspensión celular en una placa de fondo redondo de 96 pocillos y complementar con 150 μL de tampón de tinción por pocillo.
  5. Centrifugar la placa de 96 pocillos a 800 × g durante 1 min a 4 °C para granular las células, retirar con cuidado el sobrenadante por decantación, vorticear brevemente la placa y añadir 200 μL de tampón de tinción por pocillo.
  6. Repita el paso 5.5 y vuelva a suspender las células con 50 μL de cóctel de anticuerpos de superficie, incluidos CD4, CD25 y CD69, para detectar el estado de activación de las células T SM CD4+ . Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo e incubar en hielo durante 30 minutos en la oscuridad.
  7. Rellene cada pocillo con tampón de tinción hasta 200 μL, seguido de la centrifugación de la placa a 800 × g durante 1 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante por decantación y haga un vórtice breve en la placa.
  8. Repita el paso 5.7 dos veces.
  9. Vuelva a suspender las células en 200 μL de tampón de tinción y transfiera a un tubo de citometría de flujo.
  10. Analice las células teñidas con anticuerpos conjugados con fluorescencia con una citometría de flujo para evaluar el estado de activación de las células T SM CD4+ .
    NOTA: Los linfocitos T SM CD4+ activados exhibieron abundantes expresiones de CD25 y CD69 en comparación con los linfocitos naïve, lo que permitió procedimientos de transducción posteriores.
  11. Agregue 1 × 106 células T SM CD4+ (del paso 5.3) por pocillo en una placa de 24 pocillos. Centrifugar las células a 800 × g durante 3 min a 4 °C y, a continuación, retirar con cuidado el medio por decantación.
  12. Añada 1 ml de medio retroviral como se describe en el paso 4.13 y 8 μg de policeno a cada pocillo.
  13. Transducir por centrifugación las células a 800 × g durante 2 h a 37 °C.
  14. Deseche cuidadosamente el medio retroviral mediante pipeteo y agregue 1 mL de RPMI precalentado al 10% suplementado con 10 ng/mL de IL-2 murina recombinante a cada pocillo.
  15. Incubar las células durante 48 h en una incubadora a 37 °C que contenga 5% de CO2.
  16. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mL y centrifuga las celdas a 800 × g durante 6 min a 4 °C.
  17. Retirar el sobrenadante por decantación y resuspender las células con un volumen adecuado de 2% RPMI para obtener una densidad celular de 1 × 108 células por mL en un tubo cónico de 15 mL. Mantenga el tubo en hielo.
  18. Dispensar 50 μL de suspensión celular en una placa de fondo redondo de 96 pocillos y complementar con 150 μL de tampón de tinción por pocillo.
  19. Centrifugar la placa de 96 pocillos a 800 × g durante 1 min a 4 °C para granular las células, retirar con cuidado el sobrenadante por decantación, vorticear brevemente la placa y añadir 200 μL de tampón de tinción por pocillo.
  20. Repita el paso 5.19 y vuelva a suspender las células con 50 μL de cóctel de anticuerpos de superficie, incluidos CD4, Vα2 y anticuerpos asociados a la marca vectorial. Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo e incubar en hielo durante 30 minutos en la oscuridad.
  21. Rellene cada pocillo con tampón de tinción hasta 200 μL, seguido de la centrifugación de la placa a 800 × g durante 1 min. Deseche el sobrenadante por decantación y haga un vórtice breve en la placa.
  22. Repita el paso 5.21 dos veces.
  23. Vuelva a suspender las células en 200 μL de tampón de tinción y transfiera a un tubo de citometría de flujo.
  24. Analice las células teñidas con anticuerpos conjugados con fluorescencia con citometría de flujo para evaluar la eficiencia de la transducción en células T SM CD4+ .
    NOTA: Las células T SM CD4+ transducidas de manera eficiente exhibieron una alta expresión de la etiqueta de retrovirus, como GFP, en el estudio.
  25. Centrifugar las suspensiones celulares del paso 5.17 a 800 × g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante por decantación. Vuelva a suspender el pellet celular con RPMI y ajuste la densidad celular a 1 ×10 7 células CD4+Vα2+ SM/mL.
  26. Transfiera adoptivamente un número total de ×linfocitos T CD45.1+ SM CD4+ CD4+ 16 a cada ratón receptor C57BL/6 (de 6 a 8 semanas de edad) mediante una inyección intravenosa de 100 μL de suspensión celular en el paso 5.25.
  27. Al día siguiente, infecte a los ratones receptores de C57BL/6 con 1 × 106 unidades formadoras de placa LCMV Armstrong mediante inyección intravenosa.

6. Análisis por citometría de flujo de células SM TFH transducidas por retrovirus en la etapa temprana de infección aguda por LCMV

  1. Adquiera los esplenocitos de ratones C57BL/6 del paso 5.25 el día 3 después de la infección.
  2. Realice la tinción por citometría de flujo de marcadores de superficie, incluidos CD4, CD45.1, CXCR5, CD25 y otras moléculas interesadas, en esplenocitos como se describe en el paso 3.
  3. Para la detección de factores transcripcionales en linfocitos T SM CD4+ transducidos con retrovirus marcados por proteínas fluorescentes, añadir 200 μL de PFA al 2% a cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 20 min en la oscuridad.
  4. Realice la fijación/permeabilización, la tinción por citometría de flujo de los factores transcripcionales interesados y realice el análisis de citometría de flujo como se describe en el paso 3.

Resultados

Características de las células TFH específicas del virus diferenciadas tempranamente durante la infección aguda por LCMV
Para probar el compromiso del destino temprano de las células TFH específicas del virus, las células T SM CD4+ congénitas naïve que reconocen específicamente el epítopo I-ABGP GP66-77 de LCMV se transfirieron adoptivamente a receptores de CD45.2+ C57BL/6. Al día siguiente, estos receptores fueron infectados por vía intravenosa con una dosis alta del LCMV Armstrong resuelto agudamente (Figura 1A). El día 3 después de la infección, los esplenocitos de los receptores de C57BL/6 se analizaron mediante citometría de flujo, y los resultados indicaron una gran cantidad de células T CD45.1+ SM CD4+ transferidas (~10% del total de células T CD4+) (Figura 1B), lo que proporcionó un número suficiente de células T CD4+ específicas del virus para una mayor investigación. Los análisis posteriores de los linfocitos T SM CD4+ transferidos mostraron la coexpresión de CXCR5 y Bcl-6/TCF-1 y la expresión recíproca de CXCR5 y CD25/T-bet, definiendo así los linajes TFH (CXCR5+Bcl-6+ o CXCR5+TCF-1+) y TH1 (CXCR5-CD25+ o CXCR5-T-bet+) (Figura 1C). Para evaluar la especificidad y sensibilidad de la tinción de anticuerpos CXCR5 presentada en el estudio, cruzamos la línea de ratón CD45.1+ SM antes mencionada con la línea de ratón knock-in CXCR5-GFP, que se generó mediante la inserción de un constructo IRES-GFP después del marco de lectura abierto de Cxcr529. A continuación, las células SM reporteras CD45.1+ CXCR5-GFP se transfirieron a los receptores C57BL/6. Estos receptores se infectaron con LCMV Armstrong y sus esplenocitos se analizaron el día 3 después de la infección. De hecho, la señal de fluorescencia por el método de tinción de anticuerpos CXCR5 en el estudio se superpuso finamente con la señal de GFP en las células T CD4+ CXCR5-GFP reporteras29 SM transferidas el día 3 después de la infección (Figura 1D), lo que indica la alta especificidad del método de tinción de anticuerpos CXCR5 de tres pasos.

Sobreexpresión de Bcl-6 basada en retrovirus en linfocitos T SM CD4+
Bcl-6 es una de las moléculas más importantes en el fomento de la diferenciación de las células TFH 6,7,8. Para determinar la fiabilidad del protocolo actual en el acceso a los linfocitos TFH diferenciados tempranamente, se activaron in vivo linfocitos T CD45.1+ SM CD4+ y se transducieron con sobrenadante retroviral a partir de linfocitos 293T transfectados con plásmido de sobreexpresión MigR1-Bcl6 (Figura 2 y Figura 3A). A continuación, las células T SM CD4+ transducidas por retrovirus se transfirieron adoptivamente a receptores C57BL/6, que luego se infectaron con LCMV Armstrong (Figura 3B). El día 3 después de la infección, encontramos una bifurcación equilibrada de las células TFH yT H1 en las células T MigR1-SM CD4+, mientras que una diferenciación predominante dirigida a las células TFH en las células T MigR1-Bcl6-SM CD4+ (Figura 3C). Consistentemente, el nivel de expresión de Bcl-6 mejoró en las células T MigR1-Bcl6-SM CD4+ en comparación con las células T MigR1-SM CD4+ (Figura 3D). Por lo tanto, el fenotipo que expresa la diferenciación 6 de las células TFH 6 ectópicas de Bcl-6 se reprodujo finamente siguiendo el protocolo actual.

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Figura 1: Análisis de citometría de flujo del compromiso del destino temprano de las células SM TFH durante la infección por LCMV Armstrong. (A) Diseño experimental. Las células T esplénicas CD4+ se recolectaron de ratones CD45.1+ SM y luego se transfirieron adoptivamente a receptores C57BL/6 (CD45.2+). Al día siguiente, estos receptores se infectaron con LCMV Armstrong. El día 3 después de la infección, las células CD45.1+ SM transferidas desde el bazo de los receptores se analizaron mediante citometría de flujo. (B) Datos representativos de citometría de flujo que muestran la estrategia de activación de las células T CD45.1+ SM CD4+ transferidas desde el bazo de los receptores en el día 3 después de la infección por LCMV Armstrong. (C) Datos representativos de citometría de flujo que muestran tinciones conjuntas de CXCR5 y otras moléculas asociadas a células TFH (Bcl-6, TCF-1, CD25 y T-bet) en células CD45.1+ SM transferidas desde el bazo de los receptores en el día 3 después de la infección por LCMV Armstrong. (D) Datos representativos de citometría de flujo que muestran tinciones conjuntas de anticuerpos conjugados con fluorescencia contra la señal CXCR5 y GFP en células SM reporteras CD45.1+ CXCR5-GFP transferidas desde el bazo de los receptores en el día 3 después de la infección por LCMV Armstrong. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Transducción retroviral en linfocitos T SM CD4+ . (A) Diagrama esquemático de la producción de retrovirus y la transducción retroviral en células T SM CD4+ . Para la producción de retrovirus, las células 293T sembradas en una placa de 6 pocillos se transfectaron con plásmidos de ADN objetivo cuando la densidad celular alcanzó el ≥80% de confluencia. A continuación, se recolectó el sobrenadante de cultivo celular que contenía retrovirus 72 h después de la transfección e inmediatamente se utilizó o almacenó a -80 °C. Para la transducción retroviral en células T SM CD4+ , se inyectó por vía intravenosa a un ratón CD45.1+ SM 200 μg de péptido LCMV GP61-77 . A continuación, se diseccionó el bazo de un ratón SM 16-18 h después de la inyección de péptidos, y se detectó el estado de activación de las células T CD4+ esplénicas. Los linfocitos T SM CD4+ activados se transducieron con un sobrenadante de cultivo que contenía retrovirus y se cultivaron in vitro durante 48 h antes de alcanzar la eficiencia de la transducción. (B) Imágenes de microscopía de fluorescencia de GFP en células 293T transfectadas con ADN plasmídico. Barra de escala: 400 μm. (C) Análisis por citometría de flujo de los niveles de expresión de CD25 y CD69 en linfocitos T CD4+ naïve esplénicos de ratón naïve (naïve, izquierda) o linfocitos T CD4+ SM esplénicos de ratón SM inyectado con péptido LCMV GP61-77 (activado, derecha). (D) Análisis por citometría de flujo de la expresión de GFP en células T SM CD4+ transducidas con retrovirus (transducidas, izquierda) o células T SM CD4+ no transducidas con retrovirus (no transducidas, izquierda). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Efectos de la sobreexpresión de Bcl-6 en el compromiso con el destino de las células SM TFH. (A) Mapas lineales de las redes troncales retrovirales de MigR1 (panel superior) y el vector MigR1 modificado con la región Bcl6 CDS en la parte superior de IRES-GFP (MigR1-Bcl6) (panel inferior). (B) Diseño experimental. Las células T SM CD4+ transducidas con MigR1 o MigR1-Bcl6 se transfirieron adoptivamente a receptores C57BL/6 (CD45.2+) un día antes de LCMV Armstrong. El día 3 después de la infección, las células T CD45.1+ SM CD4+ transferidas desde el bazo de los receptores se analizaron mediante citometría de flujo. (C) Análisis de citometría de flujo de CXCR5 y CD25 en células T GFP+ SM transducidas con transducción MigR1 o MigR1-Bcl6. Los números adyacentes a la puerta indican las frecuencias de las células TFH en las células T SM CD4+. (D) Análisis por citometría de flujo del nivel de expresión de Bcl-6 en células T SM CD4+ transducidas con MigR1 o MigR1-Bcl6. MFI: intensidad media de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

La investigación en el campo de las células TFH se ha destacado desde el descubrimiento de la función especializada de las células TFH para ayudar a las células B. Los estudios acumulados indicaron que la diferenciación de las células TFH es un proceso multietapa y multifactorial30, en el que el compromiso con el destino de las células TFH se determina en la etapa temprana5. Por lo tanto, una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes a las células TFH diferenciadas tempranamente es crucial para la biología de las células TFH y el diseño racional de vacunas. En este trabajo, proporcionamos métodos para acceder al compromiso del destino temprano de las células TFH específicas del virus y para manipular la expresión génica en las células TFH diferenciadas tempranamente mediante la explotación del modelo de infección viral LCMV Armstrong, el ratón SM transgénico TCR y la transducción mediada por retrovirus.

El receptor de quimiocinas CXCR5 es un marcador de superficie importante que distingue a las células TFH de otros subconjuntos de células TH CD4+ 6,7,8,31, por lo que es necesario el método de tinción CXCR5 de alta especificidad y sensibilidad en la investigación de células TFH. En el estudio, se mostró un método de tinción CXCR5 de estreptavidina-biotina de tres pasos para identificar el subconjunto de células TFH (Figura 1C). Aunque la pérdida de especificidad es un problema difícil para los enfoques de tinción de anticuerpos con dos o tres estreptococos de alta sensibilidad, se encontró que la señal de fluorescencia por la tinción de anticuerpos CXCR5 en tres pasos se superponía casi por completo con la señal de GFP en las células T SM CD4+ reporteras de CXCR5-GFP29 en el día 3 después de la infección (Figura 1D), lo que sugiere el logro de tanto la especificidad como la sensibilidad mediante el método de tinción de anticuerpos CXCR5 en tres pasos. De hecho, esta estrategia de tinción de CXCR5 de tres estreptococos está probada y ha ayudado a los investigadores a investigar mejor la biología de las células TFH 11,14,15,21, así como otros tipos de células T que expresan CXCR529,32.

Tras la infección y la inmunización, el compromiso del destino de los linfocitos TFH generalmente se modela mediante una diferenciación bifurcada de los linfocitos T CD4+ vírgenes en linfocitos TFH o linfocitos T H efectores no TFH 2,3,30. Este estudio mostró la bifurcación equilibrada de las células TFH y TH1 en las células T SM CD4+ transferidas. Además, estos linfocitos T SM CD4+ transferidos tienen una cantidad adecuada de células en la etapa temprana de infección, por lo que actúan como un modelo adecuado para estudiar la diferenciación de los linfocitos TFH. Sin duda, la expresión ectópica de Bcl-6 mediada por retrovirus en las células T SM CD4+ transferidas estaba fuertemente sesgada hacia la diferenciación de las células TFH en comparación con la de las células T SM CD4+ de control (86,6% frente a 53,8%) (Figura 3C), lo que está alineado con el informe anterior6 y demuestra aún más la precisión de los protocolos descritos en el estudio. Alternativamente, los protocolos antes mencionados también se pueden aplicar a la eliminación mediada por retrovirus de genes interesados (p. ej., bcl6, Tcf7) en células T SM CD4+ activadas tempranamente11 (datos no mostrados).

Una limitación en el protocolo es el problema del tiempo (más de 2 h en total) y el proceso de múltiples pasos del método de tinción CXCR5 de tres pasos. Alternativamente, también se aplicaron métodos de tinciónde 18,33 o 4,9,34 CXCR5 de dos pasos en la investigación de células T FH. Se justifica una comparación de la especificidad/sensibilidad de estos métodos de tinción CXCR5.

En resumen, el estudio actual proporcionó protocolos para acceder a las células TFH específicas del virus diferenciadas tempranamente y para investigar los genes interesados que potencialmente regulan la diferenciación de las células TFH . Estos protocolos impulsarán las investigaciones sobre el compromiso temprano del destino de las célulasT FH .

Divulgaciones

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 32300785 a X.C.), el Programa Nacional Postdoctoral de China para Talentos Innovadores (No. BX20230449 a X.C.), y el Proyecto Nacional Mayor de Ciencia y Tecnología (No. 2021YFC2300602 a L.Y.).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.25% Tripsina-EDTACorning25-052-CI
4% Paraformaldehído Solución Fija, 4% PFABeyotimeP0099-500mL
70 μ filtro de células mMerckCLS431751
Alexa Fluor 647 anti-ratón TCR Vα 2 (clon B20.1)Biolegend127812dilución 1:200
Alexa Fluor 700 anti-ratón CD45.1 (clon A20)Biolegend110724dilución 1:200
APC anti-ratón CD25 (clon PC61)Biolegend101910dilución 1:200
B6 CD45.1 (B6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) ratónEl Laboratorio Jackson002014
BeaverBeads EstreptavidinaBeaver22321-10
Biotina anti-ratón F4/80 Anticuerpo (clon BM8)Biolegend123106dilución 1:200
Biotina Rata anti-ratón CD11c (clon N418)Biolegend117304dilución 1:200
Biotina Rata anti-Ratón CD19 (clon 6D5)Biolegend115504dilución 1:200
Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clon 53-6.7)Biolegend100704dilución 1:200
Biotin Rat anti-ratón NK-1.1 (clon PK136)Biolegend108704dilución 1:200
Biotin Rat anti-ratón TER-119/Células eritroides (clon TER-119)Biolegend116204dilución 1:200
albúmina sérica bovina, BSASigmaA7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clon 4B10)Biolegend644816dilución 1:100
Brilliant Violet 605 anti-ratón CD279 (PD-1) (clon 29F.1A12)Biolegend135220dilución 1:200
Ratón C57BL/6J (B6)Ratón
deEn casa; la línea de ratón knock-in CXCR5-GFP se generó mediante la inserción de una construcción IRES-GFP después del marco de lectura abierto de Cxcr5.
DMEM 10% medioDMEM medio que contiene 10% FBS
MedioDMEM Gibco11885092
EDTASigmaE9884
FACSFortesaBD Biosciences
Suero fetal bovino, FBSSigmaF8318
FlowJo (versión 10.4.0)BD Biosciences
Foxp3/Juego de tampones de tinción de factor de transcripciónInvitrogen00-5523-00El kit contiene tres reactivos: a. Concentrado de fijación/permeabilización (4X); b. Diluyente de fijación/permeabilización; c. Tampón de permeabilización.
Anticuerpo IgG anti-rata de cabra (H + L), biotiniladoLaboratorios de vectoresBA-9400-1.5Dilución 1:200
Sistema de imágenes de células automáticas Invitrogen EVOS FLThermoFisher Scientific
TampónFACS que contiene 0,5% de BSA y 2 mM EDTA
LCMV GP61-77 péptido (GLKGPDIYKGVYQFKSV)Compañía
china de péptidosKit de tinción de células muertas en infrarrojo cercano fijable LIVE/DEAD, para excitación de 633 o 635 nmLife TechnologiesL10199dilución 1:200
MigR1addgene#27490
NaN3SigmaS2002
Opti-MEM medioGibco31985070
pCL-Ecoaddgene#12371
PE anti-ratón CD69 (clon H1.2F3)Biolegend104508dilución 1:200
PE Ratón anti-Bcl-6 (clon K112-91)BD Biosciences561522dilución 1:50
Solución salina tamponada con fosfato, PBSGibco10010072
PolybreneSolarbioH8761
Rata purificada Anti-Ratón CXCR5 (clon 2G8)BD Biosciences551961Dilución 1:50
Rata monoclonal PerCP anti-ratón CD4 (clon RM4-5)Biolegend100538dilución 1:200
recombinante murino IL-2Gibco212-12-1MG
Tampón de lisis de glóbulos rojosBeyotimeC3702-500mL
RPMI 1640 medioSigmaR8758
RPMI 2%RPMI 1640 medio que contiene 2% Ratón transgénico FBS
SMARTA (SM) TCRLa línea transgénica SM TCR en nuestro laboratorio es un regalo del Dr. Rafi Ahmed (Universidad de Emory). Además, esta línea de ratones también se puede obtener de The Jackson Laboratory (tinción #: 030450).
TampónPBS que contiene 2% de FBS y 0,01% de NaN3
Estreptavidina, PE-Cyanine7eBioscience25-4317-82dilución 1:200
TCF1/TCF7 (C63D9), mAb de conejo (Alexa Fluor 488 conjugado) Tecnología de señalización celular6444S
de tinción celular TFHTampón FACS que contiene 1% de BSA y 2% de suero de ratón
Reactivo TransIT-293Mirus BioMIRUMIR2700
reportero knock-in 000664 Jackson Laboratory Tampón de aislamiento de tinción , , Tampón de dilución 1:400

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