Un ensayo in vitro para estudiar la migración plaquetaria utilizando ataduras de avidina-biotina funcionalizadas con RGD

Resumen

Se proporciona un protocolo detallado para obtener imágenes de plaquetas migratorias individuales utilizando ataduras de avidina-biotina funcionalizadas con RGD con densidad sintonizable, que revela que las plaquetas generan suficiente fuerza para romper el enlace avidina-biotina.

Resumen

A pesar de ser fragmentos de células anucleadas, las plaquetas son ahora ampliamente reconocidas por sus capacidades multifacéticas. No solo forman coágulos de sangre para evitar el sangrado después de una lesión, sino que también combaten las infecciones y mantienen la integridad vascular durante las enfermedades inflamatorias. Si bien los tapones hemostáticos requieren la activación y agregación colectiva de plaquetas, su papel en la protección de los vasos sanguíneos inflamados se realiza a nivel de una sola célula. En este contexto, datos recientes han demostrado que las plaquetas pueden migrar de forma autónoma, un proceso que depende de la mecanodetección de su entorno adhesivo. Aquí, se presenta un protocolo detallado para la obtención de imágenes de la migración de plaquetas individuales, utilizando un sistema de recubrimiento de tres capas que consta de un injerto de poli-L-lisina poli(etilenglicol) (PLL-PEG)-biotina (1), un enlazador de avidina fluorescente (2) y biotina-cíclico Arg-Gly-Asp (cRGD) (3) como motivo de unión a la integrina plaquetaria. Este enfoque reduccionista permite un control preciso de las propiedades de adhesión del sustrato y sirve como un ensayo in vitro simple y estandarizado para estudiar los mecanismos subyacentes a la migración de plaquetas. Los resultados indican que las plaquetas migratorias que se unen a cRGD ejercen fuerzas capaces de interrumpir el enlace avidina-biotina. Además, la densidad de biotina-cRGD influye significativamente tanto en la propagación como en la migración de las plaquetas.

Introducción

Las plaquetas son pequeños fragmentos de células anucleadas derivadas de megacariocitos en la médula ósea. Las plaquetas activadas se ensamblan en agregados que forman la base de un coágulo de sangre para sellar lesiones vasculares en la hemostasia fisiológica o para ocluir los vasos sanguíneos enfermos en la trombosis patológica^. Sin embargo, en las últimas décadas ha quedado claro que las plaquetas también desempeñan un papel central en la fisiopatología de la inflamación, la infección y la malignidad, donde las interacciones multifacéticas con las células inmunitarias, las células cancerosas y los patógenos invasores son críticas para dar forma a la respuesta inmunitaria del huésped ^2,3. Datos recientes han demostrado que las plaquetas tienen la capacidad de migrar de forma autónoma⁴. En respuesta a la bacteriemia sistémica, las plaquetas son reclutadas hacia los sinusoides hepáticos, donde se adhieren y migran. La migración permite que las plaquetas capturen y se unan a las bacterias, lo que a su vez favorece la activación de los leucocitos. Cabe destacar que las plaquetas permanecen intravasculares durante este proceso y no migran al tejido subendotelial⁴. Además, las plaquetas son centinelas de la inflamación vascular, escaneando los vasos sanguíneos inflamados en busca de microlesiones causadas por las células inmunitarias extravasantes⁵ y empleando la migración para proteger los vasos sanguíneos inflamados ^6,7. Aquí, las plaquetas utilizan sus integrinas para unirse al fibrinógeno depositado en el endotelio inflamado. Luego, las plaquetas forman protuberancias lamelipodiales que les permiten escanear las propiedades adhesivas de su entorno. Luego, las plaquetas se polarizan y migran hacia densidades más altas de fibrinógeno, un proceso conocido como haptotaxis. En última instancia, la migración dirigida de plaquetas apoya el posicionamiento en las microlesiones endoteliales que evitan el sangrado en los tejidos inflamados, incluidos el músculo y el pulmón.

La migración plaquetaria depende críticamente de las propiedades mecánicas del sustrato adhesivo ^4,8. La tarea de detectar y transducir las propiedades mecánicas del entorno está mediada principalmente por los receptores de integrinas, que son proteínas heterodiméricas transmembrana compuestas por una subunidad α y β con el dominio extracelular uniéndose al ligando en la matriz extracelular y el dominio intracelular uniéndose al citoesqueleto de actina a través de proteínas adaptadoras ^9,10. La integrina plaquetaria más abundante es la_{α IIb}β_3, y su ligando principal es la fibrina(ogen)¹¹. El compromiso integrina-ligando desencadena eventos de señalización que culminan en la formación de un laminupidio impulsado por Arp2/3 que forma el borde delantero de una plaqueta adherente⁷. Las plaquetas adherentes prueban instantáneamente las propiedades mecánicas de su entorno adhesivo tirando de él⁴. Cuando las fuerzas de tracción dependientes de la miosina IIa superan la estabilidad mecánica de la matriz extracelular (por ejemplo, fibrina (ógeno)), las plaquetas rompen mecánicamente los ligandos debilitados y utilizan sus protuberancias lamelipodiales para escanear el microambiente en busca de ligandos adhesivos, establecer nuevos enlaces de sustrato y migrar lejos del entorno empobrecido en ligandos⁶. Es probable que la migración celular impulsada por el agotamiento mecánico de ligandos no proteolíticos desempeñe un papel más allá de la función plaquetaria, ya que parece ser un fenómeno general observado en células capaces de remodelar mecánicamente su matriz adhesiva⁸. La tasa de agotamiento del ligando determina la velocidad de migración y depende tanto de la estabilidad del ligando como de la densidad del ligando^{del sustrato 8}. Las plaquetas a baja densidad de ligandos son capaces de interrumpir mecánicamente los ligandos de integrinas modificados (Arg-Gly-Asp cíclico (cRGD))^6,7 unidos a cubreobjetos de vidrio con ataduras de biotina-avidina que tienen una fuerza de unión de aproximadamente 160 piconewtons (pN)12,13,14,15.

Aquí, estas observaciones se aprovechan para desarrollar un protocolo in vitro simple para generar superficies adhesivas lábiles ligando, lo que facilita el estudio de los mecanismos de migración plaquetaria. El recubrimiento adhesivo descrito en este protocolo consta de tres elementos esenciales: (1) una columna vertebral PLL-PEG-biotina y (2) un enlazador de neutravidina-isotiocianato de fluoresceína (NA-FITC) que facilita la unión de (3) biotina-cRGD (un ligando adhesivo) a la columna vertebral PLL-PEG-biotina (véase también la Figura 1B). La estabilidad de este constructo depende de la fuerza del enlace biotina-avidina, que puede romperse en la interfaz (A) PLL-PEG-BIOTINA-NA-FITC o (B) FITC-NA-biotina-cRGD. Además, la densidad de los ligandos adhesivos se puede ajustar adaptando la proporción de PLL-PEG-biotina a PLL-PEG en la capa inferior. La ruptura de la unión (A) da como resultado la liberación de FITC del recubrimiento, lo que lleva a una disminución de la señal de fluorescencia debajo de las plaquetas en migración. Por lo tanto, en conjunto, el recubrimiento descrito en este protocolo permite un ajuste preciso de las propiedades mecánicas y adhesivas del sustrato y proporciona una fácil lectura basada en fluorescentes de la migración de plaquetas.

Protocolo

Los experimentos con animales realizados en este estudio se llevaron a cabo de conformidad con todas las normas éticas pertinentes para los estudios con ratones y fueron aprobados por la legislación local sobre la protección de los animales (Regierung von Oberbayern, Múnich, 190-15, 2015). En este estudio se utilizaron ratones hembra y macho C57BL/6, de 8 a 10 semanas de edad (peso corporal de 20 a 25 g). Los detalles de los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Recubrimiento de biotina-neutravidina-biotina cRGD

1. Sonicado cubreobjetos de vidrio (24 mm x 24 mm; # 1,5) dentro de un 20% de_HNO3 durante 1 min, seguido de sonicación dentro de isopropanol, etanol y H₂O durante 1 min. Después de cada sonicación, enjuague abundantemente los cubreobjetos en agua destilada (ddH₂O) y finalmente séquelos en la incubadora.
2. Trate los cubreobjetos prelimpios con plasma de O₂ en un limpiador de plasma durante 2 minutos y luego ensamble con portaobjetos adhesivos como se describió anteriormente¹⁶. Los portaobjetos pegajosos y los cubreobjetos de vidrio formarán un canal entre ellos (como se muestra en la Figura 1A).
   NOTA: Es importante un tratamiento eficiente con plasma. Utilice el O₂ como fuente de plasma.
3. Llene el canal con 2,5 μL de PLL-PEG-biotina (1 mg/mL) diluido en 97,5 μL de PLL-PEG (1 mg/mL) e incube durante 30 min a temperatura ambiente (RT), luego lave tres veces con PBS. PLL-PEG-biotina se une a la neutravidina en el siguiente paso, mientras que la columna vertebral de PLL-PEG forma un sustrato inerte que impide la unión inespecífica de proteínas y plaquetas.
   NOTA: La concentración de PLL-PEG-biotina en las soluciones de recubrimiento define la densidad final de los ligandos cRGD.
4. Añadir 100 μL de Neutravidin-FITC (25 μg/mL) e incubar durante 30 min en la oscuridad a RT, luego lavar tres veces con PBS.
   NOTA: Ajuste la concentración de Neutravidin-FITC a la concentración de PLL-PEG-biotina. Aumente la concentración de Neutravidin-FITC si se recubren densidades más altas de PLL-PEG-biotina.
5. Añadir 100 μL de ciclociclón [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys (Biotina-PEG-PEG)] (cRGD-biotina) (0,1-1 μM), incubar durante 30 min a RT y lavar tres veces con PBS. Los cubreobjetos están listos para usar. En la Figura 1B se muestra un esquema del recubrimiento.

2. Aislamiento de plaquetas de ratón de la sangre

1. Prepare el tampón Tyrode modificado, que contiene 136,9 mM de NaCl, 12,1 mM de NaHCO₃, 2,6 mM de KCl, 5,5 mM de glucosa, 10 mM de HEPES, y ajuste el pH a 7,4 y 6,5.
2. Anestesiar a los ratones (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente) mediante inyección intraperitoneal de 0,5 mg/kg de fentanilo, 5 mg/kg de midazolam y 0,05 mg/kg de medetomidina. Después de confirmar la profundidad de la anestesia mediante un pellizco en los dedos de los pies, retire la piel torácica con unas tijeras.
3. Prepare una jeringa de 2 mL (aguja de 26 G) con 150 μL de citrato-ácido dextrosa (ACD) como anticoagulante. Inserte la aguja entre la segunda y la tercera costilla en el lado izquierdo del esternón para extraer sangre del corazón. Después, sacrificar al ratón por luxación cervical.
   NOTA: (1) Composición del tampón ACD: 85 mM de citrato de sodio tribásico deshidratado y 65 mM de ácido cítrico monohidratado en 111 mM de glucosa. (2) La extracción de sangre debe realizarse sin problemas para evitar la formación de coágulos. Se puede obtener alrededor de 1 ml de sangre de ratones de 8 a 10 semanas de edad.
4. Mezclar la sangre con 1 mL de tampón Tyrode (pH 6,5) en un tubo FACS (poliestireno de fondo redondo) de 5 mL y centrifugar a 70 x g durante 20 min a RT con el freno apagado.
5. Después de la centrifugación, tome la parte superior (alrededor de 1 mL) que contiene plasma rico en plaquetas (PRP). Mezclar con 3 mL de tampón Tyrode (pH 6,5) y añadir 100 ng/mL de prostaciclina (PGI₂) para evitar la activación plaquetaria.
6. Centrifugar a 1200 x g durante 5 min en RT, desechar el sobrenadante, resuspender el pellet en 500 μL de tampón Tyrode (pH 6,5) y medir el recuento de plaquetas con un hemocitómetro.

3. Migración de plaquetas de ratón en el recubrimiento de biotina-neutravidina-biotina cRGD

1. Complemente el tampón Tyrode modificado (pH 7,4) con 10 x 10³/μL de plaquetas de ratón, 1 mM de CaCl₂, 2 μM de U46619 y 4 μM de sal sódica de adenosina 5'-difosfato (ADP), y pipetee un volumen total de 240 μL en los canales preparados en el paso 1.
2. Registre la migración de plaquetas vivas utilizando un microscopio invertido equipado con una incubadora de etapas. Alternativamente, incubar el canal durante 1 h a 37 °C en una incubadora.
3. Fijar la muestra con paraformaldehído al 4% durante 10 min a RT y lavar cinco veces con PBS.
4. Permeabilizar las plaquetas con Triton-X (0,2% en PBS) durante 5 min, y lavarlas cinco veces con PBS.
5. Diluir 2,5 μL de faloidina Alexa Fluor 594 (40x stock metanólico) en 100 μL de PBS. Incubar con plaquetas durante 30 minutos al anochecer, luego lavar cinco veces con PBS.
6. Tome imágenes de los portaobjetos bajo un microscopio de fluorescencia.

4. Cuantificación

NOTA: Las plaquetas que forman filopodios (protuberancias en forma de dedos) o laminiopodios (protuberancias en forma de láminas) se contaron como plaquetas adherentes⁴. Las plaquetas con una distancia migratoria de más de uno de su diámetro se definieron como plaquetas migratorias.

1. Fracción de plaquetas en migración: Cuente los números de adhesión o migración de plaquetas con la herramienta Multi Point en Fiji. Haga clic con el botón derecho en el menú desplegable de la herramienta Punto en la barra de herramientas para seleccionar la herramienta Multipunto . Calcule la fracción de plaquetas migratorias dividiendo el número de plaquetas migratorias por el número de plaquetas adhesivas.
2. Distancia media de migración: Extraiga la distancia de migración de muestras fijas midiendo la longitud de la ruta de migración "impresa" en el recubrimiento de neutravidina-FITC utilizando la herramienta de línea de mano libre . Haga clic con el botón derecho en el menú desplegable de Línea recta en la barra de herramientas para seleccionar la herramienta Línea a mano alzada .
3. Descriptores de forma de plaquetas: Genere máscaras binarias segmentando plaquetas fluorescentes (Alexa594-Phalloidin) utilizando la función Umbral . Seleccione Imagen > Ajustar > umbral en la barra de herramientas.
4. Los descriptores de forma, como el área, el perímetro, la circularidad y la relación de aspecto, se pueden obtener en analizar partículas. Seleccione descriptores de forma en Analizar > Establecer medidas y, a continuación, seleccione Mostrar resultados en Analizar > Analizar partículas.

Resultados

Las plaquetas activadas se adhieren y diseminan fácilmente en portaobjetos recubiertos de PLL-PEG-biotina-neutravidina-FITC-biotina-cRGD (Figura 1C y Figura 2A; 0 min y 5 min) y posteriormente se polarizan formando un laminupidio en el borde delantero (Figura 2A; 10 min). Durante este proceso, el pseudonúcleo (área oscura en el centro de las plaquetas) se movió del centro a la parte posterior de la plaqueta (Figura 2A). Luego, las plaquetas polarizadas comienzan a migrar sin direccionalidad obvia (Figura 2A; 15 min y 20 min y Figura 2B). Observamos que las plaquetas que migran en los recubrimientos PLL-PEG-biotina-neutravidina-FITC-biotina-cRGD pueden romper el enlace neutravidina-FITC-biotina-PLL-PEG, como lo demuestra la reducción de la intensidad de fluorescencia a lo largo del camino de migración (Figura 1C y Figura 2A, B). Además, el complejo neutravidina-FITC-biotina-cRGD interrumpido se acumula en la superficie plaquetaria (Figura 2A,B). Este fenómeno es similar a los hallazgos previos, donde las plaquetas migratorias eliminaron el fibrinógeno del sustrato y lo acumularon dentro de su sistema canalicular abierto (OCS)⁴.

Para investigar cómo la densidad del ligando influye en la migración plaquetaria, se ajustó la densidad de cRGD variando la proporción de PLL-PEG-biotina a PLL-PEG en la primera capa de recubrimiento. Estos datos revelan que las plaquetas de ratón alcanzan una migración óptima a una concentración del 2,5% de PLL-PEG-biotina. La migración se reduce tanto a las concentraciones más bajas (1%) como a las más altas (10%) de PLL-PEG-biotina (Figura 3A,B). Estos cambios en el comportamiento migratorio dependientes del sustrato se acompañan de alteraciones en la morfología plaquetaria (Figura 3C). A bajas densidades de ligandos (1%), las plaquetas no se diseminan adecuadamente, como lo demuestra un área y un perímetro plaquetarios proyectados bajos (Figura 3C). Esto sugiere una activación insuficiente de integrinas y una señalización de afuera hacia adentro⁷. En consecuencia, las plaquetas no pueden ejercer fuerzas sobre los ligandos cRGD, no logran remodelar el sustrato y no migran (Figura 3A,B).

A una densidad de ligando intermedia (2,5%), se produce un aumento significativo del área y el perímetro plaquetario (Figura 3C). Las plaquetas se propagan eficazmente, interrumpiendo mecánicamente los ligandos lábiles de cRGD, y migran (Figura 3A,B). Sin embargo, a altas densidades de ligandos (10%), aunque la dispersión aumenta, las plaquetas no se polarizan, lo que se indica por una relación de aspecto reducida (Figura 3C). En estas condiciones, las plaquetas permanecen adheridas al sustrato pegajoso y no migran porque no pueden romper los ligandos cRGD lábiles (Figura 3A,B).

Estos hallazgos demuestran que la migración plaquetaria depende críticamente de las propiedades adhesivas del sustrato. Las plaquetas solo pueden migrar cuando se involucran lo suficiente con los ligandos adhesivos y, al mismo tiempo, generan fuerzas de tracción lo suficientemente fuertes como para superar la tolerancia a la tensión del sustrato adhesivo 4,6,7,8.

Figura 1: Procedimiento de recubrimiento e imágenes en vivo de la interacción plaqueta-sustrato. (A) Fotografía de la cámara ensamblada. B) Principio del protocolo. Izquierda: Esquema del recubrimiento. Los cubreobjetos de vidrio tratados con plasma se recubrieron con tres capas. La primera capa es la mezcla de PLL-PEG y PLL-PEG-biotina (la columna vertebral de PLL-PEG es inerte a las células y evita la unión inespecífica). La segunda capa es neutravidina-FITC, y la tercera capa es biotina-cRGD. Neutravidin-FITC une PLL-PEG-biotina y biotina-cRGD. Las plaquetas se unen a la biotina-cRGD a través de integrinas en la membrana plasmática. Derecha: Ilustración de la unión de biotina-avidina por integrinas plaquetarias. Las plaquetas ejercen fuerzas sobre el sustrato a través de la unión de la integrina-cRGD y rompen el enlace superior cRGD-biotina - neutravidina-FITC - o el enlace inferior neutravidin-FITC - PLL-PEG-BIOTINA - . La ruptura del enlace inferior entre la neutravidina-FITC y la biotina-PLL-PEG da lugar a una reducción de la señal fluorescente, mientras que la ruptura del enlace superior entre la biotina-cRGD y la neutravidina-FITC no lo hace. (C) Series temporales que muestran la migración de plaquetas y la depleción de los ligandos lábiles de cRGD. Las áreas de fluorescencia reducida indican las trayectorias de migración de las plaquetas (véase también la Figura 2A), y las áreas de fluorescencia aumentada indican la acumulación de FTIC-neutravidina-biotina-cRGD en las plaquetas migratorias. Barra de escala: 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Imagen de inmunofluorescencia de la migración plaquetaria codificada por el sustrato remodelado. (A) Secuencia de película representativa de la migración de plaquetas individuales. Izquierda: Imágenes de contraste de fase de plaquetas en migración. Las plaquetas se polarizan formando un laminipidio en el borde delantero y posteriormente migran. Derecha: La neutravidina-FITC se retiró del sustrato, dejando la "huella" de la migración plaquetaria. La ruptura de la cRGD-biotina-neutravidina-FITC se acumula en el centro de las plaquetas en migración. (B) Imágenes representativas de la migración plaquetaria en recubrimientos de ligando lábil cRGD-biotina-avidina. Superior: Las plaquetas teñidas con faloidina (Alexa FluorTM 594) mostraron una gran formación de laminupidio y una forma polarizada que recuerda a las plaquetas en migración. Las plaquetas migratorias rompen el enlace cRGD-biotina-neutravidina-FITC, generando vías de migración en el sustrato indicadas por la reducción de la señal FITC. Inferior: imagen recortada con mayor aumento. (C) Las huellas migratorias se dibujaron manualmente en Fiji con líneas amarillas. Barras de escala: 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: La proporción de PLL-PEG-biotina a PLL-PEG determina la migración y la forma de las plaquetas. (A) Imágenes representativas de plaquetas en recubrimientos de PLL-PEG-biotina al 1%, 2,5% y 10%, barra de escala: 5 μm. (B) Cuantificación de la adhesión plaquetaria, la eficiencia de migración y la distancia de migración, n = 4 experimentos independientes; Media/DE; ANOVA de un factor/Tukey; **p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001, ns: no significativo (C) Cuantificación de los descriptores de forma plaquetaria (área, perímetro, circularidad y relación de aspecto), n = 4 experimentos independientes; Media/Mín.-Máx.; ANOVA de un factor/Tukey; **p < 0,01; p < 0,001; P < 0,0001, ns: no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

En este protocolo, se presenta un procedimiento de recubrimiento de tres capas que consta de (1) un esqueleto PLL-PEG-biotina y (2) un enlazador neutravidina-FITC que facilita la unión de (3) biotina-cRGD (un ligando adhesivo) al esqueleto PLL-PEG-biotina (también ver Figura 1B) que permite un ajuste preciso de las propiedades mecánicas y adhesivas del sustrato variando la proporción de PLL-PEG-biotina a PLL-PEG y proporciona una fácil lectura basada en fluorescencia de la migración de plaquetas. Si bien este protocolo utiliza neutravidina conjugada con FITC y faloidina conjugada con Alexa Fluor 594 para rastrear la migración y la forma de las plaquetas, se pueden usar otras avidinas y faloidinas conjugadas con fluoróforos. Dado que todos los reactivos de recubrimiento, incluidos PLL-PEG, PLL-PEG-biotina, neutravidina-FITC y cRGD-biotina, así como los activadores de plaquetas están disponibles comercialmente, este experimento se puede realizar sin mucho esfuerzo adicional. El paso crítico es el tratamiento con plasma porque un tratamiento con plasma ineficiente conduce a una unión inadecuada de PLL-PEG/PLL-PEG-biotina al sustrato, lo que resulta en una falla de la adhesión y migración de las plaquetas. El rendimiento del limpiador de plasma es importante. En general, los limpiadores de plasma con generadores de 13,6 MHz funcionan mejor que los de 40 KHz o 100 KHz. Además, una fuente de plasma de oxígeno es más adecuada que el aire ambiente. Después de un tratamiento con plasma exitoso, los pasos de recubrimiento casi no son propensos a errores.

Se ha demostrado previamente que las plaquetas utilizan el modo de migración mesenquimatoso, que depende en gran medida de las adherencias del sustrato ^4,17. De manera análoga a los fibroblastos, las bajas densidades de ligandos impiden la migración, ya que las plaquetas luchan por adherirse al sustrato, mientras que las altas densidades de ligandos dificultan la migración al impedir la desunión de las adherencias firmes¹⁸ (Figura 3). A densidades intermedias, las plaquetas se adhieren, mientras que las fuerzas de tracción dependientes de la miosina IIA por enlace a la integrina siguen siendo suficientes para romper las adherencias. Cabe destacar que la alta afinidad entre la integrina α_IIbβ₃ y su ligando fibrina (ógeno) resulta en el desensamblaje de adherencias no a través de la liberación del ligando adhesivo, sino más bien a través de su ruptura o desprendimiento del sustrato subyacente, como células endoteliales in vivo o cubreobjetos in vitro ^4,6. La fuerza de liberación necesaria para separar el fibrinógeno del sustrato subyacente está fuertemente influenciada por propiedades físicas y (bio)químicas que a menudo son difíciles de controlar, lo que puede conducir a una variabilidad significativa en la eficiencia de la migración. El ensayo presentado aquí ofrece un enfoque reduccionista para abordar este problema. Sin embargo, la fuerza de rotura del enlace avidina-biotina está fijada en torno a 160 pN, por lo que se deben utilizar sensores de tensión más sofisticados, como los basados en un anclaje de ADN bicatenario, para estudiar la adhesión plaquetaria a regímenes de fuerza más bajos¹⁹.

Estudios previos encontraron que la migración de plaquetas está involucrada en la infección bacteriana y la inflamación vascular in vivo. En consecuencia, las plaquetas con defectos de migración, como la contractilidad de la miosina, la polimerización de la actina o la señalización de la integrina de afuera hacia adentro, muestran un deterioro en el aclaramiento de las bacterias y en la integridad vascular ^4,6,7. El ensayo presentado aquí es simple, estable y, por lo tanto, adecuado para el cribado de inhibidores moleculares pequeños y sus efectos sobre la migración plaquetaria. Proporciona una novedosa herramienta in vitro para explorar dianas terapéuticas en la inflamación o la trombosis.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Adenosina 5′-difosfato sódico sal (ADP)	Sigma-Aldrich	A2754
Alexa Fluor 594 faloidina	Thermofisher	A12381
Contador de sangre	Sysmex	XN-1000
Bottomless 6 canales sticky slide	IBIDI, sticky slides VI0.4	80608
Centrífuga	Eppendorf	5804
Microscopio confocal	Zeiss	LSM880
cyclo [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(Biotin-PEG-PEG)]	Péptido internacional	PCI-3697-PI
FACS tubos	Corning Brand
FITC conjugado neutravidina	Thermofisher	A2662
Formaldehído	Thermofisher	28908
Solución HEPES	Sigma-Aldrich	H0887
Microscopio de contraste de fase y epifluorescente	Olympus	IX83
Limpiador de plasma	Diener	116531
PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-biotina(50%)	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-biotina (50%)
Poli(L-lisina)- injerto de poli(etilenglicol) copolímero	Susos PLL	(20)-g[3.5]-PEG(2)
Sal sódica de prostaglandina I2 (PGI2)	Abcam	ab120912
Sonicador	BANDELIN	SONNOREX RK514M
Ttriton X-100 20% v/v	Cayman Chemical
U46619	Enzo Ciencias de la Vida	BML-PG023-0001)