Este protocolo describe el montaje de un sistema neumático para el suministro de aire presurizado a una aguja durante el proceso de biselado de la aguja. El protocolo describe con más detalle el proceso de biselado para crear agujas de microinyección afiladas y cómo medir el tamaño relativo de la abertura de la aguja.
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Artículo de método
Biselado húmedo de agujas de microinyección que utiliza presión de aire constante para obtener información sobre la apertura de la aguja
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Resumen
Resumen
Las agujas de microinyección son una herramienta fundamental en la entrega de reactivos de modificación del genoma, componentes CRISPR (ARN guía, proteína Cas9 y plantilla de donante) y componentes del sistema de transposones (plásmidos y ARNm de transposasa) en embriones de insectos en desarrollo. Las agujas de microinyección afiladas son particularmente importantes durante la administración de estos agentes modificadores, ya que ayudan a minimizar el daño al embrión que se inyecta, aumentando así la supervivencia de estos embriones en comparación con la inyección con agujas no biseladas. Además, el biselado de las agujas produce agujas que son más consistentes de una aguja a otra en comparación con las agujas abiertas rompiendo aleatoriamente la punta de la aguja al rozar la punta contra un objeto (el costado de un cubreobjetos, la superficie del embrión que se va a inyectar, etc.). El proceso de biselado húmedo de agujas de microinyección con aire a presión constante suministrado a la aguja permite a la persona que bisela la aguja saber cuándo la aguja está abierta (presencia de burbujas) y también da una indicación relativa de qué tan grande se ha creado una abertura de la aguja. El tamaño relativo de la abertura en la aguja se puede determinar ajustando la presión de aire suministrada a la aguja hasta que se alcance un equilibrio y las burbujas dejen de fluir desde la punta de la aguja. Cuanto menor sea la presión a la que se alcance el equilibrio, mayor será el tamaño de la aguja; y a la inversa, cuanto mayor sea la presión, menor será el tamaño de la aguja.
Introducción
La modificación genética de insectos es un proceso desarrollado originalmente en Drosophila por Rubin y Spradling, y a lo largo de los años, este proceso se ha modificado para crear modificaciones genéticas enotras especies. El proceso se basa en la entrega precisa de componentes de modificación microinyectados en embriones en una ventana de tiempo y lugar específicos dentro del embrión en desarrollo 2,3,4. Las agujas afiladas de microinyección son una herramienta crítica en el proceso de modificación genética de algunos insectos, como los mosquitos 4,5,6,7,8,9 y los flebótomos10, mientras que no son tan críticas para otros insectos, como los gusanos de seda11. Las agujas afiladas suelen ser un factor clave entre el éxito y el fracaso cuando se trata de crear un insecto modificado genéticamente 2,4. Por lo general, las agujas de vidrio microcapilar se extraen calentando el vidrio hasta el punto en que el vidrio se vuelve elástico, lo que permite que el capilar se convierta en una aguja de punta cerrada que se estrecha. Antes de que se pueda usar la aguja, debe abrirse de manera que se cree una punta afilada para la inyección. Tradicionalmente, las agujas se abren rozando suavemente la punta de la aguja contra algo (el borde de un portaobjetos, o el embrión, etc.) que hace que una pequeña cantidad de vidrio se desprenda de la punta, creando aleatoriamente una punta afilada 2,3. Un proceso un poco menos aleatorio es el biselado en seco, donde la aguja se baja rápidamente sobre una placa abrasiva giratoria ópticamente plana durante un corto período de tiempo, lo que hace que una pequeña cantidad de vidrio se desgaste de la punta de la aguja, creando una punta afilada. El biselado en seco es un poco menos aleatorio que rozar la punta de la aguja contra algo. El protocolo que se describe a continuación lleva el proceso de biselado un paso más allá al suministrar aire comprimido a la aguja que se está biselando y biselarla debajo de una capa líquida para que las burbujas sean visibles tan pronto como se abra la aguja. Este protocolo detalla un método para producir agujas de microinyección afiladas y confiables. El biselado debajo de una capa líquida es una mejora con respecto a la rotura aleatoria de la aguja como se describió anteriormente, y el biselado en seco porque el usuario recibe comentarios sobre el proceso de biselado, lo que le permite a la persona que bisela saber cuándo la aguja está abierta y qué tan grande es la abertura de la aguja. Conocer el tamaño relativo de la abertura de la punta de la aguja puede permitir a la persona que bisela crear agujas con diferentes tamaños de apertura. Varios tamaños de apertura de aguja tienen diferentes ventajas; Por ejemplo, los tamaños de abertura de aguja más grandes pueden acomodar mezclas de inyección de alta viscosidad, mientras que las agujas de apertura más pequeñas causan menos daño al embrión que se inyecta.
El aire se suministra a la aguja mediante un regulador y un sistema de tubos de uretano basado en un sistema de inyección modificado regulado por presión de aire2. Mientras que el aire se suministra a la aguja a una presión constante, la aguja se bisela bajo una capa de líquido. El proceso de biselado se compone de un proceso repetido de cinco pasos: 1) bajar la aguja a la superficie abrasiva, 2) permitir que la aguja se bisele durante un corto período de tiempo, 3) elevar la aguja lejos de la placa abrasiva mientras se mantiene debajo de la superficie de la capa líquida, 4) detener el giro de la placa abrasiva para verificar la aparición de burbujas. Si no hay burbujas, se repiten los pasos 1 a 4 hasta que aparezcan burbujas; 5) Una vez que las burbujas están presentes, la presión del aire se puede ajustar para determinar el tamaño relativo de la abertura de la aguja. Cuanto menor sea la presión necesaria para detener la formación de burbujas, mayor será la abertura en la punta de la aguja.
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Protocolo
NOTA: El protocolo que se describe a continuación utiliza el biselado microcapilar Sutter BV-10. Sin embargo, este protocolo puede ser modificado para su uso con cualquier modelo microcapilar biselado.
1. Montaje del regulador, manómetro y tubo de suministro de aire
- Corte una sección de tubo de uretano para la conexión desde el suministro de aire hasta la base del regulador (R; Sección 1, Figura 1). La longitud de esta sección dependerá de la distancia desde el suministro de aire hasta el regulador, que se ubicará junto a la biseladora.
- Deslice una abrazadera de manguera en el tubo de uretano, luego empuje un conector de manguera en el extremo del tubo. Asegúrese de que el conector de la manguera esté completamente insertado colocando el conector de la manguera contra una superficie dura. Mientras sostiene el tubo cerca del conector de la manguera, presione el tubo firmemente en la manguera hasta que el conector de la manguera esté completamente insertado. Juntos, la abrazadera de manguera y el conector de manguera forman la conexión HC (Figura 1).
- Deslice la abrazadera de la manguera hasta el extremo del tubo donde se inserta el conector de la manguera. Gire la abrazadera de la manguera sobre el extremo de la lengüeta insertada para que forme una conexión hermética.
- Atornille el conector de la manguera en la base del regulador (R) con la mano, luego termine de apretar la conexión con una llave pequeña. Asegúrese de que la conexión sea hermética pero no demasiado.
- En el puerto lateral del regulador, atornille un conector en T (T) con la mano, luego use una llave pequeña para terminar de apretar.
- Corte un pequeño trozo de tubo de uretano (Figura 1, Sección 2), de aproximadamente 3-5 cm de longitud. Coloque dos abrazaderas de manguera en la pieza de tubería, luego inserte un conector de manguera en cada extremo de la tubería y termine las conexiones (HC) como se describe en los pasos 1.2-1.4 para cada extremo del tubo.
- Atornille un extremo del tubo corto en la base del manómetro, luego termine de apretar con una llave como en el paso 1.5.
- Atornille el otro extremo del tubo corto en uno de los puertos del conector T (T) conectado al regulador en el paso 1.5.
- Corte una sección de tubo de uretano (Figura 1, Sección 3) para la conexión entre el regulador y el portaagujas (NH). El tamaño de esta sección dependerá de la distancia desde la biseladora hasta la ubicación del regulador.
- Coloque una abrazadera de manguera en la sección de la tubería, luego inserte un conector de manguera como se describe en los pasos 1.2-1.4.
- En el otro lado de esta sección del tubo, coloque el conector luer hembra (LC) que se suministra con el portaagujas (NH).
- Retire la abrazadera de retención y la arandela de nailon (Figura 2, f) del manipulador. La abrazadera de retención y la arandela están diseñadas para sostener solo un microcapilar de vidrio, no están diseñadas para sostener el peso adicional de un soporte de microcapilar, varilla roscada y tubo de suministro de aire.
- Corta un trozo rectangular de lámina de embalaje de goma de 1,5 cm x 2 cm para envolver la varilla roscada en la abrazadera del guardabarros de la bicicleta. Esto ayudará a sujetar la varilla roscada y el soporte de la aguja de forma más segura en la abrazadera del guardabarros de la bicicleta. Con dos alicates de punta fina, abra el clip del guardabarros de la bicicleta, doble la pieza rectangular de lámina de embalaje de goma sobre la varilla roscada a 3,5 cm de un extremo de la varilla para que forme una U sobre la varilla. Inserte la varilla roscada cubierta con lámina de goma en la abrazadera del guardabarros de la bicicleta abierta y use los alicates para cerrar la abrazadera alrededor de la varilla y la lámina de goma. Instale la abrazadera de bicicleta y el conjunto de varilla roscada en el perno del manipulador, reemplace la abrazadera de retención sin la arandela de nailon y apriete la abrazadera de retención hasta que sujete firmemente el conjunto de varilla roscada.
- Enhebre el portaagujas en la varilla roscada. Asegúrese de que el conector luer termine en una posición que no se atasque el tubo de uretano cuando esté conectado (Figura 2, g).
- Conecte el conector luer hembra al conector luer macho (Figura 2, g) del portaagujas (Figura 2, d).
- Conecte el extremo libre del tubo de la Figura 1, Sección 1 al suministro de aire (esta conexión variará según el suministro de aire utilizado). El suministro de aire debe ser limpio, seco y libre de residuos de aceite. El suministro de aire puede provenir de una fuente de aire doméstica o de un cilindro de gas, ya sea aire comprimido o nitrógeno.
2. Biselado de agujas de borosilicato
- Tire de las agujas de microinyección utilizando microcapilares de vidrio de borosilicato con los siguientes ajustes en el instrumento: Calor: 305, Fil: 4, Vel: 70, Del: 235, Pul: 160, con tiempo de bucle de 12.24.
- Ensamble el conjunto de esmerilado de acuerdo con las instrucciones del fabricante, que consta de la placa abrasiva y el anillo de retención con imanes12.
NOTA: Es posible que sea necesario envolver la placa abrasiva con una tira delgada de película transparente para evitar fugas prematuras de Photo-Flo (agente humectante) de la placa abrasiva. Esto solo es necesario si la solución de agente humectante se filtra prematuramente en el aceite del pedestal, lo que hace que la placa de molienda deje de girar. El agente humectante reduce el riesgo de marcas de secado en las agujas de vidrio después del biselado. El uso de un agente humectante no es crítico para el proceso de biselado, y el agua puede ser sustituida. - Coloque 10 gotas de aceite de pedestal sobre la superficie ópticamente plana del pedestal y coloque el conjunto de molienda encima. Inicie el conjunto de molienda.
- Encienda la fuente de luz para iluminar la superficie. Asegúrese de que la fuente de luz esté colocada detrás del biselado y brille en un ángulo de 45° con respecto a la placa abrasiva y la aguja. El ángulo de iluminación es necesario para que se vea fácilmente la sombra de la aguja. Con un aumento de 90x, gire el cabezal del microscopio en su lugar. Detenga brevemente el giro de la placa abrasiva y enfoque el microscopio en la superficie de la placa abrasiva.
- Agregue un 1% de agente humectante a la mecha hasta que la mecha esté completamente mojada. Agregue un 1% de agente humectante a la superficie de la placa abrasiva. Asegúrese de que el agente humectante cubra la superficie abrasiva pero no se derrame sobre el anillo de retención negro.
- Coloque la mecha prehumedecida sobre la superficie de la placa abrasiva mientras gira. Asegúrese de que la mecha esté en el lado izquierdo de la placa abrasiva (mientras mira hacia abajo desde la parte superior) y se extienda desde las 11 en punto hasta las 6 en punto (con la placa como esfera de reloj). Asegúrese de que la mecha no se monte en la parte negra del anillo de retención.
- Inserte una aguja en el portaagujas (Figura 2, d) y apriete el anillo de retención para mantener la aguja en su lugar. Abra el regulador (Figura 1, R) y aumente la presión a 24 psi.
- Levante el soporte de la aguja girando la perilla de ajuste del curso (Figura 2, a) Asegúrese de que la aguja esté lo suficientemente alta como para que esté más alta que la superficie de la placa abrasiva giratoria, luego gire todo el manipulador para que la aguja gire en su lugar por encima de la placa abrasiva giratoria. La aguja a biselar debe colocarse sobre la placa abrasiva giratoria orientada de tal manera que la rotación de la placa se aleje de la punta de la aguja (Figura 3A)
- Mirando desde un lado, use la perilla de ajuste grueso (Figura 2, a) para bajar la aguja hacia la superficie de la placa abrasiva. Deténgase cuando la aguja esté casi tocando la superficie del líquido.
- Utilice el zoom para reducir el aumento del microscopio y, a continuación, mueva el microscopio de modo que la aguja quede en el centro del campo de visión. Una vez en el centro de visión, aumente el aumento, ajustando la posición del manipulador para que la punta de la aguja permanezca en el centro de visión. Una vez que haya alcanzado el aumento máximo, detenga la placa de molienda y enfoque el microscopio en la superficie de la placa abrasiva, luego reinicie inmediatamente la rotación de la placa una vez que la superficie esté enfocada. Es posible que la aguja no esté a la vista en este punto.
- Con la perilla de ajuste grueso del manipulador, baje la aguja hacia la placa abrasiva. En el campo de visión, se verá una imagen de la aguja y una sombra de la aguja. Cuando la aguja y la(s) sombra(s) de la aguja estén cerca de tocarse, cambie a la perilla de ajuste fino del manipulador y continúe bajando la aguja hasta que la aguja y su(s) sombra(s) parezcan tocarse. En este punto, lea el calibrador (Figura 2, c) y anote la lectura. La superficie de la placa abrasiva está en o por debajo de esta lectura de calibre.
NOTA: Es difícil ver cuando la aguja toca la superficie de la placa abrasiva giratoria, por lo que es posible que la aguja no esté tocando la placa abrasiva en este punto. - Deje que la aguja permanezca en este nivel de lectura del calibre durante 5-10 s.
- Con la perilla de ajuste fino del manipulador, levante la aguja, asegurándose de que permanezca debajo de la superficie del agente humectante. Detenga la rotación de la placa abrasiva durante unos segundos y observe si se escapan burbujas de la punta de la aguja. Si hay burbujas, continúe con el paso 2.15. Si no hay burbujas, continúe con el paso 2.14.
- Mueva la aguja de regreso a la lectura de la pinza usando la perilla de ajuste fino del manipulador, luego muévala un poco más abajo y tome una nueva lectura de la pinza, luego repita los pasos 2.12-2.13.
- Vuelva a encender la placa abrasiva para ver si se observa la formación de burbujas mientras la placa está girando. Si la evidencia de formación de burbujas es visible durante la rotación de la placa, es probable que la abertura de la punta de la aguja sea demasiado grande para microinyecciones de embriones sensibles, como las inyecciones de embriones de mosquitos. Si la formación de burbujas no es visible durante la rotación de la placa abrasiva, entonces la abertura de la aguja es ideal para su uso en procedimientos que requieren una aguja de apertura afilada y pequeña.
- Utilice la perilla de ajuste del curso del manipulador para elevar la aguja por encima de la placa abrasiva a una posición que esté lo suficientemente alta por encima de la placa para que la aguja no golpee nada mientras se gira todo el manipulador para alejar la aguja de la placa abrasiva y el microscopio.
- Una vez que la aguja esté en una posición en la que se pueda quitar sin golpear nada, baje la presión del aire a cero, retire la aguja y colóquela en una caja de almacenamiento de agujas (una placa de Petri con cinta adhesiva de doble palo o arcilla para modelar para sostener las agujas biseladas) hasta su uso.
3. Determinación del tamaño relativo de la abertura de la aguja biselada
NOTA: La determinación de los tamaños relativos de apertura de la aguja biselada se realiza en el paso 2.13. Los pasos a continuación describen este proceso con más detalle.
- Una vez que se observan burbujas en el paso 2.13, con la placa abrasiva sin girar, disminuya lentamente la presión de aire girando la perilla de ajuste del regulador (Figura 1, R) hasta que las burbujas dejen de fluir desde la punta de la aguja. Fíjate en la presión a la que las burbujas dejan de fluir de la punta.
- Aumente la presión del aire hasta que las burbujas vuelvan a fluir de la punta de la aguja. Cuanto mayor sea la presión, menor será la abertura de la aguja.
- Proceda a mover la aguja a una posición en la que se pueda extraer de forma segura, pasos 2.16-2.17.
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Resultados
El procedimiento descrito anteriormente produce agujas de microinyección consistentemente afiladas. Las agujas afiladas se caracterizan por ser capaces de insertarse en embriones blandos de insectos corion, como los embriones de mosquitos, con poca o ninguna resistencia de la membrana embrionaria. Cuando los embriones de mosquito se microinyectan para la modificación genética, la membrana embrionaria es relativamente elástica. Empujar una aguja desafilada contra la membrana del embrión hará que se hunda (
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Discusión
La modificación genética de los mosquitos se basa en la microinyección precisa de los materiales de modificación (plásmidos, ARN guía o proteínas) en embriones pre-blastodermo 3,4,5,6,7,8. Cruciales para este proceso son las agujas afiladas que perforan fácilmente el embrión durante la inyecc...
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Divulgaciones
El autor no tiene nada que revelar.
Agradecimientos
El autor desea agradecer a las siguientes personas. El personal del Centro de Transformación de Insectos de la Universidad de Maryland: Channa Aluvihare, Robert Alford y Daniel Gay. Sin su dedicado trabajo, el Centro de Transformación de Insectos no existiría. Vanessa Meldener-Harrell por la revisión de este manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microcapilares de diámetro exterior de 1,0 mm | World Precision Instruments Aceite | ||
| pedestal biselador | Sutter Instruments | 008 | |
| Clip de guardabarros de bicicleta | VeloOrange | R-clip Paquete de 4 | https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack |
| Microscopio de soporte de brazo | AmScope | AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Microscopio estereoscópico o | |
| equivalente BV-10 Biseladora | Sutter Instruments | BV-10 | |
| Placa abrasiva de diamante | Sutter Instruments | 104F | Placa abrasiva de diamante - extrafina (tamaños de punta de 0,2 y micro; a 1,0 y micro) |
| Junta, Buna-N | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | 11761-2-pkg | Se utiliza para sellar la conexión en conectores T o L, si aún no está incluido con estas piezas |
| Abrazadera de manguera | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | 5000-2-pkg | |
| Conector de manguera | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | CT4-pkg | Necesita 5 conectores de manguera Portaagujas |
| microinyección | World Precision Instruments | MPH3-10 | Portaagujas para microcapilares de 1 mm de diámetro exterior |
| P-2000 | Sutter Instruments | Cualquier extractor de agujas | |
| Photo-Flo 200 Solution | B& H Foto, Vídeo y Audio | BH #KOPF200P MFR #1464510 | agente humectante |
| Manómetro | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | PG-100 | Calibre de 0-100 psi |
| Mecha de referencia | Sutter Instruments | X050300 | |
| Soporte de mecha de referencia | Sutter | ||
| Regulador | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | 01-Mar | Necesidad de puertos #10-32 para conexiones Hoja de |
| embalaje de caucho 6 inx 6 en | Danco | Modelo # 59849 | |
| T fitting | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | 15002-2-pkg | |
| Barra | Ya sea una varilla roscada o una barra con extremo roscado. Los subprocesos deben ser 10-32. | ||
| Tubo de uretano | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | URH1-0804-BLT-050 |
Referencias
- Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable Element Vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
- O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W. Transformation systems in insects. Methods Mol Biol. 260, 227-254 (2004).
- Handler, A. M., James, A. A. Insect Transgenesis: Methods and Applications. , CRC Press. Boca Rato. (2000).
- Harrell, R. A. Mosquito embryo microinjection. Cold Spring Harbor Protocols. , 10.1101/pdb.prot107686 (2023).
- Allen, M. L., O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. Stable, germ-line transformation of Culex Quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 38 (5), 701-710 (2001).
- Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Mol Biol. 10 (6), 597-604 (2001).
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- Perera, O. P., Harrell, R. A., Handler, A. M. Germ-line transformation of the South American malaria vector, Anopheles albimanus, with a piggyBac/EGFP transposon vector is routine and highly efficient. Insect Mol Biol. 11 (4), 291-297 (2002).
- Harrell, R. A. Mosquito embryo microinjection under halocarbon oil or in aqueous solution. Cold Spring Harb Protoc. , 10.1101/pdb.prot108203 (2023).
- Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. CRISPR/Cas9 mutagenesis in Phlebotomus papatasi: The immune deficiency pathway impacts vector competence for Leishmania major. mBio. 10 (4), e01941(2019).
- Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat Biotechnol. 18 (1), 81-84 (2000).
- BV-10 Micropipette Beveler Operation Manual Rev. 3.00. , Available from: https://www.manualslib.com/manual/2073788/Sutter-Instrument-Bv-10.html (2018).
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Reimpresiones y permisos
