Aislamiento de mitocondrias para el análisis de supercomplejos mitocondriales a partir de muestras de pequeños tejidos y cultivos celulares

Summary

Este protocolo describe una técnica para el análisis de supercomplejos respiratorios cuando solo se dispone de pequeñas cantidades de muestras.

Abstract

A lo largo de las últimas décadas, la evidencia acumulada sobre la existencia de supercomplejos respiratorios (SCs) ha cambiado nuestra comprensión de la organización de la cadena de transporte de electrones mitocondrial, dando lugar a la propuesta del "modelo de plasticidad". Este modelo postula la coexistencia de diferentes proporciones de SCs y complejos en función del tejido o del estado metabólico celular. La naturaleza dinámica del ensamblaje en las SC permitiría a las células optimizar el uso de los combustibles disponibles y la eficiencia de la transferencia de electrones, minimizando la generación de especies reactivas de oxígeno y favoreciendo la capacidad de las células para adaptarse a los cambios ambientales.

Más recientemente, se han descrito anomalías en el ensamblaje de SC en diferentes enfermedades como trastornos neurodegenerativos (enfermedad de Alzheimer y Parkinson), síndrome de Barth, síndrome de Leigh o cáncer. El papel de las alteraciones del ensamblaje de las SC en la progresión de la enfermedad aún debe confirmarse. Sin embargo, la disponibilidad de cantidades suficientes de muestras para determinar el estado del ensamblaje SC es a menudo un desafío. Esto sucede con biopsias o muestras de tejido que son pequeñas o que deben dividirse para múltiples análisis, con cultivos celulares que tienen un crecimiento lento o provienen de dispositivos microfluídicos, con algunos cultivos primarios o células raras, o cuando se debe analizar el efecto de tratamientos costosos particulares (con nanopartículas, compuestos muy caros, etc.). En estos casos, se requiere un método eficiente y fácil de aplicar. En este trabajo se presenta un método adaptado para obtener fracciones mitocondriales enriquecidas a partir de pequeñas cantidades de células o tejidos para analizar la estructura y función de las SC mitocondriales mediante electroforesis nativa seguida de ensayos de actividad in-gel o western blot.

Introduction

Los supercomplejos (SC) son asociaciones supramoleculares entre complejos de cadenas respiratorias individuales ^1,2. A partir de la identificación inicial de las SC y la descripción de su composición por el grupo de Schägger ^2,3, posteriormente confirmada por otros grupos, se estableció que contienen complejos respiratorios I, III y IV (CI, CIII y CIV, respectivamente) en diferentes estequiometrías. Se pueden definir dos poblaciones principales de SC, las que contienen CI (y CIII solo o CIII y CIV) y con un peso molecular muy alto (MW, comenzando ~1,5 MDa para las SC más pequeñas: CI + CIII₂) y las que contienen CIII y CIV pero no CI, con un tamaño mucho menor (como CIII₂ + CIV con ~680 kDa). Estas SC coexisten en la membrana mitocondrial interna con complejos libres, también en diferentes proporciones. Así, mientras que el CI se encuentra principalmente en sus formas asociadas (es decir, en las SC: ~80% en el corazón bovino y más del 90% en muchos tipos de células humanas)³, el CIV es muy abundante en su forma libre (más del 80% en el corazón bovino), con CIII mostrando una distribución más equilibrada (~40% en su forma libre más abundante, como un dímero, en corazón bovino).

Si bien su existencia es ahora generalmente aceptada, su papel preciso sigue siendo objeto de debate 4,5,6,7,8,9,10. De acuerdo con el modelo de plasticidad, pueden existir diferentes proporciones de SCs y complejos individuales dependiendo del tipo de célula o del estado metabólico ^1,7,11. Esta naturaleza dinámica del ensamblaje permitiría a las células regular el uso de los combustibles disponibles y la eficiencia del sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS) en respuesta a los cambios ambientales ^4,5,7. Las SC también podrían contribuir al control de la tasa de generación de especies reactivas de oxígeno y participar en la estabilización y renovación de complejos individuales 4,12,13,14. Se han descrito modificaciones del estado de ensamblaje del SC en asociación a diferentes situaciones fisiológicas y patológicas^15,16 y al proceso de envejecimiento¹⁷.

Así, se han descrito cambios en los patrones de SC en levaduras dependiendo de la fuente de carbono utilizada para el crecimiento² y en células de mamíferos cultivadas cuando la glucosa es sustituida por galactosa⁴. También se han reportado modificaciones en el hígado de ratón después del ayuno⁸ y en los astrocitos cuando se bloquea la oxidación de los ácidos grasos mitocondriales¹⁸. Además, se ha encontrado una disminución o alteraciones de las SC y OXPHOS en el síndrome de Barth¹⁹, la insuficiencia cardíaca²⁰, varios trastornos metabólicos²¹ y neurológicos 22,23,24 y diferentes tumores 25,26,27,28 . Todavía se investiga si estas alteraciones en el ensamblaje y los niveles de SC son una causa primaria o representan efectos secundarios en estas situaciones patológicas^15,16. Diferentes metodologías pueden dar información sobre el ensamblaje y la función de los SC; Estos incluyen mediciones de actividad ^8,29, análisis ultraestructural^30,31 y proteómica^32,33. Una alternativa útil que se está empleando cada vez más y que es el punto de partida de algunas de las metodologías mencionadas anteriormente es la determinación directa del estado de ensamblaje de SC mediante electroforesis nativa azul (BN) desarrollada para este fin por el grupo de Schägger^34,35.

Este enfoque requiere procedimientos reproducibles y eficientes para obtener y solubilizar las membranas mitocondriales y puede complementarse con otras técnicas como el análisis de actividad en gel (IGA), la electroforesis de segunda dimensión y el western blot (WB). Una limitación en los estudios sobre la dinámica de las SC mediante electroforesis BN puede ser la cantidad de células de partida o muestras de tejido. Presentamos una serie de protocolos para el análisis del ensamblaje y la función de las SC, adaptados de los métodos del grupo de Schägger, que se pueden aplicar a muestras de células o tejidos frescos o congelados a partir de tan solo 20 mg de tejido.

Protocol

NOTA: La composición de todos los medios de cultivo y tampones se especifica en la Tabla 1 y los detalles relacionados con todos los materiales y reactivos utilizados en este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Aislamiento de mitocondrias a partir de cultivos celulares

NOTA: El volumen mínimo de células analizadas ha sido de ~30-50 μL de células empaquetadas (paso 1.4). Esto puede corresponder aproximadamente a al menos dos o tres placas de cultivo celular de 100 mm o a una placa de 150 mm al 80-90% de confluencia, dependiendo del tipo de célula (entre 5 × 10⁶ y 10⁷ células en células derivadas de L929 o MDA-MB-468). La rotura eficiente de las células es un paso crítico.

1. Cultive células adherentes hasta aproximadamente un 80% de confluencia o células suspendidas hasta una densidad adecuada.
2. Recolección de células por centrifugación a 500 × g durante 5 min (directamente de la suspensión celular en el caso de células no adherentes o después de la tripsinización estándar con una solución de tripsina-EDTA al 0,05% de tripsina y 0,02% de EDTA en 1x PBS, en el caso de células adherentes).
3. Lavar las células 2x con PBS frío 1x y sedimentarlas por centrifugación a 500 × g durante 5 min.
   NOTA: A partir de este punto, todos los pasos deben realizarse a 4 °C. Por lo tanto, todos los reactivos deben estar fríos y los tubos que contienen células o mitocondrias deben mantenerse en hielo.
4. Después de la segunda centrifugación, deseche el sobrenadante, estime el volumen de gránulos celulares (cpv) y congele las células a -80 °C durante al menos 15 minutos para facilitar la ruptura de la membrana en el paso 1.8.
   NOTA: El protocolo se puede detener en este punto y las celdas se pueden almacenar a -80 °C durante semanas. Por lo general, son apropiados tubos graduados de 10 o 15 mL con fondos cónicos.
5. Deje que las células se descongelen lentamente sobre hielo.
6. Vuelva a suspender el pellet de celda empaquetada en un volumen de tampón hipotónico igual a 7 veces el cpv (10 mM de MOPS, 83 mM de sacarosa, pH 7,2) (por ejemplo, 100 μL de células empaquetadas en 700 μL de tampón).
   NOTA: El volumen debe ser suficiente para obtener pops eficientes (ver NOTA en el paso 1.8).
7. Transfiera la suspensión celular a un homogeneizador Potter-Dounce del tamaño adecuado y deje que las células se hinchen incubándolas en hielo durante 2 minutos. Por ejemplo, para un volumen de 700-800 μL de suspensión celular, un homogeneizador de capacidad de 1 mL es adecuado.
8. Rompa las membranas celulares realizando de ocho a diez golpes en el homogeneizador acoplado a un mortero de teflón accionado por motor que gira a 600 rpm.
   NOTA: Al realizar los trazos, es importante crear un vacío que aumente la eficiencia de la rotura celular junto con las acciones hipotónicas y de congelación para hinchar y fragilizar las membranas, respectivamente. Si está bien hecho, se escuchará un sonido de "pop" al tirar hacia abajo del homogeneizador con un movimiento rápido en cada golpe.
9. Añadir el mismo volumen de tampón hipertónico a la suspensión celular (7 veces el cpv) (30 mM MOPS, 250 mM de sacarosa, pH 7,2) para generar un ambiente isotónico.
10. Transfiera el homogeneizado a un tubo de 10-15 ml y centrifuga en un rotor fijo a 1.000 × g durante 5 min a 4 °C.
    NOTA: El tubo original que contiene las células intactas se puede utilizar para este propósito.
11. Transfiera el sobrenadante, que contiene la fracción mitocondrial, a tubos de polipropileno de 1,5 mL.
12. OPCIONAL: Para aumentar el rendimiento de las mitocondrias, vuelva a suspender el pellet del paso 1.10 en 7 veces el volumen del pellet celular del tampón A (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,32 M de sacarosa, pH 7,4) pipeteando hacia arriba y hacia abajo y centrifugar a 1.000 × g durante 5 min a 4 °C. Combine el nuevo sobrenadante con el anterior antes de continuar con el paso 1.13.
13. Centrifugar en una microfuga a 16.000 × g durante 2 min a 4 °C para recoger la fracción bruta mitocondrial.
14. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender cada gránulo enriquecido con mitocondrias con 0,5 ml de tampón A, combinando el contenido de dos tubos en uno y centrifugando en las mismas condiciones descritas en el paso 1.13. Repita el mismo proceso hasta que todo el material esté en un solo tubo.
15. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet final con 300 μL de tampón A y cuantifique la concentración de proteínas mitocondriales mediante el ensayo de Bradford. Vuelva a centrifugar como antes y continúe con la sección 3.

2. Aislamiento de mitocondrias a partir de pequeñas cantidades de tejidos animales

NOTA: La cantidad mínima de tejido para aplicar este protocolo con cierta confianza depende del tipo de célula y su abundancia mitocondrial, pero podría ser de ~ 20-30 mg de tejido para la mayoría de los casos. Las muestras de tejido pueden ser material fresco o muestras congeladas. En este último caso, deje que las muestras se descongelen en un tampón de homogeneización colocado en hielo antes de comenzar el procedimiento.

1. Pesar o estimar lo más fielmente posible la cantidad (mg) de tejido.
2. Cortar el pañuelo con unas tijeras y hacer 3-4 lavados en tampón de homogeneización con la ayuda de un colador teniendo cuidado de no perder los trozos más pequeños.
   NOTA: Este paso es más importante en tejidos como el músculo esquelético o el corazón que en el cerebro o tejidos más blandos cuyas células se pueden desagregar fácilmente directamente mediante el paso de homogeneización.
3. Añadir medio de homogeneización fresco (4 mL por gramo de hígado, 10 mL por gramo de corazón, tejido adiposo marrón (BAT) o músculo, y 5 mL por gramo de cerebro o riñón; ver composición tampón específica para cada caso en la Tabla 1).
4. Transfiera los trozos de tejido con tampón al homogeneizador y siga el protocolo óptimo de homogeneización y aislamiento de mitocondrias en función del tejido seleccionado.
5. Aislamiento de mitocondrias del hígado, el bazo y el riñón
   1. Homogeneizar con cuatro a seis golpes de subida y bajada en el Elvehjem-Potter con un mortero de teflón accionado por motor a 600 rpm.
   2. Transfiera el tejido homogeneizado a un tubo centrífugo estéril. Centrífuga en un rotor oscilante a 1.000 × g durante 5 min a 4 °C.
   3. Llene tubos de polipropileno de 1,5 mL con el sobrenadante obtenido en el paso anterior. Centrifugar durante 2 min a 16.000 × g en un microfófugo a 4 °C y proceder a continuación como se ha descrito anteriormente (pasos 1.13 a 1.15)
6. Aislamiento de mitocondrias a partir de muestras de corazón y músculo
   1. Homogeneizar con seis a ocho golpes en el Elvehjem-Potter con un mortero de teflón accionado por motor a 600 rpm. Transfiera el tejido homogeneizado a un tubo centrífugo estéril.
   2. Centrífuga en un rotor oscilante a 1.000 × g durante 5 min a 4 °C. Vierta el sobrenadante en tubos limpios de polipropileno de 1,5 mL.
      NOTA: Se puede realizar una segunda homogeneización del pellet obtenida en el paso 2.6.2 con 4-5 golpes adicionales y 1/2 volumen de tampón de homogeneización para aumentar el rendimiento mitocondrial. El nuevo sobrenadante (después de la centrifugación de nuevo a 1.000 × g durante 5 min a 4 °C) puede combinarse con el anterior antes de continuar con el paso 2.6.3. Una alternativa para aumentar el rendimiento bruto de mitocondrias es disociar muestras de tejido cardíaco y muscular en solución de tripsina antes de la homogeneización^36,37. En este caso, la tripsina debe inactivarse/eliminarse de manera eficiente antes de que las membranas mitocondriales se solubilicen con digitonina (paso 3.2).
   3. Centrifugar a 16.000 × g en una microfuga durante 2 min a 4 °C para obtener la fracción mitocondrial bruta.
   4. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender cada gránulo enriquecido con mitocondrias con 0,5 mL de tampón AT, combinando el contenido de dos tubos en uno y centrifugando en las mismas condiciones descritas en el paso 2.6.3. Repita el mismo proceso hasta que todo el material esté en un solo tubo.
   5. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet final con 300 μL de tampón A (sin BSA) y cuantifique la concentración de proteínas mitocondriales mediante el ensayo de Bradford. Vuelva a centrifugar como antes y continúe con la sección 3.
7. Aislamiento de mitocondrias del cerebro
   1. Homogeneice las piezas del cerebro con 10-15 golpes utilizando un homogeneizador de vidrio tipo Dounce con un mortero de vidrio accionado manualmente. Transfiera el tejido homogeneizado a un tubo centrífugo estéril.
   2. Centrífuga en un rotor oscilante a 1.000 × g durante 5 min a 4 °C.
   3. Recoja el sobrenadante en un tubo de centrífuga limpio.
   4. Resuspender el pellet obtenido en la etapa de centrifugación anterior en el mismo volumen de medio AT utilizado en la primera homogeneización. Vuelva a homogeneizar el pellet repitiendo el proceso descrito en el paso 2.7.1 utilizando de 5 a 10 pasadas y centrifugar la suspensión en un rotor oscilante a 1.000 × g durante 5 min a 4 °C.
   5. Retire el sobrenadante y añádalo al tubo preparado en el paso 2.7.3. Centrífuga a 10.000 × g en un rotor de ángulo fijo durante 10 min a 4 °C para obtener la fracción mitocondrial bruta.
   6. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1/2 del volumen de homogeneización inicial (paso 2.7.1) del medio AT. Distribuir la suspensión mitocondrial en tubos limpios de polipropileno de 1,5 mL y centrifugar a 16.000 × g en un microfuge durante 2 min a 4 °C.
   7. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender cada gránulo enriquecido con mitocondrias con 0,5 ml de tampón AT, combinando el contenido de dos tubos en uno y centrifugando en las mismas condiciones que se describen en el paso 2.7.6. Repita el mismo proceso hasta que todo el material esté en un solo tubo.
   8. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet final con 300 μL de tampón A (sin BSA) y cuantifique la concentración de proteínas mitocondriales mediante el ensayo de Bradford. Vuelva a centrifugar como antes y continúe con la sección 3.
8. Aislamiento de mitocondrias a partir de BAT
   1. Homogeneizar con ocho a diez golpes de subida y bajada en el Elvehjem-Potter con un mortero de teflón accionado por motor a 600 rpm. Transfiera el tejido homogeneizado a un tubo centrífugo estéril.
   2. Centrífuga en un rotor oscilante a 1.000 × g durante 5 min a 4 °C.
   3. Llene tubos de polipropileno de 1,5 mL con el sobrenadante obtenido en el paso anterior evitando la capa superior de grasa.
      NOTA: Se puede realizar una segunda homogeneización del pellet obtenida en el paso 2.8.2 para aumentar el rendimiento mitocondrial. El nuevo sobrenadante (después de la centrifugación de nuevo a 1.000 × g durante 5 min a 4 °C) puede combinarse con el anterior antes de continuar con el paso 2.8.4.
   4. Centrifugar durante 2 min a 16.000 × g durante 2 min en una microfuga a 4 °C.
   5. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender cada gránulo enriquecido con mitocondrias con 0,5 ml de tampón AT2, combinando el contenido de dos tubos en uno y centrifugando en las mismas condiciones descritas en el paso 2.8.4. Repita el mismo proceso hasta que todo el material esté en un solo tubo.
   6. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet final con 300 μL de tampón A (sin BSA) y cuantifique la concentración de proteínas mitocondriales mediante el ensayo de Bradford. Vuelva a centrifugar como antes y continúe con la sección 3.

3. Preparación de muestras para el análisis de Blue Native

1. Resuspender las fracciones mitocondriales (obtenidas de cultivos o tejidos celulares de mamíferos) en tampón de muestra BN (50 mM de NaCl, 50 mM de Imidazol, 5 mM de ácido aminocaproico, 4 mM de PMSF) para obtener una concentración de proteína de alrededor de 10 mg/mL. Consulte la Tabla 2 para conocer los rendimientos esperados para los diferentes tipos de muestras.
2. Solubilizar las membranas mitocondriales mediante la adición de digitonina (solución madre al 10%) para obtener una proporción de 4 g de digitonina/g de proteína mitocondrial (4 μL de digitonina 10% de stock por 10 μL de la suspensión mitocondrial preparada en el paso 3.1).
   NOTA: La relación detergente/proteína (g/g) debe optimizarse para cada tipo de muestra para obtener resultados reproducibles; Se encontró que 2-8 g de digitonina/g de proteína mitocondrial era óptimo para la mayoría de los tejidos ^34,35.
3. Mezcle pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Incubar las muestras en hielo durante 5 min.
   NOTA: Después de este paso, la suspensión mitocondrial debería volverse más clara (cambiar de opaca a translúcida); de lo contrario, podría indicar que la cantidad de detergente es insuficiente para una correcta solubilización de la membrana.
4. Centrifugar a toda velocidad en una microfuga (20.000 × g aprox.) durante 25 min a 4 °C para eliminar el material insoluble.
5. Recoja el sobrenadante en un tubo nuevo. Añadir al sobrenadante un volumen de 5% G-250 (Coomassie Blue G-250 5% en ácido aminocaproico 0,75 M) equivalente a 1/3 del volumen de resuspensión inicial (paso 3.1, esto correspondería a una proporción final de 1,6 g de Coomassie/g de proteína) y mezclar por pipeteo.
6. Mantener en hielo antes de cargar en el gel o congelar las alícuotas a -80 °C.

4. Electroforesis en gel Blue Native

NOTA: La electroforesis se realiza en la cámara frigorífica (4-8 °C). Si no hay una instalación de cámara frigorífica, se puede introducir un bloque de enfriamiento en el tanque de electroforesis. Se utilizan geles comerciales de poliacrilamida nativa^{al 3-13% 29}, pero también se pueden utilizar geles caseros de las concentraciones de gradiente deseadas^38,39.

1. Cargue las cámaras superior e inferior con los amortiguadores de cátodo frío A y ánodo, respectivamente. Alternativamente, cargue las muestras en los pocillos antes de llenar cuidadosamente la cámara superior con tampón catódico A.
   NOTA: En nuestro laboratorio se utilizan tampones de electroforesis comerciales, pero se pueden preparar como se indica en la Tabla 1.
2. Carga entre 30 y 100 μg de proteína mitocondrial.
   NOTA: Por lo general, se cargan 30-50 μg de proteína (para WB), o 40-100 μg de proteína (para IGA) por pocillo en un gel de 10 carriles (pocillos de 0,5 x 0,15 cm). El tampón del cátodo A contiene Coomassie Blue G-250 y tiene un color azul intenso que dificulta la visión de los pocillos de gel para la carga de muestras. Es conveniente marcar el centro de cada pocillo, con un rotulador rojo, por ejemplo, para ayudar a colocar la punta de la pipeta durante este paso. Los marcadores de peso molecular nativos pueden ser útiles a la hora de configurar la técnica BN-PAGE para confirmar que los geles de gradiente están formados correctamente y que el patrón de complejos y SCs es el correcto.
3. Ejecute a 80-100 V durante 25-30 min y luego a 160-180 V, limitando la corriente a 12 mA / gel, hasta que el tinte llegue al fondo del gel (~125-165 min en total).
4. Si se van a realizar ensayos de actividad en gel (IGA), sustituya el tampón catódico A por el tampón catódico B cuando el frente del colorante esté en el centro del gel (~1 h después del comienzo de la ejecución).
   NOTA: Aunque los geles se pueden documentar sin ninguna tinción justo después de la corrida, ya que algunas bandas son visibles (principalmente el complejo V, que puede considerarse un fabricante "interno" con un MW de ~ 600 kDa) debido a su unión al colorante G-250, por lo general, los SC y los complejos individuales no serán visibles sin tinción o ensayos de IGA. Los geles que se utilizarán en los ensayos de IGA o para WB no deben mancharse ni fijarse.
5. Desmonte el gel del casete y continúe con la tinción con azul de Coomassie (sección 5), el análisis de IGA (sección 6) o la inmunodetección de WB (sección 7).

5. Tinción en gel

1. Teñir el gel durante 10-15 min a temperatura ambiente (RT) utilizando soluciones de colorante azul de Coomassie (colorante Coomassie R-250 al 0,25% en metanol al 40%, ácido acético al 10%; tinción durante 10-15 min).
2. Decolorar con varios lavados (normalmente 4-5 x 15 min) en 40% de metanol más 10% de ácido acético en RT.
3. Documenta el gel.

6. Ensayos de actividad en gel (IGA)

1. Preparar soluciones de IGA para el análisis de los diferentes complejos respiratorios antes del final de la electroforesis y mantenerlas en la oscuridad (utilizando cajas de plástico de color oscuro o cubriéndolas con papel de aluminio, por ejemplo). La composición de cada búfer se detalla en la Tabla 1.
2. Coloque el gel o los carriles a utilizar en una caja de plástico lo más pequeña posible para acomodarlo.
3. Agregue suficiente volumen de la solución adecuada para cubrir el gel (generalmente 5 o 10 mL para 5 o 10 carriles de gel, respectivamente) e incube a RT con agitación suave (60-80 rpm) y lejos de la luz.
   NOTA: El tiempo de incubación depende del complejo a analizar y de la naturaleza y cantidad de muestra cargada; CI y CIV son los más fáciles y rápidos de dar resultados. Por lo tanto, la actividad de CI generalmente comenzará a hacerse visible después de unos minutos, mientras que CII y CIV necesitan ~ 30 min para ser observados y CV ~ 1.5-2 h. La reacción puede continuar durante horas en todos los casos y la tasa de intensificación de la señal puede reducirse trasladando la incubación a una cámara frigorífica (4-6 °C), por ejemplo, para una incubación nocturna (ON). La actividad CIII funciona solo para la electroforesis nativa clara (CN), no para BN³⁴.
4. Cuando se hayan desarrollado las bandas apropiadas, detenga las reacciones retirando las soluciones de ensayo, lavando 2 veces con agua destilada y fijando el gel con un 40% de metanol más un 10% de ácido acético (excepto para el CV que se fija solo con metanol) durante 30 min.
   1. Para analizar la actividad de CIV después de la detección de CI por IGA, lavar el gel 2 veces con agua destilada, documentar la actividad de CI, incubar el gel (¡sin fijarlo!) con 50 mM de tampón de fosfato de potasio (pH 7,2) 2 veces durante 30 min, y luego con el tampón de reacción CIV completo hasta que aparezcan las bandas IV complejas (generalmente incubando ON a RT o 4 °C).
5. Documenta los geles.
   NOTA: Para la actividad de ATPasa, como las bandas desarrolladas son blancas, al documentar el gel, colóquelo sobre un fondo oscuro para que las bandas transparentes sean visibles.

7. Análisis de Western blot

1. Prepare el tampón de transferencia de acuerdo con la Tabla 1 y manténgalo a 4 °C hasta el final de la electroforesis.
2. Coloque el gel en una bandeja y agregue el tampón de transferencia. Incubar en RT durante 10-15 min.
3. Cortar un trozo de membrana de PVDF del mismo tamaño que el gel y activarlo en metanol durante 10 s bajo agitación. Lavar varias veces con agua destilada y agregar tampón de transferencia. Incubar en RT durante 10-15 min agitando suavemente.
4. Prepare el sándwich de transferencia, de abajo hacia arriba, evitando burbujas entre el gel y la membrana, en el siguiente orden: lado negro del cassette-esponja-papel secante-gel-membrana-papel secante-esponja-lado transparente del cassette.
5. Cierre y bloquee el casete y coloque el sándwich en el tanque de transferencia en la orientación correcta para la transferencia (lado negro hacia el polo negativo).
6. Llene el tanque de transferencia con tampón de transferencia, agregue un agitador magnético para agitar el tampón y conecte la fuente de alimentación a 80 V durante 2 h o a 100 V durante 1 h. Realice la transferencia entre 4 y 8 °C (por ejemplo, en la cámara frigorífica) y con un bloque de enfriamiento en el sistema de transferencia.
7. Recuperar la membrana y continuar con un protocolo estándar de western blot, utilizando anticuerpos específicos para los diferentes complejos respiratorios a detectar²⁹.

Results

Los rendimientos de mitocondrias obtenidos siguiendo los protocolos descritos anteriormente varían en función de varios factores, como la línea celular o el tipo de tejido, la naturaleza de las muestras (es decir, si se utilizan tejidos frescos o congelados) o la eficiencia del proceso de homogeneización. Los rendimientos esperados de mitocondrias de diferentes líneas celulares y tejidos se recogen en la Tabla 2. Una vez obtenidas las fracciones mitocondriales, el siguiente paso es el análisis del patrón de SCs respiratorias, que se realiza tras la solubilización de la muestra mitocondrial bruta y la separación electroforética por BN-PAGE, seguida de un análisis de IGA o inmunodetección de WB. La Figura 1 muestra el aspecto de los carriles de gel sin teñir justo después de la corrida y el patrón de bandas después de la tinción estándar de Coomassie de una línea celular cultivada y una muestra mitocondrial de hígado de ratón.

En la Figura 2A, B, se pueden observar claras diferencias entre los patrones de ensamblaje de SC en células humanas y de ratón después de usar ensayos de IGA. Por lo tanto, el complejo I libre se observa en las células de ratón, mientras que no es detectable en las mitocondrias humanas. El patrón complejo de IV-IGA es muy similar en ambas líneas celulares humanas (Figura 2B), mientras que presenta diferencias entre las dos líneas celulares de ratón analizadas en la Figura 2A. Estas diferencias se deben al hecho de que las células BL6 expresan una variante mutante de SCAF1⁸.

Los patrones de SC, obtenidos con el protocolo de aislamiento mitocondrial descrito aquí para trabajar con muestras pequeñas, se mantienen con respecto a los protocolos "convencionales" utilizados para muestras más grandes. Esto se puede observar en la Figura 2C, comparando los carriles 1 y 6 (obtenidos tras el aislamiento mitocondrial utilizando un protocolo convencional a partir de 3 g de hígado y 1,1 g de BAT) con, respectivamente, los carriles 2 y 5 (obtenidos utilizando los protocolos aquí presentados a partir de alrededor de 0,1 g de ambos tejidos). Como se propone en el modelo de plasticidad, la proporción relativa de complejos respiratorios y SC varía según el tipo de célula y el estado metabólico. Como se muestra en la Figura 2C,D, los diferentes tejidos muestran diferentes patrones de ensamblaje de SC. Así, las mitocondrias cerebrales muestran niveles muy bajos de complejo I libre y una mayor proporción de SCs en comparación con los otros tejidos, y la MTD se caracteriza por sus bajos niveles de CV (Figura 2A) y altas cantidades de SC III + IV (Figura 2D). Las mitocondrias cardíacas presentan altos niveles de SCs y CVs. Los patrones de ensamblaje de CV son muy similares entre la línea celular cultivada y una muestra mitocondrial de hígado de ratón (Figura 2E).

El ensamblaje de SC también puede ser analizado por WB, como se muestra en la Figura 3 para dos muestras obtenidas de células de control de bazo y tumores. En este caso, 30-50 μg de proteína mitocondrial suelen ser suficientes para detectar los diferentes complejos y SCs con los anticuerpos específicos. La Figura 4 muestra algunos de los principales escollos que pueden ocurrir durante la aplicación de estos protocolos. Los gradientes de gel incorrectos pueden producir patrones de migración anormales y no deseados, como en la Figura 4A, carril 1, donde los SC permanecen cerca del pozo en la parte superior del carril debido a una concentración de acrilamida más alta de lo normal en el gel. La incubación de las muestras, incluso durante tiempos relativamente cortos, a altas temperaturas (en este caso, 37 °C y 40 °C durante 10 min) provoca la degradación de las SC y de la IC (Figura 4A , carriles 2-4). Del mismo modo, la proporción de detergente a proteína es fundamental para obtener buenos resultados y una resolución de gel adecuada. Por debajo de una proporción de 2 g de digitonina/g de proteína, la resolución de la banda se reduce progresivamente y a la concentración más baja (0,5 g/g) solo se aprecia un frotis en el área correspondiente a las SC (Figura 4B).

Figura 1: Patrón de complejos y supercomplejos mitocondriales después de la separación BNGE de mitocondrias permeabilizadas con digitonina de una línea celular en cultivo (L929^Balbc) e hígado de ratón. Los carriles de la izquierda (1 y 2) representan el aspecto del gel sin manchar justo después de la carrera, donde solo se detecta CV, mientras que los carriles de la derecha (3 y 4) muestran el patrón de bandas después de la tinción de Coomassie. Abreviaturas: BNGE = electroforesis en gel Blue Native; CV = complejo V; SCs = supercomplejos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Análisis IGA de mitocondrias aisladas de diferentes líneas celulares y tejidos de ratón. (A,B) Actividad en gel de los complejos indicados en mitocondrias aisladas de líneas celulares (A) de ratón o (B) humanas. L929^Balbc es una línea celular transmitocondrial generada en nuestro laboratorio mediante la transferencia de mitocondrias de plaquetas de ratón Balb/cJ a células ρ°L929neo como se ha descrito anteriormente^40,41. Los fibroblastos BL6 son una línea celular inmortalizada generada en nuestro laboratorio a partir de una biopsia de oreja de un ratón BL6. (C) Patrones de CI-IGA a partir de mitocondrias de ratón aisladas utilizando un método convencional que comienza con 3 g de hígado (carril 1) y con 1,1 g de BAT (carril 6) o el protocolo presentado aquí y que comienza con alrededor de 0,1 g de tejido en todos los casos (carril 2, hígado; carril 3, corazón; carril 4, cerebro y carril 5 BAT). (D) Patrones de CIV-IGA (realizados después de CI-IGA mostrado en el panel 2C, carriles 2-5) en hígado, corazón, cerebro y mitocondrias BAT de ratón. (E) Actividad CV-IGA analizada en células cultivadas de ratón e hígado. Se cargaron alrededor de 60-75 μg de proteína mitocondrial por carril. Abreviaturas: IGA = actividad en gel; SCs = supercomplejos; IC = complejo I; BAT = tejido adiposo marrón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Inmunodetección de WB de los diferentes complejos y supercomplejos mitocondriales en muestras de bazo. Después de la separación de Blue Native PAGE de los complejos mitocondriales y los SC obtenidos de muestras de control de bazo (Spleen M9) y tumor (Tumor M9), se transfirieron a una membrana de PVDF y se hibridaron secuencialmente con anticuerpos que reconocen las subunidades CI, CIII, CIV y CII indicadas (paneles A-D, respectivamente). Se cargaron alrededor de 50 μg de proteína mitocondrial por carril. Los asteriscos indican la señal que queda de una mancha occidental anterior. Abreviaturas: SC = supercomplejo; IC = complejo I; CIII = complejo III; CIV = complejo IV; CII = complejo II. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Trampas en el análisis de SC por Blue-Native PAGE. Análisis CI IGA de mitocondrias aisladas de (A) hígado fresco de ratón y (B) hígado de rata congelado en diferentes condiciones de solubilización. (A) Carril 1, concentración de gradiente de gel incorrecta (8-13% en lugar del 3-13% normal). Carriles 2-4, muestras incubadas durante 10 min en hielo o a 37 °C y 40 °C antes de cargar, respectivamente. (B) Patrón después de IGA para IC de mitocondrias obtenidas de hígado de rata congelado utilizando diferentes proporciones de digitonina/proteína para la solubilización. Abreviaturas: SC = supercomplejo; PAGE = electroforesis en gel de poliacrilamida; IC = complejo I; IGA = actividad en gel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Medio	Composición
Tampón hipotónico	10 mM MOPS, 83 mM de sacarosa, pH 7,2
Tampón hipertónico	30 mM MOPS, 250 mM de sacarosa, pH 7,2
Tampón de homogeneización A	10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,32 M sacarosa, pH 7,4
Tampón de homogeneización AT	225 mM manitol, 1 mM EGTA, 75 mM sacarosa, 0,01% BSA pH 7,4
tampón de homogeneización AT2	225 mM manitol, 1 mM EGTA, 75 mM sacarosa, 0,02% BSA pH 7,4
Tampón de muestra BN	50 mM de NaCl, 50 mM de Imidazol, 2 mM de ácido aminocaproico, 1 mM de EDTA pH 7.0
Solución Digitonin	10% de digitonina en 50 mM de NaCl, 50 mM de imidazol, 5 mM de aminocaproico, 4 mM de PMSF
Búfer de carga BN	5% Coomassie Blue G en ácido aminocaproico 0,75 M
Tampón catódico BN A	50 mM de tricina, 15 mM de Bis-Tris pH =7,0 (4 °C), 0,02% G-250 (Coomassie azul brillante G-250)
Tampón catódico BN B	50 mM tricina, 15 mM Bis-Tris pH=7,0 (4 °C), 0,002% G-250
Búfer de ánodo BN	50 mM Bis-Tris, pH=7.0
Sustrato IGA complejo I	5 mM de Tris-HCl pH 7,4, 0,1 mg/mL de NADH, 2,5 mg/mL de Nitroblue Tetrazolio (NBT)
Sustrato IGA del complejo II	50 mM Tampón de fosfato de potasio pH 7,4, 20 mM de succinato de sodio, 0,2 mM de metosulfato de fenazina (PMS), 2,5 mg/mL de NBT
Sustrato IGA del complejo III	50 mM Tampón de fosfato de potasio pH 7,2, 0,05% diaminobenzidina (DAB)
Sustrato IGA complejo IV	La misma solución que CIII más 50 μM de citocromo c
Sustrato Complejo V IGA	35 mM Tris, 270 mM glicina pH 8.3, 14 mM MgSO4, 0.2% Pb(NO3)2, 8 mM ATP
Solución de tinción	Colorante Coomassie R-250 al 0,25% en 40% de metanol y 10% de ácido acético
Solución de decoloración/fijación	40% metanol, 10% ácido acético
Búfer de transferencia	48 mM de Tris, 39 mM de glicina, 20% de metanol

Tabla 1: Búferes y composición de medios.

Tipo de célula/tejido	Importe inicial	Rendimiento esperado (μg de proteína mitocondrial)	Número de carriles (50-60 μg/carril)
Células cultivadas
MDA-MB-468	100 μL vpc	300-400 μg	6-9
Derivado de 143B	100 μL vpc	200-350 μg	4-7
Fibroblastos de ratón	100 μL vpc	150-200 μg	3-5
Corazón	100 mg	400-500 μg	10-12*
Músculo esquelético	100 mg	300-400 μg	8-10*
Hígado	100 mg	400-500 μg	8-10
Bazo	50 mg	150-250 μg	3-5
MURCIÉLAGO	100 mg	200-300 μg	4-6
Cerebro	100 mg	250-300 μg	5-8

Tabla 2: Rendimientos esperados de mitocondrias de diferentes tipos de células y tejidos de ratón. Las fracciones mitocondriales obtenidas del corazón o del músculo esquelético son más puras que las obtenidas de otros tejidos. Por lo tanto, se pueden cargar cantidades más pequeñas en los geles (*).

Discussion

Las adaptaciones metodológicas introducidas en los protocolos aquí descritos están destinadas a evitar pérdidas y aumentar el rendimiento, manteniendo al mismo tiempo las actividades del complejo mitocondrial (lo cual es crucial cuando la disponibilidad de cantidades suficientes de muestras se ve comprometida) y reproducir el patrón esperado de SC del tejido o de la línea celular (ver Figura 2C). Con este propósito y dado que no se requiere una alta pureza mitocondrial para detectar correctamente las SC, se ha reducido el número de pasos, tiempos y volúmenes siempre que ha sido posible.

Así, tras la homogeneización y eliminación de núcleos y células ininterrumpidas por centrifugación a baja velocidad, los sobrenadantes que contienen las mitocondrias se transfieren a tubos de polipropileno de 1,5 mL, y las centrifugaciones posteriores para obtener las fracciones mitocondriales crudas se realizan en un microfuge aumentando la velocidad y reduciendo los tiempos y volúmenes con respecto a los protocolos convencionales. Esto permite el procesamiento de varias muestras en un tiempo relativamente corto: una estimación cercana es que se pueden procesar 10 muestras en ~2-2,5 h (desde el inicio de la homogeneización (paso del protocolo 1.6. o equivalente para tejidos) hasta la obtención de la fracción de SCs lista para ser cargada en un gel (paso del protocolo 3.7) y minimiza las pérdidas mientras se mantienen las actividades. Otro cambio con respecto a los protocolos originales del grupo de Schägger es sustituir, después de la solubilización por membrana para la obtención de la fracción SCs, una etapa de ultracentrifugación por una simple centrifugación de microfuga (paso 3.4 del protocolo).

Hay algunos pasos críticos en el procedimiento. En primer lugar, la eficiencia de la rotura celular, especialmente en el caso de células cultivadas (ver nota después del paso 1.8 del protocolo) y particularmente en el caso de células pequeñas. Los tejidos y las líneas celulares presentan un grado de dificultad variable en la rotura celular: por ejemplo, en el corazón y el músculo, este paso suele ser menos eficiente que en el hígado o el bazo, pero se compensa en rendimiento porque los primeros tienen un mayor contenido mitocondrial. Una alternativa para mejorar el rendimiento mitocondrial cuando se aísla del músculo o del corazón sería el tratamiento de las muestras con tripsina antes de la homogeneización. El cerebro es otro tejido que presenta baja eficiencia en la rotura celular debido a la homogeneización manual, que es más leve y menos eficiente y probablemente también debido a la mayor variación de los tipos celulares en este tejido, como se ha reportado previamente ⁴². Esto puede compensarse parcialmente con un segundo paso de homogeneización como se sugiere en nuestro protocolo (paso 2.7.4). Por otro lado, si la rotura celular es excesiva, la muestra final que contiene SCs podría estar contaminada con fragmentos de ADN nuclear que pueden interferir con el funcionamiento electroforético. Este problema se muestra como un aumento de la viscosidad de la muestra cuando se añade digitonina para solubilizar las membranas mitocondriales y puede solucionarse mediante el tratamiento con ADNasa I.

En segundo lugar, si la relación detergente-proteína es demasiado baja, eso resultaría en una solubilización de membrana menos eficiente y la posibilidad de formación de agregados. Esto podría mostrarse en los geles como una mala resolución en SCs de alto peso molecular (ver Figura 4) o como CIV dando múltiples bandas correspondientes a oligómeros⁴³. Si la relación es demasiado alta, podría conducir a la desagregación de los SC (principalmente CI-SC). En tercer lugar, es importante evitar calentar las muestras durante todo el procedimiento (ver Figura 4) y evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación, ya que pueden afectar el estado del ensamblaje SC.

En la Tabla 2, se presenta un resumen de los rendimientos esperados para varios tipos de células y muestras de tejido. Los valores son aproximados y dependerán de la eficiencia de rotura de la célula y de la naturaleza de la fuente. En el caso de los tejidos, si el material de partida está congelado tiende a dar un rendimiento mayor que con las muestras frescas. Se presenta una estimación del número de carriles (considerando una carga entre 50 y 60 μg de proteína mitocondrial por carril) que se pueden cargar.

Los protocolos presentados aquí cubren una variedad de tejidos y tipos de células con pequeñas variaciones, se pueden usar con muestras frescas o congeladas y requieren un equipo simple y un costo relativamente bajo, que no implica el uso de costosos kits de purificación o gradientes. Sin embargo, es posible que necesiten algunas adaptaciones para ser utilizados con tipos de células o muestras particulares, así como cuando poblaciones mitocondriales específicas, como las mitocondrias sinápticas cerebrales o las mitocondrias subsarcolemales musculares, por ejemplo, son objeto de análisis.

Dado que aún no se han definido las funciones fisiológicas precisas, así como la posible implicación de las SC en situaciones patológicas, es necesario analizar su dinámica y los factores que afectan a su ensamblaje, estabilidad y función. Nuestros protocolos pueden representar herramientas valiosas que permiten obtener resultados reproducibles sobre los patrones de las SCs con tamaños de muestra pequeños y de una variedad de tipos de células y tejidos, particularmente cuando es necesario comparar múltiples condiciones experimentales²⁹.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ácido acético	PanReac	131008
Ácido aminocaproico	Fluka Analytical	7260
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
Bis Tris	Acrons Ensayo de	327721000
Bradford	Biorad 5000002
Coomassie Blue G-250	Serva	17524
Coomassie Blue R-250	Merck	1125530025
Citocromo c	Sigma-Aldrich	C2506
Diamino  bencidina (DAB)	Sigma-Aldrich	D5637
Digitonin	Sigma-Aldrich	D5628
EDTA	PanReac	131669
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Libre de ácidos grasos BSA	Roche	10775835001
Glycine	PanReac	A1067
Homogeneizador Mortero de teflón	Deltalab 196102
Imidazol	Sigma-Aldrich	I2399
K2HPO4	PanReac	121512
KH2PO4	PanReac	121509
manitol	Sigma-Aldrich	M4125
Metanol	Labkem	MTOL-P0P
MgSO4	PanReac	131404
Mini Trans-Blot Cell	BioRad	1703930
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
MTCO1 Anticuerpo monoclonal	Invitrogen	459600
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NADH	Roche	10107735001
NativePAGE 3 a 12% Mini Geles de Proteínas	Invitrogen	BN1001BOX
NativePAGE Aditivo tampón catódico (20x)	Invitrogen	BN2002
NativePAGE Running Buffer (20x)	Invitrogen	BN2001
NDUFA9 Anticuerpo monoclonal	Invitrogen	459100
Nitroblue sal de tetrazolio (NBT)	Sigma-Aldrich	N6876
Pb(NO3)2	Sigma-Aldrich	228621
Membrana PDVF	Amersham	10600023
Metasulfato de fenazina (PMS)	Sigma-Aldrich	P9625
Pierce ECL Sustrato	Thermo Scientific	32106
PMSF	Merck	PMSF-RO
SDHA Anticuerpo monoclonal	Invitrogen	459200
Succinato de sodio	Sigma-Aldrich	S2378
Estreptomicina/penicilina	PAN biotech	P06-07100
Sacarosa	Sigma-Aldrich	S3089
Tris	PanReac	A2264
UQCRC1 Anticuerpo Monoclonal	Invitrogen	459140
XCell  SureLock Mini-Cell	Invitrogen	EI0001