Aislamiento de mitocondrias para el análisis de supercomplejos mitocondriales a partir de muestras de pequeños tejidos y cultivos celulares

Raquel Moreno-Loshuertos; Patricio Fernández-Silva

doi:10.3791/66771

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Artículo de método

Aislamiento de mitocondrias para el análisis de supercomplejos mitocondriales a partir de muestras de pequeños tejidos y cultivos celulares

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DOI:

10.3791/66771

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3 de mayo de 2024

Raquel Moreno-Loshuertos¹^,² , Patricio Fernández-Silva¹^,²

¹Department of Biochemistry, University of Zaragoza, ²Institute for Biocomputation and Physics of Complex Systems, University of Zaragoza

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe una técnica para el análisis de supercomplejos respiratorios cuando solo se dispone de pequeñas cantidades de muestras.

Resumen

A lo largo de las últimas décadas, la evidencia acumulada sobre la existencia de supercomplejos respiratorios (SCs) ha cambiado nuestra comprensión de la organización de la cadena de transporte de electrones mitocondrial, dando lugar a la propuesta del "modelo de plasticidad". Este modelo postula la coexistencia de diferentes proporciones de SCs y complejos en función del tejido o del estado metabólico celular. La naturaleza dinámica del ensamblaje en las SC permitiría a las células optimizar el uso de los combustibles disponibles y la eficiencia de la transferencia de electrones, minimizando la generación de especies reactivas de oxígeno y favoreciendo la capacidad de las células para adaptarse a los cambios ambientales.

Más recientemente, se han descrito anomalías en el ensamblaje de SC en diferentes enfermedades como trastornos neurodegenerativos (enfermedad de Alzheimer y Parkinson), síndrome de Barth, síndrome de Leigh o cáncer. El papel de las alteraciones del ensamblaje de las SC en la progresión de la enfermedad aún debe confirmarse. Sin embargo, la disponibilidad de cantidades suficientes de muestras para determinar el estado del ensamblaje SC es a menudo un desafío. Esto sucede con biopsias o muestras de tejido que son pequeñas o que deben dividirse para múltiples análisis, con cultivos celulares que tienen un crecimiento lento o provienen de dispositivos microfluídicos, con algunos cultivos primarios o células raras, o cuando se debe analizar el efecto de tratamientos costosos particulares (con nanopartículas, compuestos muy caros, etc.). En estos casos, se requiere un método eficiente y fácil de aplicar. En este trabajo se presenta un método adaptado para obtener fracciones mitocondriales enriquecidas a partir de pequeñas cantidades de células o tejidos para analizar la estructura y función de las SC mitocondriales mediante electroforesis nativa seguida de ensayos de actividad in-gel o western blot.

Introducción

Los supercomplejos (SC) son asociaciones supramoleculares entre complejos de cadenas respiratorias individuales ^1,2. A partir de la identificación inicial de las SC y la descripción de su composición por el grupo de Schägger ^2,3, posteriormente confirmada por otros grupos, se estableció que contienen complejos respiratorios I, III y IV (CI, CIII y CIV, respectivamente) en diferentes estequiometrías. Se pueden definir dos poblaciones principales de SC, las que contienen CI (y CIII solo o CIII y CIV) y con un peso molecular muy alto (MW, comenzando ~1,5 ....