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Artículo de método

Aislamiento de mitocondrias para el análisis de supercomplejos mitocondriales a partir de muestras de pequeños tejidos y cultivos celulares

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DOI:

10.3791/66771

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3 de mayo de 2024

 , 
1Department of Biochemistry, University of Zaragoza, 2Institute for Biocomputation and Physics of Complex Systems, University of Zaragoza

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe una técnica para el análisis de supercomplejos respiratorios cuando solo se dispone de pequeñas cantidades de muestras.

Resumen

A lo largo de las últimas décadas, la evidencia acumulada sobre la existencia de supercomplejos respiratorios (SCs) ha cambiado nuestra comprensión de la organización de la cadena de transporte de electrones mitocondrial, dando lugar a la propuesta del "modelo de plasticidad". Este modelo postula la coexistencia de diferentes proporciones de SCs y complejos en función del tejido o del estado metabólico celular. La naturaleza dinámica del ensamblaje en las SC permitiría a las células optimizar el uso de los combustibles disponibles y la eficiencia de la transferencia de electrones, minimizando la generación de especies reactivas de oxígeno y favoreciendo la capacidad de las células para adaptarse a los cambios ambientales.

Más recientemente, se han descrito anomalías en el ensamblaje de SC en diferentes enfermedades como trastornos neurodegenerativos (enfermedad de Alzheimer y Parkinson), síndrome de Barth, síndrome de Leigh o cáncer. El papel de las alteraciones del ensamblaje de las SC en la progresión de la enfermedad aún debe confirmarse. Sin embargo, la disponibilidad de cantidades suficientes de muestras para determinar el estado del ensamblaje SC es a menudo un desafío. Esto sucede con biopsias o muestras de tejido que son pequeñas o que deben dividirse para múltiples análisis, con cultivos celulares que tienen un crecimiento lento o provienen de dispositivos microfluídicos, con algunos cultivos primarios o células raras, o cuando se debe analizar el efecto de tratamientos costosos particulares (con nanopartículas, compuestos muy caros, etc.). En estos casos, se requiere un método eficiente y fácil de aplicar. En este trabajo se presenta un método adaptado para obtener fracciones mitocondriales enriquecidas a partir de pequeñas cantidades de células o tejidos para analizar la estructura y función de las SC mitocondriales mediante electroforesis nativa seguida de ensayos de actividad in-gel o western blot.

Introducción

Los supercomplejos (SC) son asociaciones supramoleculares entre complejos de cadenas respiratorias individuales 1,2. A partir de la identificación inicial de las SC y la descripción de su composición por el grupo de Schägger 2,3, posteriormente confirmada por otros grupos, se estableció que contienen complejos respiratorios I, III y IV (CI, CIII y CIV, respectivamente) en diferentes estequiometrías. Se pueden definir dos poblaciones principales de SC, las que contienen CI (y CIII solo o CIII y CIV) y con un peso molecular muy alto (MW, comenzando ~1,5 MDa para las SC más pequeñas: CI + CIII2) y las que contienen CIII y CIV pero no CI, con un tamaño mucho menor (como CIII2 + CIV con ~680 kDa). Estas SC coexisten en la membrana mitocondrial interna con complejos libres, también en diferentes proporciones. Así, mientras que el CI se encuentra principalmente en sus formas asociadas (es decir, en las SC: ~80% en el corazón bovino y más del 90% en muchos tipos de células humanas)3, el CIV es muy abundante en su forma libre (más del 80% en el corazón bovino), con CIII mostrando una distribución más equilibrada (~40% en su forma libre más abundante, como un dímero, en corazón bovino).

Si bien su existencia es ahora generalmente aceptada, su papel preciso sigue siendo objeto de debate 4,5,6,7,8,9,10. De acuerdo con el modelo de plasticidad, pueden existir diferentes proporciones de SCs y complejos individuales dependiendo del tipo de célula o del estado metabólico 1,7,11. Esta naturaleza dinámica del ensamblaje permitiría a las células regular el uso de los combustibles disponibles y la eficiencia del sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS) en respuesta a los cambios ambientales 4,5,7. Las SC también podrían contribuir al control de la tasa de generación de especies reactivas de oxígeno y participar en la estabilización y renovación de complejos individuales 4,12,13,14. Se han descrito modificaciones del estado de ensamblaje del SC en asociación a diferentes situaciones fisiológicas y patológicas15,16 y al proceso de envejecimiento17.

Así, se han descrito cambios en los patrones de SC en levaduras dependiendo de la fuente de carbono utilizada para el crecimiento2 y en células de mamíferos cultivadas cuando la glucosa es sustituida por galactosa4. También se han reportado modificaciones en el hígado de ratón después del ayuno8 y en los astrocitos cuando se bloquea la oxidación de los ácidos grasos mitocondriales18. Además, se ha encontrado una disminución o alteraciones de las SC y OXPHOS en el síndrome de Barth19, la insuficiencia cardíaca20, varios trastornos metabólicos21 y neurológicos 22,23,24 y diferentes tumores 25,26,27,28 . Todavía se investiga si estas alteraciones en el ensamblaje y los niveles de SC son una causa primaria o representan efectos secundarios en estas situaciones patológicas15,16. Diferentes metodologías pueden dar información sobre el ensamblaje y la función de los SC; Estos incluyen mediciones de actividad 8,29, análisis ultraestructural30,31 y proteómica32,33. Una alternativa útil que se está empleando cada vez más y que es el punto de partida de algunas de las metodologías mencionadas anteriormente es la determinación directa del estado de ensamblaje de SC mediante electroforesis nativa azul (BN) desarrollada para este fin por el grupo de Schägger34,35.

Este enfoque requiere procedimientos reproducibles y eficientes para obtener y solubilizar las membranas mitocondriales y puede complementarse con otras técnicas como el análisis de actividad en gel (IGA), la electroforesis de segunda dimensión y el western blot (WB). Una limitación en los estudios sobre la dinámica de las SC mediante electroforesis BN puede ser la cantidad de células de partida o muestras de tejido. Presentamos una serie de protocolos para el análisis del ensamblaje y la función de las SC, adaptados de los métodos del grupo de Schägger, que se pueden aplicar a muestras de células o tejidos frescos o congelados a partir de tan solo 20 mg de tejido.

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Protocolo

NOTA: La composición de todos los medios de cultivo y tampones se especifica en la Tabla 1 y los detalles relacionados con todos los materiales y reactivos utilizados en este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Aislamiento de mitocondrias a partir de cultivos celulares

NOTA: El volumen mínimo de células analizadas ha sido de ~30-50 μL de células empaquetadas (paso 1.4). Esto puede corresponder aproximadamente a al menos dos o tres placas de cultivo celular de 100 mm o a una placa de 150 mm al 80-90% de confluencia, dependiendo del tipo de célula (entre 5 × 106 y 107 células en células derivadas de L929 o MDA-MB-468). La rotura eficiente de las células es un paso crítico.

  1. Cultive células adherentes hasta aproximadamente un 80% de confluencia o células suspendidas hasta una densidad adecuada.
  2. Recolección de células por centrifugación a 500 × g durante 5 min (directamente de la suspensión celular en el caso de células no adherentes o después de la tripsinización estándar con una solución de tripsina-EDTA al 0,05% de tripsina y 0,02% de EDTA en 1x PBS, en el caso de células adherentes).
  3. Lavar las células 2x con PBS frío 1x y sedimentarlas por centrifugación a 500 × g durante 5 min.
    NOTA: A partir de este punto, todos los pasos deben realizarse a 4 °C. Por lo tanto, todos los reactivos deben estar fríos y los tubos que contienen células o mitocondrias deben mantenerse en hielo.
  4. Después de la segunda centrifugación, deseche el sobrenadante, estime el volumen de gránulos celulares (cpv) y congele las células a -80 °C durante al menos 15 minutos para facilitar la ruptura de la membrana en el paso 1.8.
    NOTA: El protocolo se puede detener en este punto y las celdas se pueden almacenar a -80 °C durante semanas. Por lo general, son apropiados tubos graduados de 10 o 15 mL con fondos cónicos.
  5. Deje que las células se descongelen lentamente sobre hielo.
  6. Vuelva a suspender el pellet de celda empaquetada en un volumen de tampón hipotónico igual a 7 veces el cpv (10 mM de MOPS, 83 mM de sacarosa, pH 7,2) (por ejemplo, 100 μL de células empaquetadas en 700 μL de tampón).
    NOTA: El volumen debe ser suficiente para obtener pops eficientes (ver NOTA en el paso 1.8).
  7. Transfiera la suspensión celular a un homogeneizador Potter-Dounce del tamaño adecuado y deje que las células se hinchen incubándolas en hielo durante 2 minutos. Por ejemplo, para un volumen de 700-800 μL de suspensión celular, un homogeneizador de capacidad de 1 mL es adecuado.
  8. Rompa las membranas celulares realizando de ocho a diez golpes en el homogeneizador acoplado a un mortero de teflón accionado por motor que gira a 600 rpm.
    NOTA: Al realizar los trazos, es importante crear un vacío que aumente la eficiencia de la rotura celular junto con las acciones hipotónicas y de congelación para hinchar y fragilizar las membranas, respectivamente. Si está bien hecho, se escuchará un sonido de "pop" al tirar hacia abajo del homogeneizador con un movimiento rápido en cada golpe.
  9. Añadir el mismo volumen de tampón hipertónico a la suspensión celular (7 veces el cpv) (30 mM MOPS, 250 mM de sacarosa, pH 7,2) para generar un ambiente isotónico.
  10. Transfiera el homogeneizado a un tubo de 10-15 ml y centrifuga en un rotor fijo a 1.000 × g durante 5 min a 4 °C.
    NOTA: El tubo original que contiene las células intactas se puede utilizar para este propósito.
  11. Transfiera el sobrenadante, que contiene la fracción mitocondrial, a tubos de polipropileno de 1,5 mL.
  12. OPCIONAL: Para aumentar el rendimiento de las mitocondrias, vuelva a suspender el pellet del paso 1.10 en 7 veces el volumen del pellet celular del tampón A (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,32 M de sacarosa, pH 7,4) pipeteando hacia arriba y hacia abajo y centrifugar a 1.000 × g durante 5 min a 4 °C. Combine el nuevo sobrenadante con el anterior antes de continuar con el paso 1.13.
  13. Centrifugar en una microfuga a 16.000 × g durante 2 min a 4 °C para recoger la fracción bruta mitocondrial.
  14. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender cada gránulo enriquecido con mitocondrias con 0,5 ml de tampón A, combinando el contenido de dos tubos en uno y centrifugando en las mismas condiciones descritas en el paso 1.13. Repita el mismo proceso hasta que todo el material esté en un solo tubo.
  15. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet final con 300 μL de tampón A y cuantifique la concentración de proteínas mitocondriales mediante el ensayo de Bradford. Vuelva a centrifugar como antes y continúe con la sección 3.

2. Aislamiento de mitocondrias a partir de pequeñas cantidades de tejidos animales

NOTA: La cantidad mínima de tejido para aplicar este protocolo con cierta confianza depende del tipo de célula y su abundancia mitocondrial, pero podría ser de ~ 20-30 mg de tejido para la mayoría de los casos. Las muestras de tejido pueden ser material fresco o muestras congeladas. En este último caso, deje que las muestras se descongelen en un tampón de homogeneización colocado en hielo antes de comenzar el procedimiento.

  1. Pesar o estimar lo más fielmente posible la cantidad (mg) de tejido.
  2. Cortar el pañuelo con unas tijeras y hacer 3-4 lavados en tampón de homogeneización con la ayuda de un colador teniendo cuidado de no perder los trozos más pequeños.
    NOTA: Este paso es más importante en tejidos como el músculo esquelético o el corazón que en el cerebro o tejidos más blandos cuyas células se pueden desagregar fácilmente directamente mediante el paso de homogeneización.
  3. Añadir medio de homogeneización fresco (4 mL por gramo de hígado, 10 mL por gramo de corazón, tejido adiposo marrón (BAT) o músculo, y 5 mL por gramo de cerebro o riñón; ver composición tampón específica para cada caso en la Tabla 1).
  4. Transfiera los trozos de tejido con tampón al homogeneizador y siga el protocolo óptimo de homogeneización y aislamiento de mitocondrias en función del tejido seleccionado.
  5. Aislamiento de mitocondrias del hígado, el bazo y el riñón
    1. Homogeneizar con cuatro a seis golpes de subida y bajada en el Elvehjem-Potter con un mortero de teflón accionado por motor a 600 rpm.
    2. Transfiera el tejido homogeneizado a un tubo centrífugo estéril. Centrífuga en un rotor oscilante a 1.000 × g durante 5 min a 4 °C.
    3. Llene tubos de polipropileno de 1,5 mL con el sobrenadante obtenido en el paso anterior. Centrifugar durante 2 min a 16.000 × g en un microfófugo a 4 °C y proceder a continuación como se ha descrito anteriormente (pasos 1.13 a 1.15)
  6. Aislamiento de mitocondrias a partir de muestras de corazón y músculo
    1. Homogeneizar con seis a ocho golpes en el Elvehjem-Potter con un mortero de teflón accionado por motor a 600 rpm. Transfiera el tejido homogeneizado a un tubo centrífugo estéril.
    2. Centrífuga en un rotor oscilante a 1.000 × g durante 5 min a 4 °C. Vierta el sobrenadante en tubos limpios de polipropileno de 1,5 mL.
      NOTA: Se puede realizar una segunda homogeneización del pellet obtenida en el paso 2.6.2 con 4-5 golpes adicionales y 1/2 volumen de tampón de homogeneización para aumentar el rendimiento mitocondrial. El nuevo sobrenadante (después de la centrifugación de nuevo a 1.000 × g durante 5 min a 4 °C) puede combinarse con el anterior antes de continuar con el paso 2.6.3. Una alternativa para aumentar el rendimiento bruto de mitocondrias es disociar muestras de tejido cardíaco y muscular en solución de tripsina antes de la homogeneización36,37. En este caso, la tripsina debe inactivarse/eliminarse de manera eficiente antes de que las membranas mitocondriales se solubilicen con digitonina (paso 3.2).
    3. Centrifugar a 16.000 × g en una microfuga durante 2 min a 4 °C para obtener la fracción mitocondrial bruta.
    4. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender cada gránulo enriquecido con mitocondrias con 0,5 mL de tampón AT, combinando el contenido de dos tubos en uno y centrifugando en las mismas condiciones descritas en el paso 2.6.3. Repita el mismo proceso hasta que todo el material esté en un solo tubo.
    5. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet final con 300 μL de tampón A (sin BSA) y cuantifique la concentración de proteínas mitocondriales mediante el ensayo de Bradford. Vuelva a centrifugar como antes y continúe con la sección 3.
  7. Aislamiento de mitocondrias del cerebro
    1. Homogeneice las piezas del cerebro con 10-15 golpes utilizando un homogeneizador de vidrio tipo Dounce con un mortero de vidrio accionado manualmente. Transfiera el tejido homogeneizado a un tubo centrífugo estéril.
    2. Centrífuga en un rotor oscilante a 1.000 × g durante 5 min a 4 °C.
    3. Recoja el sobrenadante en un tubo de centrífuga limpio.
    4. Resuspender el pellet obtenido en la etapa de centrifugación anterior en el mismo volumen de medio AT utilizado en la primera homogeneización. Vuelva a homogeneizar el pellet repitiendo el proceso descrito en el paso 2.7.1 utilizando de 5 a 10 pasadas y centrifugar la suspensión en un rotor oscilante a 1.000 × g durante 5 min a 4 °C.
    5. Retire el sobrenadante y añádalo al tubo preparado en el paso 2.7.3. Centrífuga a 10.000 × g en un rotor de ángulo fijo durante 10 min a 4 °C para obtener la fracción mitocondrial bruta.
    6. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1/2 del volumen de homogeneización inicial (paso 2.7.1) del medio AT. Distribuir la suspensión mitocondrial en tubos limpios de polipropileno de 1,5 mL y centrifugar a 16.000 × g en un microfuge durante 2 min a 4 °C.
    7. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender cada gránulo enriquecido con mitocondrias con 0,5 ml de tampón AT, combinando el contenido de dos tubos en uno y centrifugando en las mismas condiciones que se describen en el paso 2.7.6. Repita el mismo proceso hasta que todo el material esté en un solo tubo.
    8. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet final con 300 μL de tampón A (sin BSA) y cuantifique la concentración de proteínas mitocondriales mediante el ensayo de Bradford. Vuelva a centrifugar como antes y continúe con la sección 3.
  8. Aislamiento de mitocondrias a partir de BAT
    1. Homogeneizar con ocho a diez golpes de subida y bajada en el Elvehjem-Potter con un mortero de teflón accionado por motor a 600 rpm. Transfiera el tejido homogeneizado a un tubo centrífugo estéril.
    2. Centrífuga en un rotor oscilante a 1.000 × g durante 5 min a 4 °C.
    3. Llene tubos de polipropileno de 1,5 mL con el sobrenadante obtenido en el paso anterior evitando la capa superior de grasa.
      NOTA: Se puede realizar una segunda homogeneización del pellet obtenida en el paso 2.8.2 para aumentar el rendimiento mitocondrial. El nuevo sobrenadante (después de la centrifugación de nuevo a 1.000 × g durante 5 min a 4 °C) puede combinarse con el anterior antes de continuar con el paso 2.8.4.
    4. Centrifugar durante 2 min a 16.000 × g durante 2 min en una microfuga a 4 °C.
    5. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender cada gránulo enriquecido con mitocondrias con 0,5 ml de tampón AT2, combinando el contenido de dos tubos en uno y centrifugando en las mismas condiciones descritas en el paso 2.8.4. Repita el mismo proceso hasta que todo el material esté en un solo tubo.
    6. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet final con 300 μL de tampón A (sin BSA) y cuantifique la concentración de proteínas mitocondriales mediante el ensayo de Bradford. Vuelva a centrifugar como antes y continúe con la sección 3.

3. Preparación de muestras para el análisis de Blue Native

  1. Resuspender las fracciones mitocondriales (obtenidas de cultivos o tejidos celulares de mamíferos) en tampón de muestra BN (50 mM de NaCl, 50 mM de Imidazol, 5 mM de ácido aminocaproico, 4 mM de PMSF) para obtener una concentración de proteína de alrededor de 10 mg/mL. Consulte la Tabla 2 para conocer los rendimientos esperados para los diferentes tipos de muestras.
  2. Solubilizar las membranas mitocondriales mediante la adición de digitonina (solución madre al 10%) para obtener una proporción de 4 g de digitonina/g de proteína mitocondrial (4 μL de digitonina 10% de stock por 10 μL de la suspensión mitocondrial preparada en el paso 3.1).
    NOTA: La relación detergente/proteína (g/g) debe optimizarse para cada tipo de muestra para obtener resultados reproducibles; Se encontró que 2-8 g de digitonina/g de proteína mitocondrial era óptimo para la mayoría de los tejidos 34,35.
  3. Mezcle pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Incubar las muestras en hielo durante 5 min.
    NOTA: Después de este paso, la suspensión mitocondrial debería volverse más clara (cambiar de opaca a translúcida); de lo contrario, podría indicar que la cantidad de detergente es insuficiente para una correcta solubilización de la membrana.
  4. Centrifugar a toda velocidad en una microfuga (20.000 × g aprox.) durante 25 min a 4 °C para eliminar el material insoluble.
  5. Recoja el sobrenadante en un tubo nuevo. Añadir al sobrenadante un volumen de 5% G-250 (Coomassie Blue G-250 5% en ácido aminocaproico 0,75 M) equivalente a 1/3 del volumen de resuspensión inicial (paso 3.1, esto correspondería a una proporción final de 1,6 g de Coomassie/g de proteína) y mezclar por pipeteo.
  6. Mantener en hielo antes de cargar en el gel o congelar las alícuotas a -80 °C.

4. Electroforesis en gel Blue Native

NOTA: La electroforesis se realiza en la cámara frigorífica (4-8 °C). Si no hay una instalación de cámara frigorífica, se puede introducir un bloque de enfriamiento en el tanque de electroforesis. Se utilizan geles comerciales de poliacrilamida nativaal 3-13% 29, pero también se pueden utilizar geles caseros de las concentraciones de gradiente deseadas38,39.

  1. Cargue las cámaras superior e inferior con los amortiguadores de cátodo frío A y ánodo, respectivamente. Alternativamente, cargue las muestras en los pocillos antes de llenar cuidadosamente la cámara superior con tampón catódico A.
    NOTA: En nuestro laboratorio se utilizan tampones de electroforesis comerciales, pero se pueden preparar como se indica en la Tabla 1.
  2. Carga entre 30 y 100 μg de proteína mitocondrial.
    NOTA: Por lo general, se cargan 30-50 μg de proteína (para WB), o 40-100 μg de proteína (para IGA) por pocillo en un gel de 10 carriles (pocillos de 0,5 x 0,15 cm). El tampón del cátodo A contiene Coomassie Blue G-250 y tiene un color azul intenso que dificulta la visión de los pocillos de gel para la carga de muestras. Es conveniente marcar el centro de cada pocillo, con un rotulador rojo, por ejemplo, para ayudar a colocar la punta de la pipeta durante este paso. Los marcadores de peso molecular nativos pueden ser útiles a la hora de configurar la técnica BN-PAGE para confirmar que los geles de gradiente están formados correctamente y que el patrón de complejos y SCs es el correcto.
  3. Ejecute a 80-100 V durante 25-30 min y luego a 160-180 V, limitando la corriente a 12 mA / gel, hasta que el tinte llegue al fondo del gel (~125-165 min en total).
  4. Si se van a realizar ensayos de actividad en gel (IGA), sustituya el tampón catódico A por el tampón catódico B cuando el frente del colorante esté en el centro del gel (~1 h después del comienzo de la ejecución).
    NOTA: Aunque los geles se pueden documentar sin ninguna tinción justo después de la corrida, ya que algunas bandas son visibles (principalmente el complejo V, que puede considerarse un fabricante "interno" con un MW de ~ 600 kDa) debido a su unión al colorante G-250, por lo general, los SC y los complejos individuales no serán visibles sin tinción o ensayos de IGA. Los geles que se utilizarán en los ensayos de IGA o para WB no deben mancharse ni fijarse.
  5. Desmonte el gel del casete y continúe con la tinción con azul de Coomassie (sección 5), el análisis de IGA (sección 6) o la inmunodetección de WB (sección 7).

5. Tinción en gel

  1. Teñir el gel durante 10-15 min a temperatura ambiente (RT) utilizando soluciones de colorante azul de Coomassie (colorante Coomassie R-250 al 0,25% en metanol al 40%, ácido acético al 10%; tinción durante 10-15 min).
  2. Decolorar con varios lavados (normalmente 4-5 x 15 min) en 40% de metanol más 10% de ácido acético en RT.
  3. Documenta el gel.

6. Ensayos de actividad en gel (IGA)

  1. Preparar soluciones de IGA para el análisis de los diferentes complejos respiratorios antes del final de la electroforesis y mantenerlas en la oscuridad (utilizando cajas de plástico de color oscuro o cubriéndolas con papel de aluminio, por ejemplo). La composición de cada búfer se detalla en la Tabla 1.
  2. Coloque el gel o los carriles a utilizar en una caja de plástico lo más pequeña posible para acomodarlo.
  3. Agregue suficiente volumen de la solución adecuada para cubrir el gel (generalmente 5 o 10 mL para 5 o 10 carriles de gel, respectivamente) e incube a RT con agitación suave (60-80 rpm) y lejos de la luz.
    NOTA: El tiempo de incubación depende del complejo a analizar y de la naturaleza y cantidad de muestra cargada; CI y CIV son los más fáciles y rápidos de dar resultados. Por lo tanto, la actividad de CI generalmente comenzará a hacerse visible después de unos minutos, mientras que CII y CIV necesitan ~ 30 min para ser observados y CV ~ 1.5-2 h. La reacción puede continuar durante horas en todos los casos y la tasa de intensificación de la señal puede reducirse trasladando la incubación a una cámara frigorífica (4-6 °C), por ejemplo, para una incubación nocturna (ON). La actividad CIII funciona solo para la electroforesis nativa clara (CN), no para BN34.
  4. Cuando se hayan desarrollado las bandas apropiadas, detenga las reacciones retirando las soluciones de ensayo, lavando 2 veces con agua destilada y fijando el gel con un 40% de metanol más un 10% de ácido acético (excepto para el CV que se fija solo con metanol) durante 30 min.
    1. Para analizar la actividad de CIV después de la detección de CI por IGA, lavar el gel 2 veces con agua destilada, documentar la actividad de CI, incubar el gel (¡sin fijarlo!) con 50 mM de tampón de fosfato de potasio (pH 7,2) 2 veces durante 30 min, y luego con el tampón de reacción CIV completo hasta que aparezcan las bandas IV complejas (generalmente incubando ON a RT o 4 °C).
  5. Documenta los geles.
    NOTA: Para la actividad de ATPasa, como las bandas desarrolladas son blancas, al documentar el gel, colóquelo sobre un fondo oscuro para que las bandas transparentes sean visibles.

7. Análisis de Western blot

  1. Prepare el tampón de transferencia de acuerdo con la Tabla 1 y manténgalo a 4 °C hasta el final de la electroforesis.
  2. Coloque el gel en una bandeja y agregue el tampón de transferencia. Incubar en RT durante 10-15 min.
  3. Cortar un trozo de membrana de PVDF del mismo tamaño que el gel y activarlo en metanol durante 10 s bajo agitación. Lavar varias veces con agua destilada y agregar tampón de transferencia. Incubar en RT durante 10-15 min agitando suavemente.
  4. Prepare el sándwich de transferencia, de abajo hacia arriba, evitando burbujas entre el gel y la membrana, en el siguiente orden: lado negro del cassette-esponja-papel secante-gel-membrana-papel secante-esponja-lado transparente del cassette.
  5. Cierre y bloquee el casete y coloque el sándwich en el tanque de transferencia en la orientación correcta para la transferencia (lado negro hacia el polo negativo).
  6. Llene el tanque de transferencia con tampón de transferencia, agregue un agitador magnético para agitar el tampón y conecte la fuente de alimentación a 80 V durante 2 h o a 100 V durante 1 h. Realice la transferencia entre 4 y 8 °C (por ejemplo, en la cámara frigorífica) y con un bloque de enfriamiento en el sistema de transferencia.
  7. Recuperar la membrana y continuar con un protocolo estándar de western blot, utilizando anticuerpos específicos para los diferentes complejos respiratorios a detectar29.

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Resultados

Los rendimientos de mitocondrias obtenidos siguiendo los protocolos descritos anteriormente varían en función de varios factores, como la línea celular o el tipo de tejido, la naturaleza de las muestras (es decir, si se utilizan tejidos frescos o congelados) o la eficiencia del proceso de homogeneización. Los rendimientos esperados de mitocondrias de diferentes líneas celulares y tejidos se recogen en la Tabla 2. Una vez obtenidas las fracciones mitocondriales, el siguiente paso es el análisis del patrón...

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Discusión

Las adaptaciones metodológicas introducidas en los protocolos aquí descritos están destinadas a evitar pérdidas y aumentar el rendimiento, manteniendo al mismo tiempo las actividades del complejo mitocondrial (lo cual es crucial cuando la disponibilidad de cantidades suficientes de muestras se ve comprometida) y reproducir el patrón esperado de SC del tejido o de la línea celular (ver Figura 2C). Con este propósito y dado que no se requiere una alta pureza mitocondrial para detectar correcta...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo ha contado con el apoyo de la subvención número "PGC2018-095795-B-I00" del Ministerio de Ciencia e Innovación (https://ciencia.sede.gob.es/) y de las subvenciones "Grupo de Referencia: E35_17R" y subvención número "LMP220_21" de la Diputación General de Aragón (DGA) (https://www.aragon.es/) a PF-S y RM-L.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ácido acéticoPanReac131008
Ácido aminocaproicoFluka Analytical7260
ATPSigma-AldrichA2383
Bis TrisAcrons Ensayo de327721000
BradfordBiorad 5000002
Coomassie Blue G-250Serva17524
Coomassie Blue R-250Merck1125530025
Citocromo cSigma-AldrichC2506
Diamino  bencidina (DAB)Sigma-AldrichD5637
DigitoninSigma-AldrichD5628
EDTAPanReac131669
EGTASigma-AldrichE3889
Libre de ácidos grasos BSARoche10775835001
GlycinePanReacA1067
Homogeneizador Mortero de teflónDeltalab 196102
ImidazolSigma-AldrichI2399
K2HPO4PanReac121512
KH2PO4PanReac121509
manitolSigma-AldrichM4125
MetanolLabkemMTOL-P0P
MgSO4PanReac131404
Mini Trans-Blot CellBioRad1703930
MOPSSigma-AldrichM1254
MTCO1 Anticuerpo monoclonalInvitrogen459600
NaClSigma-AldrichS9888
NADHRoche10107735001
NativePAGE 3 a 12% Mini Geles de ProteínasInvitrogenBN1001BOX
NativePAGE Aditivo tampón catódico (20x)InvitrogenBN2002
NativePAGE Running Buffer (20x) InvitrogenBN2001
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Nitroblue sal de tetrazolio (NBT)Sigma-AldrichN6876
Pb(NO3)2Sigma-Aldrich228621
Membrana PDVFAmersham10600023
Metasulfato de fenazina (PMS)Sigma-AldrichP9625
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SDHA Anticuerpo monoclonalInvitrogen459200
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UQCRC1 Anticuerpo MonoclonalInvitrogen459140
XCell  SureLock Mini-CellInvitrogen  EI0001

Referencias

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