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Artículo de método

Aislamiento de células madre mesenquimales de gelatina de Wharton y sus exosomas derivados/pequeñas vesículas extracelulares

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DOI:

10.3791/66778

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11 de noviembre de 2025

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1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Ain Shams University, 2School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire Hosted by Global Academic Foundation, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Ain Shams University, 4Department of Pharmacology and Biochemistry, Faculty of Pharmacy, The British University in Egypt, 5Health Research Center of Excellence, Drug Research and Development Group (DRD-G), The British University in Egypt

En este artículo

Resumen

El tejido del cordón umbilical es una fuente rica, fácilmente disponible y no invasiva de células madre mesenquimales (MSC). En este protocolo, se proporcionan pasos detallados para el aislamiento y la caracterización de las MSC de gelatina de Wharton humanas (WJ-MSC), seguidos de un protocolo corto y simple para aislar sus exosomas derivados o pequeñas vesículas extracelulares.

Resumen

En el campo de la medicina regenerativa, las células madre mesenquimales (MSC) han despertado una atención particular. Las MSC del tejido del cordón umbilical (CU), conocidas como gelatina de Wharton, se han establecido particularmente bien en una variedad de aplicaciones. En comparación con otras fuentes de MSC, las MSC de gelatina de Wharton (WJ-MSC) ofrecen una serie de beneficios y están aisladas de la CU, que generalmente se elimina como desecho médico. Las WJ-MSC, por lo tanto, no plantean ninguna cuestión ética similar a la relativa a las células madre embrionarias. Se utilizó una técnica de explante simple y reproducible para aislar las WJ-MSC del tejido de CU. Dentro de los cinco a diez días posteriores al aislamiento, las WJ-MSC emergen como células adherentes con forma fibroblástica. Después de ser aisladas, las células alcanzan aproximadamente el 80% de confluencia en 14-18 días. A continuación, en el pasaje 3, las WJ-MSC aisladas se caracterizaron completamente induciéndolas a diferenciarse a lo largo de los linajes mesenquimales adipogénicos, osteogénicos y condrogénicos. Además, se probó el inmunofenotipado de marcadores de superficie de grupo de diferenciación (CD) negativos, incluidos CD34, CD14 y HLA-DR, así como marcadores de superficie distintivos de MSC como CD105, CD90, CD73 y CD44. Además, se utilizó un reactivo precipitante en un enfoque sencillo para aislar exosomas / pequeñas vesículas extracelulares (sEV) del medio condicionado de esas WJ-MSC. Después de ser aislados, se observaron exosomas/sEV bajo un microscopio electrónico de transmisión y se utilizó el análisis del tamaño de las partículas para calcular su tamaño promedio. En resumen, las WJ-MSC proporcionan un suministro renovable, no invasivo y fácilmente disponible de células madre que pueden usarse como fábricas para producir exosomas/sEV. Estas WJ-MSC y sus exosomas / sEV derivados se pueden utilizar en una amplia gama de aplicaciones terapéuticas y de investigación posteriores.

Introducción

Hace solo unos años, se pensaba que las células madre tomaban la delantera en la medicina 1,2. Sin embargo, la preocupación ética planteada por las células madre embrionarias (ESC) fue un gran obstáculo que dificultó el rápido progreso en el campo3. Esto despertó mucho interés en la exploración de fuentes renovables alternativas para las células madre, especialmente aquellas que pueden aislarse postnatalmente del cordón umbilical (CU)4. La CU se une naturalmente a la placenta y al feto dentro de una madre embarazada. El papel innato de la CU es nutrir al feto en crecimiento con un suministro continuo y suficiente de sangre a través de los vasos sanguíneos y garantizar la protección de estos vasos evitando cualquier posible torsión, compresión o torsión del feto durante su movimiento5. Anatómicamente, la CU humana consta de dos arterias y una vena que están incrustadas dentro de un tejido conectivo mucoide y encerradas dentro de una capa externa de epitelio amniótico6. La matriz de CU, o el tejido conectivo mucoide que encierra los tres vasos umbilicales, se conoce como "gelatina de Wharton" (WJ) y está compuesta principalmente de proteoglicanos y colágeno7.

Recientemente, las células madre mesenquimales (MSC) han llamado mucho la atención por ser una nueva modalidad terapéutica eficaz para una amplia gama de aplicaciones de medicina regenerativa 7,8,9,10,11,12. Lo más intrigante de las MSC es su facilidad de aislamiento, así como las actividades inmunomoduladoras demostradas y la multipotencia 13,14,15. Otras ventajas superiores de las MSC en general y de las derivadas de WJ en particular son que no se manifiestan teratomas tras el trasplante, a diferencia de las ESC, y el hecho de que mantienen su propiedad de tallo incluso después de varios pasajes celulares16,17. Por lo tanto, ahora se cree que las MSC podrían proporcionar intervenciones terapéuticas revolucionarias para diversas enfermedades 8,18,19. Es importante señalar que en 2006, la Sociedad Internacional de Terapia Celular y Génica (ISCT) definió criterios mínimos específicos para la caracterización adecuada de las MSC20. Primero, cuando se cultivan / cultivan en condiciones de cultivo estándar, se supone que las MSC son adherentes al plástico. En segundo lugar, las MSC deben expresar algún grupo característico de marcadores de superficie de diferenciación (CD) como CD90, CD105 y CD73, y no deben mostrar la expresión de otros como CD14, CD34 y CD45. En tercer lugar, las MSC deben diferenciarse en linajes osteogénicos, adipogénicos y condrogénicos in vitro20. Hasta el día de hoy, las MSC se han aislado de múltiples fuentes, incluidos tejidos adultos como la médula ósea (BM), el tejido adiposo21, así como fuentes fetales / perinatales como la placenta, la sangre de CU (UCB) y la matriz de CU22,23. Cabe destacar aquí que al comparar la tasa de éxito de la recolección de MSC, se ha informado que alcanza casi el 100% del tejido WJ en comparación con solo alrededor del 6% de UCB24,25. Por lo tanto, aunque UCB es de hecho una fuente rica en células madre hematopoyéticas, también se considera una buena fuente de MSC, aunque significativamente más baja que WJ 26,27,28.

Las WJ-MSC son excepcionales en comparación con otros tipos de MSC porque, aunque son MSC de buena fe (típicas), que poseen propiedades similares a las de sus contrapartes adultas, también poseen la expresión de varios marcadores de pluripotencia / ESC17,29. En consecuencia, se cree que las WJ-MSC se encuentran en algún lugar entre las células madre adultas y embrionarias17. Curiosamente, se ha descubierto que las WJ-MSC expresan marcadores de MSC y ESC humanas y son capaces de mantener la tallo durante varios pasajes16. Afortunadamente, tras el trasplante, no forman teratomas17. Esto se puede dilucidar por su perfil transcriptómico único en comparación con las ESC, así como con otras MSC29,30. Las WJ-MSC presentan varias ventajas sobre las MSC adultas, e incluso sobre otros tipos de células madre en general. Sus medios de aislamiento están fácilmente disponibles, a través de la CU que se desecha rutinariamente al nacer y, por lo tanto, se considera un desecho médico. Por lo tanto, a diferencia de las ESC, las WJ-MSC no tienen preocupaciones éticas y, a diferencia de las BM-MSC, se aíslan mediante una técnica invasiva31. Además, al igual que otros tipos de MSC, las WJ-MSC carecen de la expresión del antígeno leucocitario humano relacionado con D (HLA-DR) y, en particular, se ha encontrado que expresan el antígeno leucocitario humano G (HLA-G), lo que les proporciona un privilegio inmunológico adicional32. Esto sugiere que las WJ-MSC exhiben un papel inmunosupresor simulando lo que generalmente ocurre en la interfaz feto-madre in vivo 33,34,35. Finalmente, al igual que sus análogos aislados de UCB, las WJ-MSC tienen un gran potencial para la banca36. Dadas todas estas ventajas, se defiende que las WJ-MSC sean el nuevo estándar de oro para las terapias basadas en MSC30.

Curiosamente, una gran cantidad de investigaciones han revelado que las MSC exhiben sus efectos terapéuticos principalmente a través de la señalización paracrina. En muchos casos, se ha informado que tales efectos ocurren en respuesta a exosomas / pequeñas vesículas extracelulares (sEV) secretadas por MSC37. Los exosomas/sEV se conocen como vesículas bioactivas de tamaño nanométrico que se adquieren del sistema de endomembranas de la célula. Actúan como lanzaderas que transfieren cargas específicas de proteínas, ARNm, así como ARN no codificantes como microARN y ARN largo no codificante (LncRNA), como un mensaje en una botella38. Como consecuencia, pueden reprogramar las células receptoras y se denotan como "señalosomas" que manipulan funciones celulares esenciales39. Los exosomas / sEV derivados de MSC han demostrado su superioridad sobre las terapias de MSC al ser una posible alternativa libre de células. Al igual que sus MSC parentales, se ha descubierto que los exosomas/sEV provocan efectos terapéuticos y regeneración celular en varias enfermedades. Sin embargo, a diferencia de sus células madre, pueden atravesar las barreras biológicas más fácilmente. Además, carecen de problemas críticos de seguridad; no imparten ningún riesgo de rechazo inmunológico o formación de tumores a largo plazo40. Además, los exosomas/sEV pueden emplearse para aplicaciones de terapia génica como medio de un sistema de administración de fármacos, estando naturalmente equipados para transferir información genética41. Por lo tanto, los exosomas/sEV han encendido nuevas y emocionantes vías para nuevas intervenciones terapéuticas de diversas enfermedades 42,43,44.

En este protocolo, se presenta un protocolo completo basado en explantes para el aislamiento y la caracterización de WJ-MSC del tejido de la CU. A esto le seguirá un protocolo conciso para el aislamiento de exosomas/sEV de medios condicionados de estas WJ-MSC.

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Protocolo

Todos los experimentos y procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas aprobadas y fueron aprobados por los Comités de Ética de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Ain Shams, El Cairo, Egipto (ACUC-FP-ASU RHDIRB2020110301 REC # 220) y la Facultad de Farmacia de la Universidad Británica de Egipto, El Cairo, Egipto (CL-2309). Las CU se obtuvieron después de obtener el consentimiento informado firmado de los padres.

1. Aislamiento de WJ-MSC del cordón umbilical humano

  1. Coloque aproximadamente 30-40 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en un recipiente (bolsa de recolección sellada) para recolectar el cordón umbilical (CU) (aproximadamente 15 cm de largo) inmediatamente después del parto. Mantenga la CU recolectada en hielo y procésela dentro de un máximo de 4-5 h desde la recolección.
    NOTA: La muestra no se puede procesar después de 4-5 h, ya que esto disminuirá en gran medida el rendimiento de las MSC. Asegúrese de que el PBS y el recipiente estén estériles.
  2. Prepare medios de cultivo completos para WJ-MSC compuestos por medio Eagle modificado de Dulbecco con bajo contenido de glucosa (LG-DMEM) complementado con suero fetal bovino (FBS) al 10%, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina y 0,25 μg/ml de anfotericina B.
  3. Coloque 3 ml de medios completos por pocillo en placas de 6 pocillos, luego coloque las placas de 6 pocillos que tienen medios en una incubadora de CO2 a 37 °C y 5% de CO2 para calentar y prepararse.
  4. En el gabinete de bioseguridad, prepare ocho placas de cultivo celular de 10 cm, cada una de ellas llena con 10 ml de PBS estéril.
  5. Con cuidado, usando pinzas esterilizadas, transfiera la CU de la bolsa de plástico sellada a la primera placa de Petri que contiene PBS para lavar la sangre (repita este paso hasta que se elimine toda la sangre de la muestra).
  6. Rocíe etanol al 70% en un hisopo estéril y utilícelo para limpiar la CU durante 30 s.
  7. Transfiera la CU a una nueva placa de Petri llena de PBS estéril para eliminar cualquier etanol residual.
  8. Transfiera la CU a otra placa de Petri previamente llena con PBS estéril y, con unas tijeras estériles, corte la CU en trozos más pequeños (de unos 3 cm cada uno). Luego, mueva esas piezas de 3 cm de largo a otra placa de Petri con PBS fresco estéril para evitar que se libere sangre durante el proceso de corte.
    NOTA: A partir de este momento, las piezas UC deben mantenerse en hielo, así como todos los pasos de procesamiento posteriores. Esto es realmente importante para evitar la liberación de materia gelatinosa y garantizar el éxito del procedimiento de aislamiento de WJ-MSC del tejido de la CU. El procesamiento de la CU recolectada en un plazo máximo de 4-5 h es crucial para el éxito del proceso de aislamiento. Anteriormente, la CU se procesaba dentro de períodos más largos después de la recolección y, desafortunadamente, el procedimiento no mostró resultados exitosos (datos no mostrados).
  9. Comience a procesar las piezas de CU una por una (en hielo) en una placa de Petri llena de PBS estéril. Use tijeras y fórceps estériles para cortar los vasos sanguíneos y aislar el tejido de gelatina de Wharton (WJ). Luego coloque las piezas transparentes de WJ en otra placa de Petri llena de PBS estéril con hielo.
    NOTA: Durante el aislamiento del tejido WJ de la pieza de CU, la primera incisión se realiza en el lado transparente de la pieza de CU, lejos de los vasos sanguíneos, para evitar cortar el vaso. Luego, los vasos sanguíneos se sujetan, se cortan y se retiran.
  10. Repita el paso anterior en todas las piezas de CU para obtener tejido WJ claro sin vasos sanguíneos.
    NOTA: Cambie la placa de Petri de PBS, si es necesario, durante el procesamiento de las piezas de CU y la extracción de los vasos sanguíneos, si la solución de PBS se vuelve sanguinolenta o poco clara durante el aislamiento del tejido WJ.
  11. Lave las piezas de WJ recolectadas con PBS transfiriéndolas a una placa de cultivo celular fresca de 10 cm llena de PBS estéril.
  12. Use un bisturí y pinzas estériles y afilados para cortar los tejidos WJ recolectados en trozos pequeños de 10 mm de largo.
  13. Transfiera las piezas WJ a las placas de 6 pocillos preparadas previamente en el paso 1.3. Coloque 5-6 piezas de WJ por pocillo, luego incube las placas de 6 pocillos que contienen explantes de tejido WJ en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 a 37 ° C en la incubadora de CO2 y déjelas reposar durante 3 días.
  14. Al4º día de la colocación de los explantes de tejido WJ, agregue con cuidado 1 ml de medio por pocillo, teniendo cuidado de no perturbar los explantes.
    NOTA: Evite tocar o rayar la parte inferior de la placa donde se unen las piezas WJ.
  15. Repita el paso anterior el6º día después de colocar los explantes de tejido WJ.
  16. En el8º día después de colocar los explantes de tejido WJ (es decir, casi 1 semana después de la colocación del explante), comience a cambiar la mitad del medio por pocillo cada dos días hastael día 12-14 después de la colocación del explante. Reemplace la mitad de los medios de cultivo de cada pocillo retirando aproximadamente 2,5 ml de cada pocillo y agregando 2,5 ml nuevos de medios tibios completos (37 ° C).
    NOTA: Retire el medio de la superficie del pocillo y evite tocar o rayar la parte inferior de la placa donde se unen las piezas WJ. Las WJ-MSC generalmente aparecen debajo y alrededor de los explantes de tejido WJ dentro de los 5 a 10 días posteriores a la colocación de los explantes.
  17. Observe las placas de 6 pocillos de forma rutinaria bajo un microscopio invertido (aumento de 10x), y si las células liberadas están proliferando y su confluencia está aumentando, alcanzando el 50-60%, continúe con el siguiente paso; Si no es así, repita el paso 1.16. otra vez. Las piezas de WJ se reducen significativamente de tamaño con el tiempo.
  18. Retire suavemente los explantes WJ adheridos al fondo de los pocillos y retire todo el medio. La eliminación de las piezas de explante de WJ generalmente se realiza entre el día 12y el 14 desde su colocación inicial.
    NOTA: Incline ligeramente las placas en un ángulo de 45° mientras retira el medio para asegurarse de que se retiren todos los medios.
  19. Lave cada pocillo con 2 ml de PBS, agite suavemente el plato y luego deseche el PBS. Repita este paso de lavado dos veces.
    NOTA: Agregue suavemente PBS a la pared del pozo y evite tocar el fondo de los pocillos para asegurarse de que no se alteren las células en absoluto.
  20. Agregue 2 ml de medio completo tibio por pocillo suavemente (medio con composición exacta como la descrita en el paso 1.2) e incube las placas de 6 pocillos en condiciones humidificadas con 5% de CO2 a 37 °C.
  21. Cambie el medio por completo cada dos días (2 ml de medio completo por pocillo) hasta que las células alcancen aproximadamente el 80% de confluencia.
  22. Cuando las células alcancen aproximadamente el 80% de confluencia, pase las células usando tripsina-EDTA a matraces de cultivo celular T25 (el total de células obtenidas de una placa de 6 pocillos se puede pasar a un matraz de cultivo T25, use 8-9 ml de medios completos por matraz T25). Estas WJ-MSC se denotan como células P1.
    NOTA: No deje las células por mucho tiempo con tripsina-EDTA para evitar efectos tóxicos; Por lo general, 3 min son suficientes para el desprendimiento de las células. Diferentes proveedores pueden proporcionar tripsina-EDTA con potencia variable. En consecuencia, esto debe tenerse en cuenta al especificar el tiempo de incubación.
  23. Cambia los medios cada dos días. Una vez que las células hayan alcanzado aproximadamente el 80% de confluencia, pasar las células usando tripsina-EDTA a matraces de cultivo celular T75 (el total de células obtenidas de un matraz de cultivo T25 se puede pasar a un matraz de cultivo T75; use 15-18 ml de medios completos por matraz T75); estas WJ-MSC se denominan células P2.
  24. Cambia los medios cada dos días. Una vez que las células hayan alcanzado aproximadamente el 80% de confluencia, separe las células con tripsina-EDTA, luego siembre WJ-MSC a una densidad de aproximadamente 0,75 x 106-1 x 106 células por matraz T75. Estas WJ-MSC se denominan células P3.
    NOTA: Utilice células entre P3-P5 para futuros experimentos descritos en este protocolo.
  25. Criopreservar las WJ-MSC aisladas en nitrógeno líquido utilizando medios de criopreservación compuestos por 80% de FBS, 10% de medios completos (como se describe en el paso 1.2) y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO).
    NOTA: En la Figura 1 se proporciona una presentación esquemática de todos los pasos para el aislamiento de WJ-MSC.

2. Caracterización de WJ-MSC aisladas mediante inmunofenotipado mediante análisis de citometría de flujo para varios marcadores de superficie de CD

  1. Separe las células usando tripsina-EDTA en el paso 4. Lave las células con PBS dos veces y cuente su número con un hemocitómetro.
    NOTA: El tiempo de incubación mínimo (durante 3 min) durante la tripsinización es fundamental para separar las células con éxito sin ejercer ningún daño. La incubación prolongada con tripsina-EDTA podría dañar los marcadores de la superficie celular y afectar negativamente los resultados del ensayo de inmunofenotipado.
  2. Incubar unas 100.000 células (en condiciones de oscuridad) durante 20 min a 4 °C con anticuerpos monoclonales humanos marcados con ficoeritrina (PE) o isotiocianato de fluoresceína (FITC) de la siguiente manera: Anti-CD90 PE, Anti-CD73 PE, Anti-CD105 FITC, Anti-CD44 PE, Anti-CD34 PE, Anti-CD14 PE y Anti-HLA-DR FITC, y utilizar células no teñidas como controles
  3. Enjuague las células con PBS y vuelva a suspenderlas después en 500 μL de tampón FACS; analizar mediante citometría de flujo45.

3. Evaluación del potencial de diferenciación de las WJ-MSC aisladas hacia varios linajes mesenquimales

  1. Diferenciación adipogénica
    1. Vuelva a suspender las células en medios de proliferación completa (como se describe en el paso 1.2). A continuación, se cultivan las células a una densidad de 3,7 x 104 células/pocillo (0,5 ml de medio/pocillo) en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Luego, incubar en condiciones humidificadas de 5% deCO2 a 37 °C. A continuación, cada dos días, cambie el medio hasta que las células alcancen casi el 100% de confluencia; Esto suele tardar entre 3 y 4 días.
    2. Retire el medio de proliferación y reemplácelo con medios de diferenciación adipogénicos para inducir la adipogénesis. Complemente el medio LG-DMEM con 100 μg/ml de estreptomicina, 100 U/ml de penicilina, 0,25 μg/ml de anfotericina B y el suplemento adipogénico proporcionado en el kit de identificación funcional de células madre mesenquimales. Después, cambie el medio suavemente (0,5 ml/pocillo) cada 3 días y evite la interrupción de las vacuolas lipídicas.
    3. Después de aproximadamente 21 días, mediante un examen microscópico, tiña las vacuolas lipídicas con Oil Red para evaluar la diferenciación adipogénica.
    4. Prepare una solución madre fresca de Oil Red; disuelva 30 mg de tinción Rojo Aceite en 10 ml de isopropanol y deje reposar durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, prepare una solución de trabajo mezclando 2 partes de agua doble destilada (ddH2O) con 3 partes de solución madre, mezclándolas bien y dejándolas reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después, filtrar con un filtro de 0,22 o 0,45 μm.
      NOTA: Para obtener los mejores resultados de tinción, prepare recién el tinte Oil Red.
    5. Para documentar con éxito la diferenciación adipogénica, lave las células dos veces con PBS y fíjelas con formalina al 10% tamponada neutra (0,75 ml / pocillo) durante 15 min. Después, lave las células dos veces con PBS usando 1 ml / pocillo (antes de desechar el PBS después de cada lavado, incube las células durante aproximadamente 5 min).
      NOTA: Las células mantenidas en medios de proliferación (descritas en el paso 1.2) se utilizan como células de control, no inducidas. Agregue formalina tamponada neutra lentamente a las paredes, no directamente sobre las células, para evitar daños celulares. Después del lavado final con PBS, la aspiración completa de PBS es crucial antes de agregar la solución de trabajo para manchas Oil Red para evitar manchas ineficientes.
    6. Después del lavado final, tiña las células (1 ml/pocillo) con la solución de trabajo Oil Red e incuba durante 60 min a 37 °C. A continuación, retire y deseche la solución de tinción y enjuague suavemente las células dos veces con PBS. Luego, bajo el microscopio, observe las gotas de lípidos teñidas.
  2. Diferenciación osteogénica
    1. Vuelva a suspender las células en medios de proliferación completa (como se describe en el paso 1.2). Posteriormente, en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos, sembrar 7,4 x103 células/pocillo (añadir 0,5 mL medio/pocillo), e incubarlas durante 3 días en condiciones húmedas al 5% de CO2 a 37 °C para alcanzar casi el 70% de confluencia.
    2. Con una confluencia de aproximadamente el 70%, reemplace los medios de proliferación con medios de inducción de diferenciación que incorporen el suplemento osteogénico, proporcionado en el kit de identificación funcional de células madre mesenquimales, en medios LG-DMEM complementados con 10% de FBS, junto con 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina y 0,25 μg/ml de anfotericina B.
    3. Reemplace el medio de diferenciación una vez cada 3 días y continúe la inducción osteogénica durante aproximadamente 21 días.
    4. Prepare una solución de trabajo de tinción Alizarin Red S; traiga 9 ml de ddH2O y disuelva 200 mg de tinción de rojo de alizarina S en él, y luego use hidróxido de amonio y HCl para ajustar el pH a 4.1-4.3. A continuación, complete el volumen a 10 ml con ddH2O. Luego, filtre la solución con un filtro (0,22 o 0,45 μm) para eliminar los precipitados.
    5. Al final del período de inducción, enjuague las células dos veces con PBS y luego fíjelas con formalina al 10% tamponada neutra (0,75 ml / pocillo) y déjelas reposar durante 15 min. Después, enjuague las células dos veces con PBS (1 ml/pocillo) y asegúrese de incubar las células durante 5 min con cada enjuague.
      NOTA: Las células mantenidas en medios de proliferación (descritas en el paso 1.2) se utilizan como células de control, no inducidas.
    6. Agregue la solución de trabajo al 2% de Alizarin-Red S preparada en el paso 3.2.4 a las células fijas del paso anterior e incube en la oscuridad durante unos 45-60 minutos a temperatura ambiente.
    7. Posteriormente, deseche la solución de tinción y enjuague las células con ddH2O dos veces y luego con PBS una vez, luego evalúe la diferenciación osteogénica exitosa bajo el microscopio observando la matriz extracelular rica en calcio teñida.
  3. Diferenciación condrogénica
    1. Vuelva a suspender las células en medios de proliferación completa (como se describe en el paso 1.2). Posteriormente, en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos, sembrar 7,4 x 103 células/pocillo (añadir 0,5 mL de medio/pocillo) e incubarlas en condiciones húmedas al 5% de CO2 a 37 °C durante 3 días para alcanzar casi el 90% de confluencia.
    2. Con una confluencia de aproximadamente el 90%, comience a inducir la diferenciación condrogénica utilizando DMEM/F12 sin suero suplementado con insulina-transferrina selenio (ITS) y un suplemento condrogénico, provisto con el kit de identificación funcional de células madre mesenquimales, junto con 0,25 μg/ml de anfotericina B, 100 U/ml de penicilina, 2 mM de L-glutamina y 100 μg/ml de estreptomicina46.
      NOTA: El medio de inducción de diferenciación condrogénico completo se mantiene en la oscuridad a 2-8 °C.
    3. Continuar la inducción de la diferenciación condrogénica durante unos 21 días; Mientras tanto, cambie los medios cada 3 días.
    4. Prepare la solución de trabajo de tinción azul alcián de la siguiente manera: Primero, prepare ácido acético glacial al 3% en ddH2O (agregue 3 ml de ácido acético glacial y llene hasta 100 ml con ddH2O). Luego, prepare una solución de trabajo para tinción de azul alcián agregando 20 mg a 20 ml de solución de ácido glacial al 3%, manteniéndola reposar durante aproximadamente 30 minutos y filtrando posteriormente con un filtro de 0,22 μm o 0,45 μm para eliminar cualquier precipitado.
    5. Al final del período de inducción, enjuague las células dos veces con PBS, luego fíjelas con formalina tamponada neutra al 10% (0,75 ml / pocillo) y déjelas reposar durante 15 min. Después de eso, lave las células dos veces con PBS (1 ml / pocillo). Asegúrese de incubar las células durante 5 minutos cada vez.
      NOTA: Las células mantenidas en medios de proliferación (como se describe en el paso 1.2) se utilizan como células de control, no inducidas.
    6. Incubar las células fijas en la solución de trabajo preparada con azul alcián al 0,1% durante unos 60 min a 37 °C. Enjuague las células con ddH2O dos veces y con PBS una vez para eliminar la mancha residual. Luego, mediante un examen microscópico, observe los proteoglicanos sulfatados teñidos.

4. Aislamiento de exosomas/sEV de medios condicionados con WJ-MSC

  1. Vuelva a suspender las WJ-MSC en medios de proliferación completos (como se describe en el paso 1.2) y siembre placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos con estas WJ-MSC a una densidad de 150.000 células/pocillo (2 ml de medios/pocillo) e incubarlas a 37 °C en condiciones húmedas al 5% de CO2.
  2. Prepare los medios de recolección de exosomas sin suero (SF) de la siguiente manera: Medio de águila modificado de Dulbecco con bajo contenido de glucosa (LG-DMEM) suplementado con 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina y 0,25 μg/ml de anfotericina B.
    NOTA: Los medios de recolección de exosomas tienen la misma composición que los medios de proliferación completos (descritos en el paso 1.2) pero sin FBS.
  3. Siga las placas de 6 pocillos (preparadas en el paso 4.1) y reemplace el medio cada dos días usando el medio de proliferación (como se describe en el paso 1.2). Observe las células bajo un microscopio hasta que alcancen aproximadamente un 75-80% de confluencia.
  4. Cuando se alcance el 70% de confluencia, lavar las células dos veces con PBS (1 ml/pocillo), luego agregar medios de recolección de exosomas sin suero (SF) (1,5 ml/pocillo) (descritos en el paso 4.2) e incubar durante 48 h a 37 °C en condiciones húmedas al 5% de CO2.
  5. Después de 48 h, recoja los medios acondicionados de WJ-MSC de las placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos colocadas en el paso anterior en tubos de recolección de centrifugación de 15 ml. A continuación, lleve a cabo los siguientes pasos secuenciales de centrifugación y filtración para limpiar los medios acondicionados recogidos47.
    NOTA: Usando un colorante de exclusión de azul de tripano seguido de un recuento de células con el hemocitómetro, evalúe el porcentaje de viabilidad de las células utilizadas inicialmente para derivar los medios acondicionados recolectados; Idealmente, las células viables deberían ser superiores al 90%. Después, almacene el sedimento celular recogido a -80 °C en caso de que sea necesario para futuras investigaciones.
    1. Centrifugar el medio acondicionado recogido a 300 x g durante 10 min a 4 °C para eliminar las células en suspensión. A continuación, recoge el sobrenadante y realiza el siguiente paso de centrifugación para este sobrenadante recogido (medio acondicionado).
    2. Centrifugar el medio acondicionado obtenido del paso 4.5.1 a 3000 x g durante 15 min a 4 °C para eliminar las células necróticas y los restos celulares.
      NOTA: Los pasos de centrifugación se realizan preferiblemente a 4 °C, pero también se pueden realizar a temperatura ambiente con resultados similares.
    3. Filtre el sobrenadante obtenido del paso anterior pasándolo a través de un filtro de 0,22 μm en un nuevo tubo de polipropileno de 50 ml de recolección para eliminar los restos de células residuales y los vehículos eléctricos grandes.
      NOTA: El medio acondicionado filtrado se puede utilizar inmediatamente para los pasos posteriores para aislar exosomas/sEV, almacenar en el frigorífico a 4 °C y no más de 3 días, o almacenar a -80 °C para almacenamiento a largo plazo hasta que se requiera aislar exosomas/sEV. Es preferible que los medios acondicionados aclarados almacenados a -80 °C se procesen en un plazo máximo de 1 a 3 meses; cuanto antes mejor.
  6. Coloque 7,5 ml de medios acondicionados aclarados (obtenidos del paso 4.5) en un tubo de centrífuga de 15 ml y agregue 1,5 ml de reactivo. Agregue el reactivo al medio en una proporción de 1:5 (es decir, 1 ml de reactivo precipitante Exoquick-TC por cada 5 ml de medio). Luego, invierta el tubo hacia arriba y hacia abajo, y gírelo varias veces para asegurar una mezcla adecuada del reactivo precipitante con el medio.
    NOTA: El reactivo precipitante es un reactivo pesado y viscoso. Por lo tanto, el volumen requerido debe retirarse lenta y cuidadosamente para garantizar que el volumen deseado se transfiera por completo.
  7. Almacene el tubo que contiene el medio con el reactivo precipitante a 4 °C en posición vertical durante la noche durante aproximadamente 16 h (al menos 12 h).
  8. Al día siguiente, centrifugar la mezcla de medios/reactivos precipitantes a 1500 x g durante 30 min a 4 °C. Después de la centrifugación, el gránulo de exosomas / sEV aparece como un gránulo blanco o beige muy pequeño que se ha asentado en el fondo del tubo.
    NOTA: Este paso de centrifugación también se puede realizar a temperatura ambiente con resultados similares. En caso de que el gránulo de exosoma / sEV no sea visible al final de este paso de centrifugación, se puede agregar un tiempo de centrifugación adicional a 3000 x g durante 20-30 min adicionales a 4 ° C. A veces, el pellet de exosomas/EV permanece invisible incluso después del tiempo de centrifugación prolongado, lo que significa que hay una pequeña cantidad de exosomas/sEV. En este caso, continúe con el protocolo dejando los 5-10 μL inferiores del tubo.
  9. Aspirar el sobrenadante y centrifugar la mezcla de medios residuales/reactivos precipitantes a 1500 x g durante 5 min a 4 °C. Luego, con mucho cuidado, aspire los restos restantes de líquido sin alterar los exosomas/gránulos de sEV precipitados.
  10. Suspenda el pellet de exosomas / sEV en 100-300 μL de PBS estéril de acuerdo con el tamaño y la visibilidad del pellet. Posteriormente, estos exosomas/sEV pueden utilizarse inmediatamente o almacenarse en un ultracongelador a -80 °C para experimentos posteriores.
    NOTA: En caso de comenzar con más de un tubo de centrífuga para el mismo medio (descrito en el paso 4.9), y los gránulos de exosomas / sEV (obtenidos en el paso 4.10) son invisibles, los gránulos de exosomas / sEV recolectados de todos ellos se pueden agrupar utilizando aproximadamente 100-300 μL de PBS estéril para suspenderlos todos juntos.
  11. Cuantifique los exosomas / sEV recolectados en relación con su contenido de proteínas utilizando un kit de cuantificación de proteínas de ácido bicinconínico (BCA) disponible comercialmente, según lo indicado por el fabricante.
    NOTA: En la Figura 2 se proporciona una presentación esquemática de todos los pasos de aislamiento de los exosomas / sEV derivados de WJ-MSC.

5. Obtención de imágenes de exosomas aislados/sEV mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM)

  1. Suspender exosomas/sEV recién aislados en 100-300 μL de PBS estéril de acuerdo con el tamaño y la visibilidad del gránulo (como se describió anteriormente en el paso 4.11).
    NOTA: Es mucho más preferible utilizar exosomas/sEV recién aislados en lugar de congelados para la obtención de imágenes TEM
  2. Pipetee 20 μL de suspensión de exosomas/sEV en una rejilla recubierta de carbono y déjela secar durante 10 min.
  3. Fije los exosomas / sEV colocados con una solución de glutaraldehído (2% en agua destilada) durante unos 15 min.
  4. Después, tiña los exosomas fijos/sEV con acetato de uranilo al 2% y déjalos durante unos 3 min en la oscuridad, luego examínalos bajo un microscopio electrónico de transmisión (TEM) (aumento de 20000) utilizando la configuración predeterminada de TEM.

6. Determinación del tamaño medio de los exosomas/sEV aislados mediante un analizador de tamaño de partícula

  1. Diluya exosomas/sEV recién aislados con PBS estéril pH 7,4 en una proporción de 1:250.
  2. Mida la distribución media del tamaño de partícula de exosomas aislados/sEV utilizando un analizador de tamaño de partícula a 25 °C.

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Resultados

Aislamiento y caracterización de WJ-MSC

Como se demuestra en la Figura 3, las pequeñas células similares a fibroblastos aparecieron inicialmente debajo y alrededor de los tejidos del explante WJ dentro de los 5-10 días posteriores a la siembra de esos explantes (Figura 3A). Estas WJ-MSC liberadas continúan proliferando ...

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Discusión

En este protocolo, pudimos presentar pasos detallados para aislar WJ-MSC del tejido de CU humano y también para aislar sus exosomas / sEV derivados. La CU es una fuente no invasiva sin explotar fácilmente alcanzable para obtener MSC, y no se requiere equipo especial para la recolección o el procesamiento 11,15,30,32,48. Se han...

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Divulgaciones

Todos los coautores declaran no tener ningún conflicto de intereses asociado con este trabajo.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado parcialmente por la Universidad de Ain Shams - Subvención de Apoyo a la Investigación del Plan Estratégico (2024/2025), Egipto, y el Centro de Investigación en Nanotecnología (NTRC) - Premio de Acceso (2019/2020), Universidad Británica en Egipto (BUE), El Cairo, Egipto.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich, EE. UU.A3157
Alizarin Red SSigma-Aldrich, EE. UU.A5533
Hidróxido de amonioFisher Scientific, Alemania1336-21-6
Anticuerpo para CD-105 humano, FITCR& D systems Inc., MN, EE. UU.FAB10971F
Anticuerpo para CD-14, PE humanoBeckman Coulter, EE. UU.IM0650U
Anticuerpo para CD-34 y PE humanoBeckman Coulter, EE. UU.IM1420
Anticuerpo para CD-44, PE humanoBeckman Coulter, EE. UU.A32537
Anticuerpo para CD-73, PE humanoR& D systems Inc., MN, EE. UU.FAB5795P
Anticuerpo para el CD-90 humano, PER& D systems Inc., MN, EE. UU.FAB2067P
Anticuerpo para HLA-DR humano, FITCBeckman Coulter, EE. UU.IM1638U
Kit de cuantificación de proteínas de ácido bicinquinínico (BCA)Thermofisher23227
Armario de bioseguridad, flujo laminar, MSC AdvantageThermo Scientific, EE. UU.
Incubadora CO2 Incubadora, Forma DirectaThermo Scientific, EE. UU.
Centrífuga de refrigeraciónSigma, Alemania
Centrífuga de refrigeraciónEppendorf, Alemania
Citómetro de flujo CytoFLEX  Beckman Coulter, FL, EE. UU.
Dimetilsulfóxido (DMSO)Fisher Scientific, AlemaniaBP231-100
DMEM - Glucosa baja 1 g/LLonza, Suiza12-707F
DMEM/F12 Lonza, Suiza12-719F
Agua libre de ADNAsa/ARNAsaGibco Thermo Fisher, EE. UU.10977-035
Etanol absoluto, grado de biología molecularSigma-Aldrich, Alemania24103
ExoQuick-TCBiociencias del Sistema (SBI), EE. UU.EXOTC50A-1Agente precipitante
Suero fetal bovino (FBS)Gibco Thermo Fisher, Brasil10270-106
Formaldehído 37%Fisher ScientificBP531-500
Ácido acético glaciarSigma Aldrich, AlemaniaA38S-500
Solución de glutaraldehído  SigmaG7776
Ácido clorhídrico (HCl)Fisher Scientific, AlemaniaA144-212
Microscopio invertidoOlympus, Japón
L-GlutaminaGibco Thermo Fisher, EE. UU.25030-024
Kit de identificación funcional de células madre mesenquimalesas  R& D systems Inc., MN, EE. UU.SC006
Lector de microplacasCromate, Awareness Technologies, EE. UU.
Mancha Roja de AceiteSigma-Aldrich, EE. UU.O0625
Penicilina-Estreptomicina-AnfotericinaGibco Thermo Fisher, EE. UU.15240062
Solución salina tamponada con fosfato, 1x, sin Ca/MgLonza, SuizaBE17-516F
Baños de agua agitadosDaihan Wisebath, Corea
Filtro de jeringuilla, 0,2 micrasCorning, EE. UU.431224
Microscopio electrónico de transmisiónJEM-1200EX II, Jeol, Alemania
Trippan blue Gibco Thermo Fisher, EE. UU.15250061
Tripsina-Verseno-EDTA, 1xLonza, SuizaCC-5012
Solución de acetato de uranilo (2%)Electron Microsopy Sciences, EE. UU.22400-2
Espectrofotómetro UV-VisibleShimadzu, Japón
VórticeSciLogex
Zeta-sizer Nano ZNMalvern Panalytical Ltd, Reino Unido y nbsp;Analizador de tamaño de partículas

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