Este artículo describe un protocolo experimental detallado para medir el contenido de carbono de los macrófagos de las vías respiratorias con el objetivo de evaluar la dosis de exposición interna a nivel de exposición individual a partículas.
Artículo de método
Medición del contenido de carbono en macrófagos de las vías respiratorias expuestos a partículas que contienen carbono
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Los macrófagos pulmonares exhiben un patrón dependiente de la dosis en las partículas fagocitizantes. Después de la inmersión, estos macrófagos se excretan posteriormente con esputo, lo que hace que los macrófagos y las partículas sean visibles y cuantificables bajo microscopía óptica. En particular, el carbono elemental dentro del cuerpo de los mamíferos se origina exclusivamente a partir de contaminantes externos. En consecuencia, el contenido de carbono en los macrófagos de las vías respiratorias (CCAM) sirve como un biomarcador de exposición válido, estimando con precisión la exposición individual a las partículas (PM) que contienen carbono. Este artículo describe un protocolo que involucra la recolección, preservación, procesamiento, preparación de portaobjetos y tinción, así como la adquisición y análisis de fotos de macrófagos. Después de eliminar los núcleos de los macrófagos, se calculó la proporción de área del citoplasma ocupada por partículas de carbono (PCOC) para cuantificar el contenido de carbono en cada macrófago. Los resultados indican una elevación en los niveles de CCAM después de la exposición a PM que contiene carbono. En resumen, este método no invasivo, preciso, confiable y estandarizado permite la medición directa de partículas de carbono dentro de las células objetivo y se utiliza para la cuantificación a gran escala de CCAM individuales a través de esputo inducido.
Introducción
La contaminación del aire ambiente está asociada a muertes por enfermedades respiratorias y cardiovasculares, lo que supone una grave amenaza para la salud humana 1,2. Los datos epidemiológicos indican que la exposición crónica a partículas ambientales de menos de 2,5 μm de diámetro (PM2,5) es responsable de la muerte prematura de entre 4 y 9 millones de personas en todo el mundo. Las PM2.5 fueron clasificadas como el quinto factor de riesgo más importante para la mortalidad mundial en el Estudio de la Carga Global de Enfermedades, Lesiones y Factores de Riesgo (GBD) de 20153,4,5,6. Los estudios han revelado que el cumplimiento de las directrices de la OMS sobre contaminación atmosférica podría evitar 51.213 muertes al año por exposición a PM2,53. En la actualidad, la mayoría de los estudios carecen de la evaluación de la exposición intraindividual y sólo se basan en evaluaciones crudas en centros de vigilancia regionales más amplios, que están lejos de los niveles de exposición individual. Los biomarcadores disponibles de exposición interna, como los HAP urinarios y el benzo(a)pireno, no reflejan las asociaciones entre la exposición a material particulado y los efectos sobre la salud 7,8,9. Esto conduce a la incapacidad de establecer una relación precisa con los efectos sobre la salud. Por lo tanto, la búsqueda de marcadores que reflejen el nivel de exposición a partículas en un individuo es una de las claves para una evaluación precisa de la exposición de los individuos.
Las partículas inhaladas en los bronquios pueden excretarse con el esputo a través de oscilaciones ciliares en los bronquios. La ausencia de un sistema de transporte de flujo mucoso ciliado en los alvéolos significa que la principal ruta de eliminación de las partículas que ingresan a los alvéolos es a través de la fagocitosis y la translocación por los macrófagos10,11. Según la estructura anatómica del pulmón, su eliminación de partículas extrañas insolubles es lenta. Esto permite que el material particulado interactúe con las células pulmonares durante períodos prolongados e inicie diversos efectos biológicos, causando daño al tejido pulmonar y otros órganos12,13. La estimulación por material particulado conduce a la activación de los macrófagos, desencadenando una cascada de factores inflamatorios en los pulmones que pueden causar una respuesta inflamatoria sistémica14. Teniendo en cuenta el papel crucial de la citofagia de macrófagos en la provocación de tormentas de citoquinas en los pulmones, se teoriza que las partículas de carbono de los macrófagos pulmonares podrían reflejar la dosis biológicamente efectivade exposición a partículas nucleadas de carbono en el aire. Además, dado que no hay agregación de carbono elemental en las células de los mamíferos y las partículas que contienen carbono pueden observarse como partículas negras bajo un microscopio óptico, la recolección de macrófagos alveolares y bronquiales y la medición del contenido de carbono en ellos puede servir como marcador para evaluar la exposición a la materiaparticulada 16.
Este estudio identificó un método para evaluar con precisión los niveles individuales de exposición a partículas, conocido como el contenido de carbono de los macrófagos de las vías respiratorias (CCAM). En concreto, se recogieron muestras de esputo de la población después de que los participantes inhalaran solución salina hipertónica generada por un nebulizador ultrasónico. A continuación, estas muestras se conservaron utilizando una solución fijadora. Los macrófagos de las vías respiratorias se aislaron, se tiñeron y se fotografiaron bajo un microscopio óptico para identificar los macrófagos que contenían partículas que contenían carbono, que luego se cuantificaron. Este método proporciona un marcador biológico para evaluar con precisión los niveles individuales de exposición a partículas. Establece una base metodológica para investigar la relación entre la exposición a partículas y los efectos en la salud, sirviendo como base de investigación para explorar las asociaciones entre la exposición a PM y los resultados de salud, como las enfermedades pulmonares.
Protocolo
El estudio recibió la aprobación del Comité de Ética Médica del Instituto de Salud Ocupacional y Control de Envenenamientos, Centro Chino para el Control y la Prevención de Enfermedades (NIOHP201604), con el consentimiento informado por escrito obtenido de todos los sujetos antes del estudio y la recolección de muestras biológicas. Para este estudio, se seleccionaron empacadores de negro de humo que habían estado trabajando en una fábrica de negro de humo durante más de 1 año y estuvieron expuestos a aerosoles de negro de humo. Para llevar a cabo el estudio, se reclutó a trabajadores de una fábrica de agua hidráulica sin exposición ocupacional significativa a factores nocivos de la zona como población de control. Se seleccionaron los siguientes criterios de inclusión y exclusión para la población de estudio: Los criterios de inclusión para los empacadores de negro de humo incluyeron el contacto directo con el negro de humo durante la mayoría de los turnos y un mínimo de un año de trabajo en el área de exposición al negro de humo. Se incluyó a los trabajadores de obras hidráulicas que no habían tenido exposición ocupacional al negro de humo u otros contaminantes en su entorno de trabajo. Los criterios de exclusión abarcaron a los trabajadores con enfermedades crónicas como el cáncer, aquellos que habían estado expuestos a rayos X en los últimos tres meses, individuos con antecedentes de tuberculosis pulmonar, cirugía pulmonar, miocarditis viral, cardiopatía congénita, fiebre o inflamación reciente y trabajadores que habían tomado antibióticos recientemente. Los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Conservación del esputo
- Prepare la solución fijadora siguiendo los pasos que se indican a continuación:
- Derretir un 2% de polietilenglicol (PEG1500) en un baño de agua. Tome 20 ml de PEG1500 derretida en un tubo de centrífuga. Agregue 20 ml de etanol al 50% al tubo de centrífuga y agite bien la mezcla para crear el licor madre.
- Vierta gradualmente 40 mL del licor madre en 960 mL de etanol al 50%. Agite bien la solución para formar la solución de fijación Saccomanno. Guarde la solución en un lugar fresco y oscuro.
- Agregue 20-30 mL de la solución fijadora preparada a un tubo de centrífuga que contenga aproximadamente 2 mL de esputo. Mezcle bien el contenido.
NOTA: Asegúrese de que el volumen total no exceda los 40 ml. - Selle el tubo de centrífuga con una película de sellado. Guárdelo en un lugar fresco y oscuro. Transporta el tubo al laboratorio para su posterior procesamiento cuando esté listo.
NOTA: Siempre derrita PEG1500 en un baño de agua y úselo según la dosis prescrita.
2. Preparación de la suspensión celular en el esputo
- Prepare la solución digestiva disolviendo 0,1 g de ditiotreitol en 100 ml de solución salina según la dosis real. Almacene la solución preparada a 4 °C durante un máximo de 48 h.
- Centrifugar el tubo que contiene el esputo a 1.998 x g durante 30 min a 4 °C.
- Deseche el sobrenadante. Agregue un volumen igual de digestión de esputo al precipitado. Agite bien la mezcla.
- Coloque el tubo en un baño de agua a 37 °C hasta que se complete la licuefacción (10-15 min).
NOTA: Agite continuamente el tubo durante el proceso de licuefacción.
- Coloque el tubo en un baño de agua a 37 °C hasta que se complete la licuefacción (10-15 min).
- Filtre la mezcla licuada con una membrana filtrante de 70 μm.
- Centrifugar la solución filtrada a 500 x g durante 7 min a 4 °C.
- Desechar el sobrenadante, reteniendo el precipitado celular.
- Vuelva a suspender el precipitado celular en el tampón de fosfato de Duchenne. Centrifugar la solución resuspendida a 500 x g durante 7 min a 4 °C para obtener un precipitado de célula pura.
3. Preparación del frotis celular
- Añadir 200-600 μL de tampón de fosfato al sedimento celular. Mezcle bien el contenido; Ajuste el volumen del búfer en función de los resultados del recuento de células (apunte a >1,0 × 105 celdas).
- Tome 20 μL de la suspensión celular y cree un frotis celular utilizando el método del hematocrito17.
- Deje que la mancha se seque al aire de forma natural (dentro de las 48 h). Fije el frotis con una solución de tinción disponible en el mercado durante 10 s.
- Sumerja el frotis en una solución de tinción A durante 8 s. Durante la tinción, levante suavemente el portaobjetos hacia arriba y hacia abajo y enjuague el exceso de mancha con agua corriente.
- Teñir el frotis en solución de tinción B durante 8 s. Levante el portaobjetos durante la tinción y enjuague el exceso de mancha con agua corriente.
NOTA: Las soluciones de tinción A y B están disponibles en el kit de tinción disponible comercialmente. - Sumerja el portaobjetos en etanol anhidro dos veces, cada vez durante 2-3 s.
- Una vez seco, aplicar una cantidad adecuada de goma neutra. Selle la corredera con cubreobjetos.
4. Análisis cuantitativo de CCAM
- Utilice un microscopio óptico con un objetivo de lente de aceite de 100x. Capture imágenes de macrófagos seleccionados al azar, bien teñidos y morfológicamente intactos. Tome 50 imágenes de macrófagos al azar para cada muestra.
- Realice el análisis de imágenes en el software Image J siguiendo los pasos que se indican a continuación:
- Mida la escala y determine la longitud real y la conversión de píxel a píxel (282 píxeles = 10 μm). Establezca la escala en Imagen J (Analizar > Establecer escala), ingrese Distancia en píxeles, longitud real, unidad de longitud (μm) y marque Global.
- Usa una forma irregular para delinear las celdas. Elimine el fondo (selecciones a mano alzada, Editar > Borrar exterior). Mida el área total de las celdas (Analizar > medición).
- Recorta el núcleo (Editar > Cortar). Convierta la imagen en escala de grises a blanco y negro (Tipo de imagen > > 8 bits).
- Ajuste el valor de la escala de grises específico de cada tinción celular para un recuento preciso de partículas de carbono (imagen > Ajustar > umbral > aplicar, analizar >> medición).
- Calcule el contenido de carbono de 50 macrófagos por muestra en función del área medida y el análisis de imágenes en el software Image J.
Resultados
El esputo, conservado y procesado con la solución fijadora, mostró una morfología de macrófago intacta bajo un microscopio óptico durante el examen morfológico. Los macrófagos exhibían núcleos celulares claros, redondos o en forma de riñón, fácilmente teñibles. Después de la tinción, los núcleos celulares aparecieron de color púrpura azulado, mientras que el citoplasma era de color rosa claro o azul claro. El campo microscópico mostró impurezas mínimas, lo que facilitó la fácil identificación de las células. Dentro de las células, las partículas de carbono negro eran claramente visibles en pequeños agregados, lo que permitió el análisis cuantitativo de las partículas de carbono.
En la Figura 1 se presentan imágenes representativas de macrófagos de esputo, que muestran un número variable de partículas de carbono en diferentes células. Por ejemplo, la Figura 1A no muestra partículas de carbono, mientras que la Figura 1D exhibe la concentración más alta. Los valores de CCAM se midieron como 0,00%, 2,24%, 6,64% y 34,61% para los macrófagos (A-D), respectivamente. Durante el proceso de determinación de los parámetros CCAM, se llevó a cabo una evaluación cuantitativa del contenido de carbono en cada macrófago para mitigar los sesgos derivados de las variaciones en el tamaño de los macrófagos y la superposición de las partículas de carbono con los núcleos celulares. Se realizaron cálculos y análisis de CCAM para 50 macrófagos por sujeto de estudio, como se muestra en la Figura 2.
El estudio seleccionó a los empacadores de negro de humo (CBP) de una fábrica específica de negro de carbón acetileno como el grupo expuesto y reclutó a trabajadores de bombas de agua de plantas de agua locales, que no tenían exposición ocupacional aparente a factores dañinos, como el grupo de control (no CBP). Los resultados presentados en la Figura 2 indican un mayor CCAM en los trabajadores de empaque de negro de humo en comparación con el grupo de control.
Figura 1: Imagen microscópica óptica que muestra partículas de carbono dentro de los macrófagos de las vías respiratorias. El color negro en el citoplasma representa las partículas de carbono. Los paneles (A-D) muestran imágenes representativas de macrófagos de las vías respiratorias, cada uno de los cuales exhibe diferentes niveles de CCAM. Los valores de CCAM para los macrófagos en (A-D) fueron 0,00%, 2,24%, 6,64% y 34,61%, respectivamente. El nivel más alto de CCAM se observó en (D). Barras de escala: 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Niveles cuantitativos de CCAM en la población. Se seleccionaron aleatoriamente cincuenta macrófagos citoplasmáticamente intactos y bien teñidos para su análisis y cuantificación por sujeto de estudio. Los datos se analizaron mediante la prueba t de Student: *P < 0,05. CBP: empacadores de negro de humo; No CBP: grupo de control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discusión
Este estudio presenta un protocolo experimental detallado para el uso de CCAM derivado del esputo inducido como marcador biológico para la exposición interna a material particulado atmosférico. La CCAM puede detectarse y cuantificarse mediante microscopía óptica, sirviendo como un biomarcador de exposición interna preciso que refleja la relación con los efectos sobre la salud. Por lo tanto, existe la necesidad de establecer y optimizar un método de preservación de esputo inducido conveniente, confiable y eficiente y un método de cuantificación de CCAM para estandarizar los procedimientos metodológicos.
La determinación del contenido de carbono de los macrófagos pulmonares implica varios pasos, incluida la recolección de macrófagos pulmonares, el frotis, la tinción, la fotografía y el análisis de imágenes. En la actualidad, existen dos métodos para la recolección de macrófagos pulmonares: el esputo inducido y el lavado pulmonar, cada uno con sus propias ventajas y limitaciones18,19. El lavado pulmonar puede producir muchos macrófagos pulmonares homogéneos, pero es un método de muestreo traumático que requiere anestesia y otras afecciones médicas. Por lo tanto, no es adecuado para el muestreo a gran escala de la población general. Por el contrario, el esputo inducido es fácil de realizar, no invasivo y adecuado para el muestreo a gran escala de la población general. También permite obtener muestras repetidas. El lavado pulmonar obtiene macrófagos de los alvéolos o bronquiolos distales, mientras que el esputo inducido obtiene macrófagos que pueden originarse en las vías respiratorias. En este estudio, realizamos esputo inducido siguiendo el protocolo estándar publicado por la European Respiratory Society20.
La tasa de éxito del esputo inducido está influenciada por diversos factores, entre ellos la concentración de solución salina inhalada nebulizada y la presencia de enfermedades respiratorias en el paciente 21,22,23. Las muestras de esputo también pueden contener saliva, lo que puede interferir con la medición del contenido de carbono de los macrófagos, lo que podría reducir el recuento de macrófagos de las vías respiratorias en la muestra24. Los procedimientos operativos en este estudio estaban estandarizados, los métodos eran sencillos y la reproducibilidad era alta. Se observó que factores como el tamaño del caudal de inhalación nebulizado, la adecuación del tiempo de inducción y la presencia de intervalos durante la inducción afectaron la tasa de éxito del esputo inducido. Estas consideraciones son importantes para garantizar una medición precisa y fiable de la CCAM como biomarcador de la exposición a partículas.
La solución fijadora de Saccomanno, compuesta por un 50% de etanol y un 2% de polietilenglicol, se utiliza normalmente como fijador para preservar muestras biológicas como el líquido de lavado broncoalveolar. En este estudio, por primera vez, se utilizó esta solución fijadora para preservar el esputo obtenido de investigaciones epidemiológicas de campo. Los resultados cumplieron con la cuantificación posterior del carbono en los macrófagos, similar a la preservación de las células de esputo por la mañana para obtener frotis claros de células cancerosas25. Los procedimientos operativos estaban estandarizados, los métodos eran sencillos y la reproducibilidad era alta. Las ventajas de la conservación inducida del esputo en este estudio incluyen (1) la fácil configuración del fijador, (2) no se necesita refrigeración para la conservación, lo cual es conveniente para las encuestas epidemiológicas a gran escala, y (3) las muestras se pueden conservar en un lugar fresco y alejado de la luz. Visión clara bajo el microscopio después de la tinción, con núcleos identificables, impurezas mínimas y morfología celular completa. Esto es superior al procesamiento directo del esputo y a la aplicación del frotis en términos de morfología26.
En cuanto a los métodos experimentales, se observaron los siguientes detalles: El esputo se agitó periódicamente durante la digestión en un baño de agua a 37 °C hasta que se licuó completamente. Después de la licuefacción, se realizó una filtración en una membrana de 70 μm antes de la centrifugación para eliminar las impurezas y obtener un fondo de tinción más claro. Los precipitados celulares se lavaron nuevamente con DPBS antes de untarlos en los portaobjetos. El exceso de líquido se eliminó durante la tinción lavando los portaobjetos con agua corriente. Los portaobjetos se cambiaron entre la tinción I y la tinción II para evitar residuos. Para la fotografía, se seleccionaron aleatoriamente macrófagos con morfología completa y buena tinción, lo que afectó la cuantificación de CCAM27.
Las opciones de software de análisis cuantitativo para este estudio incluyen Image SXM e Image J28. Image SXM requiere la edición manual de imágenes antes del análisis para mejorar la precisión, lo que amplía significativamente el tiempo requerido. También se limita al procesamiento de un solo tipo de célula. Por el contrario, el software Image J utilizado en este estudio ofrece una mejor especificidad en el procesamiento de imágenes y una compatibilidad más amplia. En otras disciplinas, se han empleado métodos de microscopía de cribado de alto contenido para la selección y posterior análisis de células marcadas con fluorescencia, logrando operaciones automatizadas de alto rendimiento. La dirección futura de la investigación metodológica puede implicar el desarrollo de un etiquetado automatizado de macrófagos en el esputo y procedimientos de cribado29. Durante el procesamiento de la imagen J, los factores que influyen en la medición de CCAM incluyen el conocimiento del medidor de la información de la muestra y la determinación de los umbrales de valor en escala de grises. La adopción de un enfoque ciego puede reducir el sesgo del observador, y es posible que algunas muestras deban medirse repetidamente para evaluar la reproducibilidad. La captura y el análisis independientes de imágenes por parte de dos personas con experiencia de alto nivel pueden mejorar la precisión de la identificación de macrófagos.
El estudio empleó métodos estándar del Instituto Nacional de Seguridad y Salud Ocupacional (NIOSH) para evaluar la exposición de los sujetos a material particulado ocupacional. Se realizaron múltiples evaluaciones sobre los niveles de material particulado fino (PM2.5) y el contenido de carbono elemental (EC) relacionado con PM2.5 en el área de empaque de negro de humo y las áreas de trabajo de los trabajadores de la planta de agua del grupo de control. Hasta el 99,6% de las partículas de negro de humo (CB) tenían un diámetro aerodinámico inferior a 2,5 μm, y el 96,7% eran inferiores a 1,0 μm. En el otoño de 2012, el nivel medio de PM2,5 en la planta de envasado de CB fue de 800 microgramos por metro cúbico, con un nivel de CE relacionado con PM2,5 de 657,0 microgramos por metro cúbico30,31. En otoño de 2018, la media geométrica de CB fue de 637,4 μg/m3, y el nivel de CE relacionado con PM2,5 fue de 364,6 μg/m3. En ambas observaciones, la relación CE/CT superó el 92,5%, lo que concuerda con el hecho de que el CB es CE casi puro. Por lo tanto, se puede inferir de este estudio que las partículas de carbono en los macrófagos se derivan principalmente de la exposición al negro de humo30,31. Como resultado, la concentración de PM2.5 en el ambiente de trabajo de la población expuesta al negro de humo en este estudio fue de 637.4 μg/m3, significativamente más alta que la concentración de PM2.5 en el ambiente de trabajo de la población control (130.0 μg/m3) y aproximadamente cinco veces mayor que la de la población control. Los niveles de carbono elemental en la población expuesta al negro de humo fueron de 364,6 μg/m3, muy superiores a los 2,0 μg/m3 de la población control.
En resumen, este estudio utilizó esputo inducido por solución salina hipertónica para recolectar muestras, obtuvo macrófagos pulmonares, hizo frotis celulares y cuantificó el contenido de carbono dentro de 50 macrófagos, utilizando el número medio para representar el nivel de contenido de carbono de macrófagos para cada individuo. Esta metodología de investigación se puede adaptar para muestras de población a gran escala y se puede utilizar para evaluar con precisión el nivel de exposición interna de un individuo a las partículas.
Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo contó con el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82273669, 82241086, 42207488), el Programa de Becarios de Taishan de la Provincia de Shandong (No. tsqn202211121) y el Programa de Innovación y Tecnología para los Jóvenes Excelentes Becarios de Educación Superior de la Provincia de Shandong (2022KJ295).
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Pajitas estériles de 3 mL | Shanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD | 84202ES03 | |
| Tubo de centrífuga de 50 mL | Thermo Fisher Scientific, EE. UU. | 339652 | |
| Alcohol etílico absoluto | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD | 64-17-5 | |
| Aceite de cedro | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., LTD | C805296 | |
| Tinción rápida solución | Shanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD | 40748ES76 | |
| Dithiothreitol | Solebo Bio Co., LTD | D8220 | |
| Tampón de fosfato Duchenne (DPBS) | Thermo Fisher Scientific, EE. UU. | Cámara | |
| Olympus Corporation of Japan | DP72 | ||
| Goma de árbol neutra | Solebo Bio Co., LTD | G8590 | |
| Membrana de filtro de nylon 70um | BD Falcon Bioscience, EE. UU. | 211755 | |
| Microscopio óptico | Olympus Corporation de Japón | BX60 | |
| Polietilenglicol | Grupo Sinopharm Reactivo químico Co. LTD | 25322-68-3 | |
| Ultracentrífuga | Thermo Fisher Scientific, EE. UU. | SL40R | |
| Corredera viscosa | Jiangsu SHitAI EXPERIMENTAL Equipment Co. LTD |
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