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Artículo de método

Cultivo de una biopelícula polimicrobiana relevante para la fibrosis quística para sondear los fenotipos de la comunidad

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DOI:

10.3791/66785

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19 de abril de 2024

 , 
1Département de Biologie, Université de Sherbrooke

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un modelo de biopelícula polimicrobiana de cuatro especies relevante para los pulmones con fibrosis quística (FQ) que se puede utilizar para explorar el impacto de las interacciones bacterianas entre especies.

Resumen

La mayoría de los modelos in vitro carecen de la capacidad de investigar completamente los fenotipos bacterianos que emergen de las complejas interacciones observadas en entornos de la vida real. Esto es particularmente cierto en el contexto de infecciones difíciles de tratar, crónicas y polimicrobianas basadas en biopelículas detectadas en las vías respiratorias de personas que viven con fibrosis quística (FQ), una enfermedad genética multiorgánica. Si bien múltiples estudios de microbioma han definido las composiciones microbianas detectadas en las vías respiratorias de las personas con FQ (pwCF), hasta ahora ningún modelo in vitro ha integrado completamente las características pulmonares críticas relevantes para la FQ. Por lo tanto, existe una importante laguna de conocimiento en la capacidad de investigar los mecanismos que impulsan la patogénesis de las infecciones pulmonares por FQ de especies mixtas. Aquí, describimos un modelo de comunidad microbiana de cuatro especies desarrollado recientemente, que incluye Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguinis y Prevotella melaninogenica cultivadas en condiciones similares a la FQ. A través de la utilización de este sistema, se observaron y exploraron a nivel molecular fenotipos clínicamente relevantes, como la recalcitrancia antimicrobiana de varios patógenos. La utilidad de este modelo in vitro reside en su flujo de trabajo estandarizado que puede facilitar el estudio de las interacciones entre especies en el contexto de las infecciones pulmonares crónicas por FQ.

Introducción

Las estrategias destinadas a erradicar los microbios causantes de enfermedades, como los detectados en las vías respiratorias de la fibrosis quística (FQ), una enfermedad genética multiorgánica, a menudo fracasan1. Es decir, la presencia de comunidades microbianas resistentes similares a biopelículas que crecen en el entorno pulmonar rico en moco de la FQ puede causar infecciones crónicas que abarcanvarias décadas. Además, aunque la utilización de antimicrobianos de primera línea (Abx) y moduladores ha dado lugar a mejores resultados en las personas con FQ (pwCF), el enfoque clínico de "un insecto, una infección" que se emplea normalmente contra los patógenos canónicos de la FQ, como Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus, ha sido ineficaz para resolver las infecciones difíciles de tratar detectadas en los pulmones de estos individuos 3,4. 5,6,7.

En las últimas dos décadas, múltiples estudios han cambiado nuestra comprensión de la enfermedad pulmonar crónica por FQ8. Es decir, los informes indican que las infecciones detectadas en las vías respiratorias de las pcCF no son causadas únicamente por un solo patógeno, sino que son de naturaleza polimicrobiana8. Además, aunque la patogenia de las infecciones pulmonares por FQ de especies mixtas es todavía poco conocida, la evidencia clínica muestra que las pwCF coinfectadas con S. aureus y P. aeruginosa en sus vías respiratorias tienen una función pulmonar peor que los individuos colonizados por cualquiera de estos dos patógenos9.

Se plantea la hipótesis de que las interacciones entre especies entre los patógenos de la FQ son una razón por la que las infecciones basadas en biopelículas polimicrobianas no se erradican fácilmente mediante la utilización de terapias para la FQ, lo que en última instancia repercute en los resultados de los pacientes3. En apoyo de esto, los estudios in vitro han demostrado que las interacciones entre microbios como P. aeruginosa, S. aureus y otros pueden afectar fenotipos clínicamente relevantes, como la respuesta de Abx a los medicamentos de primera línea para la FQ, incluida la vancomicina y la tobramicina 6,10,11. Por lo tanto, aún no se ha logrado revisar las estrategias de tratamiento actuales destinadas a erradicar los patógenos de la FQ en el contexto de infecciones de especies mixtas.

El estándar de oro en el tratamiento de las infecciones pulmonares por FQ de base microbiana depende en gran medida de la utilización de pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos (AST) para guiar las intervenciones clínicas12. Sin embargo, la AST se realiza típicamente utilizando monocultivos bacterianos cultivados en cultivos ricos y bien mezclados, lo que no refleja las condiciones de crecimiento microbiano detectadas en las vías respiratorias de FQ 3,13. Dada la importante desconexión entre los resultados de los pacientes y el éxito del tratamiento, los informes clínicos abogan ahora por el desarrollo de nuevos enfoques que integren las características críticas del pulmón con FQ12,14.

Pocos estudios han desarrollado sistemas bacterianos multiespecie in vitro relevantes para la FQ que contienen más de dos patógenos15,16. Sin embargo, estos modelos (1) no reflejan completamente la naturaleza polimicrobiana y biofilmística del pulmón con FQ y (2) no utilizan condiciones nutricionales y ambientales que se aproximen a las detectadas en la vía aérea de FQ15,16. A través de la minería de grandes conjuntos de datos y computación de genes de ARNr 16S derivados de CF-pulmón, Jean-Pierre y sus colegas desarrollaron recientemente un modelo de cocultivo in vitro que integra las características mencionadas anteriormente10. Este sistema incluye P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. y Prevotella spp. cultivados en condiciones similares a las vías respiratorias de FQ y estables hasta por 14 días. Los autores también informaron sobre el crecimiento específico de la comunidad de Prevotella spp. y varios cambios en la capacidad de respuesta Abx de estos patógenos de FQ a través de mecanismos que aún no se han identificado10. Este sistema in vitro tratable también ofrecía la posibilidad de profundizar en cuestiones de enfoque mecánico relacionadas con la recalcitrancia de Abx de una variante común de P. aeruginosa frecuentemente detectada en las vías respiratorias de pwCF10. Por lo tanto, el objetivo de este protocolo es proporcionar a la comunidad de investigación de la FQ un flujo de trabajo experimental estandarizado para cultivar una biopelícula in vitro que tenga el potencial de expandirse aún más para abordar una serie de preguntas relevantes para la FQ.

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Protocolo

Los detalles de todos los reactivos y equipos se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación del medio de esputo artificial

NOTA: A lo largo de este protocolo, el medio de esputo artificial (ASM) se define como el medio relevante para la FQ modificado de SCFM2, publicado previamente por Turner y colegas17. A continuación se muestra una descripción de los pasos para preparar este medio. Consulte la Tabla de Materiales para realizar soluciones de stock y condiciones de almacenamiento. Esta versión de ASM difiere de Turner et al.17 en que la capacidad de amortiguación de la versión original no permite un pH estable en el tiempo. Es decir, la actividad de fermentación llevada a cabo por Streptococcus spp. y anaerobios como Prevotella spp. resulta en la acidificación del medio de crecimiento (observaciones no publicadas). Por lo tanto, la concentración de ácido 3-morfolinopropano-1-sulfónico (MOPS) se ha ajustado de 10 mM a 100 mM.

NOTA: La preparación de una solución madre base de ASM 2x (ASMb) facilita la adición de componentes como mucina, agar, agua, etc., sin afectar la concentración final de moléculas presentes en ASM10,18. El 2x ASMb puede prepararse con antelación y almacenarse a 4 °C durante un máximo de dos semanas en un lugar oscuro. Si el medio se vuelve amarillo, deséchelo.

  1. Para preparar 2 bases de MAPE, en un vaso de precipitados limpio que contenga 400 ml de diH2O, añada lo siguiente mientras remueve:
    1. Añadir 6,50 mL de un 0,2 M NaH2PO4. Stock H2O; 6,25 mL de una culata de 0,2 M Na2HPO4 ; 348 μL de una culata KNO3 de 1 M; 1.084 mL de una culata K2SO4 de 0.25 M.
    2. Añadir 4,0 g de Levadura puntera sintética sin Triptófano; 3.032 g de NaCl; 20,92 g de fregonas; 1,116 g de KCl y 0,124 g de NH4Cl.
    3. Añadir 9,30 mL de un caldo de ácido L-láctico de 1 M; 2,70 mL de un stock de glucosa de 1,1 M; 1,75 mL de una culata de CaCl1 M 2,2H 2O; 1,20 mL de un stock de N-acetilglucosamina de 0,25 M y 1,00 mL de un stock de FeSO4,7H 2O de 3,6 mM.
    4. Añadir 660 μL de un caldo de triptófano de 0,1 M; 606 μL de una culata de 1 M MgCl2,6H 2O; 0,60 g de ácido desoxirribonucleico procedente de esperma de arenque; 400 μL de una cepa de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) de 250 mg/mL.
    5. Una vez añadidos todos los componentes, ajustar el pH a 6,80 con un caldo de NaOH de 5 M. Completar hasta 500 mL con diH2O. Esterilizar con un filtro de 0,22 μm y almacenar a 4 °C.
  2. Para preparar un caldo de mucina de 10 mg/mL (2x), utilice un frasco de vidrio limpio que contenga 250 mL dediH2O y mientras revuelve:
    1. Añadir 5,0 g de mucina de estómago porcino - Tipo II. Mezcla la suspensión durante 10 min. Completo hasta 500 mL con diH2O.
    2. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 min. Mantener a 4 °C hasta su utilización.
  3. Reconstituir la MAPE.
    NOTA: Este paso debe realizarse el día del experimento.
    1. Mezcle una proporción de volumen de 1:1 de la calada ASMb 2x y la calada de mucina de 10 mg/mL.
    2. Vortex a fondo antes de usar.

2. Preparación de medios selectivos polimicrobianos para la comunidad

NOTA: A continuación se muestran las cantidades necesarias para preparar un volumen de 1 L de medio.

  1. Para preparar agar sal de manitol (MSA) y agar de aislamiento de Pseudomonas (PIA), siga las instrucciones del fabricante.
  2. Para preparar Prevotella Agar Selectivo (PSA), en una botella de vidrio limpia, agregue lo siguiente:
    1. 30,0 g de caldo de soja tríptico (TSB). 15,0 g de agar. 5,00 g de extracto de levadura. 0,50 g de clorhidrato de L-cisteína.
    2. 10,0 mL de un caldo de hemina de 0,5 mg/mL. 100 μL de un caldo de menadiona de 10 mg/mL.
    3. Añadir 940 mL de diH2O y remover. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 min.
    4. Cuando se enfríe (es decir, el frasco se puede sostener con las manos desnudas), agregue mientras revuelve: 50.0 mL de sangre de oveja desfribrinada. 2,00 mL de un stock de kanamicina de 50 mg/mL. 150 μL de un caldo de vancomicina de 50 mg/mL. 500 μL de un caldo de polimixina B de 10 mg/mL.
  3. Para preparar Streptococcus Selective Agar (SSA), en una botella de vidrio limpia, agregue lo siguiente:
    1. 30,0 g de TSB. 15,0 g de agar.
    2. Añadir 950 mL de diH2O y remover. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 min.
    3. Cuando se enfríe (es decir, el frasco se puede sostener con las manos desnudas), agregue mientras revuelve: 50.0 mL de sangre de oveja desfribrinada. 1,00 mL de un caldo de polimixina B de 10 mg/mL. 1,00 mL de un caldo de ácido oxolínico de 10 mg/mL.
      NOTA: Verter en platos y mantener a 4 °C durante un máximo de 1 mes. Antes de usar, deje que las placas se sequen a temperatura ambiente hasta 24 horas antes de inocularlas. El PSA ha sido validado con P. melaninogenica y Prevotella intermedia. La SSA ha sido validada con S. sanguinis y el grupo Streptococcus milleri (Streptococcus constellatus, Streptococcus intermedius y Streptococcus anginosus, denotado como SMG). Se recomienda encarecidamente validar de novo estos medios selectivos si se van a ensayar nuevas cepas.

3. Preparación de medios líquidos bacterianos y condiciones de crecimiento

  1. Para cultivar rutinariamente P. aeruginosa y S. aureus, use un medio rico estéril (por ejemplo, caldo de lisogenia (LB) o TSB).
    1. Comience a tomar líquido durante la noche eligiendo una sola colonia previamente cultivada en una placa de agar LB / TSB durante 20-24 h a 37 ° C.
    2. Cultivar los cultivos de caldo a 37 °C durante la noche con agitación a 250 rpm durante 16-18 h.
  2. Para cultivar Streptococcus spp., utilice un caldo estéril Todd Hewitt complementado con un 0,5 % de extracto de levadura (THB-YE).
    1. Iniciar el cultivo líquido durante la noche a partir de una sola colonia previamente cultivada en una placa de agar TSB suplementada con un 5% de sangre de oveja desfibrinada (placa de agar sangre) durante 24 h a 37 °C + 5% de CO2.
    2. Cultive los cultivos de THB-YE anaeróbicamente o a 37 °C + 5% CO2 durante la noche sin agitar durante 18-22 h.
  3. Para cultivar Prevotella spp., prepare 1 L de medio de crecimiento de Prevotella (PGM) agregando lo siguiente a una botella limpia:
    1. 30,0 g de TSB. 5,00 g de extracto de levadura. 0,50 g de clorhidrato de L-cisteína. 10,0 mL de un caldo de hemina de 0,5 mg/mL y 100 μL de un caldo de menadiona de 10 mg/mL.
    2. Añadir 990 mL de diH2O. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 min. Envuelve la botella en papel de aluminio para protegerla de la luz.
    3. Cultivar colonias de Prevotella spp. en una placa de agar sangre incubada anaeróbicamente a 37 °C durante 48 h.
    4. Inocular una sola colonia en PGM y crecer durante la noche sin agitar a 37 °C anaeróbicamente durante 24 h.
      NOTA: El PGM se puede mantener a temperatura ambiente hasta por dos semanas. Se recomienda encarecidamente realizar pruebas de esterilidad en cada medio de crecimiento antes de su uso. Si no se utiliza una cámara anaeróbica, puede ser necesario iniciar las noches líquidas de Prevotella spp. desde un parche de colonias.

4. Preparación del experimento de cocultivo

NOTA: En la Figura 1 se muestra un flujo de trabajo experimental resumido. La configuración del experimento se puede realizar en condiciones óxicas si el tiempo de preparación es inferior a 1 h. Si se espera que tome más tiempo que eso, se recomienda encarecidamente realizar el experimento utilizando una cámara anaeróbica (con 10% de CO2, 10% de H2 y 80% de gas mezclado N2 ). También se pueden utilizar frascos anaeróbicos para incubar las muestras experimentales.

  1. Preparación de los monocultivos y cocultivos
    NOTA: Realice todos los pasos de centrifugación a 10.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente. Para los cocultivos, mezcle las muestras bacterianas justo antes de inocular las placas de 96 pocillos. Por lo general, se recolecta un volumen de 1 mL para las cepas de P. aeruginosa y S. aureus de los cultivos nocturnos. Para Streptococcus spp. y Prevotella spp., los volúmenes durante la noche pueden variar entre 2-4 mL. Estos volúmenes se pueden ajustar en función del número de condiciones que se vayan a probar.
    1. Usando el líquido bacteriano de los cultivos nocturnos, realice los siguientes pasos:
      1. En el caso de las cepas de P. aeruginosa y S. aureus , lávese dos veces con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
      2. Para Streptococcus spp. y Prevotella spp., lavar una vez con PBS estéril.
        NOTA: Utilice una pipeta para desechar cuidadosamente los sobrenadantes, ya que los gránulos pueden perderse fácilmente.
      3. Después de los lavados, vuelva a suspender cada pellet en 1 ml de 1x ASMb diluido en agua.
      4. Realice una dilución 1:10 de cada muestra en PBS estéril y mida el OD600.
      5. Ajuste todos los cultivos a un OD600 de 0,2 en ASM.
      6. Utilizando las suspensiones OD600 = 0,2, diluir en ASM las muestras bacterianas hasta una DO final600 de 0,01 (para cada microbio) para los monocultivos y cocultivos.
      7. Vórtice a fondo durante 5 s.
        NOTA: Por ejemplo, para preparar un total de 1 mL de suspensión de monocultivo de ASM de P. aeruginosa a DO600 = 0,01, agregue 50 μL de P. aeruginosa a DE600 = 0,2 a un volumen de 950 μL de MAPE. Para el cocultivo, tomar 50 μL de cada suspensión de P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. y Prevotella spp. a un DO600 = 0,2 y añadir hasta 800 μL de ASM.
      8. Con una pipeta, agregue 100 μl de las suspensiones de monocultivo y cocultivo en tres pocillos separados de una placa de plástico estéril de fondo plano de 96 pocillos.
      9. Incubar la placa (sin agitar) durante 24 h a 37 °C en condiciones anóxicas.
        NOTA: Otras tensiones de oxígeno (por ejemplo, microxia, normoxia) también se pueden utilizar aquí. Sin embargo, el modelo ha sido desarrollado y validado con condiciones anóxicas. Confirme los inóculos de inicio diluyendo en serie las suspensiones bacterianas mono y de cocultivo, y se recomienda encarecidamente la siembra de placas en PIA, MSA, SSA y PSA. La concentración inicial prevista para cada especie bacteriana es de 1 × 107 UFC/mL (P. aeruginosa), 3,5 × 106 UFC/mL (S. aureus), 1,2 × 106 UFC/mL (Streptococcus spp.) y 4,6 × 106 UFC/mL (Prevotella spp.). Los inóculos bacterianos también pueden ser modificados, como lo describieron Jean-Pierre y colaboradores10.
  2. Reemplace el medio después de la formación de la biopelícula.
    1. Después de 24 h de incubación, extraiga las células no adheridas (planctónicas) por aspiración con una pipeta multicanal.
    2. Reponga las biopelículas preformadas con 100 μL de ASM fresco o el tratamiento deseado (por ejemplo, antibióticos, metabolitos, etc.).
    3. Incubar la placa durante 24 h adicionales a 37 °C en condiciones anóxicas.
      NOTA: Estos pasos se pueden realizar aeróbicamente si se realizan rápidamente (es decir, menos de 1 min). De lo contrario, utilice una cámara anaeróbica.

5. Recolección y colocación de las muestras

  1. Después de las 24 h adicionales de incubación, aspire las células no adheridas (planctónicas) con una pipeta multicanal.
    NOTA: La fracción planctónica puede conservarse, diluirse en serie y platearse en medios selectivos o desecharse.
  2. Lave suavemente las biopelículas dos veces con 125 μL de PBS estéril y deseche los volúmenes.
  3. Agregue 50 μL de PBS estéril y separe las biopelículas raspando suavemente las células de la placa con un replicador de 96 pines.
  4. Transfiera las células de biopelícula resuspendidas a la fila A de una nueva placa estéril de 96 pocillos.
    NOTA: La placa de 96 pocillos contendrá PBS estéril en las filas B a H.
  5. Realice una dilución en serie 10 veces de las fracciones planctónicas (si es necesario) y de biopelícula.
  6. Coloque 3-5 μL de cada muestra de dilución en PIA, MSA, SSA y PSA.
  7. Deje que las manchas de inoculación se sequen.

6. Incubación de las placas selectivas y recuento de unidades formadoras de colonias (UFC)

  1. Para P. aeruginosa y S. aureus, incubar a 37 °C durante 18-20 h.
  2. En el caso de Streptococcus spp, incubar a 37 °C en condiciones anóxicas durante 24 h.
  3. En el caso de Prevotella spp, incubar a 37 °C en condiciones anóxicas durante 48 h.
  4. Después de la incubación, cuente las colonias (~ 10-35 por punto) y calcule la UFC por mL.
  5. Trace los datos con una herramienta de visualización.

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Resultados

Como se representa en la Figura 2, se informaron varios fenotipos, incluyendo (1) una reducción en el número de recuentos de células viables de P. aeruginosa y S. aureus cuando se cultivaron en comunidades planctónicas mixtas en comparación con el monocultivo, (2) un aumento en el crecimiento polimicrobiano de células de S. sanguinis y, (3) crecimiento de comunidades mixtas de P. melaninogenica como se informó previamente por Jean-Pierre y colegas

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Discusión

La utilidad de este sistema de cocultivo in vitro clínicamente informado reside en su capacidad para detectar funciones bacterianas específicas de polimicrobianos. Es decir, a través de la utilización de este modelo hemos reportado fenotipos microbianos que van desde el crecimiento específico de la comunidad de Prevotella spp. (Figura 2) hasta cambios en la susceptibilidad a la CF Abx de primera línea de P. aeruginosa, S. aureu...

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Divulgaciones

Los autores declaran no divulgar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer al Dr. George A. O'Toole y al Dr. Thomas H. Hampton por su importante papel en el diseño y desarrollo del modelo comunitario polimicrobiano in vitro . Agradecemos a la Dra. Sophie Robitaille por sus útiles comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación de Fibrosis Quística JEAN21F0 a F.J-P. La figura 1 del manuscrito fue creada utilizando BioRender.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC)Fisher Scientific NC0387928Prepare un caldo de 250 mg/mL en cloroformo directamente en el frasco. Mantener a -20 ° C. Concentración final 200 ° C. g/mL en 2x base ASM.
Ácido 3-morfolinopropano-1-sulfónico (MOPS)SigmaM1254Concentración final 200 mM en base ASM 2X.
Replicador de 96 pinesFisher Scientific05-450-9También se pueden utilizar replicadores desechables. Gato #NC1567338.
Placa estándar estéril de 96 pocillos con tapaFisher Scientific62406-081
AgarFisher ScientificDF0145-17-0
AnaeroPack 2.5 L Tarro rectangularFisher Scientific23-246-385
CaCl2*2H2O Fisher ScientificC79-500Prepare un caldo de 1 M en agua y filtre la esterilización con un 0.22 μ Filtro M. Concentración final 3.5 mM en base 2x ASM.
de oveja desfribrinadaPara preparar placas de crecimiento para Streptococcus y Prevotella.
Ácido desoxirribonucleico de esperma de arenqueSigmaD7290Concentración final 1,2 mg/mL en 2x base ASM.
FeSO4*7H2O Fisher Scientific AA1449830Prepare un caldo de 1 mg/mL (3,6 mM) en agua y filtre la esterilización con un 0,22 μ Filtro M. Mantener envuelto en papel de aluminio. Concentración final 0.0072 mM en base 2x ASM.
GasPaksFisher ScientificB260678
GlucosaFisher ScientificD16-3Preparar como un 20% de caldo (1,1 M) en agua y esterilizar en autoclave. Concentración final 6 mM en base 2x ASM.
HeminSigma51280Disuelva 100 mg de hemina en 2 mL de NaOH 1 M y luego aumente el volumen a 200 mL con agua. Almacene en una botella ámbar o una botella regular envuelta con papel de aluminio a 4 & C.
K2SO4Fisher ScientificP304-500Prepare un caldo de 0,25 M en agua y filtre la esterilización con un 0,22 μ Filtro M. Concentración final 0,54 mM en base 2x ASM.
KanamicinaPrepare una solución madre de 50 mg/mL en agua. Filtro esterilizar con un 0.22 μ m filtrar y almacenar a 4 °C.
KClFisher ScientificP217-500Concentración final 30.0 mM en 2x base ASM.
KNO3Fisher ScientificP263-500Prepare un caldo de 1 M en agua y filtre la esterilización con un 0.22 μ Filtro M. Concentración final 0.70 mM en base 2x ASM.
Clorhidrato de L-cisteínaFisher Scientific AAA1038922
ácido L-láctico SigmaL1750Prepare un caldo de 1 M en agua y filtre la esterilización con un 0,22 μ Filtro M. Ajuste el pH a 7.0. Concentración final 18.6 mM en base 2x ASM.
L-TriptófanoSigmaT0254Preparar un caldo de 0,1 M en NaOH de 0,2 M y esterilizar por filtro con un 0,22 μ Filtro M. Mantener refrigerado a 4 & grados; C envuelto en papel de aluminio. Concentración final 0.132 mM en base 2x ASM.
Agar Sal de ManitolFisher ScientificB11407Prepárese siguiendo las recomendaciones del fabricante.
MenadioneSigmaM5625Prepare una solución madre de 10 mg/mL disuelta en etanol al 96-100%. Conservar a 4 ° C envuelto en papel de aluminio. Vortex antes de usar.
MgCl2*6H2O Fisher ScientificAA12288A9Prepare un caldo de 1 M en agua y filtre la esterilización con un 0.22 μ Filtro M. Concentración final 1.21 mM en base 2x ASM.
Mucina del estómago porcino - Tipo II SigmaM2378Prepare un caldo de 10 mg/mL (2x) en agua; mezcle bien antes de esterilizar en autoclave. Manténgalo a 4 °C.
Na2HPO4Fisher ScientificS375-500Prepare un caldo de 0,2 M en agua y filtre la esterilización con un 0,22 μ Filtro M. Concentración final 2.5 mM en base 2x ASM.
N-acetilglucosamina SigmaA8625Prepare un caldo de 0,25 M en agua y filtre la esterilización con un 0,22 μ Filtro M. Mantener el caldo refrigerado a 4 &°C. Concentración final 0,6 mM en base 2x ASM.
NaClFisher ScientificS271-500Concentración final 103.7 mM en 2x base ASM.
NaH2PO4*H2OFisher ScientificS369-500Prepare un caldo de 0,2 M en agua y filtre la esterilización con un 0,22 μ Filtro M. Concentración final 2.6 mM en base 2x ASM.
NaOHFisher ScientificS318-500Prepare una solución madre de 5 M. Úselo para ajustar el pH de 2 veces el material base ASM.
NH4ClFisher ScientificA661-500Concentración final 4,6 mM en 2x base ASM.
oxolínicoPrepare una solución madre de 10 mg/mL de NaOH 0,5 M. Filtro esterilizar con un 0.22 μ m filtrar y almacenar a 4 °C.
Polymixin BPrepare una solución madre de 10 mg/mL en agua. Filtro esterilizar con un 0.22 μ m filtrar y almacenar a 4 °C.
Pseudomonas Isolation AgarFisher ScientificDF0927-17-1Prepárese siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Todd Hewitt BrothFisher ScientificDF0492-17-6Prepare siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Caldo de soja trípticoFisher ScientificDF0370-17-3Prepárese siguiendo las recomendaciones del fabricante.
VancomicinaPrepare una solución madre de 50 mg/mL en agua. Filtro esterilizar con un 0.22 μ m filtrar y almacenar a 4 °C.
Extracto de levaduraFisher ScientificB11929
Gota sintética de levadura sin triptófano SigmaY1876Concentración final 8.0 mg/mL en 2x base ASM.
Sangre Ácido

Referencias

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