Cultivo de una biopelícula polimicrobiana relevante para la fibrosis quística para sondear los fenotipos de la comunidad

Resumen

Este protocolo describe un modelo de biopelícula polimicrobiana de cuatro especies relevante para los pulmones con fibrosis quística (FQ) que se puede utilizar para explorar el impacto de las interacciones bacterianas entre especies.

Resumen

La mayoría de los modelos in vitro carecen de la capacidad de investigar completamente los fenotipos bacterianos que emergen de las complejas interacciones observadas en entornos de la vida real. Esto es particularmente cierto en el contexto de infecciones difíciles de tratar, crónicas y polimicrobianas basadas en biopelículas detectadas en las vías respiratorias de personas que viven con fibrosis quística (FQ), una enfermedad genética multiorgánica. Si bien múltiples estudios de microbioma han definido las composiciones microbianas detectadas en las vías respiratorias de las personas con FQ (pwCF), hasta ahora ningún modelo in vitro ha integrado completamente las características pulmonares críticas relevantes para la FQ. Por lo tanto, existe una importante laguna de conocimiento en la capacidad de investigar los mecanismos que impulsan la patogénesis de las infecciones pulmonares por FQ de especies mixtas. Aquí, describimos un modelo de comunidad microbiana de cuatro especies desarrollado recientemente, que incluye Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguinis y Prevotella melaninogenica cultivadas en condiciones similares a la FQ. A través de la utilización de este sistema, se observaron y exploraron a nivel molecular fenotipos clínicamente relevantes, como la recalcitrancia antimicrobiana de varios patógenos. La utilidad de este modelo in vitro reside en su flujo de trabajo estandarizado que puede facilitar el estudio de las interacciones entre especies en el contexto de las infecciones pulmonares crónicas por FQ.

Introducción

Las estrategias destinadas a erradicar los microbios causantes de enfermedades, como los detectados en las vías respiratorias de la fibrosis quística (FQ), una enfermedad genética multiorgánica, a menudo fracasan¹. Es decir, la presencia de comunidades microbianas resistentes similares a biopelículas que crecen en el entorno pulmonar rico en moco de la FQ puede causar infecciones crónicas que abarcan^{varias décadas.} Además, aunque la utilización de antimicrobianos de primera línea (Abx) y moduladores ha dado lugar a mejores resultados en las personas con FQ (pwCF), el enfoque clínico de "....

Protocolo

Los detalles de todos los reactivos y equipos se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación del medio de esputo artificial

NOTA: A lo largo de este protocolo, el medio de esputo artificial (ASM) se define como el medio relevante para la FQ modificado de SCFM2, publicado previamente por Turner y colegas¹⁷. A continuación se muestra una descripción de los pasos para preparar este medio. Consulte la Tabla de Materiales para realizar soluciones de stock y condiciones de almacenamiento. Esta versión de AS....

Resultados

Como se representa en la Figura 2, se informaron varios fenotipos, incluyendo (1) una reducción en el número de recuentos de células viables de P. aeruginosa y S. aureus cuando se cultivaron en comunidades planctónicas mixtas en comparación con el monocultivo, (2) un aumento en el crecimiento polimicrobiano de células de S. sanguinis y, (3) crecimiento de comunidades mixtas de P. melaninogenica como se informó previamente por Jean-Pierre y colegas

Discusión

La utilidad de este sistema de cocultivo in vitro clínicamente informado reside en su capacidad para detectar funciones bacterianas específicas de polimicrobianos. Es decir, a través de la utilización de este modelo hemos reportado fenotipos microbianos que van desde el crecimiento específico de la comunidad de Prevotella spp. (Figura 2) hasta cambios en la susceptibilidad a la CF Abx de primera línea de P. aeruginosa, S. aureu.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC)	Fisher Scientific NC0387928		Prepare un caldo de 250 mg/mL en cloroformo directamente en el frasco. Mantener a -20 ° C. Concentración final 200 ° C. g/mL en 2x base ASM.
Ácido 3-morfolinopropano-1-sulfónico (MOPS)	Sigma	M1254	Concentración final 200 mM en base ASM 2X.
Replicador de 96 pines	Fisher Scientific	05-450-9	También se pueden utilizar replicadores desechables. Gato #NC1567338.
Placa estándar estéril de 96 pocillos con tapa	Fisher Scientific	62406-081
Agar	Fisher Scientific	DF0145-17-0
AnaeroPack 2.5 L Tarro rectangular	Fisher Scientific	23-246-385
CaCl2*2H2O	Fisher Scientific	C79-500	Prepare un caldo de 1 M en agua y filtre la esterilización con un 0.22 μ Filtro M. Concentración final 3.5 mM en base 2x ASM.
		de oveja desfribrinada	Para preparar placas de crecimiento para Streptococcus y Prevotella.
Ácido desoxirribonucleico de esperma de arenque	Sigma	D7290	Concentración final 1,2 mg/mL en 2x base ASM.
FeSO4*7H2O	Fisher Scientific AA1449830		Prepare un caldo de 1 mg/mL (3,6 mM) en agua y filtre la esterilización con un 0,22 μ Filtro M. Mantener envuelto en papel de aluminio. Concentración final 0.0072 mM en base 2x ASM.
GasPaks	Fisher Scientific	B260678
Glucosa	Fisher Scientific	D16-3	Preparar como un 20% de caldo (1,1 M) en agua y esterilizar en autoclave. Concentración final 6 mM en base 2x ASM.
Hemin	Sigma	51280	Disuelva 100 mg de hemina en 2 mL de NaOH 1 M y luego aumente el volumen a 200 mL con agua. Almacene en una botella ámbar o una botella regular envuelta con papel de aluminio a 4 & C.
K2SO4	Fisher Scientific	P304-500	Prepare un caldo de 0,25 M en agua y filtre la esterilización con un 0,22 μ Filtro M. Concentración final 0,54 mM en base 2x ASM.
Kanamicina			Prepare una solución madre de 50 mg/mL en agua. Filtro esterilizar con un 0.22 μ m filtrar y almacenar a 4 °C.
KCl	Fisher Scientific	P217-500	Concentración final 30.0 mM en 2x base ASM.
KNO3	Fisher Scientific	P263-500	Prepare un caldo de 1 M en agua y filtre la esterilización con un 0.22 μ Filtro M. Concentración final 0.70 mM en base 2x ASM.
Clorhidrato de L-cisteína	Fisher Scientific AAA1038922
ácido L-láctico	Sigma	L1750	Prepare un caldo de 1 M en agua y filtre la esterilización con un 0,22 μ Filtro M. Ajuste el pH a 7.0. Concentración final 18.6 mM en base 2x ASM.
L-Triptófano	Sigma	T0254	Preparar un caldo de 0,1 M en NaOH de 0,2 M y esterilizar por filtro con un 0,22 μ Filtro M. Mantener refrigerado a 4 & grados; C envuelto en papel de aluminio. Concentración final 0.132 mM en base 2x ASM.
Agar Sal de Manitol	Fisher Scientific	B11407	Prepárese siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Menadione	Sigma	M5625	Prepare una solución madre de 10 mg/mL disuelta en etanol al 96-100%. Conservar a 4 ° C envuelto en papel de aluminio. Vortex antes de usar.
MgCl2*6H2O	Fisher Scientific	AA12288A9	Prepare un caldo de 1 M en agua y filtre la esterilización con un 0.22 μ Filtro M. Concentración final 1.21 mM en base 2x ASM.
Mucina del estómago porcino - Tipo II	Sigma	M2378	Prepare un caldo de 10 mg/mL (2x) en agua; mezcle bien antes de esterilizar en autoclave. Manténgalo a 4 °C.
Na2HPO4	Fisher Scientific	S375-500	Prepare un caldo de 0,2 M en agua y filtre la esterilización con un 0,22 μ Filtro M. Concentración final 2.5 mM en base 2x ASM.
N-acetilglucosamina	Sigma	A8625	Prepare un caldo de 0,25 M en agua y filtre la esterilización con un 0,22 μ Filtro M. Mantener el caldo refrigerado a 4 &°C. Concentración final 0,6 mM en base 2x ASM.
NaCl	Fisher Scientific	S271-500	Concentración final 103.7 mM en 2x base ASM.
NaH2PO4*H2O	Fisher Scientific	S369-500	Prepare un caldo de 0,2 M en agua y filtre la esterilización con un 0,22 μ Filtro M. Concentración final 2.6 mM en base 2x ASM.
NaOH	Fisher Scientific	S318-500	Prepare una solución madre de 5 M. Úselo para ajustar el pH de 2 veces el material base ASM.
NH4Cl	Fisher Scientific	A661-500	Concentración final 4,6 mM en 2x base ASM.
		oxolínico	Prepare una solución madre de 10 mg/mL de NaOH 0,5 M. Filtro esterilizar con un 0.22 μ m filtrar y almacenar a 4 °C.
Polymixin B			Prepare una solución madre de 10 mg/mL en agua. Filtro esterilizar con un 0.22 μ m filtrar y almacenar a 4 °C.
Pseudomonas Isolation Agar	Fisher Scientific	DF0927-17-1	Prepárese siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Todd Hewitt Broth	Fisher Scientific	DF0492-17-6	Prepare siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Caldo de soja tríptico	Fisher Scientific	DF0370-17-3	Prepárese siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Vancomicina			Prepare una solución madre de 50 mg/mL en agua. Filtro esterilizar con un 0.22 μ m filtrar y almacenar a 4 °C.
Extracto de levadura	Fisher Scientific	B11929
Gota sintética de levadura sin triptófano	Sigma	Y1876	Concentración final 8.0 mg/mL en 2x base ASM.

Sangre Ácido