Este estudio presenta un modelo ortotópico de cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) basado en la inoculación intrapulmonar de esferoides multicelulares de células fluorescentes A549-iRFP. El modelo recapitula los estadios clínicos del CPNM y responde al cisplatino, de acuerdo con la monitorización dinámica in vivo de la fluorescencia de longitud de onda larga.
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Artículo de método
Construcción de un modelo de xenoinjerto ortotópico de cáncer de pulmón de células no pequeñas que imita la progresión de la enfermedad y predice las actividades de los fármacos
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Resumen
Resumen
El cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) es una enfermedad altamente letal con un microambiente tumoral complejo y heterogéneo. En la actualidad, los modelos animales comunes basados en la inoculación subcutánea de suspensiones de células cancerosas no recapitulan el microambiente tumoral en el CPCNP. En este trabajo describimos un modelo de xenoinjerto ortotópico murino de cáncer de pulmón que emplea la inoculación intrapulmonar de esferoides multicelulares tridimensionales (MCS). Específicamente, las células fluorescentes de NSCLC humano (A549-iRFP) se cultivaron en microplacas de 96 pocillos de baja adherencia con colágeno durante 3 semanas para formar MCS, que luego se inocularon intercostalmente en el pulmón izquierdo de ratones desnudos atímicos para establecer el modelo de cáncer de pulmón ortotópico.
En comparación con la línea celular A549 original, la MCS de la línea celular A549-iRFP respondió de manera similar a los medicamentos contra el cáncer. La señal fluorescente de longitud de onda larga de las células A549-iRFP se correlacionó fuertemente con marcadores comunes del crecimiento de células cancerosas, incluido el volumen de esferoides, la viabilidad celular y el nivel de proteínas celulares, lo que permitió el monitoreo dinámico del crecimiento del cáncer in vivo mediante imágenes fluorescentes. Después de la inoculación en ratones, el xenoinjerto A549-iRFP MCS progresó de manera confiable a través de fases muy parecidas a las etapas clínicas del NSCLC, incluida la expansión del tumor primario, la aparición de tumores secundarios vecinos y las metástasis de las células cancerosas en el pulmón derecho contralateral y órganos remotos. Además, el modelo respondió al fármaco de referencia contra el cáncer de pulmón, el cisplatino, con la toxicidad prevista y una progresión más lenta del cáncer. Por lo tanto, este modelo de xenoinjerto ortotópico murino de CPNM serviría como plataforma para recapitular la progresión de la enfermedad y facilitar el desarrollo de posibles fármacos contra el cáncer.
Introducción
Entre todos los trastornos oncológicos, el cáncer de pulmón no solo inflige la mayor pérdida de vidas, sino que también se cobra el segundo mayor número de nuevos pacientes cada año enlos EE. UU. Esta devastadora neoplasia maligna se erige como un obstáculo importante en la atención sanitaria moderna, lo que exige una comprensión más profunda de su intrincada biología y modalidades terapéuticas más eficaces2. El cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) representa el 85% de los cánceres de pulmón y tiende a convertirse en tumores sólidos3. Uno de los principales desafíos en el cáncer de pulm....
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Protocolo
El estudio en animales se realizó con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad del Pacífico (Protocolos Animales 19R10 y 22R10). Para el presente estudio se utilizaron ocho ratones machos desnudos atímicos de 5-6 semanas de edad, con un peso de 20-25 g, criados con la dieta de roedores de referencia y alojados en condiciones libres de patógenos (SPF). Las jaulas, la ropa de cama y el agua potable se esterilizaban en autoclave y se cambiaban regularmente. En la Figura 1 se muestra un esquema de la inoculación tumoral en ratones. Consulte la Tabla de Materiales para obten....
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Resultados
Caracterización del MCS A549-iRFP
Los MCS A549-iRFP se cultivaron con éxito en microplacas esferoides con la ayuda de colágeno y centrifugación. Cuando la SQM alcanzó un diámetro de aproximadamente 500 μm después de 1 semana, tanto la SQM A549 como la A549-iRFP se expusieron a una variedad de medicamentos y formulaciones contra el cáncer durante 3 días y luego se mantuvieron en un medio de crecimiento sin drogas durante 4 días adicionales. El MCS A549-iRFP exhibió un patrón de respuesta muy similar al.......
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Discusión
La construcción de A549-iRFP MCS es un procedimiento de laboratorio sencillo y altamente reproducible y se puede traducir a la formación de MCS para múltiples líneas celulares. El SQM generado con la ayuda de la centrifugación y el colágeno exhibe una estructura más integral y similar a la de un tumor sólido en 3-4 días. Este método asegura la formación de esferoides robustos que mantienen su estructura integral durante períodos prolongados, generalmente de 2 a 3 semanas o incluso más hasta que comienzan a surgir pequeño.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Este trabajo contó con el apoyo de las subvenciones SAAG y SEED de la Universidad del Pacífico. Agradecemos al Dr. William Chan por otorgar acceso al sistema Odyssey Infrared Imaging 205 y al Dr. John Livesey por otorgar acceso al lector de placas SpectraMax iD3. Agradecemos a la Dra. Melanie Felmlee por el asesoramiento técnico sobre los protocolos con animales.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 100 y micro; L Jeringa de vidrio | Hamilton | Part/REF #80601 | |
| Aguja de 20 g | Thermo Fisher Scientific Inc. | 14 826D | |
| Microplaca de esferoide de fijación ultrabaja de 96 pocillos | Corning | 15-100-173 | |
| A549-iRFP | Imanis Ciencias de la Vida | CL082-STAN | |
| AIN-93M Dieta para roedores maduros | Dietas de investigación, Inc. | ||
| Ratón desnudo atímico | Charles River Laboratories, Inc. | Código de cepa: 490; homocigoto | |
| BCA | Pierce | 23227 | |
| Clorhidrato de buprenorfina | Patterson Número | NDC veterinario: 42023-179-05 | |
| CellTiter-Glo Ensayo de viabilidad celular 3D | Promega | G9683 | |
| Colágeno | Gibco | A1064401 | |
| DMEM | Corning | MT10013CV | |
| Suero Fetal Bovino (FBS) | Cytiva HyClone | SH3039603 | |
| ImageJ Herramienta | de código abierto (https://imagej.net/ij/) | N/A | |
| Image Studio | LI-COR | Versión 5.2 | |
| Isoflurano | Patterson Número | NDC veterinario: 17033-0091-25 | |
| Ketamina | Patterson Número | NDC veterinario: 50989-0161-06 | |
| Microscopio | Keyence | Número de modelo: BZ-X710 | |
| Matrigel | Corning | CB-40234 | |
| Odyssey Infrared Imaging 205 System | LI-COR Número de | modelo: 9140 | |
| PBS Sistema | de | MT21040CV | |
| Pearl Trilogy | LI-COR Número de | modelo: 9430 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Corning | MT30002CI | |
| Puromicina | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| software ReViSP de MATLAB | Herramienta de código abierto en Sourceforge (https://sourceforge.net/projects/revisp/) | N/A | |
| Clips quirúrgicos--AutoClip System | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| Xylazine | Patterson Veterinary | NDC Number: 61133-6017-01 |
Referencias
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 70 (1), 7-30 (2020).
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin
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Reimpresiones y permisos
