Artículo de método

Bioimpresión integrada de estructuras similares a tejidos utilizando medio sub-microgel de κ-carragenina

DOI:

10.3791/66806

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3 de mayo de 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Institute of Smart Medicine and Biological Engineering, Ningbo University, 2Health Science Center, Ningbo University, 3Key Laboratory of Precision Medicine for Atherosclerotic Diseases of Zhejiang Province, The First Affiliated Hospital of Ningbo University, 4The First Affiliated Hospital of Ningbo University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio presenta un nuevo baño de suspensión de submicrogel de κ-carragenina, que muestra notables propiedades de transición reversibles de atasco-desatasco. Estos atributos contribuyen a la construcción de tejidos y órganos biomiméticos en bioimpresión 3D integrada. La impresión exitosa de tejidos similares al corazón y al esófago con alta resolución y crecimiento celular demuestra aplicaciones de bioimpresión e ingeniería de tejidos de alta calidad.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La bioimpresión tridimensional (3D) incrustada que utiliza un baño de soporte de hidrogel granular se ha convertido en una técnica crítica para crear andamios biomiméticos. Sin embargo, la ingeniería de un medio de suspensión de gel adecuado que equilibre la deposición precisa de biotinta con la viabilidad y la función celular presenta múltiples desafíos, particularmente para lograr las propiedades viscoelásticas deseadas. Aquí, se fabrica un novedoso baño de soporte de gel de κ-carragenina a través de un proceso de molienda mecánica fácil de operar, que produce partículas submicroscópicas homogéneas. Estos submicrogeles exhiben un comportamiento de flujo típico de Bingham con un pequeño límite elástico y propiedades de adelgazamiento rápido por cizallamiento, que facilitan la deposición suave de las biotintas. Además, la transición reversible gel-sol y las capacidades de autocuración de la red de microgel κ-carragenina garantizan la integridad estructural de las construcciones impresas, lo que permite la creación de estructuras tisulares complejas de varias capas con características arquitectónicas definidas. Después de la impresión, los submicrogeles de κ-carragenina se pueden eliminar fácilmente con un simple lavado con solución salina tamponada con fosfato. La bioimpresión adicional con biotintas cargadas de células demuestra que las células dentro de las construcciones biomiméticas tienen una alta viabilidad del 92% y extienden rápidamente los seudópodos, además de mantener una proliferación robusta, lo que indica el potencial de esta estrategia de bioimpresión para la fabricación de tejidos y órganos. En resumen, este nuevo medio de submicrogel de κ-carragenina surge como una vía prometedora para la bioimpresión integrada de calidad excepcional, con profundas implicaciones para el desarrollo in vitro de tejidos y órganos modificados.

Introducción

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Los andamios de ingeniería de tejidos, incluidas las fibras electrohiladas, las esponjas porosas y los hidrogeles poliméricos, desempeñan un papel fundamental en la reparación y reconstrucción de tejidos y órganos dañados al proporcionar un marco estructural que apoya el crecimiento celular, la regeneración de tejidos y la restauración de la función de los órganos 1,2,3. Sin embargo, los andamios tradicionales enfrentan desafíos para replicar con precisión las estructuras de los tejidos nativos, lo que lleva a un desajuste entre los tejidos diseñados y los naturales. Esta limitación dificulta la cicatrización eficiente de los tejidos defectuosos, lo que enfatiza la necesidad urgente de avances en el diseño de andamios para lograr una biomímesis más precisa. La bioimpresión tridimensional (3D) es una técnica de fabricación innovadora que construye con precisión estructuras complejas de tejidos biológicos capa por capa utilizando biomateriales, tintas y células4. Entre varios biomateriales, los hidrogeles poliméricos emergen como biotintas ideales con su red distintiva que facilita la encapsulación in situ de las células y apoya su crecimiento de manera crucial 5,6. Sin embargo, muchos hidrogeles blandos y altamente hidratados tienden a inducir un desenfoque o un colapso rápido de las estructuras de andamios impresas durante el proceso de impresión cuando se utilizan como biotintas. Para hacer frente a este desafío, la tecnología de bioimpresión 3D integrada emplea un baño de microgel como material de soporte, lo que permite una deposición precisa de biotinta blanda. Tras la gelificación de las biotintas de hidrogel, se obtienen andamios biónicos refinados con estructuras intrincadas mediante la eliminación del baño de microgel. Materiales como la gelatina 7,8, la agarosa9 y la goma gellan10,11 se han empleado para crear baños de microgel para la bioimpresión 3D integrada, lo que ha avanzado significativamente en la aplicación de hidrogeles blandos en la ingeniería de tejidos. Sin embargo, el tamaño de partícula a nivel de micras y no uniforme de estos geles de partículas afecta negativamente la resolución y la fidelidad de la impresión 3D 12,13,14. Existe una necesidad urgente de fabricar un flotador de suspensión similar a un gel con partículas pequeñas y uniformemente dispersas, que ofrezca ventajas para lograr una bioimpresión de alta fidelidad.

En este protocolo, se presenta un novedoso baño de suspensión de κ-carragenina granulado de sacrificio con un nivel submicrónico uniforme para la impresión 3D integrada. Este innovador comportamiento de baño de sub-microgel de transición rápida de atasco-desatasco facilita la fabricación precisa de andamios de hidrogel biomimético con alta fidelidad estructural15. Utilizando este nuevo medio de suspensión, se imprimen con éxito una serie de construcciones biomiméticas de tejidos y órganos con estructuras de tejido multicapa, empleando una biotinta compuesta por metacrilato de gelatina y fibrometacrilato de seda. En este estudio, elegimos el esófago como objeto biomimético de bioimpresión 3D principalmente porque el esófago no solo tiene una estructura de tejido de múltiples capas, sino que también su capa muscular exhibe una estructura de capas compleja circular interna y longitudinal externa. Asegurar la alineación y organización adecuadas de estas capas es esencial para la regeneración funcional de los tejidos. Por lo tanto, deseamos mucho replicar la arquitectura multicapa del esófago. Y lo que es más importante, utilizamos submicrogeles de κ-carragenina como baño de suspensión y GelMA/SFMA como biotinta para diseñar y construir un andamio biomimético para la ingeniería de tejidos. El esófago impreso se puede liberar fácilmente mediante un lavado repetido con solución salina tamponada con fosfato. Además, el baño de submicrogel de κ-carragenina está libre de sustancias citotóxicas, lo que garantiza una alta citocompatibilidad15. Las células musculares lisas cargadas dentro de andamios anisotrópicos exhiben una notable actividad de propagación. Este medio de suspensión uniforme de submicrogel ofrece una nueva vía para la fabricación de tejidos y órganos complejos a través de la bioimpresión 3D integrada.

Protocolo

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1. Preparación del baño de suspensión de submicrogel de κ-carragenina

  1. Prepare 500 mL de baño en suspensión de κ-carragenina (0,35% en peso/vol) añadiendo 1,75 g de polvo de κ-carragenina en 500 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) dentro de un frasco de vidrio de 1.000 mL.
  2. Introduzca una barra agitadora magnética de 70 mm en la botella de vidrio para agitar la mezcla acuosa. Apriete la tapa de la botella de vidrio y luego aflójela media vuelta.
  3. Coloque la botella de vidrio en un baño de agua a 70 °C y caliéntela. Encienda el agitador magnético a una velocidad de 300 rpm, coloque la botella y revuelva hasta que el polímero se disuelva por completo.
  4. Tome otro frasco de vidrio y colóquelo en un autoclave para su esterilización, funcionando a 121 °C durante 30 minutos.
  5. Después de que el esterilizador de alta presión se enfríe a 80 °C, retire el frasco del esterilizador y transfiéralo al banco de trabajo ultralimpio para su posterior manipulación.
  6. Filtre la solución de κ-carragenina completamente disuelta en el frasco de vidrio esterilizado con un filtro de 0,22 μm.
    NOTA: Realice la filtración rápidamente mientras la solución está caliente para evitar que el κ-carragenina se enfríe y obstruya el filtro.
  7. Almacene la solución de κ-carragenina a 4 °C para inducir una gelificación reticulada catiónica durante 12 h.
  8. Molienda mecánica de los hidrogeles κ-carragenina con un agitador magnético de 60 mm con una velocidad de agitación de 1200 rpm a 25 °C hasta que se transforme con éxito en estado líquido, tardando aproximadamente 60 min.
    NOTA: Almacenar los hidrogeles de κ-carragenina entre 25-37 °C para evitar la gelificación a bajas temperaturas o la disolución a altas temperaturas.

2. Preparación de biotintas compuestas de metacrilato de gelatina/fibroína de seda

  1. Prepare biotintas compuestas combinando un 10% (peso/vol) de metacrilato de gelatina (GelMA) y un 6% (peso/vol) de metacrilato de fibroína de seda (SFMA) en una solución de PBS (pH 7,4). Pesar 2,0 g de GelMA y 1,2 g de polvos de SFMA por separado.
  2. Agregue lentamente los polvos en dos tubos de centrífuga de 50 ml. Agregue 10 ml de solución de PBS por separado en los tubos de centrífuga de 50 ml.
  3. Agregue un agitador magnético de 10 mm a cada uno y revuelva y caliente constantemente en un baño de agua a 45 ° C. Deje que los polvos GelMA y SFMA se disuelvan por completo, tomando aproximadamente 30 minutos.
  4. Mezclar las soluciones de GelMA y SFMA en un volumen igual bajo agitación continua a 45 °C. Filtre las biotintas compuestas con un filtro de tamaño de poro de 100 μm.
  5. Esterilizar las biotintas compuestas GelMA/SFMA mediante irradiación UV en una cabina de bioseguridad durante 12 h.
    NOTA: Prepare y use las biotintas inmediatamente para evitar la gelificación prematura del SFMA a través del autoensamblaje.

3. Caracterización reológica del baño de suspensión de submicrogel de κ-carragenina

  1. Puesta en marcha y preparación de equipos relacionados con la reología.
    1. Encienda el compresor de aire durante 30 minutos y asegúrese de que la presión alcance los 30 psi. Retire la abrazadera del cojinete girando la varilla de tracción en sentido contrario a las agujas del reloj. Fije la cubierta negra de abajo y gire el eje de la perilla en la parte superior del instrumento en el sentido de las agujas del reloj.
    2. Encienda el reómetro y permita que se inicialice. Encienda el interruptor de circulación de agua y deje que la temperatura alcance los 15 °C.
    3. Abra el software de control del reómetro para establecer la conexión en línea.
  2. Calibre el reómetro e instale la geometría de la placa paralela.
    1. Realice la calibración del instrumento en el software de control, que implica principalmente ajustar la trayectoria de inercia del instrumento de calibración. Coloque una geometría de placa paralela de 40 mm de diámetro en el extremo de la varilla de tracción. Mantenga presionado el botón de bloqueo durante 3 segundos para mover el eje del motor a la posición inicial para una colocación uniforme de la geometría.
    2. Seleccione el Administrador de calibración en el software de control y, a continuación, haga clic en Inercia, Calibración de fricción y Mapeo rotacional para calibrar la geometría de la placa paralela.
  3. Ponga a cero la altura del espacio del reómetro mediante la realización de un procedimiento estándar de puesta a cero del espacio para garantizar una medición precisa.
  4. Configure los pasos experimentales, incluida una rampa de flujo que oscila entre 0,01 y 1000 1/s de velocidad de cizallamiento, un barrido de amplitud que oscila entre el 0,1% y el 100% de deformación a 10 rad/s, un barrido de tiempo de oscilación de varios pasos que dura 60 s con deformaciones alternas de 1% y 100% a 10 rad/s, y un barrido de retención máxima de varios pasos que dura 120 s con una velocidad de corte alterna de 0,1 1/s y 10 1/s.
  5. Coloque 2 mL de suspensiones de κ-carragenina al 0,35% en la placa Peltier del reómetro.
  6. Coloque el espacio de geometría a 510 μm y elimine cualquier exceso de desbordamiento en el borde del dispositivo de sujeción. Ajuste el espacio de la muestra a 500 μm para permitir que la muestra se extienda ligeramente más allá del borde de la abrazadera.
  7. Realice un experimento de flujo seleccionando la Rampa de flujo de las opciones de diseño experimental.
    1. Elija la prueba de rampa de flujo en el diseño experimental. Ajuste las velocidades de cizallamiento de 0,001 a 10 1/s a una temperatura de 25 °C.
    2. Realice el paso 3.5 y el experimento de la rampa de flujo en la muestra agregada.
  8. Realice una prueba cíclica de retención máxima para evaluar el rendimiento de recuperación del material.
    1. Elija el barrido Peak Hold en el diseño experimental y establezca 5 experimentos consecutivos con un tiempo de 120 s a 25 °C.
    2. Ajuste la velocidad de cizallamiento a 0,01 1/s para el primer, tercer y quinto paso y a 10 1/s para el segundo y cuarto paso.
    3. Añadir una nueva muestra de 2 mL. Realice el paso 3.5 y la prueba de recuperación cíclica.
  9. Realizar análisis de viscoelasticidad para evaluar la posible transición gel-sol del baño de suspensión de κ-carragenina.
    1. Elija la prueba de barrido de amplitud en el diseño experimental. Ajuste la tensión de oscilación de 0,1% a 100% a una temperatura de 25 °C. Haga clic en Iniciar para realizar el experimento de barrido de amplitud en la muestra agregada.
  10. Realice análisis de deformación alternativos para evaluar el rendimiento de recuperación elástica del material.
    1. Elija el barrido de tiempo de oscilación en el diseño experimental y establezca 5 experimentos consecutivos con un tiempo de 60 s a 25 °C.
    2. Ajuste la tensión al 1% para el primer, tercer y quinto paso y al 100% para el segundo y cuarto paso.
    3. Añadir una nueva muestra de 2 mL. Realice el paso 3.5 y la prueba de recuperación cíclica continua.
      NOTA: Limpie la placa de geometría y la placa Peltier después de cada prueba de experimento y agregue una nueva muestra de 2 mL.

4. Impresión de andamios de hidrogel biomimético utilizando una bioimpresora de microextrusión diseñada a medida

  1. Diseñe cubos en formato STL utilizando un software de gráficos 3D y descargue modelos similares a tejidos de la base de datos 3D (www.thingiverse.com; https://3d. nih.gov/.).
    1. Importe los modelos en formato STL en el software PANGO e introduzca los parámetros de impresión. Establezca las coordenadas X, Y y Z específicas del modelo en el espacio 3D, introduzca el tamaño de escala esperado del modelo en milímetros (mm), ajuste el tamaño y la relación de escala del objeto en los ejes X, Y y Z, y ajuste el ángulo de rotación del modelo en el espacio según sea necesario.
    2. Introduzca el diámetro estimado del filamento (normalmente alrededor de 200-500 μm para la mayoría de las biotintas) en el campo de espesor de capa para determinar el grosor del eje Z de cada capa. Ajuste la velocidad de impresión de acuerdo con el grosor de línea esperado (aproximadamente 10-90 mm/s) y establezca la densidad de relleno en 30%-80%.
    3. Exporte los parámetros finales como código G a una tarjeta SD.
  2. Haga funcionar la bioimpresora y la bomba de microextrusión.
    1. Encienda el controlador de la bomba de microextrusión, seleccione la jeringa de volumen correspondiente (5 mL) y ajuste la velocidad de extrusión a 0,08 mL/min y la duración de la extrusión en coordinación con el tiempo de impresión deseado obtenido dividiendo el volumen de hidrogel por la velocidad de extrusión.
    2. Coloque la jeringa con una aguja con un diámetro interior de 210 μm en la ranura de la jeringa de la bioimpresora.
    3. Ajuste el controlador de la jeringa para asegurarse de que el émbolo de la jeringa esté en estrecho contacto con el tornillo.
    4. Coloque 3 mL de baño de suspensión en una placa de cultivo celular de 35 mm. Coloque la antena en la plataforma en función de la configuración del código y confirme que el cabezal de impresión esté 1 mm por encima de la parte inferior de la placa.
      NOTA: Realice una prueba previa para garantizar la precisión de las posiciones de los platos en la plataforma de impresión durante la impresión.
    5. Inserte la tarjeta SD que contiene el código en la bioimpresora 3D, active el archivo de códigos, inicie la bioimpresora y haga clic en el botón Inicio del controlador.
  3. Procesamiento de los constructos
    1. Exponga la construcción impresa a una luz azul de 405 nm durante 1 minuto para iniciar la reticulación fotográfica.
    2. Retirar el gel de κ-carragenina con una pipeta de 1 mL, seguido de la adición de 3 mL de PBS (pH 7,4) para el lavado y posterior extracción. Repita este proceso para un lavado a fondo.
      NOTA: Realice el proceso de lavado suavemente para evitar dañar las construcciones impresas.

5. Bioimpresión 3D integrada de análogos de la capa muscular esofágica

  1. Cultivo de células de músculo liso esofágico de conejo (eSMCs).
    1. Iniciar el cultivo en matraces T75 con 2 x 106 células utilizando 15 mL de medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina/estreptomicina.
    2. Mantener los eSMC a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 y 95% de aire hasta que alcancen el 80% de confluencia.
  2. Preparación de la capa de músculo esofágico biotinta
    1. Aspirar el medio al alcanzar la confluencia y lavar los eSMC con 5 mL de 1x PBS.
    2. Añadir 2 mL de Tripsina-EDTA al 0,2% al matraz e incubar durante 2 min para digerir las células. Golpee el matraz para separar las celdas de la pared.
    3. Finalice la digestión agregando 2 mL de DMEM y transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 mL. Mida la densidad celular utilizando un contador de células con 10 μL de suspensión celular.
    4. Centrifugar a 675 x g durante 3 min, aspirar cuidadosamente el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en las biotintas compuestas GelMA/SFMA (tal y como se preparó en el paso 2.1). Ajuste la concentración celular final para lograr una densidad de 10 x 106 células/mL en la biotinta, optimizando así las condiciones para posteriores aplicaciones de bioimpresión 3D.
  3. Preparación de la bioimpresora 3D y materiales asociados
    1. Autoclave los instrumentos de impresión esenciales, incluidas las agujas de jeringa, las pinzas, un agitador magnético y una botella de vidrio de silicato de 1000 ml, en condiciones de esterilización estándar (121 °C durante 30 min) para garantizar un entorno aséptico para el proceso de impresión.
    2. Coloque la bioimpresora dentro de un gabinete de bioseguridad y esterilícela con luz ultravioleta (UV) durante 30 minutos para mantener la esterilidad.
    3. Prepare 50 mL de κ-carragenina estéril y 5 mL de biotintas compuestas estériles GelMA/SFMA, como se describe en el paso 1 y el paso 2, respectivamente.
    4. Diseñe el modelo, establezca los parámetros deseados y prepare la bioimpresora como se describe en el paso 4.1.
  4. Inicio del proceso de bioimpresión
    1. Realice los procedimientos descritos en los pasos 4.2 y 4.3 para bioimprimir la capa muscular esofágica en 3D, seguidos de lavado y reemplazo de PBS.
    2. Realice la impresión celular con técnicas estériles durante todo el proceso de impresión para minimizar el riesgo de contaminación celular en la estructura impresa.
  5. Reemplazo del medio de cultivo celular posterior a la impresión
    1. Aspire cuidadosamente el PBS y reemplácelo con 3 mL de DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina/estreptomicina. Asegúrese de que las construcciones impresas estén completamente sumergidas para proporcionar condiciones óptimas de crecimiento celular.
    2. Incubar la placa de cultivo celular que contiene las construcciones impresas en una incubadora ajustada a 37 °C con 5% de CO2. Reemplace el medio de cultivo celular con medio fresco diariamente, usando 3 mL cada vez, y monitoree el estado de las células dentro de las construcciones usando microscopía óptica.

6. Evaluación de la viabilidad de las eSMCs dentro de las construcciones impresas mediante tinción de ensayos Live/Dead

  1. Retire el medio de cultivo celular después de 5 h de incubación y lave las construcciones cargadas de células con PBS.
  2. Añadir 2 mL de la solución estándar de calceína-AM/yoduro de propidio (1:1000) a las construcciones cargadas de células impresas e incubar.
  3. Lave las construcciones 3 veces con PBS después de una incubación de 45 minutos y luego agregue medio de cultivo celular fresco.
  4. Observe células vivas y muertas y capture imágenes fluorescentes mediante microscopía de barrido láser confocal (CLSM).

7. Observación de las eSMCs dentro de las construcciones impresas mediante tinción FITC-Phalloidin/DAPI

  1. Teñir las construcciones impresas con isotiocianato de fluoresceína (FITC) marcado con faloidina (verde) para F-actina y 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, azul) para nuclear después de 5 días de incubación.
  2. Preparación de la solución de fijación
    1. Combine 4 mL de PBS 1x con 0,16 mL de paraformaldehído (PFA) en un tubo de polietileno (PE) de 5 mL, logrando una concentración final del 4%.
    2. Coloque la placa de cultivo que contiene las construcciones bioimpresas sobre una superficie limpia. Retire el medio y cubra suavemente las construcciones con la solución de PFA, asegurando su inmersión completa. Deje que la fijación proceda a temperatura ambiente durante 20 minutos antes de desechar la solución.
      NOTA: Manipule los líquidos con cuidado durante los procesos de adición y eliminación para preservar la integridad estructural de las construcciones bioimpresas.
    3. Introduzca 2,5 mL de 1x PBS en la placa de cultivo, sumergiendo completamente las construcciones para eliminar cualquier reactivo de tinción residual.
  3. Permeabilización de la membrana celular
    1. Formule una solución de Triton X-100 al 0,5 % añadiendo 20 μL de Triton X-100 a 4 ml de 1x PBS en un tubo de PE de 5 mL.
    2. Administre la solución Triton X-100 a las construcciones durante 30 minutos a temperatura ambiente para permear las membranas celulares, luego retire la solución.
    3. Introduzca 2,5 mL de 1x PBS en la placa de cultivo, sumergiendo completamente las construcciones para eliminar cualquier reactivo de tinción residual.
  4. Bloqueo de enlaces no específicos
    1. Cree una solución de bloqueo de albúmina sérica bovina (BSA) al 3% en un tubo de PE de 5 mL agregando 0,12 mL de BSA a 4 mL de PBS 1x.
    2. Introduzca la solución BSA a los constructos durante 30 minutos a temperatura ambiente para bloquear sitios no específicos, luego deseche la solución.
  5. Tinción de actina con FITC-Phalloidin
    1. Prepare una solución de FITC-faloidina al 0,2% en un tubo de PE de 5 mL con 4 mL de PBS 1x y 8 μL de reactivo de tinción.
    2. Sumerja los constructos en esta solución durante 60 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, luego deseche la solución.
    3. Añada 2,5 mL de PBS 1x a la placa de cultivo, sumergiendo completamente las construcciones para eliminar los reactivos de tinción residuales.
  6. Tinción nuclear con DAPI
    1. Aplique 4 mL de solución de tinción DAPI a los constructos, asegurando una cobertura completa.
    2. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 minutos antes de retirar la solución de DAPI.
  7. Lavado final e inmersión en PBS: Agregue 2,5 mL de 1x PBS a la placa de cultivo, sumergiendo completamente las construcciones para eliminar los reactivos de tinción residuales.
    NOTA: Prepare las soluciones de tinción con anticipación y manéjelas con cuidado. En ningún momento las células deben sufrir desecación dentro del recipiente de cultivo.
  8. Observación con un microscopio confocal: Inspeccione y obtenga imágenes de las construcciones teñidas mediante microscopía confocal para evaluar el crecimiento celular, lo que garantiza una documentación completa de los resultados.

8. Evaluación de la proliferación de eSMCs dentro de las construcciones impresas utilizando el ensayo CCK-8

  1. Retire el medio de cultivo de los constructos en los días 7 y 14. Lave las construcciones con PBS para eliminar el medio residual y las células desprendidas.
  2. Agregue la solución CCK-8 a cada construcción siguiendo las instrucciones del fabricante. Asegúrese de que el volumen de la solución CCK-8 sea el adecuado para cubrir cada construcción por completo.
  3. Incubar los constructos con la solución CCK-8 a 37 °C durante 2 h. Después de la incubación, transfiera cuidadosamente el sobrenadante a una nueva placa de 96 pocillos.
  4. Mida la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El baño de gel de κ-carragenina granular se generó rompiendo mecánicamente los hidrogeles a granel en una suspensión de gel de partículas. El estudio más reciente demostró que las partículas de κ-carragenina exhibieron un diámetro promedio de aproximadamente 642 ± 65 nm con morfologías uniformes a 1000 rpm de mezcla mecánica15, significativamente menor que las dimensiones de los microgeles reportadas previamente en la literatura 16,17,18. Los tiempos de ruptura más largos y las velocidades más grandes dan como resultado tamaños de micropartículas más pequeños, con un tiempo de mezcla de 60 minutos a 1200 rpm que producen submicropartículas con un diámetro promedio de 565 ± 86 nm en este estudio (Figura complementaria 1). Se prevé que un tamaño de partícula tan pequeño mejore la resolución de los procesos de impresión. Estas partículas se ensamblan en un gel granular a través de la formación de enlaces de hidrógeno e interacciones catiónicas (Figura 1A). Cuando se somete a estrés, el medio submicrogel de κ-carragenina exhibe comportamientos característicos como la elasticidad, el adelgazamiento por cizallamiento y una transición reversible de atasco-desatasco, todos los cuales son esenciales para el éxito de la bioimpresión 3D integrada. La Figura 1B muestra el comportamiento representativo del rendimiento y el adelgazamiento por cizallamiento de geles granulares de κ-carragenina en una prueba de rampa de flujo. Con el aumento de la velocidad de cizallamiento de 0,001 a 10 s-1, las tensiones de cizallamiento para los geles granulares de κ-carragenina al 0,35% (peso / vol) permanecen relativamente sin cambios a tasas de cizallamiento inferiores a 0,3 s-1, lo que indica un bajo límite elástico de 3,5 Pa. Posteriormente, se observa que los esfuerzos cortantes aumentan linealmente con las tasas de corte, lo que sugiere un comportamiento de flujo similar al de un fluido Bingham. Además, las mediciones reológicas de barrido de deformación de los submicrogeles de κ-carragenina revelan una transición distintiva del gel al sol. Estos geles rinden a deformaciones superiores al 10% y se someten a una transición gel-sol a una deformación del 35% (Figura 1C). La pequeña tensión de rendimiento de los geles de subpartículas se atribuye a la red física establecida a través de enlaces de hidrógeno e interacciones catiónicas. Este comportamiento de transición gel-sol es reversible. Como se muestra en la Figura 1D, a una deformación del 100%, el módulo de almacenamiento de los submicrogeles de κ-carragenina cae en picado de 38 Pa a 6 Pa, por debajo del módulo de pérdida, lo que indica un estado solar. Por el contrario, tras una reducción repentina de la deformación al 1%, el módulo de almacenamiento vuelve rápidamente a aproximadamente 38 Pa. Supera el módulo de pérdida en 5 s, lo que sugiere que los submicrogeles de κ-carragenina son capaces de restablecer rápidamente los enlaces cruzados físicos entre las partículas.

Los geles granulares de κ-carragenina, caracterizados por sus morfologías pequeñas y homogéneas, exhiben propiedades de adelgazamiento por cizallamiento, rápida autorrecuperación y comportamiento de estrés de rendimiento, lo que es ventajoso para su uso en aplicaciones de bioimpresión 3D integrada. Para evaluar la eficacia de la suspensión de submicrogel de κ-carragenina como baño de soporte para la impresión integrada, se emplea una biotinta ampliamente utilizada compuesta por un 10% (peso/vol) de metacrilato de gelatina y un 6% (peso/vol) de compuestos de metacrilato de fibroína de seda (GelMA/SFMA) para los ensayos de impresión dentro del medio κ-carragenina 19,20. El GelMA fue marcado con rodamina para mejorar la visualización21. Como se ilustra en la Figura 2A, el baño de gel de κ-carragenina granular es altamente transparente, lo que facilita el monitoreo en tiempo real del proceso de impresión. Las velocidades de cizallamiento generadas por la boquilla oscilan entre 0,66 y 6 s-1 cuando las velocidades de la boquilla varían dentro del rango de 10-90 mm/s. El baño de submicrogel de κ-carragenina todavía exhibe un comportamiento de autocuración dentro de los 20 s después de un cizallamiento cíclico continuo a velocidades alternas de 6 s-1 y 0.01 s-1 (Figura suplementaria 2). Se mantuvo una estructura de rejilla de 15 x 15 x 2 mm3, con un espesor de capa de 150 μm, dentro del baño de submicrogel de κ-carragenina. En particular, la cuadrícula demostró una integridad y resolución notables, con filamentos individuales que miden aproximadamente 200 μm de ancho y un espaciado entre filamentos de aproximadamente 350 μm, según lo verificado por imágenes de microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) (Figura 2B, C). Además, la estructura de la cuadrícula 3D presentaba una red porosa con poros interconectados. Estos son atributos vitales que influyen en la imprimibilidad y, en última instancia, afectan los comportamientos celulares, como la supervivencia, la proliferación y el potencial de diferenciación de las células.

Para confirmar aún más la idoneidad del medio submicrogel de κ-carragenina para generar estructuras complejas de tejidos y órganos, se fabricó un modelo de corazón humano y una válvula cardíaca de tres valvas utilizando la tinta GelMA/SFMA a una alta densidad de relleno del 80%. El modelo de corazón impreso replica con precisión la forma anatómica en 3D, incluidas las venas y arterias principales (Figura 2D), y exhibe estabilidad mecánica después de la extracción del agua (Figura 2E). La válvula cardíaca de tres valvas muestra distintas valvas valvulares y estructuras de soporte (Figura 2F). Además, los filamentos dentro de las construcciones se despegan fácilmente (Figura 2G). Además, se recrea con precisión un modelo cíclico jerárquico como el esófago. Como se muestra en la Figura 2H y 2I, el esófago impreso exhibe una clara estratificación, con distintas demarcaciones entre las capas individuales para replicar las capas de tejido esofágico correspondientes, lo que sugiere que el medio de submicrogel de κ-carragenina soporta la complejidad estructural requerida para la ingeniería de tejidos. Si bien el modelo actual no llega a replicar la funcionalidad completa de los tejidos y órganos humanos auténticos, el baño de submicrogel de κ-carragenina ofrece potencialmente una estrategia viable y prometedora para la fabricación in vitro de tejidos y órganos intrincados, con aplicaciones potenciales en investigación, terapia y diagnóstico.

Los andamios de rejilla con anisotropía longitudinal y transversal imitan la capa muscular del esófago (Figura 3A,B), que consta de una capa muscular circular interna distinta y una capa muscular longitudinal externa. Para replicar esta arquitectura anisotrópica in vitro, las células de músculo liso esofágico (eSMC) de conejo se incrustaron cuidadosamente dentro de las biotintas GelMA/SFMA. Mediante la utilización del medio de submicrogel de κ-carragenina, se logró con éxito un andamio biomimético con eSMC que se parecía mucho a la estructura muscular de doble capa del esófago. Se evaluó la viabilidad de las células encapsuladas dentro de los hidrogeles con la tinción Vivo/Muerto después de 5 h de cultivo. Reveló una presencia predominante de células vivas (teñidas de verde) y una proporción mínima de células muertas (teñidas de rojo) dentro de las redes de hidrogel, lo que indica una alta viabilidad celular (Figura 3C). El análisis cuantitativo mostró una tasa de supervivencia notablemente alta, de hasta el 92% (Figura 3D). Estos resultados indican la biocompatibilidad del material de hidrogel, así como la eficacia de las metodologías de impresión y reticulación en la preservación de la integridad celular. Para examinar más a fondo la morfología celular dentro de las construcciones GelMA/SFMA, se capturaron imágenes de faloidina (verde)/DAPI (azul) después de 3 días de cultivo celular. Como se muestra en la Figura 3E, un número significativo de eSMCs dentro de las construcciones biomiméticas han proyectado una abundancia de seudópodos y exhibieron una alineación a lo largo de las microfibras, como se muestra después de 3 días de cultivo. La reconstrucción en 3D confirma aún más la reproducción precisa de las capas musculares del esófago (Figura complementaria 3). Además, se evaluó la proliferación de eSMC mediante el ensayo CCK-8 en los días 1, 7 y 14. Los valores del grado de absorbancia a 450 nm aumentaron notablemente desde el día 1 hasta el 7 y 14, lo que refleja un comportamiento proliferativo robusto (Figura suplementaria 4). Estos resultados indican el importante potencial del medio sub-microgel de κ-carragenina para facilitar la bioimpresión biomimética de alta calidad.

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Figura 1: Medio submicrogel de κ-carragenina autoensamblado y su análisis reológico. (A) Ilustración esquemática de un flotador de submicrogel de κ-carragenina formado a través de enlaces de hidrógeno e interacciones catiónicas para bioimpresión 3D integrada. (B) Rampa de flujo en submicrogeles de κ-carragenina atascados al 0,35% (peso/vol) a 25 °C. (C) Mediciones de la transición gel-sol en submicrogeles de κ-carragenina a través de un barrido de amplitud que oscila entre el 0,1% y el 100% a 25 °C. (D) Análisis de la autocuración en submicrogeles de κ-carragenina al 0,35% (peso/vol) tras un cizallamiento cíclico continuo a deformaciones alternas del 1% y del 100% a 25 °C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Bioimpresión 3D incrustada de alta fidelidad de tintas GelMA/SFMA marcadas con rodamina utilizando el baño de suspensión de submicrogel de κ-carragenina. (A) Observación en tiempo real de la impresión 3D incrustada dentro del baño de suspensión de sub-microgel de κ-carragenina. (B, C) Imágenes de microscopio de escaneo láser confocal que ilustran la (B) reconstrucción 3D y (C) la estructura interna de las cuadrículas impresas. (D, E) Fotografías de un modelo en forma de corazón impreso en 3D en una solución de agua (D) y en su estado natural (E). (F) Imágenes de una válvula cardíaca de tres valvas y (G) los filamentos que se desprenden de las construcciones. (H) fotografías de vista superior e (I) frontal que capturan un modelo de esófago impreso con la tinta GelMA/SFMA, que muestra estructuras jerárquicas de cuatro capas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Bioimpresión cargada de células incrustadas utilizando el baño de suspensión de submicrogel de κ-carragenina. (A, B) Diagramas esquemáticos de (A) la estructura muscular circular interna y longitudinal externa del esófago y (B) un andamio biomimético de la capa muscular esofágica anisotrópica producido por bioimpresión 3D integrada. (C) Imágenes de tinción vivas/muertas y (D) viabilidad cuantitativa de eSMCs cultivadas en andamios GelMA/SFMA a las 5 h. (E) Imágenes de proyección de eSMCs cultivadas en andamios GelMA/SFMA en el día 3. De izquierda a derecha: el núcleo, la F-actina y la vista de fusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: (A) Imagen de microscopía electrónica de barrido que muestra la morfología homogénea de los submicrogeles de κ-carragenina. (B) La distribución del diámetro de las micropartículas de κ-carragenina se midió mediante un analizador láser de tamaño de partícula nanométrico. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Análisis de auto-recuperación en sub-microgeles de κ-carragenina de 0,35% (peso/vol) tras cizallamiento cíclico continuo a velocidades alternas de 0,01 s-1 y 6 s-1 a 25 °C. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Imagen de reconstrucción 3D de las cuadrículas impresas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 4: La actividad de proliferación de las eSMC encapsuladas en el hidrogel GelMA/SFMA después de 1, 7 y 14 días se evaluó mediante el ensayo CCK-8 (n = 3). La significación estadística se analizó mediante ANOVA de un factor seguido de un análisis post hoc de Tukey entre tres grupos, **p<0.01, ****p < 0.0001. Los datos se muestran como la media ± la desviación estándar. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

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La preparación de baños de suspensión de submicrogel de κ-carragenina para su uso en bioimpresión es un proceso cuidadosamente orquestado que implica varios pasos críticos para garantizar que el medio resultante exhiba las propiedades deseadas para soportar las biotintas. Inicialmente, se prepara una solución de κ-carragenina disolviendo el polvo de κ-carragenina en agua desionizada a temperaturas elevadas, creando una mezcla homogénea. La concentración de la solución es clave y debe ser optimizada para su posterior gelificación. 0,3-0,6% (wt/vol) de κ-carragenina demostró un excelente rendimiento en bioimpresión 3D integrada15. Al enfriarse, esta solución se convierte en un gel a granel.

A continuación, el gel a granel se somete a una estrategia de molienda mecánica para producir partículas de submicrogel. Esto implica fuerzas mecánicas de alto cizallamiento que descomponen el gel en partículas de tamaño uniforme. Los parámetros del proceso de molienda, incluida la intensidad del cizallamiento, el tiempo y la temperatura, se controlan con precisión para lograr la distribución deseada del tamaño de partícula. Después de la molienda, las partículas de submicrogel se almacenan a 25-37 °C para evitar la agregación o la disolución, lo cual es esencial para mantener una suspensión uniforme que soporta las complejas tareas de bioimpresión. Se recomienda que el gel se prepare y se use de inmediato.

La producción de baños de suspensión de submicrogel de κ-carragenina es fácil de operar, lo que garantiza la alineación con las aplicaciones industriales y la creciente demanda de esfuerzos de ingeniería de tejidos y medicina regenerativa a gran escala. Además, los baños de suspensión de submicrogel de κ-carragenina emplean PBS o medio de cultivo compatible con células como disolvente, lo que garantiza una excelente biocompatibilidad y lo convierte en un medio ideal para apoyar las células dentro de construcciones bioimpresas. La vida útil del gel granular es de alrededor de 1 mes en condiciones de preparación aséptica.

Caracterizado por su comportamiento de flujo plástico de Bingham (Figura 1B), el baño de submicrogel de κ-carragenina demuestra excelentes propiedades de adelgazamiento por cizallamiento junto con capacidades de autocuración rápida (Figura 1C, D), que son fundamentales para mejorar la precisión de las construcciones impresas. La aplicación de este baño de sub-microgel ha demostrado ser eficaz en la creación de tejidos con arquitecturas de varios niveles (Figura 2), asegurando la producción de estructuras con alta fidelidad y resolución. Cabe destacar la capacidad de extensión rápida de los seudópodos en las células incrustadas dentro de biotintas cargadas de células (Figura 3), lo que subraya la compatibilidad del baño con los procesos celulares. En consecuencia, este baño de submicrogel de κ-carragenina es prometedor y transformador para el campo de la fabricación in vitro de tejidos y órganos. Está llamado a tener un profundo impacto en la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa al permitir el desarrollo de construcciones de tejidos más complejas, viables y funcionalmente integrativas.

A pesar del considerable potencial del baño de submicrogel de κ-carragenina para aplicaciones en bioimpresión e ingeniería de tejidos, aún existen varios desafíos y limitaciones. Una de las principales preocupaciones es que su composición se parezca mucho al medio de cultivo celular, lo cual es crucial para mantener la viabilidad celular durante la impresión prolongada de órganos grandes. Los submicrogeles de κ-carragenina se producen predominantemente utilizando PBS como disolvente, lo que requiere la incorporación de varios medios de cultivo celular para disolver el material. Además del PBS, el κ-carragenina también se gelatiniza utilizando una solución de cloruro de calcio. Sin embargo, la solución de cloruro de calcio puede causar toxicidad a las células o crear un desequilibrio de presión osmótica. Por lo tanto, el uso de un medio de cultivo celular sería ideal para disolventes de κ-carragenina y agentes de reticulación. Además, lograr una producción estéril de microgeles de alto rendimiento presenta un desafío importante. La esterilización de las soluciones de κ-carragenina requiere la filtración a través de un filtro de 0,22 μm a temperaturas elevadas. Sin embargo, el rendimiento de κ-carragenina estéril a menudo se ve obstaculizado por varios factores, incluida la calidad de la solución de PBS y el enfriamiento del κ-carragenina durante el proceso de filtración. Cada lote de filtración suele dar como resultado solo 20-50 mL de κ-carragenina estéril, lo que representa una barrera significativa para la producción de alto rendimiento de microgeles de κ-carragenina. En consecuencia, la investigación futura se centrará en optimizar el proceso de biofabricación, evaluar la viabilidad y la función celular a largo plazo y explorar la integración de tejidos impresos en sistemas vivos.

Divulgaciones

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Los autores no tienen ningún interés financiero en los productos descritos en este manuscrito.

Agradecimientos

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Esta investigación contó con el apoyo de la Fundación de Ciencias Naturales de Ningbo (2022J121, 2023J159), el proyecto clave de la Fundación de Ciencias Naturales de la ciudad de Ningbo (2021J256), la Fundación Abierta del Laboratorio Estatal Clave de Ingeniería Molecular de Polímeros (Universidad de Fudan) (K2024-35) y el Laboratorio Clave de Medicina de Precisión para Enfermedades Ateroscleróticas de la provincia de Zhejiang, China (2022E10026). Gracias por el apoyo técnico de las Instalaciones Principales, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Ningbo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Bioimpresora 3DDiseño a
4',6-Diamidino-2-PhenylindoleSolarbio Life ScienceC0065Luz
UV de 405 nmEFLXY-WJ01
Contador de célulasCorningCyto smart 6749
Microscopio de barrido láser confocalLeicaSTELLARIS 5
DMEM alta glucosaVivaCellC3113-0500Alta glucosa, con piruvato de sodio y L-glutamina
Reómetro rotacional dinámicoTA InstrumentDiscovery HR-20
Células de músculo liso esofágicoSuministrado por el Departamento de Biología Celular y Medicina Regenerativa, Centro de Ciencias de la Salud, UniversidadCélulas primarias del esófago de conejo
Suero fetal bovinoUEF9070L
Isotiocianato de fluoresceína marcado con faloidinaSolarbio Life ScienceCA1610300T
Metacrilato de gelatinaEFLEFL-GM-6060% sustitución
k-carrageninaAladdinC121013-100gGrado reactivo
Litio Fenil (2,4,6-trimetilbenzoil) fosfinatoAladdinL157759-1g365~405 nm
Kit Live-DeadbeyotimeC2015M Lector
microplacasPotenovPT-3502B
ParaformaldehídoSolarbio Life ScienceP1110 4%
Penicilina/estreptomicinaSolarbio Life ScienceMA0110100 &agudo;
Solución salina tamponada con fosfatoVivaCellC3580-0500pH 7.2-7.4
Metacrilato de fibroína de sedaEFL EFL-SilMA-00139% de sustitución
Triton X-100Solarbio Life ScienceT8200
Tripsina-EDTAVivaCellC100C10,25%, sin rojo fenol
medida listo para usar de Ningbo de

Referencias

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