Method Article

Pipeline para el estudio anatómico tridimensional multiescala del corazón humano

DOI:

10.3791/66817

⸱

June 28th, 2024

 ,  ,  , 
1University of California Los Angeles (UCLA) Cardiac Arrhythmia Center, UCLA Health System, David Geffen School of Medicine at UCLA, 2Neurocardiology Program of Excellence, UCLA, 3Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Crump Institute for Molecular Imaging, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Jonsson Comprehensive Cancer Center, David Geffen School of Medicine at UCLA

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo presenta una línea completa para analizar muestras obtenidas de corazones humanos que abarcan las escalas microscópica y macroscópica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El estudio detallado de los corazones humanos no defectuosos rechazados para trasplante ofrece una oportunidad única para realizar análisis estructurales a escala microscópica y macroscópica. Estas técnicas incluyen la limpieza de tejidos (imágenes tridimensionales (3D) habilitadas para inmunomarcaje modificado de órganos aclarados con solvente) y tinción inmunohistoquímica. Los procedimientos de examen mesoscópico incluyen la disección estereoscópica y la tomografía microcomputarizada (TC). Los procedimientos de examen macroscópico incluyen la disección macroscópica, la fotografía (incluidos los anaglifos y la fotogrametría), la tomografía computarizada y la impresión 3D del corazón o del corazón entero, disecado física o virtualmente. Antes del examen macroscópico, se puede realizar una fijación de presión-perfusión para mantener la arquitectura 3D y la morfología fisiológicamente relevante del corazón. La aplicación de estas técnicas en combinación para estudiar el corazón humano es única y crucial para comprender la relación entre las distintas características anatómicas, como la vasculatura coronaria y la inervación miocárdica, en el contexto de la arquitectura 3D del corazón. Este protocolo describe las metodologías en detalle e incluye resultados representativos para ilustrar el progreso en la investigación de la anatomía cardíaca humana.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dado que la función sigue a la forma, la comprensión de la arquitectura del corazón es fundamental para apreciar su fisiología. A pesar de que numerosas investigaciones han revelado la anatomía cardíaca desde la micro hasta la macroescala 1,2,3, múltiples preguntas siguen sin resolverse, especialmente las relacionadas con la anatomía cardíaca humana. Esto se debe, en parte, a que los estudios básicos centrados en la anatomía funcional generalmente utilizaban corazones de animales 4,5,6, que a menudo son distintos de los corazones humanos 1,7,8. Además, cada estudio individual, incluso aquellos que utilizan muestras de corazón humano, tiende a centrarse en estructuras muy específicas, lo que dificulta la aplicación de los hallazgos en el contexto de todo el corazón. Esto es aún más cierto si las estructuras enfocadas están en micro o mesoescala, como el perinexus9 y los plexos ganglionares10.

En este contexto, el estudio estructural sistémico del corazón humano rechazado para trasplante ofrece una oportunidad única y poco común para obtener un atlas completo de las estructuras cardíacas en foco a escalas microscópicas y macroscópicas11. Los protocolos de examen microscópico incluyen la limpieza de tejidos (imágenes tridimensionales (3D) habilitadas para inmunomarcaje modificado de órganos aclarados con solvente, iDISCO+)12,13 y tinción inmunohistoquímica. Los protocolos de examen mesoscópico incluyen disección estereoscópica, macrofotografía y tomografía microcomputarizada (TC). Los protocolos de examen macroscópico incluyen disección macroscópica14, fotografía (incluyendo anaglifos y fotogrametría)15,16,17, TC, disección virtual 18 e impresión 3D del corazón físico o virtualmente disecadoo completo 17. En preparación para el examen macroscópico, se realiza la fijación presión-perfusión para mantener la arquitectura 3D y la morfología fisiológicamente relevante del corazón 14,19,20,21. La aplicación combinada de estas técnicas es única y crucial para correlacionar distintas características anatómicas en el contexto de la arquitectura 3D del corazón humano.

Dado que la oportunidad de obtener una muestra de corazón humano no patológico es extremadamente limitada, el enfoque multiescala descrito en este documento maximiza el uso de la muestra. Mediante la aplicación de varios procedimientos que se describen a continuación, los resultados representativos ilustrarán al lector cómo los hallazgos se pueden utilizar para múltiples propósitos, incluido el descubrimiento en la investigación científica11 (análisis exhaustivos de la inervación cardíaca, distribución de los plexos ganglionares), la mejora de los procedimientos clínicos (simulación para enfoques quirúrgicos e intervencionistas) y la educación anatómica (demostración real en 3D de la anatomía cardíaca).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio utilizó muestras de tejido no identificadas recolectadas de corazones humanos de donantes no fallantes y fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de California, Los Ángeles (UCLA). Se obtuvieron muestras de corazones no defectuosos que fueron rechazados para trasplante. Los corazones se perfundieron a presión, se fijaron en paraformaldehído (PFA) al 4% y se tomaron imágenes antes del procesamiento de tejidos según los siguientes métodos. En la Figura 1 se resume el diagrama de flujo del orden del estudio. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Examen a microescala

  1. Limpieza de tejidos mediante el protocolo de imágenes 3D de órganos aclarados con disolvente (iDISCO+) habilitado para inmunomarcaje modificado.
    1. Diseccionar el tejido fijado con PFA al 4% con un bisturí para que quepa dentro de la cámara de 3 mm × 16 mm × 25 mm para microscopía confocal. Para obtener imágenes de tejidos más gruesos, se pueden apilar cámaras y/o espaciadores adicionales en el portaobjetos.
    2. Deshidrate las muestras utilizando series de metanol (MeOH) graduadas (20%, 40%, 60%, 80% y 100% de MeOH en H2O desionizado [vol/vol]) durante 1 h cada una a temperatura ambiente (RT) con agitación.
    3. Lavar con MeOH al 100% durante 1 h en RT y sumergir en 66% de diclorometano/33% de MeOH en RT con agitación durante la noche.
    4. Al día siguiente, lavar dos veces en MeOH (100%) durante 1 h a RT, enfriar a 4 °C y tratar con 5% H2O2 en MeOH (vol/vol) durante la noche a 4 °C.
    5. Rehidratar con la serie de MeOH graduada (80%, 60%, 40% y 20% de MeOH) y lavar en 0,01 mol/L de PBS durante 1 h cada uno a RT con agitación.
    6. Lavar los pañuelos dos veces en 0,01 mol/L PBS con Triton X-100 al 0,2% durante 1 h en RT.
    7. Prepárese para el inmunomarcaje permeabilizando en PBS 0,01 mol/L, 20 % de dimetilsulfóxido (DMSO), Triton X-100 al 0,2 % y glicina 0,3 mol/L durante 2 días a 37 °C con agitación.
    8. Bloquear en 0,01 mol/L de PBS con 10% de DMSO, 0,2% de Triton X-100 y 5% de suero de burro normal durante otros 2 días a 37 °C con agitación.
    9. Marcaje con un anticuerpo primario compatible con MeOH conjugado con fluoróforos diluidos en PBS de 0,01 mol/L con 10 mg/ml de heparina (PTwH), 0,2% de Tween-20, 5% de DMSO y 3% de suero de burro normal durante 3-4 días a 37 °C con agitación.
    10. Reponer la solución de anticuerpos e incubar durante otros 3-4 días a 37 °C con agitación.
    11. Después de 1 semana de incubación en solución primaria de anticuerpos, lavar de 4 a 5 veces en PTwH durante la noche en RT.
    12. Incubar con anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos diluidos en PTwH, suero de burro normal al 3% durante 3 días a 37 °C con agitación.
    13. Reponer la solución de anticuerpos secundarios, incubar durante otros 3 días a 37 °C con agitación.
    14. Después de 6 días de incubación en una solución secundaria de anticuerpos, lavar en PTwH 4-5 veces durante la noche a temperatura preparada.
    15. Deshidrate con una serie graduada de MeOH (20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 100 % y 100 % de MeOH). La muestra puede almacenarse durante la noche en RT.
    16. Incubar en 66% de diclorometano/33% de MeOH durante 3 h en RT con agitación.
    17. Lavar dos veces en diclorometano al 100% durante 15 min a RT con agitación.
    18. Incubar y almacenar muestras en éter bencílico. Llene el tubo para minimizar la oxidación del aire de la muestra.
  2. Obtención de imágenes de muestras de tejido aclaradas
    1. Coloque una cámara que contenga adhesivo en un portaobjetos y aplique esmalte de uñas alrededor del perímetro de la cámara. Para tejidos más gruesos, se pueden apilar cámaras y/o espaciadores adicionales en el portaobjetos.
    2. Coloque el pañuelo aclarado en la cámara, llénelo con éter bencílico y aplique un cubreobjetos.
    3. Aplica esmalte de uñas alrededor del cubreobjetos para crear un sello.
    4. Obtenga imágenes de escaneo en mosaico y pila Z utilizando un microscopio confocal de escaneo láser vertical con una lente de 5x o 10x para obtener imágenes a una profundidad de hasta la distancia de trabajo de la lente.
    5. Imagen a una resolución de 1024 x 1024 utilizando líneas láser apropiadas para los espectros de emisión de los fluoróforos utilizados. La autofluorescencia muscular es visible utilizando la línea láser de 488 nm.
    6. Asegúrese de que el tamaño del paso del eje z sea proporcional al muestreo de Nyquist basado en la apertura numérica del objetivo11 especificado.
    7. Cose imágenes y utilice software para la visualización en 3D.
    8. Cree figuras utilizando imágenes de proyección de máxima intensidad (MIP) de pilas Z para canales individuales y combinados (Figura 2).
  3. Inmunohistoquímica
    NOTA: Después de que el tejido se incluye en parafina22, se utiliza el siguiente procedimiento para crear portaobjetos para el estudio inmunohistoquímico.
    1. Preparación de la solución de adaptación del índice de refracción (RIMS).
      1. Prepare tampón de fosfato 0,1 mol/L añadiendo 10,9 g deNa2HPO4 (anhidro) y 3,1 g deNaH2PO4 (monohidrato) alH2O desionizado hasta un volumen total de 1 L (pH 7,4). Filtre-esterilice la solución y guárdela en RT.
      2. Diluir el tampón de fosfato a 0,02 mol/L.
      3. Disuelva Histodenz en 30 mL de tampón de fosfato de 0,02 mol/L agitando la solución durante 10 min con una barra de agitación magnética en la botella de almacenamiento final que pueda sellarse para minimizar la evaporación y la contaminación.
      4. Añadir azida sódica hasta una concentración total de 0,01% (p/v) y ajustar el pH a 7,5 con NaOH.
      5. Ajustar el IR variando la concentración final de Histodenz.
      6. Guarde el RIMS en RT durante meses. Deséchelo si se observa contaminación microbiana.
        NOTA: NO autoclave ninguna solución que contenga azida de sodio.
    2. Preparación de portaobjetos para estudio inmunohistoquímico
      1. Cree secciones de 5 μm de espesor con micrótomo. Aplique la sección de pañuelo a los portaobjetos cargados.
      2. Retire la parafina incubando los portaobjetos en >75% de xileno durante 10 min. Mueva los portaobjetos a un segundo recipiente con xileno durante 10 minutos más.
      3. Elimine el xileno sumergiendo los portaobjetos en EtOH al 100 % durante 10 minutos, luego en EtOH al 95 % durante 5 minutos y EtOH al 70 % durante 5 minutos.
      4. Enjuague los portaobjetos con H2O desionizado durante 5 min.
      5. Sumerja los portaobjetos en el tampón de recuperación de antígenos durante 25 minutos a 90-95 °C.
      6. Deje que el recipiente se enfríe a RT durante 1 h con agitación.
      7. Sumerja los portaobjetos en un tampón de remojo (0,01 mol/L PBS + 0,4% Triton X-100) durante 30 min a 4 °C.
      8. Rodee el pañuelo con una pluma PAP. Agregue PBS a cada portaobjetos y colóquelo en una cámara humidificada para evitar la desecación.
      9. Lavar los portaobjetos con PBS en RT con agitación durante 5 min.
      10. Bloquear con tampón de bloqueo (0,01 mol/L PBS + 10% Donkey Serum + 0,1% TX-100) durante 1 h con agitación.
      11. Incubar con un anticuerpo primario diluido en tampón de bloqueo durante la noche a 4 °C.
      12. Al día siguiente, deje que los portaobjetos se calienten a RT durante 15 minutos.
      13. Lave los portaobjetos 3 veces con 0,01 mol/L de PBS + 0,2% de TritonX-100 durante 5 min.
      14. Incubar con un anticuerpo secundario diluido en tampón de bloqueo durante 1 h a RT con agitación.
      15. Lave los portaobjetos 3 veces con 0,01 mol/L de PBS + 0,2% de TritonX-100 durante 5 min.
      16. Lave los portaobjetos 3 veces con 0,01 mol/L de PBS durante 5 min.
      17. Coloque 1 gota de RIMS con un gotero y aplique un cubreobjetos.
      18. Aplica esmalte de uñas alrededor del cubreobjetos para crear el sello.
      19. Como control negativo, se debe analizar una muestra sin el anticuerpo primario para demostrar la ausencia de tinción específica.
    3. Obtención de imágenes de portaobjetos inmunoteñidos
      1. Visualice los portaobjetos con un microscopio confocal de barrido láser con lentes de objetivo de 10x, 20x y 40x.
      2. Imagen a una resolución de 1024 x 1024 utilizando líneas láser apropiadas para los espectros de emisión de los anticuerpos secundarios utilizados.
      3. Cree figuras utilizando imágenes de proyección de máxima intensidad (MIP) de pilas Z para canales individuales y combinados (Figura 3).

2. Examen de mesoescala

  1. Disección estereoscópica
    1. Realice disecciones delicadas enfocándose en estructuras diminutas o delgadas, como el nódulo auriculoventricular, la arteria del nódulo auriculoventricular y el plexo nervioso cardíaco (escala submilimétrica a milímetros) con una lámpara de escritorio de aumento con pinza, telescopios quirúrgicos o microscopio estereoscópico.
  2. Micro-TC
    NOTA: La tomografía computarizada se realiza después de la perfusión a presión y la fijación y en cualquier etapa de la disección utilizando un escáner de tomografía por emisión de micropositrones (PET)/TC (Figura 4).
    1. Calentar la fuente de rayos X por TC durante 25 minutos antes de la toma de imágenes.
    2. Coloque la muestra de corazón en la base del escáner.
    3. Mueva la cama del escáner a una posición horizontal de 544 mm y una posición vertical de 14 mm para centrar el corazón en el campo de visión (FOV) de la TC.
    4. Adquiera imágenes de TC a 80 kVp, 150 μA, con 720 proyecciones durante un tiempo de exploración de 1 minuto a una resolución espacial de 200 μm.
    5. Reconstruya los datos de TC con un campo de visión de 12 cm x 12 cm x 10 cm y una matriz de vóxeles de 600 x 600 x 500, y guárdelos como un archivo DICOM.

3. Examen a macroescala

  1. Perfusión y fijación a presión
    NOTA: Los autores modifican las técnicas de perfusión y fijación a presión previamente descritas y las aplican a los corazones humanos no fallantes rechazados para trasplante 14,19,20,21.
    1. Utilice bombas de alto caudal para la fijación de la perfusión. Use etanol14 al 100 %, PFA al 4 % o formalina al 10 % para el fijador.
      NOTA: El corazón se recupera con la aorta ascendente, el tronco pulmonar y las venas cavas y pulmonares resecados lo más distalmente posible y se administran en la solución23 de la Universidad de Wisconsin.
    2. Utilice dos cánulas quirúrgicas de 20-24 Fr para la perfusión cardíaca derecha e izquierda. Para la perfusión del corazón derecho, canula la vena cava superior y coloque un respiradero en el tronco pulmonar o la arteria pulmonar con jeringas de plástico de 12 a 30 ml de tamaño medio cortado con puntas Luer-Lock conectadas a llaves de paso de tres vías.
    3. Ocluya la vena cava inferior y la otra arteria pulmonar con un cordón después de colocar una jeringa de plástico medio cortada con llave de tamaño adecuado o un tubo centrífugo de 1,5-5,0 ml.
      1. Para la perfusión anterógrada del corazón izquierdo, canula una de las venas pulmonares y coloque un orificio de ventilación en el extremo distal de la aorta con las jeringas de plástico de 12-30 ml de tamaño medio cortado con puntas Luer-Lock conectadas a llaves de paso de tres vías.
      2. Para la perfusión retrógrada del corazón izquierdo, canula una de las ramas del arco aórtico y coloca un respiradero en otra rama del arco aórtico. Coloque las puntas de las cánulas en ambos ventrículos.
    4. Ocluya los orificios de otros vasos con cordel después de insertar una jeringa de plástico medio cortada cerrada de tamaño adecuado o un tubo de microcentrífuga de 1,5-5,0 ml. Use una gasa delgada para cubrir la parte de inserción de las jeringas/tubos/cánulas para evitar fugas y deslizamientos. Repare las fugas grandes con sutura, bandas o aglomeraciones. Se permiten pequeñas fugas.
    5. Suspende el corazón en un recipiente de plástico.
    6. Conecte un tubo de plástico blando de 22-24 Fr a cada cánula e inserte el otro extremo del tubo en el recipiente lleno de fijador.
    7. Hacer circular el fijador a través de los circuitos del corazón derecho e izquierdo utilizando una bomba de alto flujo configurada a aproximadamente 100-300 mL/min para el corazón derecho y 200-400 mL/min para el corazón izquierdo para lograr aproximadamente 20 mmHg en el ventrículo derecho y 80 mmHg en el ventrículo izquierdo, respectivamente.
    8. Mantener la perfusión a 4 °C durante 24 h.
    9. Lavar el corazón con 0,01 mol/L de PBS durante 30 min agitando cuatro veces.
    10. Almacene el corazón en 0,01 mol/L de PBS/azida de sodio al 0,02% a 4 °C.
      NOTA: La fijación de presión-perfusión solo es efectiva para un corazón fresco, no para un corazón recuperado de un cadáver embalsamado.
  2. Disección macroscópica
    1. Realizar la disección progresiva con registros fotográficos en cada etapa de la disección.
    2. Para mantener la relevancia clínica, preste especial atención a evitar distorsionar/deformar cualquier estructura para mantener la morfología fisiológica del corazón.
    3. Obtener imágenes de las estructuras diana utilizando la orientación clínicamente relevante, como la orientación oblicua anterior derecha.
  3. Fotografía
    1. Coloque el corazón fijo y perfundido a presión en un trípode con una plataforma montada con múltiples puntas y la capacidad de girar 360grados.
    2. Fotografíe el corazón con una cámara réflex digital de un solo lente (Figura 5)24 mientras usa múltiples paneles de luz de diodo emisor de luz colocados en los soportes C y una amplia tela de fondo dúvredn negra.
    3. Fotografíe con el objetivo con una distancia focal larga (200 mm) a una distancia de trabajo de 4-6 pies para minimizar la distorsión del sujeto14.
  4. Anaglifos
    1. Para mostrar imágenes anaglíficas, reconstruya un par de fotografías o imágenes renderizadas en volumen a partir de conjuntos de datos de TC con una diferencia de 10° en el ángulo de rotación en el plano horizontal.
    2. Convierta un conjunto de estas imágenes bidimensionales (2D), denominadas estereogramas, en anaglifos utilizando el software gratuito16.
    3. Para ver un anaglifo, use anteojos rojos/cian.
  5. Fotogrametría
    NOTA: La fotogrametría es la ciencia aplicada a la generación de una reconstrucción tridimensional de la superficie a partir de múltiples fotografías bidimensionales tomadas desde diferentes ángulos17.
    1. Cuelgue la muestra en C-Stands o colóquela en la mesa giratoria para obtener cientos de fotografías multidireccionales con un teléfono inteligente.
    2. Genere el modelo 3D en formato FBX utilizando software disponible en el mercado.
  6. Tomografía computarizada
    NOTA: La tomografía computarizada se puede realizar después de la perfusión y fijación a presión y en cualquier etapa de la disección.
    1. Suspende la muestra de corazón de una barra colocada en la parte superior del recipiente. Para evitar que el corazón se balancee durante la exploración, sostenga la base del corazón con puntas de plástico fijadas en la parte inferior del recipiente. Por lo tanto, el aire servirá como un contraste negativo.
    2. Realice la tomografía computarizada utilizando un escáner de tomografía computarizada de fila de detectores múltiples disponible en el mercado con los siguientes parámetros: voltaje del tubo de 120 kV, corriente del tubo de 800-900 mA y una rotación del pórtico de 280 ms. La longitud de la dosis del producto es generalmente de 500-1200 mGy.cm.
    3. Reconstruya los datos de la imagen axial utilizando los siguientes parámetros: un espesor de sección, 0,6 mm; un intervalo incremental, 0,3 mm; un campo de visión, lo más pequeño posible (generalmente 100-200 mm); y una matriz, 512 × 512.
  7. Disección virtual
    1. Analice las imágenes de la tomografía computarizada utilizando el software disponible en el mercado para generar imágenes de disección virtuales.
      NOTA: La disección virtual es una modificación del proceso de representación del volumen en el que el foco se desplaza a las paredes de las cámaras y vasos cardíacos18. En este proceso, el umbral manual elimina prácticamente la cámara mejorada de los conjuntos de datos originales.
    2. Visualice las paredes, los tabiques y las válvulas no mejorados con disección virtual para producir imágenes similares a la disección macroscópica. A diferencia de la disección macroscópica de las muestras de corazón, los planos de corte durante la disección virtual son prácticamente ilimitados. Casi cualquier vista se puede recrear para visualizar las estructuras de interés según sea necesario.
  8. Impresión 3D
    1. Abra el archivo compatible de la muestra de corazón en el software de la impresora 3D.
    2. Utilice el perfil de 0,10 mm Fast DETAIL para la configuración de impresión en la impresora 3D y reduzca la velocidad de impresión a 20 mm/s. Habilite Generar material de soporte.
    3. Utilice el perfil del filamento de TPU para "Configuración del filamento" en la impresora 3D.
    4. Utilice el perfil de la boquilla Original Prusa MK4 Input Shaper 0.4 para "Configuración de la impresora" en la impresora.
    5. Una vez completado el corte, guarde el archivo BGCODE en una unidad flash USB para la impresión 3D.
    6. Utiliza el filamento TPU de 1,75 mm para imprimir en 3D la muestra de corazón humano. Antes de la impresión 3D, seca el filamento de TPU durante 6 h con un secador de filamentos.
    7. Para reducir la tensión del filamento durante la impresión 3D, coloque la bobina de filamento en un soporte de bobina con un rodamiento incorporado para facilitar la rotación de la bobina de filamento. Realice la impresión 3D utilizando una impresora 3D disponible en el mercado con una lámina de acero texturizada con recubrimiento en polvo.
    8. Retire con cuidado los materiales de soporte cuando se complete la impresión 3D.

Results

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Exámenes a microescala
La aplicación de la limpieza de tejidos permite obtener imágenes de mayores volúmenes de tejido en 3D mediante microscopía confocal. En el corazón, se pueden visualizar los ganglios que contienen las neuronas cardíacas y el patrón neural de la inervación miocárdica (Figura 2). La figura 3 muestra una imagen confocal del miocardio del ventrículo izquierdo humano inmunoteñido para los nervios y las células musculares lisas. Se observa que los vasos sanguíneos atraviesan el miocardio y se identifican numerosas fibras nerviosas, tanto en asociación con los vasos sanguíneos como independientemente de ellos.

Exámenes de mesoescala y macroescala
Cuando se usa etanol absoluto para la perfusión y fijación a presión de 24 horas, el color natural de la muestra se blanquea, el tejido se deshidrata25 y la elasticidad se reduce significativamente. Por otro lado, tras la fijación con PFA y formalina, el color natural y la elasticidad se mantienen notablemente. Por estas razones, el PFA o formalina se utiliza principalmente como fijador preferido.

La Figura 6 muestra imágenes representativas de la disección macroscópica, la disección virtual, el modelo de polígono STL y la impresión tridimensional. La Figura 7 muestra imágenes representativas de los anaglifos creadas a partir de imágenes de disección macroscópicas y virtuales. La percepción de la profundidad se puede obtener con gafas anaglíficas. El modelo fotogramétrico único capturado se puede observar desde casi todas las direcciones utilizando el software disponible comercialmente y demuestra características anatómicas complejas relevantes para los procedimientos cardíacos transcatéter de rutina. Al aplicar estas técnicas al corazón preparadas con perfusión y fijación de presión, la información tridimensional sobre el corazón puede retenerse casi eternamente, ya sea digital o físicamente, y compartirse sin fronteras. La Figura 8 muestra las impresiones 3D a escala del 50% replicadas de los corazones disecados rechazados para trasplante.

figure-results-1
Figura 1: Diagrama de flujo del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Sección de la aurícula derecha humana con aclarado de tejido. (A) Vista oblicua posterior derecha de una aurícula derecha humana con el plexo ganglionar auricular derecho (RAGP) disecado para la limpieza de tejido. (B) Muestra de RAGP antes y después del aclarado de tejido. (C) Proyección de máxima intensidad de una porción de RAGP humano aclarada por iDISCO+ que muestra ganglios (puntas de flecha) inmunoteñidos con el producto génico 9.5 (PGP9.5) de la proteína marcador panneuronal. Las barras de escala son de 1 cm (A), 5 mm (B) y 500 μm (C). Esta figura es una adaptación de Hanna et al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Portaobjetos inmunoteñidos del ventrículo izquierdo humano. Imagen confocal del corte de miocardio del ventrículo izquierdo humano inmunoteñido con el producto génico 9.5 (PGP9.5) y el marcador de células de músculo liso α-actina de músculo liso (αSMA). La autofluorescencia muscular es visible utilizando la línea láser de 488 nm (verde). La barra de escala es de 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Imágenes de tomografía microcomputarizada de muestras de corazón. (A) Configuración de tomografía microcomputarizada para imágenes de muestras de corazón. (B) Interfaz de usuario para imágenes de microtomografía computarizada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Estudio fotográfico en el Centro de Arritmias Cardíacas de la UCLA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Disección macroscópica (arriba a la izquierda), disección virtual (arriba a la derecha), modelo de polígono STL (abajo a la izquierda) e impresión tridimensional (abajo a la derecha) de imágenes del complejo valvular aórtico y mitral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: Anaglifos de una disección macroscópica (izquierda) y una disección virtual (derecha) del complejo valvular aórtico y mitral. Las gafas anaglíficas (rojo/cian) son necesarias para obtener la percepción de la profundidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 8: Impresión tridimensional de muestras de corazón. (A) Configuración de la impresora tridimensional (3D) para la impresión 3D de muestras de corazón con un filamento de TPU. (B) Impresiones 3D de corazón representativo producidas utilizando los métodos descritos en este estudio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El presente estudio demuestra el proceso exhaustivo para analizar muestras obtenidas de corazones humanos completos. Los resultados representativos muestran exámenes anatómicos a micro y macroescala realizados de forma rutinaria para un solo corazón. Dado que una muestra de corazón humano es extremadamente valiosa, un enfoque multiescala es ideal y eficaz para no desperdiciar ninguna parte de la muestra mediante la aplicación de múltiples protocolos para diversos fines, incluido el descubrimiento en la investigación científica, la mejora de los procedimientos clínicos y la educación anatómica con el mantenimiento de la correlación anatómica en el contexto de todo el corazón.

En cuanto al examen a microescala, la inmunotinción y la microscopía se pueden aplicar para comprender la citoarquitectura de las muestras cardíacas humanas. Aquí se demuestra la aplicación del deslucide de tejidos y la inmunohistoquímica para estudiar la neuroanatomía cardíaca a escala celular. El uso de estas técnicas es útil en la caracterización del sistema nervioso cardíaco y los patrones de inervación miocárdica en relación con las estructuras de interés, como el sistema de conducción cardíaca y las cámaras cardíacas. Aunque se logra una excelente resolución espacial, el uso de la microscopía confocal, particularmente para muestras aclaradas de tejido, requiere mucho tiempo. La microscopía de hoja de luz se puede utilizar para reducir el tiempo de adquisición de imágenes a expensas de la resolución espacial.

En cuanto al examen a mesoescala a macroescala, la resolución espacial de los escáneres de micro-TC en la institución de los autores oscila entre 10 y 200 μm. El tamaño de la muestra está limitado a 20 mm para una exploración de 10 μm y a 120 mm para una exploración de 100-200 μm. Los escáneres de micro-TC en la institución de los autores no pueden acomodar todo el corazón. Así, en la institución de los autores, una gammagrafía cardíaca completa requiere el uso de un tomógrafo clínico con una resolución espacial de 600 μm, aunque los avances han permitido el desarrollo de escáneres micro-TC que pueden obtener imágenes de todo el corazón2. El desarrollo tecnológico, como la tomografía computarizada de conteo de fotones, seguramente ampliará más posibilidades. La mejora de la resolución espacial del archivo STL debería ser el primer paso para mejorar aún más la calidad de la impresión 3D. El mayor coste de la impresión 3D limita la aplicación de la técnica a la práctica clínica habitual. Las imágenes de fotogrametría generadas a partir de cualquier aplicación de teléfono inteligente son fáciles de revelar y de una calidad aceptable, pero requerirán sistemas más sofisticados, pero costosos y lentos para mejorar la resolución26. Para visualizar en 3D, la realidad extendida con cascos dedicados27,28 y monitores holográficos29 son herramientas adicionales, pero también están limitadas por el mayor costo.

En resumen, a través de análisis estructurales exhaustivos a escalas microscópicas y macroscópicas, la anatomía a microescala de cada estructura y su contribución funcional pueden entenderse en el contexto de todo el corazón. Junto con el desarrollo de imágenes de alta resolución, la distancia entre la anatomía a micro y macroescala se está expandiendo drásticamente. Es posible que los expertos en el análisis de microscopía electrónica de cardiomiocitos no estén familiarizados con el número de valvas mitrales y viceversa. Para facilitar la comprensión integral de la morfología cardíaca, los científicos deben seguir explorando más detalles de cada árbol, mientras mantienen la vista de pájaro de todo el bosque.

Acknowledgements

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Agradecemos a las personas que han donado sus cuerpos para el avance de la educación y la investigación. Estamos agradecidos a la Fundación OneLegacy, que formó la base para obtener corazones de donantes para la investigación. También agradecemos a Anthony A. Smithson y Arvin Roque-Verdeflor del Centro de Investigación Traslacional de Imágenes (Departamento de Radiología) de UCLA por su apoyo en la adquisición de datos de TC. Este proyecto fue apoyado por el Proyecto Amara Yad de UCLA. Agradecemos a los doctores Kalyanam Shivkumar y Olujimi A. Ajijola por establecer y mantener una línea de investigación sobre el corazón humano. Agradecemos a nuestra Gerente de Operaciones de Investigación, Amiksha S. Gandhi, por su dedicación para apoyar nuestros proyectos. Este trabajo fue posible gracias al apoyo de las subvenciones de los NIH OT2OD023848 y P01 HL164311 y la subvención Leducq 23CVD04 a Kalyanam Shivkumar, el Premio de Desarrollo Profesional de la Asociación Americana del Corazón 23CDA1039446 a PH y el Proyecto Amara-Yad de UCLA (https://www.uclahealth.org/medical-services/heart/arrhythmia/about-us/amara-yad-project). El escáner microPET/CT GNEXT utilizado en este estudio fue financiado por una subvención de Instrumentación Compartida para Investigación Animal de los NIH (1 S10 OD026917-01A1).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x Solución salina tamponada con fosfatoSigma-AldrichP3813
Visor 3DMicrosoft
647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch Laboratories711-605-152
647 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgGJackson ImmunoResearch Laboratories713-605-147
AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D Objetivo IF-EDNikon
Anti-Actina, α-Músculo liso - Anticuerpo Cy3Sigma-AldrichC6198
Tampón de recuperación de antígenos (100x Tampón EDTA, pH 8.0)Abcamab93680
Anti-PGP9.5 (producto génico de proteína 9.5)Abcamab108986
Anti-TH (tirosina hidroxilasa)Abcamab1542
Anti-VAChT (transportador vesicular de acetilcolina)Synaptic Systems139 103
Éter bencílicoSigma-Aldrich108014
Albúmina sérica bovinaSigma-AldrichA4503-10G
Cheetah Filamento para impresora 3D (95A), 1,75 mmCubreobjetos NinjaTek
, 22 mm x 30 mm, n.º 1,5VWR48393 151
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Conejo IgGJackson ImmunoResearch Laboratories711-165-152
DiclorometanoSigma-Aldrich270997-100ML
DimetilsulfóxidoSigma-AldrichD8418-500ML
Etanol, 100%Laboratorios Decon2701
GlicinaSigma-AldrichG7126-500G
GNEXT PET/CTSOFIE Biosciences
Heparina sal sódica de la mucosa intestinal porcinaSigma-AldrichH3149-50KU
HistodenzSigma-AldrichD2158-100G
Solución de peróxido de hidrógenoSigma-AldrichH1009-500ML
Software de imagenZeissZEN (edición negra)
Software de imagenOxford InstrumentsImaris 10
iSpacerSunjin LabsiSpacer 3mm
KIRI EngineKIRI Innovation
Microscopio confocal de barrido láserZeissLSM 880
LEAD-2 - Vertical & Bomba peristáltica multicanalLONGER
Lightview XL Brightech
Metanol (Certificado ACS)Fischer ScientificA412-4
Nikon D850Nikon
NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4NinjaTek
Suero de burro normalJackson ImmunoResearch Laboratories017-000-121
Impresora 3D Original Prusa MK4Prusa Research
Bolígrafo PAPAbcamab2601
Paraformaldehído, 32%Microscopía Electrónica Ciencias15714-S
PolycamPolycam
Anticuerpo
PrusaSlicer 2.7.1Prusa Research
SARA-Enginepita4 mobile LLC
ScaniverseNiantic
Anticuerpo
secundario SlowFade Gold Antiface MountantInvitrogenS36936
Azida sódica, 5% (c/v)Ricca Chemical Company7144.8-32
SOMATOM Definición ASSiemens Healthcare Standard
Field Surgi-Spec Telescopes, Diseños para el
SZ61OLYMPUS
StereoPhoto MakerGratuito desarrollado por Masuji Suto
Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio, prelimpiadosFisher Scientific12-550-15
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100ML
XilenoSigma-Aldrich534056-4L
Ziostation2 Ziosoft, AMIN
primario sistema de microscopio estereoscópico de visión

References

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