Artículo de método

Estudio de los efectos de los contaminantes ambientales inhalados sobre la función olfativa en ratones

DOI:

10.3791/66818

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13 de septiembre de 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Environmental and Occupational Health, School of Public Health, Qingdao University

En este artículo

Resumen

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Este artículo proporciona una descripción detallada de la prueba de alimentos enterrados y el experimento de discriminación social de olores para evaluar los efectos de la exposición a contaminantes ambientales inhalados en la función olfativa en ratones.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El deterioro olfativo es un importante problema de salud pública y predice de forma independiente el riesgo de enfermedades neurodegenerativas. La exposición a contaminantes ambientales inhalados puede afectar el olfato; Por lo tanto, existe una necesidad urgente de métodos para evaluar los efectos de la exposición a contaminantes ambientales inhalados sobre el olfato. Los ratones son modelos ideales para experimentos olfativos debido a su sistema olfativo altamente desarrollado y sus características de comportamiento. Para evaluar los efectos de la exposición a contaminantes ambientales inhalados en la función olfativa en ratones, se proporciona una prueba detallada de alimentos enterrados y un experimento de discriminación social de olores, que incluye la preparación del experimento, la selección y construcción de instalaciones experimentales, el proceso de prueba y los índices de tiempo. Mientras tanto, se discuten el equipo de cronometraje, los detalles operativos y el entorno experimental para garantizar el éxito del ensayo. El sulfato de zinc se utiliza como tratamiento para demostrar la viabilidad del enfoque experimental. El protocolo proporciona un proceso operativo simple y claro para evaluar los efectos de los contaminantes ambientales inhalados en la función olfativa en ratones.

Introducción

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El deterioro olfativo se ha convertido en un problema de salud pública notable y se asocia de forma independiente con un mayor riesgo de enfermedades neurodegenerativas. Esta afección puede afectar negativamente el bienestar general, contribuir al desarrollo de síntomas depresivos y dar lugar a una disminución de la calidad de vida. Su impacto se observa de manera prominente en la percepción alterada de la comida, el obstáculo en la comunicación social y el aumento de los sentimientos negativos1. Varios factores, como la enfermedad nasal, la infección del tracto respiratorio superior y la lesión cerebral traumática, se han considerado contribuyentes al deterioro olfativoen los seres humanos. En particular, los contaminantes ambientales inhalables como las PM2.5, que se estima que oscilan entre el 2% y el 16%, ingresan al cuerpo a través del aire inspirado, atraviesan la cavidad nasal y llegan a regiones específicas dedicadas al olfato donde se depositan 3,4,5,6,7. Hallazgos recientes indican que los contaminantes ambientales inhalables, incluyendo PM2.5 y amoníaco, pueden dañar las neuronas sensoriales olfativas 8,9,10. Sin embargo, se requiere una validación adicional para determinar si dicho daño conduce directamente a la disfunción olfativa. Por lo tanto, una evaluación meticulosa de los efectos de los contaminantes ambientales inhalables sobre la función olfativa es de particular importancia.

En la actualidad, numerosos laboratorios de investigación emplean ratones como modelo alternativo de vertebrados para experimentos conductuales destinados a comprender los cambios en la función olfativa 11,12,13,14. Los ratones fueron elegidos como el sistema modelo preferido para investigar la comunicación química de los vertebrados, y exhiben una notable sensibilidad olfativa crucial para la búsqueda de alimento y la comunicación social15. Además, la continua evolución de las herramientas para observar e influir en el comportamiento de los ratones ha hecho que esta especie sea excepcionalmente atractiva para la investigación dela función olfativa.

En este estudio, empleamos la prueba de alimentos enterrados y el experimento de discriminación social de olores para evaluar el deterioro olfativo en un modelo de ratón expuesto a contaminantes ambientales inhalables. Para mejorar la precisión de la evaluación, se optó por el método más representativo para evaluar la función olfativa. Hemos refinado sistemáticamente este método para garantizar la simplicidad y la claridad, lo que nos permite medir eficazmente el alcance de la disfunción olfativa inducida por los contaminantes ambientales inhalables.

Protocolo

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Utilizamos ratones machos C57BL/6J (edad: 6-8 semanas; peso: 20-22 g) para todas las pruebas de comportamiento. Los ratones fueron sometidos a condiciones estables (es decir, temperatura, 23 ± 1 °C; humedad, 55% ± 5%, y ciclo de luz-oscuridad de 12/12 h con las luces encendidas a las 7:00). Todas las pruebas conductuales se realizaron entre las 10:00 y las 17:00 horas. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética del Comité Profesional de Experimentos con Animales de la Universidad de Qingdao. Después de un período de aclimatación de 1 semana, todos los ratones fueron expuestos a contaminantes ambientales inhalables.

1. Exposición a contaminantes

  1. Administración intranasal por instilación
    1. Disuelva los contaminantes ambientales inhalables en una solución salina al 0,9%. Use una solución de sulfato de zinc al 5% una vez, lo que se ha demostrado que causa disfunción olfativa17. Para los ratones control, administrar solución salina normal al 0,9%.
    2. Anestesiar al ratón mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 1% 18 y evaluar la profundidad de la anestesia mediante el reflejo de pinzamiento del dedo del pie. Aplica ungüento veterinario en los ojos del ratón para prevenir la sequedad. Coloque el ratón boca arriba sobre una superficie inclinada, con la cabeza hacia abajo.
    3. Con una pistola de pipeteo, administre 10 μL de la solución en una fosa nasal del ratón, permitiendo inhalar naturalmente la solución en la cavidad nasal.
    4. Para garantizar el bienestar del ratón y evitar cualquier molestia potencial, repita la inhalación por la otra fosa nasal después de un intervalo de 10 minutos.
    5. A los 3 días después de la administración intranasal por instilación en ratones, realizar la prueba de alimentos enterrados.

2. Prueba de alimentos enterrados

  1. Llevar a cabo la privación de alimentos a las 18-24 h antes de la prueba retirando todos los pellets de comida de la tolva de comida de la jaula doméstica. Cambia los materiales de la cama para ratones. No retire la botella de agua.
  2. Organice la mesa de operaciones como se describe a continuación.
    1. 1 h antes del inicio de la prueba, llevar la jaula que contiene los ratones al quirófano para descansar.
    2. Organice el quirófano durante este período. Utilice y marque las jaulas de ratones estándar de PVC transparente como A, ya que crean un entorno familiar. Use y marque la jaula de prueba como B, que es una jaula de ardilla estándar de PVC transparente. Marque la jaula común utilizada para colocar a los ratones después del experimento como jaula C.
    3. Cubra las jaulas A y B con 3 cm de material de cama y mídalas con una regla. Coloque las jaulas una al lado de la otra, con una distancia de 0,5 m entre cada jaula (Figura 1).
    4. Defina el área experimental como un área con un radio de 2 m, siendo el centro el centro de las jaulas. Defina el área fuera del rango de 2 m como área de observación.
    5. Mantenga la jaula C y las jaulas que contengan ratones no probados lo más lejos posible del área experimental.
  3. Registre el tiempo para encontrar comida como se describe a continuación.
    1. Seleccione una posición al azar en la jaula B, entierre la comida a 1 cm por debajo de la superficie de la ropa de cama y alise la superficie de la ropa de cama.
    2. Coloca al ratón en la jaula A durante 4 min. Transfiera los ratones a la jaula B al final del cronometraje, encienda el dispositivo de video y regrese al área de observación.
    3. Cuando el ratón recoja el bloque de comida con su pata delantera, detenga la grabación de vídeo. En algunos casos, se puede ver a los ratones comiendo con la cabeza inclinada sobre la comida. Este comportamiento también indica el éxito de la prueba, incluso si el ratón no está sosteniendo la comida con su pata delantera.
    4. Registrar datos. Registre el tiempo desde el contacto con la alfombra en el fondo de la jaula B hasta que se encontró comida para cada ratón. Si los ratones no encuentran comida después de 4 minutos, registre el tiempo de búsqueda como un tiempo de retardo de 240 s.
    5. Coloque el ratón en la jaula C después de la prueba.
    6. Retire el alimento de la jaula B y colóquelo en una bolsa sellada. Reemplace la comida en la jaula B y pruebe el siguiente ratón después de cambiar el material de la cama, como se describe a continuación.
      1. Para ratones alojados en la misma jaula, pruebe con el mismo conjunto de materiales de cama en la jaula B. Para ratones en diferentes jaulas, limpie la jaula con alcohol y reemplace los materiales de la cama.
    7. Agregue alimento y agua a los ratones después del experimento. Realiza el experimento de discriminación social de olores 1 día después.
      NOTA: Se deben usar máscaras durante todo el proceso y se deben cambiar los guantes transparentes después de que cada ratón termine el experimento para evitar el cruce de olores tanto como sea posible. Mantenga la amplitud de los movimientos lo más pequeña posible para evitar el estrés del mouse.

3. Experimento de discriminación social de olores

  1. Recolección de orina
    1. Recoger por separado la orina de ratones machos y hembras sexualmente maduros y agruparla en tubos en volúmenes iguales19. Envasar en tubos de microcentrífuga de 2 mL con 300 μL de orina en cada tubo.
    2. Guarde las muestras a -80 ° C hasta su uso. Agite los tubos para distribuir uniformemente la muestra después de descongelarla. No descongele ni congele la muestra repetidamente.
  2. Organice la mesa de operaciones como se describe a continuación.
    1. 1 h antes del inicio de la prueba, llevar la jaula que contiene los ratones al quirófano para descansar.
    2. Organice el quirófano durante este período como se describe en los pasos 2.2.2-2.2.5.
  3. Registre el tiempo para encontrar la orina como se describe a continuación.
    1. Haga una ranura con cinta adhesiva alrededor de cada uno de los dos lados anchos de la jaula B, lo suficientemente grande como para sostener el tubo de microcentrífuga que contiene 300 μL de orina masculina y femenina. Coloque los tubos y mantenga las dos tapas de los tubos cerradas por ahora.
    2. Coloque el ratón en la jaula A y establezca una cuenta regresiva para 4 minutos. Abra los dos tubos de la jaula B al final del cronometraje.
    3. Transfiera el mouse a la posición central de la jaula B, a la misma distancia de los dos tubos, luego encienda el equipo de grabación de video y retírese suave y lentamente al área de observación.
    4. Cuando el ratón olfatea la pared/boca del tubo o incluso dentro del tubo, el tubo se huele con éxito. En este momento, presione el cronómetro y registre la hora como la hora de oler el tubo (M s), luego continúe registrando el tiempo de residencia (X s) hasta que el mouse se aleje del tubo.
    5. Continúa cronometrando el tiempo olfateando el otro tubo. Cuando el ratón olfatea la pared/boca del tubo o incluso dentro del tubo, el tubo se huele con éxito. Presione el cronómetro y registre el tiempo que tardó en oler el otro tubo (N s), luego continúe registrando el tiempo de residencia (Y s) hasta que el mouse se aleje del tubo.
    6. Transfiera el ratón a la jaula C al final del experimento.
    7. Cambie los tubos de orina y el material de cama de la jaula B después de cada prueba con ratones. Coloque la orina de rata usada en una bolsa limpia según el sexo.
    8. Cambie los guantes y pruebe el siguiente mouse como se describe anteriormente.
  4. Realiza el experimento en un laboratorio sin olor evidente. Evite los productos personales que emiten olores fuertes. Use guantes y mascarillas durante todo el procedimiento para evitar que los olores se crucen tanto como sea posible. Mantenga la amplitud de los movimientos lo más pequeña posible para evitar el estrés del mouse.

Resultados

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Los contaminantes ambientales inhalables deterioran la función olfativa en ratones. Se ha demostrado que el zinc atmosférico emitido por incineradores y vehículos de motor es un contaminante inhalado que puede provocar inflamación pulmonar alérgica20. El sulfato de zinc es considerado uno de los compuestos típicos causantes de disfunción olfativa21. Por lo tanto, utilizamos sulfato de zinc como tratamiento para exponer ratones mediante instilación intranasal y probamos utilizando la prueba de alimentos enterrados y el experimento de discriminación de olores sociales. En la prueba de entierro de alimentos, los ratones expuestos al sulfato de zinc tardaron más de 240 s en encontrar el alimento en comparación con el grupo de control (Figura 2). Los ratones privados de comida con olfato normal suelen encontrar la comida enterrada en 1 minuto. Cuando los ratones desarrollaron disfunción olfativa, tardaron más en encontrar comida o incluso no pudieron encontrar comida. En comparación con el grupo de control, los ratones del grupo expuesto tardaron más en encontrar comida, con algunos casos en los que no pudieron encontrar comida en 240 s, lo que indica daño en la función olfativa.

Resultados similares se observaron en el experimento de discriminación social de olores. En ratones expuestos al sulfato de zinc, no se pudo olfatear ni la orina de machos ni de hembras durante el tiempo de observación establecido (Figura 3A). Más allá del tiempo establecido, los ratones expuestos al sulfato de zinc olfatearon brevemente la orina de hembras y machos, pero el tiempo de olfateo fue significativamente menor que el de los ratones de control (Figura 3B). Cuando se presentan volúmenes iguales de orina femenina y masculina al mismo tiempo, los ratones machos suelen preferir la orina femenina22. Los ratones del grupo expuesto necesitaron más tiempo para distinguir entre la orina de las hembras y los machos o ni siquiera pudieron distinguirlos. En concreto, en comparación con el grupo de control, los ratones del grupo expuesto pasaron más tiempo oliendo la orina y menos tiempo cerca de la orina.

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Figura 1: Diseño de la tabla de operaciones. Las jaulas A y B se mantuvieron a una distancia de 0,5 m. El equipo de grabación de vídeo se controló por encima de la jaula B mediante el soporte del teléfono móvil, y el campo de vídeo se ajustó para grabar el entorno interno de la jaula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Resultados de las pruebas de alimentos enterrados. Análisis estadístico de los ratones control y ratones expuestos a sulfato de zinc en busca de alimento. Los ratones del grupo de control encontraron comida a los 30 s, y los ratones expuestos al sulfato de zinc encontraron comida durante más de 240 s, que se calculó como 240 s. Se utilizó una prueba t de muestra independiente para comparar las diferencias entre los dos grupos. Los datos se presentan como media ± DE (n = 3 ratones por grupo); ** P < 0,01. Si algún animal no encontraba el alimento después de 240 s, el tiempo para encontrar alimento se registraba como 240 s, como fue el caso de todos los animales tratados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Experimento de discriminación social de olores. (A) Análisis estadístico de los ratones control y ratones expuestos al sulfato de zinc en busca de orina. Los ratones del grupo de control encontraron orina en un plazo de 30 s, y los ratones expuestos al sulfato de zinc pasaron más de 240 s buscando orina femenina o masculina, que se contó como 240 s. Si algún animal no encontraba el frasco de orina después de 240 s, el tiempo para encontrar el frasco se registraba en 240 s, como fue el caso de todos los animales tratados. (B) Se analizó estadísticamente el tiempo de residencia en contacto con la orina para ratones control y ratones expuestos a sulfato de zinc. Se utilizó una prueba t de muestra independiente para comparar las diferencias entre los dos grupos. Los datos se presentan media ± DE (n = 3 ratones por grupo); ** p < 0,01, * p < 0,5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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Este artículo presenta dos protocolos fundamentales diseñados para la evaluación rápida del deterioro olfativo en ratones. Diversos contaminantes ambientales inhalables dan lugar a distintos niveles de disfunción olfativa en ratones. La prueba de alimentos enterrados se emplea para evaluar la capacidad de detectar olores volátiles, mientras que el experimento de discriminación social de olores evalúa la capacidad del animal para discernir y diferenciar varios olores sociales. El protocolo aquí sirve para evaluar los efectos tóxicos de los contaminantes ambientales sobre la función olfativa.

Los contaminantes ambientales inhalados, como el ozono, el amoníaco y los gases de escape del diésel, poseen olores que pueden influir en la percepción olfativa de los ratones durante el olfateo de la muestra23,24. Es crucial tener en cuenta que la realización de experimentos conductuales en ratones inmediatamente después de la conclusión de la exposición podría producir resultados falsos negativos22. Para abordar esta preocupación, implementamos medidas para mejorar la confiabilidad experimental. En concreto, se limpiaron a fondo las jaulas y se sustituyeron los materiales de cama tras el periodo de exposición. Posteriormente, se realizaron experimentos conductuales con un intervalo de 24 h post-exposición22. Este ajuste de procedimiento tiene como objetivo garantizar resultados precisos y significativos.

En el experimento de entierro de alimentos, un parámetro clave fue el tiempo que tardaron los ratones en localizar la comida oculta. Vale la pena señalar que los ratones estresados tienden a exhibir una mayor actividad y un enfoque reducido durante las pruebas, lo que puede conducir a resultados falsos positivos 25,26,27,28. Por lo tanto, es imperativo asegurarse de que los ratones permanezcan tranquilos y no estén sujetos a un estrés excesivo durante la fase de prueba. Para evitar cualquier posible interferencia, los ratones se transfirieron de su alojamiento al área de prueba 1 h antes del experimento. Este paso se tomó para permitir que los ratones se aclimataran y redujeran el estrés. Para facilitar el registro preciso del tiempo, la grabadora de video se activó cuando los ratones fueron introducidos en la jaula experimental B, y luego los observadores se retiraron inmediatamente al área de observación. Los observadores se colocaron a una distancia óptima de 2 m de la jaula, lo que garantizó una observación clara sin causar molestias. Los criterios para identificar el descubrimiento exitoso de alimentos incluyeron casos en los que los ratones usaron sus patas delanteras o inclinaron la cabeza sobre la comida. Ambos comportamientos fueron considerados indicativos de búsqueda de alimento, alineándose con estándares ampliamente aceptados19. En los casos en que varios ratones dentro del mismo grupo de dosis necesitaban pruebas, se aseguró de que no fueran devueltos a su jaula de cría original, sino que se les colocara temporalmente en una jaula C ordinaria. Solo después de probar a todos los ratones en la misma jaula, se devolvieron colectivamente a su alojamiento original. Dado el olor potencial de los alimentos probados, se tomaron precauciones para almacenarlos en bolsas herméticas de antemano y volver a sellarlos o colocarlos en recipientes herméticos después de su uso. Estas medidas se implementaron para mantener la integridad de las condiciones experimentales y garantizar resultados confiables.

En los experimentos de discriminación social de olores, es esencial utilizar muestras de orina derivadas de ratones sexualmente maduros19. La determinación de la madurez sexual se basa en la edad de los ratones, un parámetro que varía según las diferentes cepas de ratones. Después de la recolección, se recomienda almacenar la orina masculina y femenina por separado en un refrigerador a -80 °C. Estudios anteriores empleaban cronómetros con fines de cronometraje. Sin embargo, este método tenía limitaciones, como que los observadores estaban situados a una distancia considerable de la jaula experimental, lo que generaba problemas potenciales como observaciones poco claras y tiempos inexactos 19,22,29. Para hacer frente a estos desafíos, hemos mejorado los procedimientos de cronometraje incorporando equipos de video en lugar de cronómetros. Esta modificación no solo facilita la adquisición de datos más precisos, sino que también permite la recopilación de datos de múltiples grupos experimentales.

En estos experimentos, se utilizó el dispositivo de video para registrar el comportamiento de los ratones, lo que tiene la ventaja de reducir la velocidad de fotogramas del video y permitir a los observadores registrar el tiempo de varias actividades de comportamiento de los ratones con mayor precisión, compensando la deficiencia de que los observadores no podían observar el comportamiento de los ratones en el área de observación. Sin embargo, la desventaja de utilizar equipos de grabación de video es que el tiempo de análisis aumentará. Al final del experimento, necesitábamos volver a ver el video para registrar el tiempo de las diversas actividades conductuales de cada ratón. Cuando la cantidad de ratones es grande, es necesario analizar el video de cada ratón, lo que aumentará la carga laboral del laboratorio.

Los resultados de la investigación indican que varios contaminantes ambientales inhalables pueden afectar negativamente la función olfativa. Este artículo presenta un enfoque rápido, sencillo y razonablemente preciso para evaluar la toxicidad olfativa asociada con los contaminantes ambientales inhalables. Este método es crucial en la realización de evaluaciones de riesgo de disfunción olfativa atribuida a contaminantes ambientales en sujetos humanos.

Divulgaciones

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Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

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Este trabajo contó con el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82204088, 82273669) y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Shandong, China (ZR2021QH209).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.5-10 μ L  micropipeta ajustableEppendorf, Alemania3123000225Solución salina de instilación intranasal
al 0,9%Solarbio7647-14-5Disolver contaminantes
Sulfato de zinc anhidroMacklin7733-02-0Exponer ratones
Tubo de centrífuga (2 mL)Biosharp IncorporatedBS-20-MColocar orina
Balanza electrónicaChangzhou Ohaus Co. EX125DZHPeso, anestésicos y contaminantes
Prisma GraphPadSoftware GraphPad8.0.1análisis estadístico
Detector de polvo portátilTSI  DuatTrak incorporado figure-materials-18532Ratones expuestos a la inhalación Equipo de
grabaciónde vídeo Apple Inc.iPhone 6s PlusSe registró el tiempo de actividad de los ratones
Mezclador de vórticeHaimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.Vórtice-5 Solución de mezcla

Referencias

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