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Muerte inducida por LPS y ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA y su validación

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DOI:

10.3791/66831

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3 de mayo de 2024

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1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Acupuncture and Tuina School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

En este artículo

Resumen

Este protocolo se basa en la muerte inducida por LPS y ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. Utilizamos la citometría de flujo para analizar la tinción doble de anexina V y 7-AAD para detectar la muerte celular, utilizando toda la célula y empleando microscopía electrónica de barrido para observar la morfología de la membrana celular.

Resumen

La muerte celular es un proceso fundamental en todos los organismos vivos. El protocolo establece un modelo de lipídico diferenciado por forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) inducido por lipopolisacárido (LPS) y trifosfato de adenosina (ATP) en macrófagos monocitos humanos (THP-1) para observar la muerte celular. El LPS combinado con ATP es un método clásico de inducción inflamatoria, a menudo utilizado para estudiar la piroptosis, pero la apoptosis y la necroptosis también responden a la estimulación por LPS/ATP. En circunstancias normales, la fosfatidilserina solo se localiza en la valva interna de la membrana plasmática. Sin embargo, en las primeras etapas de piroptosis, apoptosis y necroptosis, la membrana celular permanece intacta y expuesta a la fosfatidilserina, y en las etapas posteriores, la membrana celular pierde su integridad. En este caso, se utilizó citometría de flujo para analizar la tinción doble de anexina V y 7-aminoactinomicina D (AAD) para detectar la muerte celular de las células enteras. Los resultados muestran que células sustanciales murieron después de la estimulación con LPS/ATP. Utilizando microscopía electrónica de barrido, observamos las posibles formas de muerte celular en células individuales. Los resultados indican que las células pueden sufrir piroptosis, apoptosis o necroptosis después de la estimulación con LPS/ATP. Este protocolo se centra en observar la muerte de los macrófagos tras la estimulación con LPS/ATP. Los resultados mostraron que la muerte celular después de la estimulación con LPS y ATP no se limita a la piroptosis y que también pueden ocurrir apoptosis y apoptosis necróticas, lo que ayuda a los investigadores a comprender mejor la muerte celular después de la estimulación con LPS y ATP y elegir un mejor método experimental.

Introducción

La muerte celular es un proceso fisiológico fundamental en todos los organismos vivos. En los últimos años, estudios sustanciales han demostrado que la muerte celular está involucrada en la inmunidad y el equilibrio dentro del organismo. El estudio de la muerte celular nos ayuda a comprender mejor la aparición y el desarrollo de las enfermedades. Se han descrito varias formas de muerte celular programada y se han identificado algunos objetivos clave en estos procesos. La piroptosis, la apoptosis y la necroptosis son las tres vías de muerte celular programada genéticamente definidas que participan en el equilibrio interno yla enfermedad.

La piroptosis se caracteriza por la formación de poros en la membrana y la liberación de contenido celular. Las caspasas o granzimas activadas escinden las gasderminas para separar sus dominios N-terminales, que luego se oligomerizan, se unen a la membrana y forman poros 2,3,4. El poro de gasdermina proporciona un canal de secreción atípico a través de las membranas celulares, lo que da lugar a respuestas celulares posteriores, incluida la liberación de contenido y la afluencia de iones 2,3,4. En última instancia, las células finalmente experimentan la ruptura de la membrana plasmática y la lisis piroptótica facilitada por la ninjurina-15. En la apoptosis, Bax y Bak activados forman oligómeros en la membrana externa mitocondrial y liberan citocromo C, que está regulado por un equilibrio entre proteínas proapoptóticas y antiapoptóticas de la familia BCL-2, caspasas iniciadoras (caspasas-8, -9 y -10) y caspasas efectoras (caspasas-3, -6 y -7)1,6,7. Los cambios morfológicos de la apoptosis incluyen la formación de ampollas en la membrana, la contracción celular, la fragmentación nuclear, la condensación de la cromatina y la formación de cuerpos apoptóticos 6,8. La serina/treonina-proteína quinasa 1 (RIPK3) que interactúa con el receptor y el dominio similar a la quinasa de linaje mixto (MLKL) son dos componentes centrales del mecanismo necroptótico1. RIPK3 recluta y fosforila MLKL, p-MLKL oligomeriza, se asocia con la membrana celular, inicia perforaciones de membrana, causa afluencia de iones, aumenta la osmolaridad intracelular y, finalmente, la ruptura celular 6,9. Las gasderminas y MLKL se unen a la membrana plasmática y median la piroptosis y la necroptosis, respectivamente, mientras que BAX/BAK media la apoptosis al unirse a la membrana externa de las mitocondrias6.

Aunque cada vía tiene mecanismos y resultados específicos, conducen a cambios similares en la membrana celular. En circunstancias normales, la fosfatidilserina (PS) solo se localiza en la valva interna de la membrana plasmática. Sin embargo, en las primeras etapas de piroptosis, apoptosis y necroptosis, la PS estará expuesta, fuera de la membrana plasmática. La caspasa-3/caspasa-7 activa las familias TMEM16 y XKR, lo que conduce a una membrana celular asimétrica y externaliza la PS durante la apoptosis10. La afluencia de Ca2+ mediada por Gasdermin D y MLKL conduce a la pérdida de la simetría de la bicapa de fosfolípidos en la membrana celular y a la exposición de PS. La exposición ocurre antes de la pérdida de la integridad de la membrana celular11,12. Sobre la base de los cambios similares en la membrana de estos tres tipos de muerte celular programada, utilizamos la citometría de flujo para analizar la tinción doble de la anexina V/7-aminoactinomicina D (7-AAD) para detectar la muerte celular. La anexina V, una proteína de unión a fosfolípidos dependiente del calcio, tiene una alta afinidad por la PS, que puede servir como una sonda sensible para detectar la PS expuesta en la superficie de la membrana plasmática13. El 7-AAD es una tinción de ácido nucleico que no puede atravesar toda la membrana celular. Es similar al yoduro de propidio (PI), un colorante de ácido nucleico comúnmente utilizado. Tienen características de fluorescencia similares, pero el 7-AAD tiene un espectro de emisión más estrecho y menos interferencia con otros canales de detección. Debido a estas similitudes, no es suficiente distinguir entre piroptosis, apoptosis y necroptosis. Utilizamos la citometría de flujo para detectar la muerte celular de células enteras. Un segundo método se utiliza para capturar la membrana celular mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) para observar las posibles formas de muerte celular en células individuales.

Establecimos un modelo de macrófagos diferenciados por forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) inducido por lipopolisacárido (LPS) y trifosfato de adenosina (ATP) en macrófagos monocitos humanos (THP-1) para observar la muerte celular. Este protocolo se centra en la observación de la muerte celular más que en la investigación de los mecanismos.

Protocolo

1. Línea celular y cultivo celular

  1. Cultive la línea celular monocítica humana THP-1 en el medio de cultivo completo RPMI-1640 con 10% de suero fetal bovino, 1% de penicilina-estreptomicina y 0,05 mM de β-mercaptoetanol. Cultivar las células a 37 °C en aire humidificado con 5% de CO2 . Subcultivo de células cada 2-3 días.
    NOTA: THP-1 es una célula de suspensión, seleccione para cambiar la mitad del medio para subcultivo. Cuando observe muchos fragmentos de células bajo el microscopio óptico, centrifugar a 300 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente. Vuelva a suspender las células en el medio de cultivo celular completo fresco precalentado.
  2. Utilice células (en los pasajes 4-10) en la fase de crecimiento logarítmico para todos los experimentos. Cuando las células están en buen estado y fase de crecimiento logarítmico, son redondas, brillantes, densas y sin grumos ni fragmentos celulares bajo el microscopio óptico a 100 x.

2. Diferenciación de las células THP-1

  1. Prepare una solución madre de PMA con una concentración de 1 mM (disuelva 1 mg de PMA en 1,62 mL de dimetilsulfóxido). Diluir la solución madre de PMA con medio de cultivo celular completo hasta una concentración de trabajo final de 100 nM.
  2. Recoja las células de la placa de cultivo en un tubo de centrífuga estéril de 10 ml. Centrifugar a 300 x g durante 3 min a temperatura ambiente, resuspender las células con 3 mL de medio de cultivo completo que contenga PMA.
  3. Abra el contador de celdas y el software de conteo. Pipetear 20 μL de suspensión celular en la placa de contador de células e insertarla en la placa de contador de células. Haga clic en Vista previa B1, gire la perilla en la parte inferior derecha del instrumento y ajuste la distancia focal para que las celdas tengan un centro brillante con contornos claros en el software. Haga clic en Contar para comenzar a contar.
  4. En función de los resultados del recuento, utilice un medio de cultivo completo que contenga PMA para ajustar la densidad celular a 1 x 106 células/mL. Las células de siembra se colocan en una placa de 6 pocillos, se incuba la placa durante 24 h a 37 °C y 5% deCO2 antes de comenzar el tratamiento posterior.

3. Tratamiento de las células THP-1

  1. Prepare una solución madre de LPS con una concentración de 1 mg/mL (disuelva 1 mg de LPS en 1 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS)). Diluir la solución madre de LPS con medio sin suero hasta una concentración de trabajo final de 1 μg/mL. Prepare una solución madre de Na2ATP con una concentración de 500 mM (disuelva 0,3026 g de ATP en 1 mL de PBS).
  2. Aspire el medio que contiene PMA de los pocillos y lávelo con PBS 1x. Añada un medio sin suero al grupo de control y un medio sin suero que contenga LPS al grupo modelo. Incubar la placa durante 6 h a 37 °C + 5% de CO2 antes de continuar con el tratamiento.
  3. Después de 6 h, agregue la solución madre de ATP al grupo modelo hasta una concentración de trabajo final de 500 nM. Incubar la placa durante 45 minutos a 37 °C + 5% de CO2 antes de continuar.

4. Análisis de citometría de flujo (Método 1)

  1. Preparación de muestras experimentales
    1. Siembre e incube las células en placas de 6 pocillos de acuerdo con el paso 2. Establezca cuatro grupos de control sin tratamiento: un control sin tinción, dos controles con tinción simple (uno para cada mancha) y un control con tinción doble. Establezca un grupo de tratamiento y trate de acuerdo con el paso 3.
    2. Después del tratamiento, aspire todo el sobrenadante de los pocillos y lave con PBS 2x. Añadir 500 μL de tripsina al 0,05% (sin EDTA) a cada pocillo e incubar en la incubadora durante 30 s.
    3. Agregue 1 mL de medio de cultivo completo RPMI-1640 a cada pocillo para detener el desprendimiento de células y recoja las células en el tubo de 5 mL. Centrifugar a 300 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
    4. Agregue 1 mL de PBS para resuspender las células. Coloque los tubos con células en un baño de agua a 37 °C durante 3 min. Centrifugar todas las muestras a 300 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
    5. Diluir 200 μL de tampón de unión 5x con 800 μL de agua destilada en 1x tampón de unión. Agregue 100 μL de tampón de unión 1x para resuspender las células y transferir las células al tubo de 5 mL.
    6. Añada 5 μL de solución de anexina V-PE a un tubo de células del grupo de control durante 10 min y 5 μL de solución de 7-AAD a otro tubo de células del grupo de control durante 5 min (como controles de tinción única por separado). Agite suavemente cada tubo para mezclar, colorear e incubar las muestras a temperatura ambiente, protegidas de la luz. Agregue 400 μL de PBS a cada tubo y haga un vórtice suavemente para finalizar la incubación.
    7. Añadir 5 μL de solución de anexina V-PE a los tubos restantes e incubar durante 5 min a temperatura ambiente. Agite suavemente cada tubo para mezclar, colorear e incubar las muestras a temperatura ambiente, protegidas de la luz. Después de 5 minutos, agregue 5 μL de solución de 7-AAD durante 5 minutos a temperatura ambiente. Agregue 400 μL de PBS a cada tubo y haga un vórtice suavemente para finalizar la incubación.
    8. Filtre la suspensión celular con una malla de nailon de 35 μm que forman parte de los tubos de poliestireno de fondo redondo de 5 mL. Coloque el tubo sobre hielo y espere a que se haga la prueba. Mezcle suavemente antes de probar y luego insértelo en el instrumento.
  2. Citometría de flujo
    1. Utilice un citómetro de flujo de clasificación celular activado por fluorescencia para las pruebas. Abra el software de análisis de datos del citómetro de flujo y confirme el rendimiento del detector y el láser. Haga clic en el citómetro y elija Inicio de fluidos, espere a que el sistema esté listo. Excluya las burbujas de la cámara de flujo haciendo clic en Citómetro > modos de limpieza > celda de flujo de desgasificación.
    2. Haga clic en Experimento, seleccione en secuencia Nueva carpeta, Experimento, Muestra, Tubo y Editar nombre. Una flecha de forma pentagonal frente del tubo, se vuelve verde cuando se ilumina.
    3. Haga clic en el icono del citómetro FACSCelesta (un icono de tecla de acceso directo), seleccione Parámetro y, a continuación, seleccione FSC, SSC y señal PE . Haga clic en el icono de Hoja de cálculo global (un icono de tecla de acceso directo) para establecer el histograma de PE. Para el citómetro de flujo utilizado en este estudio, utilice PE para la anexina V a 586 nm y trace en el eje X; PerCP-Cy5.5 para 7-AAD a 700 nm y trazado en el eje Y.
    4. Inserte primero la muestra de control sin teñir en el instrumento. Haga clic en el icono del Panel de control de adquisiciones (un icono de tecla de acceso directo), adquiera un mínimo de 10.000 eventos de la población deseada. Excluya los escombros mediante una puerta (P1) en un diagrama de puntos FSC-A y SSC-A. Ajuste el caudal a la velocidad media y registre los datos. Ajuste el voltaje para colocar la población de celdas en la diagonal del histograma FSC/SSC y haga clic en Reiniciar. Ajuste el caudal a la velocidad media y registre los datos.
    5. Haga clic en Siguiente tubo, ejecute controles de tinción individuales de anexina V y 7-AAD para ajustar la compensación. Ejecute los tubos restantes y recopile datos.

5. Imágenes SEM (Método 2)

  1. Preparación de muestras experimentales
    1. Siembre e incube las células en placas de 6 pocillos de acuerdo con el paso 2 y trátelas de acuerdo con el paso 3.
    2. Después del tratamiento, aspire todo el sobrenadante de los pocillos y lave 2 veces con PBS. Añadir 500 μL de tripsina al 0,05% (sin EDTA) a cada pocillo e incubar en la incubadora durante 30 s.
    3. Agregue 1 mL de medio de cultivo completo RPMI-1640 a cada pocillo para detener el desprendimiento de células y recoja las células en el tubo de 5 mL. Centrifugar a 300 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
    4. Fije las células con 500 μL de fijador de microscopio electrónico (dialdehído glutárico al 2,5%, 100 mM de sales de fósforo) durante 2 h a temperatura ambiente, seguido de toda la noche a 4 °C.
    5. Prepare la solución de alumbre y cromo: Agregue 1,0 g de gelatina a 100 ml de agua ultrapura, calentamiento al baño de agua a 70 °C y revuelva uniformemente. Añadir 0,05 g de alumbre de cromo, remover uniformemente y filtrar con papel de filtro. Sumerja el cubreobjetos limpio en una solución de cromo y alumbre durante 2 h a 37 °C y séquelo en un horno a 37 °C para su uso posterior.
      NOTA: El propósito es evitar el desprendimiento de células durante el experimento.
    6. Recoja células de solución fija. Centrifugar a 300 x g durante 3 min a temperatura ambiente. Agregue 100 μL de PBS y sople suavemente las células. Deje caer la suspensión de la celda sobre el cubreobjetos, déjela reposar durante 5 minutos. Aspire todo el sobrenadante y lave 3 veces con PBS durante 5 minutos cada vez.
      NOTA: La operación debe realizarse con suavidad para evitar el desprendimiento de la célula. No agite vigorosamente, muévase lentamente y agregue líquido lentamente a lo largo de la pared.
    7. Añadir 500 μL de fijación de ácido ósmico al 1% durante 1 hora. Aspire todo el sobrenadante y lave 3 veces con PBS durante 5 minutos cada vez.
    8. Deshidratar las muestras sucesivamente en una serie de concentraciones de etanol (EtOH) (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) durante 15 min por solución de EtOH.
      NOTA: Los cubreobjetos se pueden mantener en 100% EtOH durante varios días a 4 °C, pero deben secarse lo antes posible para evitar una deshidratación excesiva.
    9. Encienda el secador de puntos críticos, abra el tanque de CO2 , enfríe la cámara a 10 °C. Envuelva rápidamente la muestra con papel de filtro cuando la presión de la cámara sea de 0 psi y colóquela en la cámara.
    10. Abra la válvula de entrada, observe a través de la ventana de observación de CO2 , eleve el nivel de CO2 líquido entre las dos líneas rojas (no exceda el límite superior), cierre la válvula de entrada. Remoje la muestra durante 10 min. Abra las válvulas de entrada y escape simultáneamente para igualar el CO2 durante 1 minuto (el CO2 líquido desplaza al EtOH). Cierre la válvula de escape para elevar el nivel de CO2 líquido a la posición especificada, cierre la válvula de entrada.
    11. Ajuste la temperatura a 35 °C y la presión a 1250 psi. Una vez que la temperatura y la presión se estabilicen, despresurice a 100 psi/min. Extraiga la muestra cuando la presión de la cámara sea cero y apague el instrumento.
    12. Monte las muestras en soportes de muestras de aluminio SEM con cinta conductora. Emplee un recubridor de pulverización catódica para cubrir las muestras con una capa (2-5 nm) de oro.
  2. Imagenológico
    1. Utilice SEM de emisión de campo frío de alta resolución para la obtención de imágenes. Ajuste el voltaje de aceleración de SEM a 3 kV. Ajuste la distancia de trabajo a 10 mm. Ajuste el aumento a 1.000x para observar el panorama. Ajuste el aumento a 5.000x y 20.000x para localizar la membrana plasmática y obtener una imagen de la muestra.
      NOTA: El proceso de visualización de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA a través de SEM es similar al de otros tipos de células y tejidos y depende de los instrumentos utilizados. La referencia14 proporciona un protocolo SEM detallado con videos adjuntos.

Resultados

Las muestras celulares se trataron como se describe en el protocolo y se realizó la detección por citometría de flujo. Las células normales no se pueden teñir con anexina V y 7-AAD (anexina V-/7-AAD-). En las primeras etapas de la piroptosis, apoptosis y necroptosis, la PS estaba expuesta y unida a la anexina V, pero la membrana celular aún estaba intacta y excluía la 7-AAD del espacio extracelular (anexina V+/7-AAD-). En las etapas posteriores, la membrana celular pierde su integridad, las células se tiñen simultáneamente con anexina V y 7-AAD, mostrando resultados dobles positivos (anexina V+/7-AAD+). Las células necróticas solo se tiñeron con 7-AAD (anexina V-/7-AAD+). La Figura 1 muestra que después de la estimulación con LPS/ATP, las células de la región Q2 aumentaron significativamente, lo que indica la muerte celular.

Utilizamos SEM para capturar la superficie de la membrana plasmática, observando directamente las características de la membrana de una sola célula. La Figura 2A muestra las células de control, la Figura 2B-D muestra las células después de la estimulación con LPS/ATP. Observamos células con características de piroptosis, incluyendo ampolla de membrana y ruptura de membrana (Figura 2B), células con características apoptóticas, incluyendo ampolla de membrana y contracción celular (Figura 2C), y células con características de necroptosis, incluyendo hinchazón celular y ruptura de membrana (Figura 2D).

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Figura 1: Detección de doble tinción de anexina V/7-AAD mediante citometría de flujo. (A) Tinción de anexina V negativa y 7-AAD negativa (Q4), anexina V positiva y tinción doble negativa de 7-AAD (Q3), tinción de anexina V positiva y 7-AAD positiva (Q2) y tinción de anexina V negativa y 7-AAD positiva (Q1). B) Datos cuantitativos para (A). Los datos se presentan como media ± DE (n=3), prueba t no apareada, **p < 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Imágenes de microscopía electrónica de barrido de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. (A) Grupo de control, aumento de 5.000x/20.000x. (B, C, D) El grupo LPS/ATP muestra formación de ampollas en la membrana, ruptura de la membrana (↑), hinchazón celular (↑) y contracción celular (↑) con un aumento de 5.000x/20.000x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

En este manuscrito, se utilizaron dos métodos para detectar la muerte inducida por LPS y ATP de macrófagos THP-1 diferenciados por PMA. Se utilizó la tinción doble con anexina V/7-AAD y los resultados se analizaron mediante citometría de flujo a partir de la tinción general. Al igual que con otros análisis de citometría de flujo, se configuró un grupo de células sin tinción y dos grupos de células con una sola tinción para excluir los resultados falsos positivos y falsos negativos. Los resultados muestran que después de la estimulación con LPS/ATP, varias células perdieron la integridad de la membrana, lo que indica que puede haber ocurrido la muerte celular. Este método de detección nos permite evaluar la muerte celular de células enteras. Vale la pena señalar que la tinción doble de anexina V/7-AAD no es suficiente para distinguir entre piroptosis, apoptosis y necroptosis. En las primeras etapas de estas tres formas, la PS se expondrá fuera de la membrana plasmática y la tinción con anexina V es positiva. La integridad de la membrana se pierde durante la etapa tardía de estas tres formas, y los resultados de la tinción muestran una tinción doble positiva. Por lo tanto, utilizamos SEM para observar más a fondo las posibles formas de muerte celular que podrían ocurrir.

En la apoptosis, se produce la formación de poros BAX/BAK en la membrana externa mitocondrial, la posterior contracción celular y la formación de burbujas en la membrana celular. La necroptosis emplea MLKL para abrir los poros en la membrana celular, mientras que la señal de piroptosis activa la gasdermina para formar poros en la membrana celular. Vale la pena señalar que tanto la piroptosis como la necroptosis se acompañan de la ruptura de la membrana celular en la etapa final. Sin embargo, los poros de gasedermin son mucho más grandes que los poros de MLKL, por lo que los poros de gasdermin no tienen selectividad iónica. Las células necroptóticas exhiben una hinchazón significativa en la morfología15. En última instancia, terminan en la ruptura de la membrana. Independientemente de la vía de señalización aguas arriba de la activación de la permeabilidad de la membrana celular, los cambios en la membrana celular acompañan a estas tres formas de muerte celular. Utilizamos SEM para observar más a fondo la membrana celular, lo que proporciona una forma intuitiva de examinar la muerte celular. Observamos las características de la piroptosis, incluyendo la formación de ampollas en la membrana y la membrana de ruptura, y la necroptosis, incluyendo la hinchazón celular y la membrana de ruptura, consistentes con las características estudiadas por investigadores previos15. Observamos la formación de ampollas y la contracción celular, en consonancia con las características de apoptosis estudiadas por investigadores previos16.

En estudios previos, la combinación de LPS y ATP se utilizó a menudo para inducir piroptosis. Curiosamente, observamos características de apoptosis y necroptosis. Aunque las tres formas pueden ocurrir en la muerte celular inducida por LPS/ATP, estudios previos han demostrado que la piroptosis sigue siendo el modo dominante de muerte. El LPS es uno de los patrones moleculares asociados a patógenos más caracterizados. El ATP liberado por las células moribundas, tiene una alta concentración dentro de la célula. El ATP extracelular es uno de los patrones moleculares asociados al peligro17. LPS/ATP es un método clásico de estimulación en dos pasos para inducir piroptosis. La investigación ha demostrado que la adición de ATP a las células estimuladas por LPS puede activar rápidamente la caspasa-118, mientras que el silenciamiento del gen de la caspasa-1 puede revertir significativamente la muerte celular inducida por LPS/ATP19. En estudios previos, también hemos encontrado la activación inducida por LPS/ATP de proteínas diana apoptóticas y necrtóticas20,21. Aunque el LPS/ATP es un inductor clásico de la piroptosis, también puede inducir apoptosis y necroptosis.

De hecho, estas tres formas a menudo no existen de forma independiente, y la diafonía entre las etapas de la señal. Por ejemplo, las proteínas de gasdermina se dirigen a las mitocondrias para promover la liberación de citocromo c para mejorar la vía apoptótica mitocondrial22. La activación de la caspasa-3 puede escindir la gasdermina E y luego desencadenar la piroptosis23. Un estudio sugiere que la señalización MLKL/PIPK3 está involucrada en la activación de los inflamasomas NLRP324. Esta compleja diafonía condujo al concepto de PANoptosis, definida como una vía de muerte celular programada inflamatoria regulada por el complejo PANoptosoma con características clave de piroptosis, apoptosis y/o necroptosis que no pueden ser explicadas por ninguna de estas vías de muerte celular programada por sí solas25. A medida que se propuso el concepto de PANOPTOSIS, los científicos describieron la ocurrencia de la muerte celular programada de manera más integral, esto también destaca la complejidad de la muerte celular programada. Mientras tanto, esto también indica las limitaciones de este método de investigación. Aunque la piroptosis se considera dominante en la muerte celular inducida por LPS/ATP, no se puede determinar la proporción de estas formas de muerte o si todas existen, incluso involucrando otras formas de muerte programada. Esta puede ser un área a investigar en el futuro.

Este protocolo se basa en la muerte de macrófagos inducida por LPS y ATP. Hemos descrito un método de prueba desde el todo hasta el individuo, que también es aplicable a otros modelos y células. Los resultados indican que las células pueden haber sufrido piroptosis, apoptosis o necroptosis, que no se limita a la piroptosis, lo que ayuda a los investigadores a comprender mejor la muerte celular después de la estimulación con LPS y ATP y a elegir un mejor método experimental. En estudios previos, la anexina V/7-AAD o la doble tinción de anexina V/PI se utilizaron comúnmente para indicar la aparición de apoptosis26,27, algunos investigadores también la han utilizado para estudiar la apoptosis28. De hecho, no podemos distinguir entre los tres tipos de muerte celular a través de estas dobles tinciones. Este protocolo recuerda a los investigadores, especialmente a los principiantes, que la tinción doble con anexina V/7-AAD o anexina V/PI no puede determinar el tipo de muerte celular. Solo puede mostrar el daño celular y la muerte en su conjunto o indicar que la célula puede haber sufrido algún tipo de muerte. En investigaciones más específicas, es necesario introducir un grupo de control que inhiba otras muertes para demostrar que la muerte programada está a la mano. Del mismo modo, la investigación mecanicista adicional investigará los objetivos críticos de diferentes muertes programadas.

Además, durante la preparación del experimento, encontramos que actualmente existen muchos procedimientos experimentales detallados para SEM de células adherentes, con poca descripción de células en suspensión. Aquí, proporcionamos una descripción más detallada del método de preparación de muestras para células en suspensión. El paso 5.5 es un paso necesario para ayudar a inmovilizar las células suspendidas en portaobjetos de células. Las operaciones posteriores deben realizarse con suavidad para evitar el desprendimiento de la célula. Además de la solución de cromo y alumbre, la poli-L-lisina también puede inmovilizar células.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Expresamos nuestro gran agradecimiento a Jiayi Sun y Lu Yang del Instituto Innovador de Medicina y Farmacia China de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu, por la asistencia con la citometría de flujo, a Cuiping Chen del Laboratorio Estatal Clave de Recursos de Medicina del Suroeste de China, por la ayuda con la microscopía electrónica de barrido. Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China [82104491], la Fundación de Ciencias Naturales de Sichuan [2023NSFSC0674] y la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China [2021M693789].

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución de enzimas pancreáticas al 0,25 % (excluido EDTA)BOSTER Biological Technology co.ltdPYG0068
Tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 mLCORNING352235
tubo de centrífuga de 5 mLLabgic Technology Co., Ltd. BS-50-M Placa
de 6 pocillos Sorfa Life Science Research Co., Ltd220100
Kit de análisis de apoptosis de anexina V-PE/7-AADAbsenta (Shanghai) Tecnología biológica co.ltdabs50007Anexina V-PE, 7-AAD, 5&veces; Tampón aglutinante, solución de control positivo de apoptosis
cultivo de celcultivo2 incubadoraEsco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.N/A
plato de cultivo celular, 100 mmSorfa Life Science Research Co., Ltd230301
Celómetro K2 Contador de células fluorescentesNexcelom Bioscience LLCCelómetro K2
Celómetro SD100 Cámaras de conteoNexcelom Bioscience LLCCHT4-SD100-002
Máquina centrífugaHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., LtdL530
alumbre de cromo  Guangdong Wengjiang Reactivo químico Co., Ltd.
cubreobjetos, 9 mmLabgic Technology Co., Ltd. BS-09-RC
secador de punto críticoQuorum TechnologiesK850
dimetilsulfóxido BOSTERBiological Technology co.ltdPYG0040
fijador de microscopio electrónicoServicebio Technology co., ltd G11022.5% dialdehído glutárico, 100 mM sales de fósforo
balanza electrónicaSHIMADZUATX124
absoluto de etanolChengdu Kelong Chemical Co., Ltd2021033102
citómetro de flujoBecton,Dickinson and CompanyFACSCanto figure-materials-1
análisis de citometría de flujoBecton,Dickinson and CompanyBD FACSDivaTM software
gelatinaGuangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.PA00256 
Microscopio electrónico de barrido de emisión de campo frío de alta resoluciónTITACHIRegulus 8100
línea celular monocítica humana THP-1Procell Life Science& Tecnología Co., Ltd.CL0233
microscopio invertido Leica Microsystems Co., LtdDMi1
IR Vortex MixerVELP Scientifica SrlZX4
lipopolisacárido Beijing Solarbio Ciencia & Tecnología Co., Ltd. L8880LPS se deriva de Escherichia coli 055:B5
Na2ATPBeijing Solarbio Science & Tecnología Co., Ltd. A8270
forbol-12-miristato-13-acetato Beijing Solarbio Ciencia & Tecnología Co., Ltd. P6741
solución salina tamponada con fosfatoServicebio Technology co., ltd G4202
PipetaEppendorf AGN/A
puntas de pipeta, 10 μ LServicebio Technology co.ltd Puntas de pipeta T-10PL
, 1 mL Servicebio Technology co., ltd Puntas de pipeta T-1250L
, 200 μ LServicebio Technology co.ltd T-200L
RPMI-1640 medio de cultivo completoProcell Life Science& Tecnología Co., Ltd.CM0233RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoetanol + 1% P/S
RPMI-1640 medios de cultivo Shanghái   BasalMedia  Tecnologías Co., LTD.
fluido de la vainaBECKMAN COULTER8546733
recubridor de pulverización catódicaCressington Scientific Instruments Ltd108
baño de agua termostáticoGUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd HH-1
PA04354software de K211104

Referencias

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