Artículo de método

Medición de la respiración mitocondrial en fibras musculares esqueléticas humanas y de ratón mediante respirometría de alta resolución

2.4K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/66834

⸱

4 de octubre de 2024

 , 
1John T. Milliken Department of Medicine, Division of Nutritional Sciences and Obesity Medicine, Washington University School of Medicine, 2Nutrition and Obesity Research Center, Cellular and Molecular Biology Core, Washington University School of Medicine, 3Nutrition and Obesity Research Center, Animal Model Research Core, Washington University School of Medicine

En este artículo

Resumen

Aquí, describimos un método integral para medir la fosforilación oxidativa mitocondrial en fibras de músculo esquelético permeabilizadas frescas a partir de músculo humano o de ratón. Este método permite la cuantificación en tiempo real de la respiración mitocondrial y la evaluación de la preferencia de combustible y la flexibilidad metabólica, al tiempo que preserva las redes mitocondriales existentes y la integridad de la membrana.

Resumen

La función mitocondrial, una piedra angular de la producción de energía celular, es fundamental para mantener la homeostasis metabólica. Su disfunción en el músculo esquelético está relacionada con trastornos metabólicos prevalentes (por ejemplo, diabetes y obesidad), distrofias musculares y sarcopenia. Si bien existen muchas técnicas para evaluar el contenido y la morfología mitocondrial, el método distintivo para evaluar la función mitocondrial es la medición de la fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS) mediante respirometría. La cuantificación de OXPHOS mitocondrial proporciona información sobre la eficiencia de la producción de energía oxidativa mitocondrial y la bioenergética celular. Un respirómetro de alta resolución proporciona mediciones robustas y altamente sensibles de OXPHOS mitocondrial en fibras musculares permeabilizadas al medir los cambios en tiempo real en la tasa de consumo de oxígeno mitocondrial. El uso de fibras musculares permeabilizadas, a diferencia de las mitocondrias aisladas, preserva las redes mitocondriales, mantiene la integridad de la membrana mitocondrial y, en última instancia, permite mediciones más relevantes fisiológicamente. Este sistema también permite medir la preferencia de combustible y la flexibilidad metabólica, aspectos dinámicos del metabolismo energético muscular. Aquí, proporcionamos una guía completa para las mediciones de OXPHOS mitocondrial en fibras musculares esqueléticas humanas y de ratón utilizando un respirómetro de alta resolución. Los grupos de músculos esqueléticos están compuestos por diferentes tipos de fibras que varían en su preferencia de combustible mitocondrial y bioenergética. Utilizando un respirómetro de alta resolución, describimos métodos para evaluar los sustratos glucolíticos aeróbicos y de ácidos grasos para evaluar la preferencia por el combustible y la flexibilidad metabólica de una manera dependiente del tipo de fibra. El protocolo es versátil y aplicable tanto a fibras musculares humanas como a las de roedores. El objetivo es mejorar la reproducibilidad y la precisión de las evaluaciones de la función mitocondrial, lo que mejorará nuestra comprensión de un orgánulo importante para la salud muscular.

Introducción

Las mitocondrias son la piedra angular de la producción de energía celular, lo que las hace indispensables para mantener una homeostasis celular y orgánica óptima. Estos orgánulos de doble membrana son los principales responsables de la fosforilación oxidativa. Este proceso convierte eficientemente los nutrientes, como los azúcares y los ácidos grasos, en trifosfato de adenosina (ATP), la moneda celular de la energía. Más allá de su papel en el metabolismo energético, las mitocondrias también son reguladores clave de varios procesos celulares, como la apoptosis, la homeostasis del calcio y las especies reactivas de oxígeno (ROS)1,2. Debido a su papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis celular y del organismo, las interrupciones en la función mitocondrial a menudo tienen efectos perjudiciales en la salud de los tejidos y el organismo. En el músculo esquelético, la disfunción mitocondrial se asocia con numerosos estados patológicos, incluidos trastornos metabólicos (por ejemplo, obesidad, diabetes y enfermedades cardiovasculares), sarcopenia y distrofia muscular 3,4,5,6,7,8.

La disfunción mitocondrial puede manifestarse principalmente como alteración del contenido, el número y la morfología mitocondrial, así como la alteración del metabolismo. Por lo tanto, lograr una comprensión integral de la disfunción mitocondrial requiere un enfoque integrador y holístico. Los estudios iniciales de caracterización incluyen el examen de los niveles de expresión de los complejos de proteínas de la cadena respiratoria como una lectura del contenido mitocondrial, la cuantificación del ADN mitocondrial y los marcadores de biogénesis como una medida de la biogénesis mitocondrial, y la obtención de imágenes sofisticadas de microscopía electrónica para evaluar la morfología mitocondrial 9,10. Las evaluaciones adicionales de la función mitocondrial incluyen la evaluación de la producción celular de ROS y ATP y el potencial de la membrana mitocondrial9.

Debido a que las mitocondrias son esenciales para la producción de energía celular y la homeostasis, un sello distintivo para evaluar la función mitocondrial es medir la fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS). La respirometría de alta resolución de fibras musculares permeabilizadas permite medir los cambios en tiempo real en la tasa de consumo de oxígeno mitocondrial como lectura de los cambios dinámicos en la actividad de la cadena respiratoria OXPHOS mitocondrial 9,11,12. La aplicación de moduladores e inhibidores químicos selectivos permite medir la actividad de diferentes complejos respiratorios de forma directa y secuencial. Aunque las mitocondrias aisladas se pueden usar en la respirometría, el uso de fibras musculares frescas y permeabilizadas mantiene las redes mitocondriales endógenas y la integridad de la membrana, lo que permite mediciones fisiológicamente más relevantes. Además, debido a que los diferentes tipos de fibras musculares tienen diferentes preferencias de sustrato y tasas de respiración, este sistema permite medir los cambios en la preferencia de combustible y la flexibilidad metabólica en función del tipode fibra 13.

Aquí, describimos un protocolo completo para las mediciones de OXPHOS mitocondrial utilizando fibras de músculo esquelético humano o de ratón en un sistema de respirómetro de alta resolución. Se incluyen métodos para cuantificar la respiración mitocondrial de oxígeno en fibras oxidativas o glucolíticas utilizando piruvato o palmitoil-carnitina como sustrato. Este protocolo permite el uso de otros sustratos de combustible para abordar cuestiones metabólicas específicas relacionadas con defectos en la utilización del sustrato y la preferencia de combustible.

Protocolo

Todos los procedimientos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Washington. Se pueden utilizar ratones de cualquier sexo, edad y peso para estos experimentos y dependerán de la naturaleza de la pregunta experimental que se pretenda abordar. Los ratones utilizados aquí son ratones adultos (12-16 semanas de edad), machos de tipo salvaje C57BL/6. Todos los procedimientos humanos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Washington. Los sujetos del estudio dieron su consentimiento para el uso de datos, y los datos representativos de sujetos humanos incluidos en este protocolo provienen de un estudio publicado14. Los datos aquí son de mujeres posmenopáusicas no diabéticas (55-75 años). En la Tabla 1 se presentan los detalles para la preparación de los reactivos necesarios para el ensayo. La información sobre los reactivos, herramientas y máquinas específicos utilizados en el ensayo se enumeran en la Tabla de materiales. En la Figura 1 se presenta una descripción general esquemática del protocolo.

figure-protocol-1
Figura 1: Esquema de respirometría de alta resolución en muestras de músculo esquelético permeabilizado. El método detallado en este manuscrito se divide en 6 secciones: 1) preparación de tampones y reactivos de respiración, 2) preparación de instrumentos y reactivos el día del ensayo, 3) preparación y permeabilización de muestras musculares, 4) preparación de muestras e instrumentos, 5) ejecución del ensayo de respiración y 6) análisis de datos. Creado con BioRender.com Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Preparación de ensayos y calibración de instrumentos

  1. El día del ensayo, retire el número necesario de alícuotas de cada compuesto respiratorio (blebbistatina, palmitoil-carnitina, glutamato, malato, ADP, succinato, citocromo C, FCCP) y descongele en hielo. Descongele los viales de BIOPS y MiR05 en hielo.
  2. Prepare las soluciones de saponina y piruvato como se indica en la Tabla 1. Prepare una solución de trabajo de MiR05 como se muestra en la Tabla 1. Prepare 5 mL de solución de trabajo de MiR05 por instrumento (2 cámaras). Escale verticalmente según sea necesario.
  3. Encienda el sistema de respirometría de alta resolución y el sistema de vacío. Retire los tapones, retire la solución de almacenamiento de etanol al 70% al vacío y vuelva a llenar la cámara con H2O de grado molecular ultrapuro. Retire H2O al vacío y vuelva a llenar. Repita para un total de 3 lavados. Después del lavado final, añadir 2 mL de MiR05 (sin creatina ni blebbistatina) a cada cámara.
  4. Abra el software de respirometría. Una vez que se inicie el software, se abrirá un cuadro emergente para la configuración del instrumento. Ajuste la velocidad de agitación de la cámara a 750 rpm, la temperatura a 37 °C y el intervalo de registro de datos a 2 s. Ajuste la ganancia a 1 y el voltaje de polarización a 800 mV para los sensores de oxígeno. Haga clic en Conectar al oxígrafo para establecer comunicación con el instrumento.
  5. Una vez establecida la comunicación, se abrirá un cuadro de diálogo para nombrar y guardar el archivo experimental. Guarde el archivo con la fecha actual y la calibración. Después de guardar el archivo, aparecerá un cuadro de diálogo emergente para los detalles experimentales. No se necesita información para la ejecución de la calibración y la caja se puede cerrar.
  6. Registre la concentración de oxígeno durante al menos 30 minutos para permitir que las cámaras se calienten y para registrar señales para la calibración del aire. Esto se puede hacer mientras se preparan las fibras musculares, como se detalla en el paso 2 a continuación.
  7. Al final del período de calibración, marque una región de calibración en la que la concentración de oxígeno (línea azul) sea estable. Para ello, mantenga pulsada la tecla Mayús y el botón izquierdo del ratón y arrastre por una región de la línea de tiempo.
  8. Abra la ventana de calibración yendo al Oxígrafo > Calibración de O2. En Calibración de aire, seleccione la marca generada en el paso 1.8. Haga clic en Calibrar y copiar en el portapapeles.
  9. Repita los pasos 1.6-1.8 para la cámara restante. Realice la calibración del aire a diario. Detenga la grabación de calibración de aire y guarde el archivo desconectándolo del instrumento. Una vez que las muestras estén listas, continúe con el paso 3 para realizar el ensayo.

2. Recolección y permeabilización de las fibras del músculo esquelético

  1. Aislamiento de tejido de ratón
    1. Para cada muestra que se vaya a analizar, llene un pocillo de una placa de cultivo de 12 pocillos con 1 ml de BIOPS. Coloque el plato sobre hielo para que se enfríe.
    2. Después de sacrificar al ratón por inhalación de dióxido de carbono seguida de dislocación cervical, extraiga el músculo esquelético de interés, asegurándose de eliminar todo el tejido conectivo y la grasa (Figura 2A). Coloque el músculo en uno de los pocillos que contienen BIOPS. Coloque en hielo hasta la preparación de la fibra.
      NOTA: Cualquier músculo esquelético puede ser examinado usando este protocolo: el tipo de músculo examinado dependerá de la pregunta experimental que se busque abordar. En el caso de los músculos esqueléticos con tipos de fibras mixtas, como el gastrocnemio, es posible separar el tejido en secciones blancas y rojas para medir las fibras predominantemente de contracción rápida (secciones blancas) y predominantemente de contracción lenta (secciones rojas) (Figura 2B).
  2. Aislamiento de tejidos humanos
    1. Recolectar tejido siguiendo el protocolo clínico14. Enjuague rápidamente el tejido con PBS frío y estéril y colóquelo en un tubo cónico que contenga 2 ml de solución BIOPS. Mantenga el pañuelo en hielo hasta que se prepare la fibra.
  3. Preparación de la fibra
    1. La permeabilización se llevará a cabo en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos. Agregue 2 mL de solución BIOPS a un conjunto de pocillos y 2 mL de MiR05 a otro conjunto de pocillos. Se requerirá un conjunto de pocillos para cada muestra que se ensaye.
    2. Empaque una bandeja con hielo y coloque una placa de Petri de vidrio boca abajo sobre el hielo. Asegúrate de mantener siempre el músculo en hielo.
    3. Transfiera las muestras de músculo recolectadas a la plataforma de la placa de Petri refrigerada con pinzas. Con dos pinzas de punta fina y un microscopio de disección con una fuente de luz, limpie suavemente el tejido eliminando los tendones, la fascia y el tejido adiposo que estén adheridos al músculo.
    4. Después de que se haya eliminado todo el tejido no muscular extraño, separe suavemente las fibras musculares con las pinzas de punta fina hasta que sean pequeños haces de fibras translúcidas que van desde 0,75 a 1,0 mm de longitud (Figura 2C-D). Después de separar las fibras, use las pinzas para transferir los haces de fibras a un pocillo en la placa de 6 pocillos que contiene la solución de BIOPS en hielo.
    5. Añada 20 μl de solución de saponina de 5 mg/ml a cada pocillo de BIOPS e incube la placa en hielo mientras se mece suavemente en una cámara fría durante 20 minutos.
    6. Después del tratamiento con saponinas, transfiera las fibras musculares al pocillo que contiene MiR05 para enjuagar antes del ensayo. Incuba en hielo mientras se mece suavemente en una habitación fría durante 15 min.
    7. Una vez completada la incubación de las fibras en MiR05, recoja las fibras con pinzas afiladas y seque suavemente las fibras musculares con una toallita de trabajo. Tara un tubo de microcentrífuga de plástico de 1,5 mL en una balanza fina y coloca 2-3 mg de fibras en el tubo. Registre el peso final de la fibra en el costado de cada tubo. Coloque el tubo sobre hielo. Repita con otras muestras. Proceda inmediatamente al paso 3.

figure-protocol-2
Figura 2: Separación de las fibras del músculo esquelético del ratón. (A) Morfología macroscópica del gastrocnemio de ratón después de la cosecha. (B) Disección del gastrocnemio en segmentos rojos (izquierda) y blancos (derecha). (C) Fibras musculares separadas mecánicamente. (D) Una imagen de 10x de fibras musculares separadas con éxito. La barra de escala es de 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Preparación de muestras musculares en el respirómetro

  1. Aspire el MiR05 utilizado para la calibración del instrumento como se detalla en el paso 1 anterior y agregue 2,1 ml de solución de MiR05 de trabajo a cada cámara.
  2. Inicie un nuevo archivo para el experimento utilizando la misma configuración del instrumento que se detalla en el paso 1.5. encima. Establezca el nombre del archivo y la configuración de guardado.
  3. Después de configurar el nombre del archivo, el siguiente cuadro de diálogo de la pantalla será para detalles experimentales específicos. Introduzca la información de la muestra y el peso de cada muestra añadida a cada cámara. Cierre el cuadro de diálogo.
  4. Una vez en el nuevo archivo experimental, configure la calibración abriendo la ventana Calibración de O2. Haga clic en Copiar de archivo y seleccione el archivo guardado del paso 1.9. encima. Haga clic en el botón Calibrar y copiar en el portapapeles . Repita el proceso para la cámara restante.
  5. Con pinzas finas, transfiera con cuidado los haces de fibras musculares a la solución respiratoria para la cámara adecuada. Repita para la cámara restante.
  6. Coloque los tapones en la cámara y semicierre con cuidado la cámara empujando los tapones hasta la mitad del fondo. Una vez que las juntas tóricas de los tapones se enganchen con la pared de la cámara y haya resistencia, use un movimiento de torsión mientras empuja hacia abajo para cerrar. Cuando la cámara está medio cerrada, se puede observar una pequeña burbuja de aire en la parte superior de la cámara.
    NOTA: Las fibras permeabilizadas están sujetas a limitaciones de difusión de oxígeno en condiciones respiratorias regulares. Para eludir esta limitación, el ensayo se realiza bajo concentraciones elevadas de oxígeno11.
  7. Llene una jeringa de plástico de 10 ml con oxígeno puro de un tanque de oxígeno. Coloque la aguja larga y roma suministrada con el instrumento en la jeringa. Coloque la aguja en la primera cámara y administre lentamente aproximadamente 1 mL de oxígeno en la cámara.
  8. Controle la concentración de oxígeno de la cámara en el software de respirometría. Cuando la concentración de oxígeno de la cámara alcance los 350-400 nmol/mL, gire suavemente el tapón mientras empuja hacia abajo para cerrar completamente la cámara. Mire dentro de la cámara y asegúrese de que no queden burbujas de aire. Si hay una burbuja de aire, vuelva a abrir la cámara con cuidado y rapidez, agregue 100 μL de solución de trabajo adicional de MiR05 y vuelva a cerrar rápidamente la cámara. Repita con las cámaras restantes.
  9. Las concentraciones de oxígeno deben mantenerse por encima de 250 nmol/mL durante el ensayo. Agregue oxígeno adicional según sea necesario abriendo parcialmente la cámara, agregando más oxígeno de la jeringa a la burbuja de aire y cerrando cuidadosamente la cámara nuevamente.
  10. Normalice los datos de flujo de oxígeno a la masa de tejido utilizada para el experimento. Para ajustar los gráficos, cambie el diseño para reflejar el flujo de O2 (pmol O2 / (s x mg)). En el menú de diseño, seleccione el diseño 06 - Flujo específico por unidad de muestra. Los datos ahora se presentarán normalizados a la cantidad de tejido en cada cámara.

4. Respirometría de alta resolución

  1. Cuando la concentración de oxígeno (línea azul) y el flujo deO2 (línea roja) se hayan estabilizado después de la adición de oxígeno, comience el protocolo de respiración. El oxígeno se puede considerar estable cuando la línea azul es plana o disminuye lentamente. El flujo de O2 también debe ser plano y dentro de 5 pmol Ø2 / s x mg.
  2. Agregue todos los reactivos usando jeringas de vidrio. Es importante no utilizar la misma jeringa para los sustratos, los inhibidores y los desacoplantes. Tenga una jeringa separada para cada uno. Después de agregar cada compuesto, registre el flujo de oxígeno durante 1-2 minutos después de que la tasa de respiración se estabilice antes de agregar el siguiente reactivo.
  3. Medición de la respiración
    1. Con una jeringa de vidrio de 10 μL, agregue 2,5 μL de malato de 0,8 M a cada cámara. Presione F4 para marcar la línea de tiempo y etiquetar la marca con M. Registre el flujo estable de O2 durante 1-2 min.
    2. Agregue reactivos específicos de nutrientes como se describe a continuación.
      1. Glucolítico aeróbico: Usando una jeringa de vidrio de 10 μL, agregue 10 μL de glutamato 2 M y 5 μL de piruvato 2 M a cada cámara. Presione F4 para marcar la línea de tiempo y etiquetar la marca con G P. Registre el flujo estable de O2 durante 1-2 minutos.
      2. Ácido graso: Con una jeringa de vidrio de 10 μL, añadir 10 μL de glutamato 2 M y 10 μL de palmitoil-carnitina 10 mM a cada cámara. Presione F4 para marcar la línea de tiempo y etiquetar la marca con G PC. Registre un flujo estable de O2 durante 1-2 min.
    3. Con una jeringa de vidrio de 25 μL, agregue 20 μL de 0,5 M (con MgCl2) de ADP a cada cámara. Presione F4 para marcar la línea de tiempo y etiquetar la marca con ADP. Registre un flujo estable de O2 durante 1-2 min.
    4. Con una jeringa de vidrio de 25 μL, agregue 20 μL de succinato 1 M a cada cámara. Presione F4 para marcar la línea de tiempo y etiquétela con S. Registre el flujo estable de O2 durante 1-2 minutos.
    5. Con una jeringa de vidrio de 10 μL, agregue 5 μL de citocromo C de 4 mM a cada cámara. Presione F4 para marcar la línea de tiempo y etiquetar la marca con Cyt C. Registre el flujo estable de O2 durante 1-2 minutos.
    6. Valoración en tres bolos de 1 μL de FCCP de 1 mM utilizando una jeringa de vidrio de 10 μL. Por lo general, hay un efecto de mezcla al agregar FCCP que resulta en una breve disminución en los niveles de flujo deO2 . Espere a que el flujo de O2 aumente y se estabilice antes de continuar con el siguiente paso. Presione F4 después de cada adición para marcar la línea de tiempo y la marca de etiqueta con FCCP. Registre el flujo estable de O2 durante 1 minuto después de cada adición.
  4. Una vez finalizado el ensayo de respiración, retire suavemente los tapones girándolos y tirando hacia arriba. Enjuague las cámaras 3 veces con H2O ultrapuro de una botella rociadora, seguido de 3 veces con etanol al 70% de una botella rociadora. Después del enjuague final con etanol, llene las cámaras con etanol al 70% para su almacenamiento.
  5. Coloque los tapones en las cámaras hasta que sienta resistencia. No cierre los tapones por completo. Coloque tapas sobre los tapones, guarde el archivo de ensayo y desconecte el instrumento del software de respirometría. Apague el instrumento.

5. Análisis de datos

  1. Abra el archivo de análisis en el software de respirometría. Extraiga datos de regiones estables de flujo de oxígeno obtenidas después de la inyección de compuestos respiratorios.
  2. Para marcar las regiones de interés, mantenga pulsada la tecla Mayús , haga clic con el botón izquierdo del ratón y arrastre el cuadro por la región de tasa de flujo de O2 estable para las etapas del ensayo que se detallan a continuación.
  3. Etapas de ensayo 14,15,16,17,18,19,20
    1. Marque la línea de tiempo después de la adición de malato/glutamato/piruvato (protocolo glucolítico aeróbico) o malato/glutamato/palmitoil-carnitina (protocolo de ácidos grasos). Esta tasa representa la tasa de respiración del Complejo I Estado 2 (LEAK(n)).
    2. Marque la línea de tiempo después de la adición de ADP. Esta tasa representa la tasa de respiración del estado 3 del complejo I (CI OXPHOS).
    3. Marque la línea de tiempo después de la adición de succinato. Esta tasa representa la tasa de respiración del Complejo I + II Estado 3 (CI + II OXPHOS).
    4. Marque la línea de tiempo después de agregar el citocromo C. Esta tasa representa la tasa de respiración del Complejo I + II + Estado 3 del Citocromo (CI + II + Cyt C OXPHOS).
    5. Marque el cronograma para la valoración de FCCP con la tasa de flujo de O2 más alta. Esta tasa representa la Frecuencia Respiratoria Máxima (MAX ETS).
  4. Recupere los valores de datos de las regiones marcadas en la escala de tiempo seleccionando Marcar > estadísticas. Copie la tasa de flujo de O2 (pmol O2/(s x mg)) de la cámara marcada en una hoja de cálculo.
  5. Repetición del marcado y extracción de datos para las cámaras adicionales.
  6. Calcule la relación de control respiratorio (RCR) dividiendo el estado 3 del complejo I + II (después de la adición de succinato) por el estado 2 del complejo I (antes de la adición de ADP).

Resultados

Las Figuras 3 y 4 muestran gráficos de oxígeno de protocolos de respirometría glucolítica aeróbica y de ácidos grasos, respectivamente, para fibras musculares gastrocnemias murinas rojas y blancas debidamente preparadas. También se muestran resultados cuantificados representativos como referencia. La Figura 5 muestra un diagrama de oxígeno de la respirometría glucolítica aeróbica en muestras de biopsia de músculo humano que se prepararon adecuadamente. También se muestran resultados cuantificados representativos. Tenga en cuenta que para la Figura 3, la Figura 4 y la Figura 5, la adición de citocromo C después de la adición de ADP no produce un impacto en el flujo de oxígeno, lo que indica que la membrana mitocondrial externa de la muestra está intacta. La Figura 6 muestra un gráfico de oxígeno de la respirometría glucolítica aeróbica donde la adición de citocromo C después de la ADP da como resultado un pico (aumento del 40%) en el flujo de oxígeno, lo que indica que la membrana mitocondrial externa ha sido dañada y, por lo tanto, la muestra no debe usarse para la respirometría: las posibles razones de este resultado pueden ser un manejo inadecuado o la congelación/descongelación del tejido. prolongar la permeabilización del tejido, y no utilizar tejido recién aislado.

figure-results-1
Figura 3: Consumo de oxígeno en ratón. Los resultados muestran el consumo de oxígeno en (A) gastrocnemio rojo y (B) blanco utilizando el protocolo de piruvato. Flujo de estado 2 después de la adición de malato, glutamato y piruvato (tono azul, FUGA DE CI). Se observa una estimulación significativa del consumo deO2 después de la administración de ADP (tono verde, CI OXPHOS), con una respiración impulsada aún más después de la adición de succinato (tono púrpura, CI+II OXPHOS). El citocromo C no indujo un aumento significativo (<15%), lo que indica que la membrana mitocondrial externa está intacta (tono naranja, CI+II+Cyt C OXPHOS). Las mitocondrias se desacoplan tras la adición de FCCP (tono amarillo, MAX ETS). La línea azul representa la concentración de oxígeno en una cámara cerrada. La línea roja representa la tasa de consumo de oxígeno (flujo deO2 ). Compuestos añadidos: Malato (m), Glutamato (g), Piruvato (p), Difosfato de adenosina (ADP), Citocromo C (cyt c), Cianuro-carbonilo-p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP). (C) El gráfico de barras refleja resultados representativos (n=8). Los datos se representan como ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 4: Consumo de oxígeno en ratón. Los resultados muestran el consumo de oxígeno en (A) gastrocnemio rojo y (B) blanco utilizando el protocolo de palmitoil-carnitina. Flujo de estado 2 después de la adición de malato, glutamato y palmitoil carnitina (tono azul, FUGA DE CI). Se observa una estimulación significativa del consumo deO2 después de la administración de ADP (tono verde, CI OXPHOS), con una respiración impulsada aún más después de la adición de succinato (tono púrpura, CI+II OXPHOS). El citocromo C no indujo un aumento significativo (<15%), lo que indica que la membrana mitocondrial externa está intacta (tono naranja, CI+II+Cyt C OXPHOS). Las mitocondrias se desacoplan tras la adición de FCCP (tono amarillo, MAX ETS). La línea azul representa la concentración de oxígeno en una cámara cerrada. La línea roja representa la tasa de consumo de oxígeno (flujo deO2 ). Compuestos añadidos: Malato (m), Glutamato (g), Palmitoil Carnitina (pc), Difosfato de adenosina (ADP), Citocromo C (cyt c), Cianuro-carbonilo-p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP). (C) El gráfico de barras refleja resultados representativos (n=7). Los datos se representan como ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 5: Resultados representativos del consumo de oxígeno en el vasto lateral humano utilizando el protocolo de piruvato. (A) Flujo de estado 2 después de la adición de malato, glutamato y piruvato (tono azul, fuga de CI). Se observa una estimulación significativa del consumo deO2 después de la administración de ADP (tono verde, CI OXPHOS), con una respiración impulsada aún más después de la adición de succinato (tono púrpura, CI+II OXPHOS). El citocromo C no indujo un aumento significativo (<15%), lo que indica que la membrana mitocondrial externa está intacta (tono naranja, CI+II+Cyt C OXPHOS). Las mitocondrias se desacoplan tras la adición de FCCP (tono amarillo, MAX ETS). La línea azul representa la concentración de oxígeno en una cámara cerrada. La línea roja representa la tasa de consumo de oxígeno (flujo deO2 ). Compuestos añadidos: Malato (m), Glutamato (g), Piruvato (p), Difosfato de adenosina (ADP), Citocromo C (cyt c), Cianuro-carbonilo-p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP). (B) El gráfico de barras refleja los resultados representativos obtenidos de las biopsias del vasto lateral (n = 24). Los datos se representan como ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-4
Figura 6: Resultado representativo que demuestra el compromiso de la integridad de la membrana mitocondrial externa en el gastrocnemio rojo de ratón. Flujo de estado 2 después de la adición de malato, glutamato y piruvato (tono azul, FUGA DE CI). Se observa una estimulación significativa del consumo deO2 después de la administración de ADP (tono verde, CI OXPHOS), con una respiración impulsada aún más después de la adición de succinato (tono púrpura, CI+II OXPHOS). El citocromo C indujo un aumento significativo en el consumo deO2 (>15%), lo que indica daño a la membrana mitocondrial externa. La línea azul representa la concentración de oxígeno en una cámara cerrada. La línea roja representa la tasa de consumo de oxígeno (flujo deO2 ). Compuestos añadidos: Malato (m), Glutamato (g), Piruvato (p), Difosfato de adenosina (ADP), Citocromo C (cyt c), Cianuro-carbonilo-p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Preparación de reactivos de compuestos respiratorios y soluciones respiratorias. Se presentan los detalles para la preparación de los reactivos necesarios para el ensayo, incluidas las concentraciones finales de existencias y cómo prepararlos y almacenarlos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

Este protocolo proporciona un protocolo de plantilla completo y sencillo para evaluar la función mitocondrial en fibras de músculo esquelético permeabilizadas para muestras humanas y de ratón. El uso de fibras permeabilizadas en lugar de mitocondrias aisladas tiene varias ventajas. Una ventaja clave es que el uso de fibras permeabilizadas requiere pequeñas cantidades (2-5 mg) de tejido, lo que hace que este método sea adecuado tanto para muestras de biopsia de músculo humano como para músculo de ratón. Otra ventaja sobre las mitocondrias aisladas es que la arquitectura celular permanece intacta, asegurando la preservación de las interacciones estructurales y funcionales entre las mitocondrias y los componentes celulares 12,21,22,23.

El uso de piruvato, malato y glutamato en nuestro protocolo glucolítico aeróbico proporciona una evaluación integral y de amplio espectro del suministro de NADH al Complejo I 24,25,26,27,28. Si bien este enfoque integral proporciona una evaluación de la actividad del Complejo I en condiciones metabólicas holísticas y fisiológicamente relevantes, el uso de piruvato-malato o glutamato-malato puede ser un enfoque experimental más apropiado. Por ejemplo, el uso de glutamato-malato puede desentrañar diferencias en la función mitocondrial relacionadas con el catabolismo de aminoácidos29. Alentamos a los investigadores a considerar cuidadosamente el enfoque apropiado a utilizar para su modelo de investigación específico.

Si bien este protocolo se centra en el uso de sustratos para evaluar la actividad mitocondrial, el uso de inhibidores específicos puede ser necesario para lograr los objetivos experimentales. Por ejemplo, la rotenona se puede utilizar para inhibir el complejoI 12,21,30, la oligomicina para inhibir el complejo V (ATP sintasa)12,21 y la antimicina A para bloquear el complejo III12,21 para la evaluación de la respiración no mitocondrial. El protocolo proporcionado anteriormente se puede adaptar fácilmente para incluir el uso de inhibidores específicos. Cabe destacar que una advertencia con respecto al uso de inhibidores es que estos compuestos son pegajosos y requieren una limpieza exhaustiva para eliminarlos de la cámara del instrumento. Encontramos que el uso de una solución de BSA al 10% durante 60 min es suficiente para la eliminación de los inhibidores residuales.

La respiración LEAK se refiere a la tasa de consumo de oxígeno que es independiente de la síntesis de ATP. Esta tasa representa el flujo de protones de regreso a la matriz mitocondrial desde a través de la membrana mitocondrial interna. Existen tres métodos aceptados para evaluar el consumo de oxígeno independientemente de la síntesis de ATP (LEAK). El primero, LEAK(n), mide la tasa de consumo de oxígeno en presencia de sustratos pero sin la adición de adenilatos (ADP o ATP)31,32,33. Este estado de fuga representa la permeabilidad intrínseca de la membrana mitocondrial. El segundo método, LEAK(t), se mide en presencia de ATP34 y el tercero, LEAK(o), se mide en presencia del inhibidor de la ATP-sintasa oligomicina 35,36,37. Este protocolo utiliza LEAK(n) para esta evaluación, pero dependiendo de los objetivos y modelos experimentales, pueden ser apropiados otros métodos para medir el flujo de oxígeno de LEAK.

Para este ensayo, MiR05 se complementa con creatina (3 mg/mL) y blebbistatina (10 μM). El transporte mitocondrial de ADP es facilitado por la creatina quinasa (CK), y la creatina se añade a la solución respiratoria para saturar la actividad de CK38,39. Las fibras musculares pueden contraerse espontáneamente y también son sensibles a la contracción inducida por ADP. Para evaluar la actividad respiratoria mitocondrial sin la influencia de la contracción, se ha añadido blebbistatina para inhibir la actividad contráctil de la fibra38. Además, los estudios en músculo humano sugieren que la capacidad respiratoria puede verse influenciada por el método de biopsia (microbiopsia versus aguja de Bergstrom) y que esta diferencia puede deberse a las diferencias en la longitud de la fibra obtenida40,41. Las fibras más cortas pueden ser más susceptibles al daño durante la preparación, y el uso de blebbistatina ayuda a preservar la función. Puede haber ciertas condiciones en las que la relajación de la fibra no se ajuste a los objetivos de la investigación y, en ese caso, la blebbistatina puede excluirse de la solución de MiR05.

La permeabilización de las fibras del músculo esquelético con saponina genera poros en la membrana plasmática, lo que permite que los sustratos e inhibidores ingresen libremente a la célula. La saponina tiene una alta afinidad por el colesterol, que es rico y abundante en las membranas plasmáticas celulares, mientras que las membranas mitocondriales son pobres en colesterol42,43. Se espera que el tratamiento con saponinas utilizado para la preparación de fibras en este protocolo preserve la integridad de la membrana mitocondrial. El daño a las mitocondrias también puede ocurrir debido a las fuerzas de cizallamiento que resultan de la separación mecánica del tejido en fibras. Sugerimos que la separación del tejido en haces de fibras se lleve a cabo rápidamente y con una manipulación mínima. Para evaluar el daño mitocondrial potencial, hemos incluido la titulación del citocromo C en el protocolo de respiración. El citocromo C no puede pasar a través de una membrana mitocondrial externaintacta 12, por lo tanto, cualquier aumento en el flujo de O2 después de la adición de citocromo C indica que se produjo daño a la membrana mitocondrial externa durante el proceso de preparación de la muestra. En uno de nuestros estudios recientes, encontramos que el flujo de O2 aumentó en un 8%15 después de la adición del citocromo C, lo que valida que el uso de saponina sugerido en este protocolo no provoca daño mitocondrial. Sugerimos que cualquier muestra que demuestre un aumento superior al 15% en el flujo deO2 después de la adición del citocromo C debe excluirse del análisis44. Este paso se incluye estrictamente como una medida de control de calidad y no como una evaluación de la actividad del Complejo IV.

Si bien la respirometría de alta resolución se destaca por proporcionar mediciones altamente sensibles y confiables del consumo de oxígeno, una limitación notable de la instrumentación es que solo se pueden medir dos muestras simultáneamente por instrumento. Esto requiere una consideración cuidadosa al diseñar estudios que involucren cohortes con múltiples muestras. Si bien puede existir la tentación de realizar mediciones en varios conjuntos de muestras a lo largo del día, recomendamos encarecidamente a los investigadores que consideren la influencia del ritmo circadiano en el metabolismo. La investigación sobre el músculo esquelético humano y de roedores ha revelado una influencia del reloj biológico en la función mitocondrial45,46. En consecuencia, recomendamos realizar mediciones durante varios días a la misma hora del día para tener en cuenta estas fluctuaciones circadianas.

Por último, para garantizar mediciones de respirometría reproducibles y robustas, el respirómetro debe recibir limpieza, mantenimiento y calibración regulares. La calibración del aire, como se detalla en el protocolo, debe realizarse diariamente. Aconsejamos a los usuarios que también realicen una calibración mensual completa (tanto de aire como de cero) de los sensores polarográficos de oxígeno. Los usuarios deben consultar la documentación y el sitio web del fabricante para obtener más información sobre este método de calibración y para obtener instrucciones sobre el mantenimiento rutinario del instrumento.

La respirometría de alta resolución sigue siendo el estándar de oro para medir la respiración mitocondrial. El método detallado en este protocolo facilita una evaluación robusta de la capacidad mitocondrial tanto en el músculo esquelético de roedores como en el humano. Este protocolo se ha aplicado a estudios que evalúan la función mitocondrial asociada a modelos genéticos de ratón15,16, en el contexto de la enfermedad renal crónica19, después de la administración de suplementos dietéticos14,20 y el ejercicio17,18.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Centro de Investigación de Nutrición y Obesidad, la subvención P30 de los NIH DK056341 y la subvención K01 de los NIH HL145326.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10 y micro; L Jeringa Hamilton (jeringa de vidrio)ThermoFisher14-813-125Para valoración de ensayos respiratorios
25 µ L Jeringa Hamilton (jeringa de vidrio)ThermoFisher14-813-133respiración
Titulación ADPMerck117105Ensayo de respirometría
Plato de disección de vidrio negro ScinticaDD-90-S-BLKPara la preparación de muestras
BlebbistatinSigmaB0560Working MiR05 Solution
BSA, sin ácidos grasosSigmaA6003MiR05 Solución
Carbonato de CalcioSigmaC4830BIOPS Solución
CreatinaSigma27900Trabajo MiR05 Solución
Citocromo CSigmaC7752Ensayo de Respirometría
DatLabOroboros InstrumentsN/ASoftware de Respirometría
Dithiothreitol (DTT) SigmaD0632Solución BIOPS
D-SacarosaSigma84097MiR05 Solución
EGTASigmaE4378BIOPS & Solución MiR05
FCCPSigmaC2920Ensayo de Respirometría
GlutamatoSigmaG1626Ensayo de Respirometría
HEPESSigmaH7523MiR05 Solución
Imidazol Sigma56750Solución BIOPS
KH2PO4 SigmaP5379MiR05 Solución
Ácido lactobiónicoSigma153516MiR05 Solución
MalatoSigmaM1000Ensayo de Respirometría
MES hydrate SigmaM8250BIOPS Solución
MgCl2 - 6 H2O SigmaM2670BIOPS & MiR05 Solución
Oroboros Oxygraph-2K (O2K) SistemaOroboros Instruments10203-03Respirómetro de alta resolución
Palmitoil-CarnitinaSigmaP4509Ensayo de Respirometría
Hidróxido de PotasioSigmaP1767BIOPS Solución
Pinzas de precisiónFisher17-467-168Para la preparación de muestras
SaponinaSigmaS2149para permeabilización de fibras
ATP de sodioSigmaA2383Solución BIOPS
Fosfocreatina sódicaSigmaP7936Solución BIOPS
Piruvato de sodioSigmaP2256Ensayo de respirometría
SuccinatoSigmaS2378Ensayo de respirometría
Taurina SigmaT0625BIOPS & Solución MiR05
Para ensayo de

Referencias

  1. Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (9), 566-578 (2012).
  2. Ruegsegger, G. N., Creo, A. L., Cortes, T. M., Dasari, S., Nair, K. S. Altered mitochondrial function in insulin-deficient and insulin-resistant states. J Clin Invest. 128 (9), 3671-3681 (2018).
  3. Simoneau, J. A., Kelley, D. E. Altered glycolytic and oxidative capacities of skeletal muscle contribute to insulin resistance in NIDDM. J Appl Physiol. 83 (1), 166-171 (1997).
  4. Ryan, T. E., et al. Extensive skeletal muscle cell mitochondriopathy distinguishes critical limb ischemia patients from claudicants. JCI Insight. 3 (21), 123235(2018).
  5. Sullivan, M. J., Green, H. J., Cobb, F. R. Skeletal muscle biochemistry and histology in ambulatory patients with long-term heart failure. Circulation. 81 (2), 518-527 (1990).
  6. Giebelstein, J., et al. The proteomic signature of insulin-resistant human skeletal muscle reveals increased glycolytic and decreased mitochondrial enzymes. Diabetologia. 55 (4), 1114-1127 (2012).
  7. Tezze, C., et al. Age-associated loss of OPA1 in muscle impacts muscle mass, metabolic homeostasis, systemic inflammation, and epithelial senescence. Cell Metab. 25 (6), 1374-1389 (2017).
  8. Hughes, M. C., et al. Early myopathy in Duchenne muscular dystrophy is associated with elevated mitochondrial H(2) O(2) emission during impaired oxidative phosphorylation. J Cachexia Sarcopenia Muscle. 10 (2), 643-661 (2019).
  9. Yin, Y., Shen, H. Common methods in mitochondrial research (Review). Int J Mol Med. 50 (4), 5182(2022).
  10. Vue, Z., et al. 3D reconstruction of murine mitochondria reveals changes in structure during aging linked to the MICOS complex. Aging Cell. 22 (12), e14009(2023).
  11. Doerrier, C., et al. High-resolution fluoRespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods Mol Biol. 1782, 31-70 (2018).
  12. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
  13. Picard, M., Hepple, R. T., Burelle, Y. Mitochondrial functional specialization in glycolytic and oxidative muscle fibers: tailoring the organelle for optimal function. Am J Physiol Cell Physiol. 302 (4), C629-C641 (2012).
  14. Yoshino, M., et al. Nicotinamide mononucleotide increases muscle insulin sensitivity in prediabetic women. Science. 372 (6547), 1224-1229 (2021).
  15. Mousa, M. G., et al. Site-1 protease inhibits mitochondrial respiration by controlling the TGF-beta target gene Mss51. Cell Rep. 42 (4), 112336(2023).
  16. Moon, S. H., et al. Genetic deletion of skeletal muscle iPLA(2)gamma results in mitochondrial dysfunction, muscle atrophy and alterations in whole-body energy metabolism. iScience. 26 (6), 106895(2023).
  17. Bittel, A. J., et al. A single bout of premeal resistance exercise improves postprandial glucose metabolism in obese men with prediabetes. Med Sci Sports Exerc. 53 (4), 694-703 (2021).
  18. Bittel, A. J., et al. A single bout of resistance exercise improves postprandial lipid metabolism in overweight/obese men with prediabetes. Diabetologia. 63 (3), 611-623 (2020).
  19. Bittel, D. C., Bittel, A. J., Varadhachary, A. S., Pietka, T., Sinacore, D. R. Deficits in the skeletal muscle transcriptome and mitochondrial coupling in progressive diabetes-induced CKD relate to functional decline. Diabetes. 70 (5), 1130-1144 (2021).
  20. Mills, K. F., et al. Long-term administration of nicotinamide mononucleotide mitigates age-associated physiological decline in mice. Cell Metab. 24 (6), 795-806 (2016).
  21. Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. (120), e54985(2017).
  22. Lemieux, H., Semsroth, S., Antretter, H., Hofer, D., Gnaiger, E. Mitochondrial respiratory control and early defects of oxidative phosphorylation in the failing human heart. Int J Biochem Cell Biol. 43 (12), 1729-1738 (2011).
  23. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int J Biochem Cell Biol. 41 (10), 1837-1845 (2009).
  24. Appelman, B., et al. Muscle abnormalities worsen after post-exertional malaise in long COVID. Nat Commun. 15 (1), 17(2024).
  25. O'Rourke, A. R., et al. Impaired muscle relaxation and mitochondrial fission associated with genetic ablation of cytoplasmic actin isoforms. FEBS J. 285 (3), 481-500 (2018).
  26. Inigo, M. R., et al. Estrogen receptor-alpha in female skeletal muscle is not required for regulation of muscle insulin sensitivity and mitochondrial regulation. Mol Metab. 34, 1-15 (2020).
  27. Musci, R. V., et al. Phytochemical compound PB125 attenuates skeletal muscle mitochondrial dysfunction and impaired proteostasis in a model of musculoskeletal decline. J Physiol. 601 (11), 2189-2216 (2023).
  28. Englund, D. A., et al. p21 induces a senescence program and skeletal muscle dysfunction. Mol Metab. 67, 101652(2023).
  29. Zhang, K., et al. Mitochondrial supercomplex assembly regulates metabolic features and glutamine dependency in mammalian cells. Theranostics. 13 (10), 3165-3187 (2023).
  30. Davis, M. S., Barrett, M. R. High-resolution fluoro-respirometry of equine skeletal muscle. J Vis Exp. (192), e65075(2023).
  31. Schytz, C. T., et al. Skeletal muscle mitochondria demonstrate similar respiration per cristae surface area independent of training status and sex in healthy humans. J Physiol. 602 (1), 129-151 (2024).
  32. Hingst, J. R., et al. Inducible deletion of skeletal muscle AMPKalpha reveals that AMPK is required for nucleotide balance but dispensable for muscle glucose uptake and fat oxidation during exercise. Mol Metab. 40, 101028(2020).
  33. Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
  34. Gnaiger, E., Mendez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (20), 11080-11085 (2000).
  35. Basse, A. L., et al. Nampt controls skeletal muscle development by maintaining Ca(2+) homeostasis and mitochondrial integrity. Mol Metab. 53, 101271(2021).
  36. Flensted-Jensen, M., et al. Combined changes in temperature and pH mimicking exercise result in decreased efficiency in muscle mitochondria. J Appl Physiol. 136 (1985), 79-88 (2024).
  37. Porter, C., et al. Mitochondrial respiratory capacity and coupling control decline with age in human skeletal muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab. 309 (3), E224-E232 (2015).
  38. Perry, C. G., et al. Inhibiting myosin-ATPase reveals a dynamic range of mitochondrial respiratory control in skeletal muscle. Biochem J. 437 (2), 215-222 (2011).
  39. Veksler, V. I., et al. Muscle creatine kinase-deficient mice. II. Cardiac and skeletal muscles exhibit tissue-specific adaptation of the mitochondrial function. J Biol Chem. 270 (34), 19921-19929 (1995).
  40. Isner-Horobeti, M. E., et al. Microbiopsies versus Bergstrom needle for skeletal muscle sampling: impact on maximal mitochondrial respiration rate. Eur J Appl Physiol. 114 (5), 885-889 (2014).
  41. Hughes, M. C., et al. Mitochondrial bioenergetics and fiber type assessments in microbiopsy vs. Bergstrom percutaneous sampling of human skeletal muscle. Front Physiol. 18 (6), 360(2015).
  42. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
  43. Elustondo, P., Martin, L. A., Karten, B. Mitochondrial cholesterol import. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1862 (1), 90-101 (2017).
  44. Ramos, P. M., Li, C., Elzo, M. A., Wohlgemuth, S. E., Scheffler, T. L. Mitochondrial oxygen consumption in early postmortem permeabilized skeletal muscle fibers is influenced by cattle breed. J Anim Sci. 98 (3), 044(2020).
  45. van Moorsel, D., et al. Demonstration of a day-night rhythm in human skeletal muscle oxidative capacity. Mol Metab. 5 (8), 635-645 (2016).
  46. de Goede, P., et al. Time-restricted feeding during the inactive phase abolishes the daily rhythm in mitochondrial respiration in rat skeletal muscle. FASEB J. 36 (2), e22133(2022).

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

OXPHOS mitocondrialtasa de consumo de oxígenofibras musculares permeabilizadasflexibilidad metabólicapreferencia de combustiblemembrana mitocondrial externafosforilación oxidativa
Medición de la respiración mitocondrial en fibras musculares esqueléticas humanas y de ratón mediante respirometría de alta resolución
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.