Aquí se muestra un procedimiento quirúrgico mínimamente invasivo, que consiste en colocar la sonda láser Doppler en el cráneo sobre la región distal de la arteria cerebral media (ACM), una ubicación periorbitaria adecuada para ratas y ratones, para evaluar el flujo sanguíneo durante la oclusión transitoria de ACM.
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Artículo de método
Colocación periorbitaria de una sonda láser Doppler para la monitorización del flujo sanguíneo cerebral antes de la oclusión de la arteria cerebral media en modelos de roedores
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Resumen
Resumen
La oclusión de la arteria cerebral media (MCAO, por sus siglas en inglés) es el método de referencia para el modelado preclínico del accidente cerebrovascular isquémico en roedores. Sin embargo, el éxito de la oclusión no está garantizado ni siquiera por las manos quirúrgicas más hábiles. Los errores ocurren principalmente cuando el filamento no se coloca a la profundidad correcta e incluyen casos de infarto o perforación del vaso, lo que puede causar la muerte. La flujometría láser Doppler (LDF) es una técnica fiable que proporciona información en tiempo real sobre el flujo sanguíneo cerebral regional (CBF) durante el procedimiento MCAO. Aquí demostramos una técnica rápida para la colocación periorbital de una sonda láser Doppler para la medición de CBF tanto en ratones como en ratas. Nuestro razonamiento fue simplificar la implementación de LDF, fomentando el uso generalizado para mejorar la confiabilidad quirúrgica. La técnica elimina la necesidad de adelgazamiento del cráneo y equipo especializado, con la colocación en la región periorbitaria en lugar de la colocación dorsal, lo que promueve la eficiencia y la facilidad de adopción. El protocolo descrito aquí abarca las preparaciones prequirúrgicas, la colocación de la sonda Doppler periorbitaria y los cuidados postoperatorios. Los resultados representativos incluyen representaciones visuales de los elementos del procedimiento junto con trazados representativos de LDF que ilustran cirugías exitosas de MCAO, con casos de colocación fallida de filamentos que conducen a complicaciones. El protocolo ilustra el LDF en la confirmación de la correcta colocación del filamento y ofrece un procedimiento simplificado en comparación con los métodos alternativos.
Introducción
El método de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) ha sido ampliamente utilizado en roedores desde que se introdujo en la comunidad científica para su aplicación en ratas en 19861 con la adaptación de Longa descrita en 19902, y adaptaciones para ratones poco después3. Aunque no se describió en la publicación de Longa, el uso de la señal de flujometría láser Doppler (LDF) para confirmar la colocación del filamento fue pronto descrito en la literatura4. El empleo de LDF durante el procedimiento MCAO ocupa un lugar destacado en la literatura, pero se designa como un paso opcional en los Procedimientos Operativos Estándar (SOP) actuales de las Redes de Evaluación Preclínica (SPAN) de Ictus5.
El uso de LDF confirma la correcta colocación del filamento durante el procedimiento MCAO y, por lo tanto, contribuye al rigor del diseño del estudio y a los resultados posteriores, especialmente en los experimentos diseñados para explorar la eficacia del fármaco. El uso de LDF reduce los errores quirúrgicos derivados de la colocación incorrecta del filamento, lo que da lugar a la situación dicotómica de ausencia de lesiones cuando el filamento no se coloca lo suficientemente lejos o de muertes de animales debido a la perforación de los vasos que se producen cuando el filamento se inserta demasiado lejos. Por otro lado, el uso de LDF no se asocia con la variabilidad del tamaño del infarto comúnmente observada siguiendo el procedimiento MCAO6. El uso de LDF en el procedimiento MCAO puede ser percibido como difícil y oneroso, particularmente en ratas, debido a que el cráneo es más grueso que en ratones y puede requerir adelgazamiento del cráneo antes de la colocación de LDF 7,8. Además, la colocación de la sonda dorsal a menudo se describe con algunos protocolos que requieren equipo especializado o preparación 7,8,9. Con cualquiera de estas barreras, es posible que no se implemente el LDF para confirmar la colocación del filamento.
En este protocolo, describimos la colocación de la sonda láser Doppler en el cráneo y sobre la región distal de la arteria cerebral media, una colocación periorbitaria, para la evaluación del flujo sanguíneo durante el procedimiento MCAO tanto en ratones como en ratas. Nuestro razonamiento fue desarrollar un procedimiento que tenga múltiples ventajas sobre algunos métodos reportados en la literatura 7,8,9,10 en el sentido de que es mínimamente invasivo, rápido y no requiere adelgazamiento del cráneo ni equipo especializado más allá de la sonda láser Doppler.
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Protocolo
Se utilizaron ratones y ratas adultos para ilustrar este protocolo (25 g, C57BL/6J, Jackson Laboratories; 250 g, Sprague Dawley, Envigo). El manejo de los animales y los procedimientos experimentales se realizaron con aprobación y de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Arizona, las leyes nacionales y de acuerdo con los principios del cuidado de los animales de laboratorio11. Las ratas y ratones se alojaron con un horario de luz/oscuridad de 12 horas (7 a.m.-7 p.m.) con comida y agua disponibles ad libitum.
1. Preparación prequirúrgica
NOTA: Por lo general, la cirugía MCAO en un roedor se realiza como una cirugía de supervivencia, lo que requiere el uso de una técnica quirúrgica aséptica o de solo puntas, como se describe en un protocolo de IACUC específico de la institución. En este caso, el cirujano utiliza una técnica de solo puntas con instrumentos y suministros esterilizados.
- Desinfecte la superficie de trabajo quirúrgico con desinfectante comercial y prepare paquetes quirúrgicos estériles de instrumentos, cortinas, gasas, hisopos, suturas y hojas de bisturí mediante autoclave. Mantener las condiciones estériles durante la cirugía de supervivencia de acuerdo con las técnicas aprobadas por la IACUC, como cubrir las perillas del microscopio y cubrir con una envoltura de plástico de grado alimenticio.
- Use un esterilizador de perlas secas germinador para volver a esterilizar los instrumentos quirúrgicos entre procedimientos si se llevan a cabo múltiples cirugías con roedores durante una sesión.
- Coloque la rata o el ratón en una cámara de inducción e induzca la anestesia con isoflurano al 3%-5% (1 L/min utilizando una mezcla combinada de 80% de aire y 20% de oxígeno).
- Traslado del animal de la cámara al banco y a la nariz para la anestesia (ratón: 0,5 L/min 80%/20% mezcla de oxígeno/aire; rata: 1,5 L/min 80%/20% mezcla de oxígeno/aire). Aplique ungüento oftálmico en ambos ojos y afeite cuidadosamente el espacio entre la oreja y la cuenca del ojo en el lado de la cirugía MCAO (comúnmente el derecho), para no cortar la piel con una maquinilla. En la rata, cuando se afeita, el hoyuelo del bigote será visible aproximadamente a mitad de camino entre la cuenca del ojo y la oreja. Continúe afeitando regiones según sea necesario para el procedimiento MCAO9 (no está en el alcance de este documento).
- Regrese el animal a la cámara según sea necesario o muévalo a una nariz en la mesa quirúrgica preparada calentada a 37 °C. Inserta un termómetro rectal. El animal debe mantenerse a una temperatura aproximada de 36 °C ± 1 °C durante todo el procedimiento y de acuerdo con el protocolo aprobado por la IACUC.
- Aplique betadine en un hisopo de algodón y desinfecte la piel, en espiral hacia afuera desde el centro de la región quirúrgica. Limpie con una almohadilla de preparación con alcohol. Repita ambos pasos durante un total de tres ciclos. Confirme la anestesia adecuada y evalúe cada 15 minutos durante el procedimiento utilizando el reflujo de pinzamiento del dedo del pie.
2. Colocación de la sonda Doppler periorbitaria
- Con unas tijeras pequeñas, haga un corte vertical (ratón: ~0,5 cm; rata: ~0,7 cm) entre el rabillo del ojo y el pliegue de la oreja, como se muestra en la Figura 2A (ratón) y la Figura 3A (rata) para exponer la superfacia y el músculo subyacente.
NOTA: Trate el dolor preoperatorio de acuerdo con la aprobación del protocolo de la IACUC. - Con pinzas afiladas y tijeras curvas, corte con cuidado la capa muscular hasta llegar al cráneo. El cráneo será plano y difícil de tocar con la punta de las pinzas. Esta es la ventana en la que se ubicará la sonda láser Doppler, como se visualiza en la Figura 2B.
- Use una herramienta de cauterización con fórceps para coagular la sangre emergente, ensanchar la ventana y asegurar la ruta hacia el cráneo.
- Una vez que la ventana esté abierta, seque con hisopos de algodón para eliminar el exceso de sangre según sea necesario.
Coloque el ratón o la rata en posición supina. - Use pinzas para retraer cualquier piel o tejido y coloque la sonda Doppler en la ventana periorbitaria de modo que coincida con el cráneo perpendicular sin piel o músculo presente para impedir la señal láser. Esta región se encuentra sobre el ACM distal, como se ilustra en la Figura 1A, B. Asegure la colocación de la sonda con cinta de laboratorio. En este protocolo, se describe el uso de una sonda recta.
NOTA: Reconocemos que los protocolos quirúrgicos variarán entre los laboratorios. En la literatura (cuando se reporta), algunos trituran el cráneo y otros no9. Puede deberse a que el cráneo es más delgado en la región periorbitaria, pero esto es solo una especulación. En nuestra experiencia, la colocación directa sin molienda se puede lograr en ratones y ratas y está demostrado en este protocolo. - Controle las lecturas relativas del flujo sanguíneo en el monitor con el software adecuado (Figura 2D, Figura 3C,D). Las lecturas de LDF pueden variar. Sin embargo, el rango óptimo para la detección de gotas de flujo sanguíneo es de >200 unidades de perfusión (UP).
- Proceda a la cirugía MCAO9 (no está en el alcance de este trabajo). Durante la cirugía MCAO, pruebe la colocación de la sonda atando brevemente la arteria carótida común, lo que debería causar una caída repentina en el flujo sanguíneo (~ 50%).
3. Retirada de la sonda Doppler y cuidados postoperatorios
- Al final de la MCAO o cuando se completen las lecturas del flujo sanguíneo, retire la sonda láser Doppler de la ventana quirúrgica. Por lo general, la sonda Doppler permanece en su lugar durante la cirugía de MCAO en ratón, ya que los tiempos de isquemia suelen ser inferiores a 90 minutos. Por otro lado, en el procedimiento de MCAO en ratas, la sonda Doppler puede retirarse después de colocar el filamento y durante la isquemia (generalmente > 90 min) y luego volver a colocarse en la ventana periorbitaria para confirmar la reperfusión repitiendo los pasos 2.6 y 2.7.
NOTA: En la Figura 4A se puede observar un trazado continuo típico de LDF del ratón MCAO. En la Figura 4B se ilustran los trazados típicos de LDF de un procedimiento MCAO en ratas. - Inyecte anestésico local aprobado por IACUC por vía subcutánea a lo largo del sitio de la incisión prospectiva.
- Cierre la piel con 1-2 suturas utilizando un nudo quirúrgico estándar con hilo de sutura reabsorbible o pegamento quirúrgico, de acuerdo con el protocolo aprobado por la IACUC. Tratar el dolor postquirúrgico de acuerdo con la aprobación del protocolo de la IACUC (por ejemplo, bupivacaína HCL al 0,5% y lidocaína al 2%, una vez intraincisión para ratones y ratas). Los animales no deben quedar desatendidos hasta que sean capaces de mantener la decúbito esternal, y ningún animal debe ser devuelto a la compañía de otros animales hasta que estén completamente recuperados.
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Resultados
La ubicación de la sonda láser Doppler en la región MCA se representa visualmente en la Figura 1, ofreciendo un pictograma de la vasculatura y sirviendo como guía visual desde las perspectivas sagital y dorsal. La Figura 2 resume los pasos críticos para la colocación de la sonda Doppler láser y los resultados en el ratón. La Figura 2A presenta una imagen de un ratón anestesiado y preparado con una marca discontinua en el sitio de la...
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Discusión
El MCAO es el procedimiento de referencia para modelar la oclusión y reperfusión de las arterias cerebrales en roedores y ha sido la piedra angular de la investigación preclínica del ictus, permitiendo la inducción de isquemia focal en roedores para imitar la fisiopatología del ictus humano. Se trata de un procedimiento quirúrgico exigente con una importante variabilidad inter e incluso intracirujano. Si bien no hay evidencia de que la aplicación de LDF reduzca la variabilidad, puede mej...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación fue financiada por NINDS 1R41NS124450. Biorender: KT26JWLYF6
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| tijera de muelle curvo | pinza Castroviejo | 1501710 | |
| #5 | Herramientas de ciencia fina | 11250-20 | |
| pinza #5/45 | Herramientas de ciencia fina | 1151-35 | |
| Forcepts Herramienta de cauterización | Conmed | M18019-01 | |
| Cinta de laboratorio | Cinta de etiquetado Fisherbrand | 15-950 | |
| Monitor Doppler láser | Instrumentos Moore | Software MOORVMS-LDF | |
| LDF Perisoft | para Windows o moorSOFT | NA | |
| Cortaratones | Philips Norelco | MG7910 | |
| Periflux System 4000, sonda 407 | El equipo Perimed | ya no está disponible | |
| Envoltura de plástico | Glad | press n seal | |
| Cortaratas | oster | A5 o similar | |
| Anestesia para pequeños roedores | JD Medical | pedido | |
| tijeras pequeñas | excelta | 362 Sissors o similar | |
| Sistema de control de temperatura con sonda | Physitemp | TCAT-2AC Controller |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Periorbital Placement of a Laser Doppler Probe for Cerebral Blood Flow Monitoring Prior to Middle Cerebral Artery Occlusion in Rodent Models
Posted by JoVE Editors on 3/18/2025. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/66839
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