Un flujo de trabajo basado en la web para seleccionar potenciadores específicos de genes y tejidos

Resumen

Presentamos un flujo de trabajo sin codificación para que los biólogos identifiquen potenciadores genéticos específicos de tejidos utilizando solo herramientas basadas en navegador. Nuestro protocolo aprovecha las marcas públicas de histonas H3K4me1/H3K27ac y los datos de Hi-C, lo que permite a los investigadores sin experiencia en programación acceder, analizar e identificar posibles elementos reguladores asociados con sus genes de interés.

Resumen

Los potenciadores son regiones del ADN que regulan la expresión génica. Las mutaciones dentro de los potenciadores pueden dar lugar a una regulación génica anormal que conduce a la enfermedad. Por lo tanto, la identificación de potenciadores que regulan la actividad génica en tejidos específicos es crucial para comprender la base genética de la enfermedad. Sin embargo, los potenciadores son difíciles de identificar ya que no codifican proteínas. Si bien existen numerosos repositorios de potenciadores y herramientas de identificación, la complejidad de estas herramientas puede presentar un desafío para los biólogos. Para facilitar a los biólogos el uso de estos recursos, presentamos un protocolo amigable para los biólogos (https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow) que aprovecha los datos genómicos existentes basados en la web, como las marcas de histonas H3K4me1 y H3K27ac y los datos de análisis de conformación de cromatina (Hi-C) para descubrir potenciadores asociados con un gen de interés (GoI) en un tejido objetivo donde el potenciador está activo. Este protocolo está completamente basado en la web y no requiere habilidades de programación por parte de los usuarios finales. Demostramos la utilidad de este enfoque mediante la caracterización de potenciadores candidatos que regulan TBX5, un gen crítico para el desarrollo del corazón. Este protocolo facilita la identificación de potenciadores asociados a este gen en el ventrículo izquierdo.

Introducción

Los potenciadores son regiones de ADN no codificantes que regulan la transcripción, el desarrollo y la diferenciación celular de los genes ^1,2. La mutación de los potenciadores puede provocar diversas enfermedades, como trastornos del desarrollo, cánceres y otras afecciones genéticas 3,4,5,6. Por lo tanto, comprender los potenciadores es primordial para comprender la expresión génica, la mutación y las enfermedades.

Para comprender cómo interactúan los potenciadores con sus genes objetivo, es importante identificar sus ubicaciones dentro del genoma. Sin embargo, la identificación de las ubicaciones de los potenciadores no siempre es sencilla, ya que los potenciadores pueden localizarse tanto cerca del sitio de inicio de la transcripción (TSS) como mucho más lejos, abarcando decenas o cientos de kilobases 2,7,8,9.

A pesar de su ubicación genómica impredecible, los potenciadores muestran firmas bioquímicas y estructurales distintas, lo que permite su rastreo sistémico. En general, los potenciadores tienden a enriquecerse en regiones intergénicas e intrónicas, con un pequeño número encontrado dentro de los exones ^2,8. A menudo se caracterizan por modificaciones específicas de histonas y unión a factores de transcripción, que definen sus funciones reguladoras y determinan su actividad espacio-temporal en diferentes etapas de desarrollo y tejidos^10,11.

ChIP-seq se utiliza para identificar sitios de unión a factores de transcripción (TFBS) y marcas de modificación de histonas, como el sello distintivo de los potenciadores, H3K4me1, marcas de potenciadores activos, H3K27ac y H3K4me3, que se enriquecen en las regiones promotoras 1,12,13,14,15. Las técnicas de captura de la conformación de la cromatina (3C) y sus derivados, como 4C, 5C, Hi-C y ChIA-PET, se utilizan para mapear las interacciones físicas entre regiones genómicas distantes. Mientras que 3C se dirige a interacciones específicas en tejidos específicos, Hi-C ofrece una arquitectura de todo el genoma en todos los tipos de células^16,17.

Además de los métodos actuales, se han desarrollado enfoques especializados para caracterizar los potenciadores, incluidas las bases de datos agrupadas de potenciadores, como EnhancerAtlas o EnhancerFinder^18,19. Sin embargo, estas herramientas a menudo requieren que los investigadores integren múltiples conjuntos de datos para investigar múltiples potenciadores en muchos tejidos, lo que puede ser abrumador para los biólogos sin experiencia en bioinformática y minería de datos.

Aquí, describimos un protocolo fácil de usar para seleccionar potenciadores, completamente basado en las herramientas web existentes. Esto permite a los investigadores consultar un gen de interés (GdI) y recuperar los potenciadores correspondientes. En este caso, el protocolo selecciona los potenciadores en función de un conjunto específico de criterios: modificaciones de histonas, interacciones con la cromatina y especificidad tisular 1,12,13,14,15,16,17,20,21. Los potenciadores que se encuentran dentro de los intrones tienen más probabilidades de mostrar actividad específica de tejido en comparación con los potenciadores intergénicos, que se posicionan en las regiones genómicas entre los genes²². Para garantizar una cobertura completa de posibles potenciadores activos, definimos el rango de búsqueda entre dos GoI vecinos para aumentar la probabilidad de capturar elementos reguladores ubicados fuera de los cuerpos genéticos. Utilizamos una marca epigenética específica del potenciador, H3K4me1, y una marca de potenciador activo, H3K27ac, para enumerar los candidatos a potenciadores. A continuación, estos candidatos se refinaron en función de los datos de Hi-C, reteniendo los potenciadores con interacciones físicas con el promotor correspondiente. Este protocolo está diseñado para guiar a los biólogos a través del proceso de identificación de potenciadores utilizando solo herramientas web disponibles públicamente. Al integrar datos epigenéticos y de interacción de la cromatina, el enfoque descrito aquí ofrece un marco práctico para generar hipótesis sobre posibles potenciadores para su posterior validación experimental.

Protocolo

NOTA: Un tutorial paso a paso está disponible en https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow. Los datos utilizados en el protocolo se resumen en la Tabla 1 y la Tabla 2. La solución de problemas está disponible en el Archivo Complementario 1.

1. Localización del GdI (Figura 1)

1. Abra el navegador del genoma EnsEMBL (https://www.EnsEMBL.org).
2. Elija el ensamblaje del genoma apropiado que coincida con la especie y la versión.
3. Introduzca GdI en el campo de búsqueda y haga clic en Ir.
4. Seleccione el enlace al ID de gen EnsEMBL apropiado.
5. Haga clic en el enlace al visor de la pestaña Región en detalles , situado debajo de la sección de resumen, para navegar por la región que rodea al GdI.

2. Definición de la región de detección del potenciador (Figura 2)

1. Identifique los dos genes vecinos del GdI para definir la región de detección. Utilice la pista Gene Legend para buscar estos genes, que se anotan como elementos visuales relacionados con la fusión de EnsEMBL/Havana en la pista Basic Gene Annotations from GENCODE . Determine la direccionalidad del GdI mediante los signos de < y > en el nombre de gen apropiado en la pista GENCODE.
2. Haga clic y arrastre para seleccionar la región intergénica entre estos genes, y haga clic en Saltar a la región en el cuadro emergente para visualizar el área seleccionada. Redefina la región de interés en cualquier momento repitiendo este paso.
3. (OPCIONAL) Personaliza la visualización seleccionando Añadir/eliminar pistas en la parte superior del visor de pistas. Modula el nivel de zoom con los controles de zoom/navegación situados encima del visor de pistas.

3. Análisis de marcas de histonas (Figura 3)

1. En la barra lateral del visor de la pestaña Región en detalle , seleccione Configurar esta página.
2. En la barra lateral de la pantalla de la pestaña Configurar imagen de región , en el menú desplegable Regulación , seleccione Actividad por célula/tejido.
3. Utilice la barra de búsqueda de células/tejidos para buscar y seleccionar tejidos de interés. Alternativamente, use la barra de navegación alfabética debajo de la barra de búsqueda para encontrar tejidos de interés.
4. Seleccione la pestaña Experimentos , junto a Célula/Tejido.
5. Seleccione H3K4me1 y H3K27ac como marcador de potenciadores, y H3K4me3 como marcador de promotores.
6. Seleccione Configurar visualización de pista.
7. Seleccione Ver pistas para visualizar las regiones marcadas con H3K4me1 en la región de detección del potenciador y las regiones marcadas con H3K4me3 aguas arriba del GdI.
8. Para los candidatos a potenciadores, recupere las coordenadas de las regiones genómicas marcadas por H3K4me1 dentro de las regiones de detección definidas haciendo clic en los elementos visuales/de cuadro coloreados en las pistas H3K4me1 recién añadidas. Esto revela la ventana emergente "Hists & Pols", que contiene información sobre la ubicación genómica del elemento en el par de bases (bp).
   1. Recupere los candidatos a potenciadores activos eligiendo las regiones H3K4me1 en las que los elementos visuales/de cuadro coloreados de H3K4me1 y H3K27ac se superponen. La granularidad del nivel de zoom puede afectar al número de candidatos a potenciador que se muestran en esta pista.
   2. Como alternativa, defina manualmente las regiones de interés para cada característica genómica haciendo clic y arrastrando en la pista para encapsular los picos del gráfico en la pista H3K4me1/H3K27ac. Copie las coordenadas de la ubicación genómica en un archivo de texto y guárdelas en formato .bed .
9. Del mismo modo, en el caso de las regiones promotoras, replique el paso 3.8 utilizando la pista H3K4me3, centrándose en la región aguas arriba del GdI.

4. Análisis de captura de la conformación de la cromatina (Hi-C) (Figura 4)

1. Acceda al portal de datos 4DN (https://data.4dnucleome.org/). En el gráfico principal de barras apiladas de la página de inicio de 4DN (Figura 5), asegúrese de que Conjuntos de experimentos esté seleccionado como eje Y, Tipo de experimento esté seleccionado como eje X y el gráfico esté agrupado por Organismo.
2. A lo largo del eje X del gráfico de barras principal, encuentre la barra Hi-C in situ. Haga clic en la parte de la barra que está agrupada para Conjuntos de experimentos humanos y luego haga clic en el botón Examinar en la ventana emergente. Filtre los conjuntos de datos relevantes mediante el panel lateral izquierdo.
3. Haga clic en el enlace de la columna Título de la biomuestra correspondiente para el tejido de interés.
4. Haga clic en Explorar datos en la pestaña Archivos procesados para explorar el conjunto de datos Hi-C con más detalle.
5. Introduzca las coordenadas del promotor identificado en el tejido de interés (desde el paso 3.9) y marque la región horizontalmente haciendo clic con el botón derecho del ratón en el mapa de calor (Figura 4). Las líneas añadidas garantizan que la región del promotor se rastree visualmente a través del mapa de calor. Elimine las líneas accidentales haciendo clic con el botón derecho en la línea y seleccionando la regla horizontal/vertical y Cerrar serie.
6. Introduzca las coordenadas de todos los potenciadores de control²³ validados experimentalmente para calcular el umbral de interacción en función de su mínimo. Se ha confirmado previamente que estos potenciadores de control interactúan con la región promotora, sirviendo como puntos de referencia para definir la interacción mínima significativa.
7. Defina el umbral del promotor-potenciador, utilizando los potenciadores de control, en función de la puntuación de interacción distinta de cero más baja de acuerdo con la clave de color en el lado derecho de la matriz.
8. Introduzca las coordenadas genómicas de todas las regiones asociadas a H3K4me1 (desde el paso 3.8) y márquelas verticalmente en el mapa de calor Hi-C. Esto permite un patrón de verificación cruzada, donde la intersección entre los potenciadores marcados con H3K4me1 (vertical) y la región promotora (horizontal) se puede examinar para detectar interacciones significativas.
   1. A continuación, filtre las regiones que interactúan débilmente comparando las puntuaciones de interacción de las regiones marcadas con H3K4me3 con el umbral de interacción (paso 4.6).
   2. Seleccione las coordenadas genómicas que exhiben frecuencias de interacción superiores al umbral definido en el mapa de calor del portal 4DN. Estas regiones aparecen como señales más concentradas (más oscuras) en el mapa de calor, excepto en formato BED.

Resultados

Para ilustrar el uso del protocolo presentado, investigamos el gen TBX5 en el corazón humano, explorando los potenciadores asociados a TBX5 utilizando el flujo de trabajo integral que involucra datos de H3K4me1, H3K27ac y Hi-C. TBX5 es un gen que contribuye al desarrollo de las extremidades y el corazón, incluida la formación de las cuatro cámaras y la separación del tabique²⁴. La mutación en este gen es una de las principales causas del síndrome de Holt-Oram (HOS), que causa anomalías en las extremidades y cardiopatías congénitas (CHD), incluyendo defectos del tabique²⁴. La mutación de los potenciadores cardíacos asociados a TBX5 puede influir de manera crítica en la enfermedad coronaria²⁴. Un estudio anterior descubrió tres potenciadores conocidos de TBX5 en tejido cardíaco específico humano, a saber, "Enhancer 2", "Enhancer 9" y "Enhancer 16" (Archivo suplementario 2), que se demostró que tienen fenotipos comparativos en ratones transgénicos²³.

Investigamos las regiones enriquecidas con H3K4me1 y H3K27ac entre RBM19 y TBX3, que son dos genes flanqueantes aguas abajo y aguas arriba de TBX5 en humanos, para recuperar potenciadores putativos en el locus TBX5 (Figura 1 y Figura 2). Para identificar los potenciadores específicos del corazón, se eligieron las células del músculo cardíaco. Las regiones potenciadoras cardíacas TBX5 putativas se recuperaron como coordenadas (chr12: inicio-fin) y se identificaron 22 regiones asociadas a H3K4me1 y H3K27ac (Figura 3 y Archivo Suplementario 3). Los potenciadores cardíacos TBX5 putativos se recuperaron de la base de datos genómica EnsEMBL para cruzar los datos de Hi-C contenidos en la base de datos 4DNucleome (Figura 4). Esto se hizo para medir las posibles interacciones entre los potenciadores potenciales y el promotor cardíaco TBX5 . Siguiendo el protocolo descrito aquí, se confirmó que 21 de las 22 regiones genómicas interactúan con el promotor TBX5 (chr12: 114400143-114410103) en las células del músculo cardíaco (Archivo suplementario 4). Hubo una región que no tuvo interacción física con el promotor (Figura 4, paso 4.8). Finalmente, comparamos este protocolo con estos potenciadores validados biológicamente y con la base de datos actual de referencia de potenciadores cardíacos, VISTA Cardiac Enhancers Browser, y revelamos potenciadores adicionales que actualmente no están capturados por la base de datos²⁵.

Realizamos una comparación cruzada de los 21 potenciadores TBX5 recuperados por el protocolo presentado aquí con las bases de datos existentes. Recuperamos 4 potenciadores TBX5 del navegador VISTA Cardiac Enhancer (Archivo suplementario 5)²⁵. De los 4 potenciadores cardíacos identificados por VISTA, 3 potenciadores, hs2329, mm1282 y m370, se superpusieron con las regiones identificadas por este protocolo de detección de potenciadores basado en la web (Figura 5). Cada uno de los potenciadores predichos también compartió las regiones genómicas con los potenciadores previamente validados experimentalmente de Smemo et ^al.23, Enhancer 2 (chr12:114025907-114026275, GRCh38) y Enhancer 16 (chr12:114415466-114420433, GRCh38), mientras que no mostraron superposición con Enhancer 9 (chr12:114263402-114266886, GRCh38). Uno de los potenciadores identificados por VISTA, hs498 , no se superpuso con ninguno de los potenciadores previstos por este protocolo o con los potenciadores validados experimentalmente por Smemo et al.²³ (Figura 5), aunque la región mostró una superposición parcial con las marcas H34Kme1 (Figura 5). De manera similar, Enhancer 9 no se superpuso con los potenciadores predichos por esta canalización, pero se asoció con las marcas H3K4me1 (Figura 5).

Figura 1: Guía paso a paso para localizar el GdI en el EnsEMBL Genome Browser. El usuario primero abre la página de inicio de EnsEMBL (1.1), selecciona la especie (Humano) e ingresa el gen en la barra de búsqueda (1.2-1.3). De la lista de resultados, se selecciona el ID de gen apropiado (1.4), que abre la página de resumen del gen. A continuación, el usuario hace clic en el hipervínculo Región en detalle (1.5) para visualizar la región genómica que rodea al GdI, incluidos los elementos vecinos y las características reguladoras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Definición de la región de detección del potenciador alrededor del GdI utilizando el navegador del genoma EnsEMBL. Para definir la región de detección del potenciador, identifique los dos genes vecinos que flanquean el GdI utilizando las anotaciones genéticas básicas de la pista GENCODE , donde los genes se muestran como bloques de color amarillo oscuro marcados con anotaciones fusionadas de EnsEMBL/Havana. La dirección transcripcional de cada gen se indica mediante puntas de flecha (< o >) junto al nombre del gen (2.1). Para seleccionar la región intergénica entre los genes vecinos, haz clic y arrastra por la región de interés y, a continuación, selecciona Saltar a la región en el cuadro desplegable para acercar la imagen (2.2). Para agregar anotaciones relacionadas con la normativa o el potenciador, haga clic en Agregar o eliminar pistas (2.3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Configuración de las pistas de modificación de histonas en la región de detección del potenciador utilizando el navegador de genomas EnsEMBL. En la barra de herramientas de la izquierda, haga clic en Configurar esta página (3.1) para acceder al panel de configuración de pista y navegue hasta "Actividad por célula/tejido" en la sección Regulación (3.2). En la pestaña abierta, seleccione la sección "Experimentos" (3.3) y utilice la barra de búsqueda de células/tejidos para localizar y seleccionar el tejido de su interés (célula de músculo cardíaco) (3.4). En el panel de marcas de histonas (3.5), habilite H3K4me1 y H3K27ac como marcas potenciadoras activas y H3K4me3 como marca promotora y luego haga clic en "Configurar visualización de pistas" (3.6). Después de confirmar las selecciones de pistas, haga clic en "Ver pistas" (3.7) para volver al visor del genoma. Los picos de las marcas de histonas ahora se muestran en la región de detección (3.8) como bloques coloreados debajo de la etiqueta de tejido correspondiente (amarillo: H3K4me1, azul: H3K27ac y naranja: H3K4me3). Ventana emergente "Hists & Pols" que contiene las coordenadas genómicas de la región en pares de bases (chr:start-end), que se pueden copiar y guardar para su análisis posterior. Aparece una ventana emergente de "Hists & Pols" después de hacer clic en los elementos coloreados de la pista. La ventana emergente contiene las coordenadas genómicas de la región en pares de bases (por ejemplo, chr12:11443450-114451611 para la región promotora), que se pueden copiar y guardar para el análisis posterior (3.8). Del mismo modo, para extraer potenciadores candidatos, priorice las regiones donde los picos H3K4me1 y H3K27ac se superpongan, como se muestra en la alineación vertical de picos y cajas a través de pistas (3.9). Las regiones superpuestas se pueden seleccionar directamente haciendo clic en sus casillas o haciendo clic y arrastrando manualmente a través de los picos alineados para definir una región (por ejemplo, chr12:114400143-114410103 para una región candidata activa). Las coordenadas que se muestran en la ventana emergente deben guardarse en formato BED para su validación o visualización posterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Visualización de las interacciones entre la cromatina promotor y potenciador utilizando mapas de calor Hi-C del Portal de Datos del Nucleoma 4D. La página de inicio del Portal de Datos del Nucleoma 4D muestra un gráfico de barras apiladas que resume los tipos de experimentos disponibles por organismo. El conjunto de datos "Hi-C in situ " para muestras humanas se selecciona haciendo clic en la sección correspondiente de la barra (4.1). Se muestra una lista filtrada de conjuntos de datos relevantes; se selecciona un conjunto de datos Hi-C derivado de células H9 diferenciadas en mioblastos cardíacos (4.2). El conjunto de datos seleccionado (4.3) se abre en el navegador HiGlass a través del botón Explorar datos (4.4). La región genómica de interés se introduce en el cuadro de coordenadas (4.5) y la matriz de contacto se representa como un mapa de calor a escala de colores. Los colores más oscuros (rojo intenso a negro) indican una mayor frecuencia de contacto con la cromatina, mientras que los colores más claros (blanco a naranja) representan interacciones más débiles. Se coloca una regla horizontal en la coordenada del promotor y se dibujan reglas verticales en las posiciones de tres potenciadores de control validados experimentalmente (4.6). Estas intersecciones se utilizan para definir un umbral de interacción estricto, establecido por la señal visible más fuerte (color más oscuro) entre los contactos promotor-potenciador (4.7). Se dibujan reglas verticales adicionales en las ubicaciones de los potenciadores marcados con H3K27ac y H3K4me1 candidatos (del paso 3.8). Se conservan los candidatos cuyas intersecciones promotor-potenciador son iguales o más oscuras que el umbral, mientras que aquellos con señales más débiles (cuadrados de color más claro) se excluyen (4.8). Las coordenadas retenidas se extraen manualmente y se guardan en formato BED para los análisis posteriores. (a. Potenciador 2, b. Potenciador 9 y c. Potenciador 16) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Vista genómica del navegador de los potenciadores TBX5 previstos en comparación con los potenciadores cardíacos validados por VISTA y los potenciadores de control. Las instantáneas del navegador del genoma muestran el rango de búsqueda del potenciador (PASO 2) comparando los potenciadores predichos recuperados por el protocolo basado en la web (abajo) con los potenciadores validados por VISTA (arriba) y los potenciadores de control validados experimentalmente (centro). El panel principal muestra el locus genómico completo con elementos reguladores anotados, incluidos los picos específicos de las células del músculo cardíaco H3K4me1 (amarillo), H3K27ac (azul) y H3K4me3 (naranja). Tres figuras ampliadas capturan la alineación entre lo recuperado por el protocolo, VISTA y los potenciadores de control. La superposición con los potenciadores de control se delinea con cuadros rojos. Las coordenadas de cada subregión se muestran en los paneles inferiores del navegador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Datos utilizados en el estudio. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Herramientas web utilizadas en el estudio. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Archivo complementario 1: Instrucciones de solución de problemas para EnsEMBL Genome Browser. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Un archivo BED en formato GRCh38, los potenciadores de control cardíaco TBX5 validados experimentalmente ²³. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 3: Un archivo BED en formato GRCh38, potenciadores cardíacos TBX5 recuperados por STEP3 de EnsEMBL. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 4: Un archivo BED en formato GRCh38, potenciadores cardíacos TBX5 recuperados por STEP4 de EnsEMBL. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 5: Un archivo BED en formato GRCh38, potenciadores cardíacos TBX5 recuperado del navegador VISTA potenciador cardíaco²⁵. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El protocolo basado en web descrito aquí funciona como un flujo de trabajo para la recuperación del potenciador, en lugar de la predicción del potenciador. Al aprovechar los conjuntos de datos específicos de tejidos disponibles públicamente, las modificaciones de histonas (H3K4me1 y H3K27ac) y los datos de interacción Hi-C, reduce los posibles potenciadores asociados con el GdI. A diferencia de las herramientas de predicción computacional que dependen del aprendizaje automático o de modelos basados en secuencias, nuestro enfoque se centra en recuperar potenciadores solo en función de datos experimentales. Las instrucciones de solución de problemas para el navegador del genoma EnsEMBL se proporcionan en el Archivo complementario 1.

Este flujo de trabajo integra elementos clave como las marcas de histonas y los datos de interacción de la cromatina, de forma similar a métodos avanzados como ChIA-PET y PLAC-seq, que mapean las interacciones potenciador-promotor con mayor precisión^10,11. Sin embargo, este método es beneficioso cuando las técnicas experimentales de alta resolución no son factibles, ya que el protocolo requiere menos recursos y ahorra mucho tiempo.

La principal limitación del enfoque presentado anteriormente es su dependencia de la disponibilidad y la calidad de los conjuntos de datos existentes, lo que puede afectar a la precisión de las interacciones recuperadas. La investigación de la actividad de los potenciadores durante el desarrollo cardíaco en el contexto de las mutaciones genéticas asociadas a TBX5 requiere una resolución específica del tejido. Para este tipo de análisis, el tejido cardíaco embrionario sería el más apropiado dada su relevancia para la regulación del desarrollo. Sin embargo, ningún conjunto de datos embrionarios incluía los datos de modificación de histonas estaba disponible públicamente en el momento del análisis. Para tener en cuenta esto, la integración de recursos alternativos como ENCODE, Enhancer Atlas 2.0 o EnhancerFinder puede ampliar la utilidad de la canalización al proporcionar conjuntos de datos adicionales para la identificación y validación del potenciador ^18,19.

En el TBX5 REPFIX, el análisis basado en H3K4me1 reveló 22 potenciadores putativos como punto de partida para futuras investigaciones. El análisis posterior de Hi-C mostró que 21 de los 22 candidatos a potenciadores basados en marcas de modificación de histonas previas interactuaron con el promotor TBX5 en las células del músculo cardíaco (Figura 5). Esto apoya la fiabilidad del enfoque basado en marcas de modificación de histonas en la predicción de regiones de interés.

Elegimos no priorizar la conservación de la secuencia entre especies en este protocolo, aunque es un criterio común para identificar potenciadores. Ya que anteriormente demostró ser menos efectivo para los potenciadores específicos de tejidos o especies, muchos de los cuales no se conservan fuertemente durante la evolución²⁶. Teniendo en cuenta esto, optamos por centrarnos en los marcadores basados en la cromatina que son más directamente indicativos de la actividad potenciadora funcional. Sin embargo, la conservación de la secuencia aún puede tener valor en contextos específicos, como el estudio de potenciadores con significado evolutivo. En este caso, podría añadirse como paso opcional para los usuarios interesados en elementos normativos conservados.

El protocolo demostró ser eficaz en la recuperación de 21 potenciadores específicos del corazón para el gen TBX5 del sitio web de EnsEMBL, que anteriormente había eludido la identificación por parte de una plataforma existente, VISTA Cardiac Enhancers Browser. Aunque el protocolo descrito aquí no pudo recuperar uno de los potenciadores, hs498, lo que sugiere la posibilidad de limitación en la detección, el enfoque descubrió algunos potenciadores no detectados por el navegador VISTA Cardiac Enhancers. Sin embargo, es necesaria una mayor validación de los potenciadores recuperados, ya que el protocolo produce un mayor número de regiones putativas en comparación con las bases de datos VISTA seleccionadas. Este recuento más alto aumenta el riesgo de falsos positivos, y un mayor número de potenciadores previstos no indica necesariamente una mayor especificidad o relevancia funcional. La incorporación de conjuntos de datos experimentales adicionales o ensayos funcionales, como el análisis de expresión génica, la perturbación CRISPR o los ensayos reporteros, será crucial para confirmar la validez biológica de estos candidatos, tal y como se realizó en Smemoet al.». S^{estudio 23}.

La comparación cruzada con tres potenciadores validados experimentalmente mostró una superposición parcial con las regiones predichas (Figura 5). El potenciador predicho "e1" se posicionó más ampliamente que el potenciador 2 validado, mientras que "e18" mostró una superposición parcial con el potenciador 16 (Figura 5). Estos resultados sugieren que este enfoque identifica con éxito regiones con actividad reguladora conocida, aunque el alcance más amplio de los potenciadores pronosticados puede reflejar la flexibilidad en los límites de los potenciadores. Los potenciadores a menudo funcionan como elementos modulares, y su actividad puede depender del contexto de la cromatina, el tipo de célula y el momento del desarrollo ^2,27. Por lo tanto, las regiones predichas pueden incluir los sitios activos centrales con secuencias adyacentes que contribuyen a la función reguladora, a pesar de la necesidad de validación experimental para determinar qué partes de estas predicciones más amplias son funcionalmente activas en un contexto específico de tejido o de desarrollo. Mientras que VISTA Cardiac Enhancer Browser identificó cuatro regiones dentro del rango definido, solo un potenciador, mm370, se superpuso parcialmente con un potenciador validado experimentalmente, Enhancer 16, específicamente en la región marcada por H3K4me1 (Figura 5)²³. La porción restante de mm370, que no se superpone con Enhancer 16, puede indicar una subregión no funcional o inactiva del potenciador^28,29.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Estación de trabajo informática	N/A	N/A	Computadora compatible con navegador web, sistema operativo Windows / Mac / Linux
Portal de datos 4DN	Portal de datos 4DN	https://data.4dnucleome.org/
Galaxia	Galaxia	https://usegalaxy.org/published/history?id=aff5db4e07064445
Github	Github	https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow
VISTA	Navegador de potenciadores cardíacos VISTA	https://portal.nersc.gov/dna/RD/heart/