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Evaluación de rasgos estructurales en Triticum aestivum y Zea mays para la diferenciación fotosintética de C3 y C4 utilizando secciones a mano alzada y semidelgadas

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DOI:

10.3791/66843

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12 de julio de 2024

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1Institute of Agricultural and Environmental Sciences, Estonian University of Life Sciences, 2Estonian Academy of Sciences

En este artículo

Resumen

La evaluación de las diferencias anatómicas entre las secciones transversales de las hojas C3 y C4 ayuda a comprender la eficiencia de la fotosíntesis. Este artículo describe la preparación y el examen de las secciones transversales de hojas semifinas y a mano alzada, junto con las advertencias en la preparación de las especies de cultivo Triticum aestivum y Zea mays.

Resumen

La mayor eficiencia de la fotosíntesis deC4 , en comparación con el mecanismo deC3 , surge de su capacidad para concentrar CO2 en las células de la vaina del haz. La eficacia de la fotosíntesisC4 y la eficiencia intrínseca del uso del agua están directamente relacionadas con la proporción de células del mesófilo y de las hojas del haz, el tamaño y la densidad de las vainas del haz, y el tamaño, la densidad y el grosor de la pared celular de las células de la vaina del haz. El análisis microscópico rápido de estos rasgos se puede realizar en secciones a mano alzada y semidelgadas utilizando microscopía óptica convencional, proporcionando información valiosa sobre la eficiencia fotosintética en cultivos deC4 mediante la identificación y el examen de tipos celulares específicos. Además, se muestran los errores en la preparación de secciones a mano alzada y semifinas que afectan a las mediciones anatómicas y a los diagnósticos de tipos de células, así como la forma de evitar estos errores. Este enfoque microscópico ofrece un medio eficiente para recopilar información sobre la aclimatación fotosintética a la variación ambiental y ayuda en la detección rápida de cultivos para climas futuros.

Introducción

La fotosíntesis es un proceso fundamental en el que la energía luminosa se convierte en energía química, sirviendo como piedra angular de las redes tróficas terrestres. La mayoría de las plantas siguen la vía C3 de la fotosíntesis, donde el principal producto fotosintético es el compuesto de tres carbonos glicerato 3-fosfato. La fotosíntesis deC3 evolucionó hace más de 2.000 millones de años en una atmósfera abundante enCO2 y baja enO21. La enzima fotosintética clave, la ribulosa 1,5 bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (Rubisco), que evolucionó en estas condiciones, no es óptima para las condiciones actuales de bajo contenido deCO2 y alto contenido deO2, ya que reacciona competitivamente con elO2, iniciando la fotorrespiración2. La fotorrespiración es una vía de despilfarro que consume energía en lugar de producirla y liberarCO2 como subproducto. En consecuencia, es crucial mantener una alta concentración deCO2 alrededor de Rubisco en los cloroplastos para prevenir la oxigenación 3,4. Debido a la incapacidad de las plantasC3 para concentrar el CO2, se produce una importante reducción de CO2 del aire ambiente a los cloroplastos, lo que frena la fotosíntesis y afecta al crecimiento de las plantas y a la producción de biomasa 2,5,6.

En las plantasC3, la fotosíntesis está limitada por la entrada de CO2 a través de los estomas, su difusión a través del mesófilo y la actividad bioquímica de las enzimas fotosintéticas. La entrada de CO2 está limitada primero por la conductancia estomática, que está controlada por condiciones ambientales como la temperatura y la humedad del aire. Luego, el CO2 se difunde a través de la fase gaseosa y líquida interna de la hoja a Rubisco7. En las plantasC3, todas las etapas de la fotosíntesis ocurren en los cloroplastos de las células mesófilas, y las plantas necesitan mantener una afluencia constante de CO2 de la atmósfera a los cloroplastos. La dependencia de la disponibilidad deCO2 en los cloroplastos de la apertura estomática, la arquitectura mesófila y las características individuales de las células y los cloroplastos hace que las plantas sean susceptibles a las limitaciones ambientales que eventualmente afectan la fotosíntesis, como la baja disponibilidad de agua y las altas temperaturas 7,8,9,10, destacando particularmente su vulnerabilidad a las condiciones del cambio climático11.

Dados los desafíos planteados por las ineficiencias de la víaC3, así como las limitaciones para mantener niveles óptimos de CO2 y susceptibilidad a factores ambientales, en ciertas plantas, ha evolucionado otra vía, la vía de fotosíntesisC4. Característicamente, las plantasC4 tienen dos vías bioquímicas separadas espacialmente; la fijación inicial de CO2 se produce en las células del mesófilo por la fosfoenolpiruvato carboxilasa, que tiene una mayor afinidad por el CO2 que Rubisco y también carece de actividad de oxigenación. El productoC4 formado se transporta posteriormente a las células de la vaina del haz, donde se descarboxila, y el CO2 es nuevamente liberado y fijado por Rubisco (fotosíntesis de C3)12,13,14. La mayor afinidad de la PEP carboxilasa al CO2 y a las paredes celulares gruesas de las células de la vaina del haz permite la concentración de CO2 en las células de la vaina del haz y, por lo tanto, las plantas deC4 minimizan la fotorrespiración al segregar espacialmente la fijación de CO2 y el ciclo de Calvin. La adopción de la vía C4 muestra la respuesta adaptativa de la naturaleza a las limitaciones ambientales, ofreciendo información sobre posibles estrategias para mejorar la productividad y la resiliencia de los cultivos en condiciones climáticas cambiantes15.

La anatomía especializada de la estructura de la hoja en las plantasC4 se caracteriza por venas rodeadas de células de la vaina del haz vascular agrandadas que contienen cloroplastos y con una disposición radial de las células del mesófilo en un patrón de anillo exterior alrededor de las células de la vaina del haz. Las células mesófilas están muy cerca de las células de la vaina del haz, lo que permite un transporte rápido y continuo de metabolitos entre los dos tipos de células. La disposición de esta célula es típica de las plantas C4 y se conoce como anatomía de Kranz16. En las especiesC3, la especialización y disposición de las células mesófilas pueden variar, pero las células de la vaina del haz son claramente más pequeñas y tienen unos pocos cloroplastos o ningún cloroplasto. La anatomía específica de Kranz permite concentrar el CO2 en los cloroplastos de las células de la vaina donde se encuentra la enzima carboxilanteC3 Rubisco, dificultando eficazmente la fotorrespiración 4,17,18. A pesar de su disposición aparentemente compleja, estos cambios han ocurrido de forma independiente múltiples veces en la evolución de las angiospermas, lo que indica que es una vía evolutiva relativamente factible 19,20,21, y se ha demostrado que varios taxones se encuentran en una etapa intermedia entre el metabolismo del carbono C3 y C 4, denominados C3-C 4 o C2, tener habilidades para concentrarse y reasimilar CO2 22,23,24,25.

Muchas plantasC4 son cultivos de gran importancia económica, y la ingeniería genética de cultivosC3, como el arroz, para mejorar su resiliencia climática y asegurar el rendimiento ha sido un tema de interés en las últimas décadas26,27. Sin embargo, los esfuerzos de ingeniería requieren una comprensión detallada de la anatomía especializada deC4 y cómo controla la fotosíntesis 2,28.

El establecimiento de la anatomía de C4 Kranz es un requisito previo para lograr el ambicioso objetivo de diseñar la fotosíntesis de C4 en cultivos de C3 25. Sin embargo, la comprensión actual de la regulación de la anatomía del Kranz y los métodos para detectar rápidamente sus rasgos anatómicos clave es limitada, lo que dificulta la identificación de especies híbridas. Estudios previos han demostrado que los rasgos clave que regulan la eficiencia fotosintética en las plantas C3 y C4 incluyen la distancia intervenal, el diámetro del complejo de la vaina del haz y el tamaño de las células de la vainadel haz 14,29. Estos rasgos pueden filtrarse fácilmente utilizando secciones a mano alzada y analizarse cuantitativamente utilizando secciones semifinas. Aquí, describimos el método de evaluación de los rasgos que permiten el diagnóstico de la diferenciación anatómica de C3 y C4 a través de microscopía cruzada y óptica a mano alzada, a saber, el área de la vaina del haz, la distancia intervenal y la frecuencia de las venas.

Protocolo

1. Condiciones de crecimiento de las plantas

  1. Seleccione el trigo (Triticum aestivum L. Var. Winter Wheat, "Fredis") y el maíz (Zea mays L. Var. Saccharata, "Golden Bantam") como plantas representativas C3 y C4 , respectivamente. Cultive ambas especies de plantas en una cámara de crecimiento de semillas controlada en un ambiente.
  2. Mantenga la humedad relativa al 55% con la temperatura del aire a 25 °C/18 °C (día/noche) con un período de luz de 12 h. Mantener la densidad de flujo de fotones fotosintéticos (Q) en la superficie de la planta a 1200 μmol/m2/s para representar sus condiciones naturales de crecimiento. Cultive todas las plantas a una concentración ambiente de CO2 de 400 μmol/mol.
  3. Riegue las plantas cada2 días con agua destilada y fertilice con la solución de Hoagland 10 días después de la emergencia de las plántulas. Cultive las plantas en las condiciones dadas durante 60 días y use hojas completamente expandidas para análisis microscópicos.

2. Preparación y visualización de las secciones a mano alzada

  1. Seleccione 3 hojas maduras no senescentes de cada planta y manténgalas en agua destilada. Con una nueva hoja de afeitar de un solo lado, haga un corte de nivelación para formar un ángulo recto con la superficie de la hoja para asegurarse de que las secciones sean secciones transversales perpendiculares a la superficie de la hoja.
  2. Coloque el espécimen de hoja en una placa de vidrio sobre un trozo de cera dental para estabilizar la muestra y evitar que se deslice. Corte moviendo la cuchilla hacia abajo sobre el espécimen de hoja para cortar limpiamente a través de las celdas. Mantenga las secciones transversales en agua destilada.
  3. Monte las muestras en un portaobjetos de vidrio colocándolas sobre una gota de agua y cubriéndolas con un cubreobjetos de vidrio para su visualización microscópica y obtención de imágenes. Evite atrapar burbujas de aire.
  4. Vea el portaobjetos bajo un microscopio de luz compuesta con aumentos de 10x y 20x. Guarde las imágenes según la guía del software, junto con la escala correspondiente.

3. Preparación de secciones semifinas

  1. Corte secciones de aproximadamente 3 mm x 5 mm de tamaño de las áreas intercostales a lo largo de la nervadura central de las hojas de Z. mays y T. aestivum en una placa de vidrio como en el paso 2.2. Asegúrese de que la longitud de la sección cortada corra a lo largo de la veta de la hoja.
  2. Colocar el material vegetal en una jeringa con 1 mL de tampón de fijación (aldehído glutárico al 4% en tampón fosfato 0,1 M, pH = 6,9, Tabla 1).
  3. Sostenga la jeringa verticalmente, retire el aire y, sosteniendo un dedo en la punta, bombee la jeringa para crear un vacío. Repita hasta que las muestras queden en el fondo de la jeringa, lo que indica una infiltración exitosa.
  4. Transfiera el contenido de la jeringa a un vial de vidrio etiquetado y almacene a 4 °C durante 48 h antes del siguiente paso (Tabla 2).
  5. Para cada vial, retire suavemente el fijador con una pipeta y agregue el tampón de fosfato hasta cubrir la muestra. Dejar actuar durante 30 min. Repita este paso 3 veces.
  6. Retire el tampón de fosfato con una pipeta y añada el tetróxido de osmio (PRECAUCIÓN) hasta cubrir la muestra. Las muestras y otras materias orgánicas se volverán negras. Use guantes dobles. Dejar actuar durante 1 h.
  7. Retire la solución anterior con una pipeta y cubra las muestras con agua destilada. Dejar actuar durante 30 minutos Repite este paso 3 veces y utiliza guantes dobles.
  8. Retire la solución anterior con una pipeta y cubra las muestras con la solución de agua-etanol destilado 50/50. Dejar actuar durante 30 min. Repita este paso con soluciones de agua-etanol destilado en las siguientes series: 30/70, 20/80, 10/90 y 2x al 100 % de etanol. Las muestras en cualquiera de estas soluciones se pueden dejar toda la noche a 4 °C.
  9. Retirar la solución anterior con una pipeta y cubrir las muestras con 1/3 de solución de resina-etanol. Poner las muestras en una placa batidora y dejar actuar durante 2 h. Repita este paso con soluciones de resina-etanol de las siguientes series: 1/2, 1/1, 2/1, 3/1 y 2x al 100% de resina. Las muestras en cualquiera de estas soluciones se pueden dejar toda la noche a 4 °C.
  10. Cubra las cavidades de un molde de incrustación plano (16 cavidades, dimensiones de la cavidad: 14 L x 4,8 W x 3 D (mm)) con resina 100% y coloque las muestras en un extremo de la cavidad. Prepare etiquetas de papel escritas a lápiz para cada muestra y colóquelas en el otro extremo de la cavidad.
  11. Rellena completamente todas las cavidades con resina 100% y endereza las muestras y etiquetas si se han movido. Cubra el molde con una película de incrustación y polimerice en un horno según las pautas del producto de resina acrílica.
  12. Coloque el bloque polimerizado con la muestra en el portamuestras del ultramicrótomo. Recorte el bloque con un cuchillo de vidrio rugoso hasta que el tejido se haga visible y se elimine el exceso de resina.
  13. Corte secciones semifinas transversalmente (1 μm) con un cuchillo de vidrio o diamante. Recoja las secciones usando un asa de inoculación de metal de la superficie del agua y colóquelas en un portaobjetos de vidrio. Seque el portaobjetos en una placa calefactora (60 °C) para fijar las secciones en el vidrio.
  14. Teñir las secciones fijas con azul de toluidina (solución acuosa al 1%) durante 5 s antes de enjuagar con agua destilada y secar de nuevo en la placa calefactora.
    NOTA: Asegúrese de que el proceso de fijación química se realice bajo una campana extractora. Las cuchillas de vidrio deben reemplazarse periódicamente para garantizar cortes afilados que permitan secciones sin desgarros ni distorsiones.

4. Obtención de imágenes de las muestras

  1. Imágenes de secciones de hojas frescas
    1. Configure el microscopio de luz compuesta con el software adjunto según el manual.
    2. Coloque la diapositiva de vidrio en el escenario. Ajuste el ocular y visualice la sección a 10x para obtener una visión general, luego a 20x y 40x objetivos.
    3. En cada objetivo, navegue por el canal Live, concéntrese en el área de interés y ubique las células de la vaina del haz alrededor de la vena.
    4. Una vez enfocado, haga clic en el botón Congelar y agregue la escala presionando el botón Barra de escala en la pestaña Herramientas. Guarde la imagen en formato . Formato TIF para el análisis de imágenes.
  2. Obtención de imágenes de secciones infiltradas con resina
    1. Configure el microscopio óptico automatizado en combinación con el software adjunto en la computadora.
    2. Cargue el canal transparente y coloque el portaobjetos en la platina del microscopio. Concéntrese en la sección con un aumento del objetivo de 40x y ajuste el brillo para asegurarse de que todas las estructuras celulares sean visibles.
    3. Establezca el área de ubicación de la sección usando la función de navegador para asegurarse de que se muestre toda la sección y haga clic en el botón Puntada .
    4. Haga clic en Listo y, a continuación, en Iniciar para permitir que el microscopio obtenga una imagen de toda la sección. Abra el software de análisis de imágenes y abra las baldosas tomadas por el microscopio.
    5. Con la función Alinear, asegúrese de que las teselas no se superpongan. Después de generar la imagen, ajuste la posición, el brillo y la rotación con la pestaña Ajustar.
    6. Imprima la escala en la imagen antes de guardarla en . Formato TIF.
  3. Mediciones anatómicas con el software ImageJ
    1. Abra el software ImageJ y cargue la imagen arrastrándola a la ventana.
    2. Con la herramienta Línea, calibre la escala de la siguiente manera: Dibuje una línea sobre la barra de escala, elija Analizar > Establecer escala, cambie la distancia conocida a la longitud de la barra de escala y cambie la unidad de longitud a la unidad correcta.
    3. Mide el rasgo prospectivo seleccionando la Herramienta Línea, dibujando una línea a través del área de interés y presionando la tecla M .
    4. Para las mediciones de área, seleccione la herramienta Selección de polígono y dibuje alrededor del tejido de interés. Concluya pulsando la tecla M . Las mediciones se muestran como una ventana emergente, que se puede copiar en una hoja de cálculo para un análisis posterior de los datos.

Resultados

La Figura 1A muestra la orientación correcta para seccionar la hoja tanto para el corte fresco como para la microscopía óptica. El método para cortar secciones frescas usando una navaja de afeitar de un solo lado y una hoja de cera dental se puede ver en la Figura 1B. Las secciones resultantes se muestran en la Figura 1C.

La Figura 2 muestra secciones a mano alzada de hojas representativas de la planta C3 T. aestivum y de la plantaC4 Z. mays. Las células de la vaina del haz son visibles alrededor de la vena, y el maíz tiene células más redondas y verdes, lo que indica una mayor presencia de cloroplastos. Es posible obtener el grosor de la hoja y el área total de la vaina del haz a partir de estas imágenes; Sin embargo, no es posible una mayor caracterización del mesófilo con este método.

La Figura 3 muestra secciones transversales semidelgadas de T. aestivum y Z. mays. Con este método, todos los tejidos de la hoja son visibles y medibles. La anatomía de Kranz es evidente en Z. mays, con células mesófilas dispuestas alrededor de las venas. Las vainas del haz están agrandadas y llenas de cloroplastos, notablemente concentrados hacia las células del mesófilo. Esto permite un rápido intercambio de metabolitos entre las células de la vaina del haz y las células del mesófilo. A partir de estas imágenes, se midieron los siguientes rasgos estructurales de las hojas: distancia intervenal entre las venas pequeñas y grandes, diámetro de la vaina del haz, área total de la vaina del haz, área de las venas, fracción del área de las células de la vaina del haz, área de las células de la vaina del haz, frecuencia de venas dentro de 500 μm y grosor de la hoja. Los diagramas de caja de la Figura 4 muestran la diferencia en tales rasgos entre T. aestivum y Z. mays. Todos los rasgos, excepto uno, la distancia intervenal entre venas grandes, son significativamente diferentes en un intervalo de confianza del 95% con un valor de p < 0,05.

La Figura 4 muestra una colección de diagramas de caja que representan las diferencias de rasgos anatómicos entre T. aestivum y Z. mays, ejemplificando las diferencias entre las estructuras de la vaina del haz C3 y C4 . Existe una distinción significativa entre las distancias intervenales entre las especies de cultivo, el diámetro de la vaina del haz (en las mismas condiciones de crecimiento), la fracción de células de la vaina del haz y el material no fotosintético (es decir, venas), y la frecuencia de las venas en un ancho de sección de 500 μm, todo lo cual es fuertemente indicativo de lo que se espera entre la anatomía de la hoja C3 y C4 .

En la Figura 5 se muestran algunos ejemplos de errores que pueden ocurrir al cortar o preparar las muestras. La anatomía de la hoja en estas imágenes está enmascarada o deformada y, por lo tanto, no es confiable para la caracterización. La tinción excesiva con azul de toluidina puede ocurrir en secciones cortadas con el ultramicrótomo en las que la tinción se deja durante demasiado tiempo, oscureciendo así la estructura celular (Figura 5A,B). Pueden ocurrir errores comunes durante el protocolo de infiltración en los que la resina no penetra completamente en los tejidos de la hoja (Figura 5C,D). Las secciones transversales de las hojas que se cortan a lo largo del grano dan como resultado celdas oblongas en las que las celdas del mesófilo y la vaina del haz no se pueden ubicar ni medir correctamente (Figura 5F, G, H).

Se realizaron análisis estadísticos en R (versión 4.3.1) para crear diagramas de caja. Los rasgos anatómicos de las hojas se midieron por triplicado (3 hojas por planta, 3 plantas por especie).

Configuración de cromatografía de sección foliar; extracción de pigmentos verdes. Diagrama de pasos para la separación de pigmentos.
Figura 1: Método correcto para cortar secciones transversales de hojas frescas. (A) La orientación de las secciones de hoja con el fin de obtener una sección transversal. (B) Técnica para seccionar hojas usando una hoja de afeitar de un solo lado sobre un trozo de cera dental plana. (C) Las secciones transversales resultantes aparecen como finas astillas de hojas que están listas para ser montadas en un portaobjetos de vidrio y vistas bajo el microscopio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Microscopía de sección transversal de la estructura de la hoja de la planta, escamas de 50 μm y 100 μm, detalle del tejido vascular.
Figura 2: Secciones a mano alzada de hojas representativas. (A) La planta C3 Triticum aestivum (aumento de 400x); y (B) la planta C4 Zea puede a (200x aumento). El tipo de célula se indica con flechas, donde V = vena, BSC = célula de la vaina del haz y MC = célula mesófila. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diagrama de anatomía de la planta que muestra la sección transversal del haz vascular con etiquetas para tejidos y estructuras.
Figura 3: Secciones transversales semifinas. (A) Zea mays y (B) Triticum aestivum para mostrar las diferencias en las vainas del haz y las posiciones de los cloroplastos en las especies C4 con anatomía Kranz (A) y C3 especies sin anatomía Kranz (B). Abreviaturas: Tl = grosor de la hoja, BS = vaina del haz, SV = vena pequeña, ID = distancia intervenal y LV = vena grande. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diagramas de caja que comparan T. aestivum y Z. mays usando la prueba T; las métricas incluyen SY-HD, LV-ID y VBA.
Figura 4: Diagramas de caja que muestran la diferencia en los rasgos anatómicos entre Triticum aestivum y Zea mays. (A) distancia intervenal entre venas pequeñas, (B) distancia intervenal entre venas grandes, (C) diámetro de la vaina del haz, (D) área total de la vaina del haz, (E) área de las venas, (F) fracción del área de las células de la vaina del haz, (G) área de las células de la vaina del haz, (H) frecuencia de las venas dentro de 500 μm y (I) espesor de la hoja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Imágenes microscópicas de secciones transversales de tejido vegetal, destacando la estructura celular y la anatomía.
Figura 5: Ejemplos de errores comunes que pueden ocurrir en el procesamiento de tejidos, indicados por flechas rojas. Sobretinción en muestras embebidas en resina acrílica LR White (A) Triticum aestivum y (B) Zea mays; desgarros en resina en secciones incrustadas en la resina epoxi de Spurr: (C) Ceratozamia robusta y (D) Dioon mejiae; Secciones a mano alzada de T. aestivum que muestran (E) sección transversal y (F) sección longitudinal; Sesgo en el corte debido a cortes oblicuos en (G) Annona muricata y (H) Encephalartos villosus. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

SoluciónPreparaciónVolumen final
Base para el búfer 1Disuelve 7,12 g de Na2HPO4 . 2H2O en 200 mL de agua destilada200 mL
Base para el tampón 2Disolver 7,12 g de NaH2PO4 . 2H2O en 200 ml de agua destilada200 mL
Solución tampón de fosfatoMezclar 36 mL de Base 1, 14 mL de Base 2 y 50 mL de agua destilada100 mL
Solución fijadoraMezclar 9,25 mL de glutaraldehído al 5% (atención: ver tabla de materiales), 12,5 mL de tampón de fosfato y 28,25 mL de agua destilada. Conservar a 4 °C.50 mL

Tabla 1: Receta de la solución fijadora.

PasoDescripciónDuraciónRepetir
1Enjuague con tampónRetire suavemente el fijador con una pipeta y añada el tampón de fosfato hasta cubrir la muestra. Dejar actuar durante 30 min.30 minutos3 veces
2Tinción con tetróxido de osmio al 1%(Precaución: ver Tabla de Materiales): Retire el tampón de fosfato con una pipeta y agregue el tetróxido de osmio hasta cubrir la muestra. Las muestras y otras materias orgánicas se volverán negras. Use guantes dobles.60 minutos1
3Enjuague de las muestras con agua destiladaRetire la solución anterior con una pipeta y cubra las muestras con agua destilada. Dejar actuar durante 30 min. Repita este paso 3 veces. Use guantes dobles.30 minutos3 veces
4Infiltración de series de etanolRetire la solución anterior con una pipeta y cubra las muestras con la solución de agua-etanol destilado 50/50. Dejar actuar durante 30 min. Repita este paso con soluciones de agua-etanol destilado en las siguientes series: 30/70, 20/80, 10/90 y etanol 100%.30 minutos1
5Infiltración en serie resina-etanolRetirar la solución anterior con una pipeta y cubrir las muestras con 1/3 de solución de resina-etanol. Poner las muestras en una placa batidora y dejar actuar durante 2 h. Repita este paso con soluciones de resina-etanol de las siguientes series: 1/2, 1/1, 2/1, 3/1 y 100% resina.120 minutos1
6Conservar en la nevera durante 72 h antes de la polimerización
7Polimerizar secciones de hojas infiltradas de acuerdo con las especificaciones del producto para obtener muestras incrustadas en resina.

Tabla 2: Protocolo de infiltración de resina.

Discusión

En este artículo, discutimos los métodos cuantitativos y cualitativos para medir la anatomía de las hojas y las formas en que se pueden optimizar. Además, la metodología se aplica a especies representativas de cultivos con el fin de determinar qué rasgos anatómicos son más útiles para distinguir entre las secciones transversales C3 y C4 . La comprensión de estos rasgos es esencial, ya que las especies híbridas, denominadas fotosíntesisC2 , se están convirtiendo en una vía de investigación más prometedora. Hasta el momento, solo se ha identificado una especie de cultivo, Diplotaxis tenuifolia (rúcula), que utiliza la fotosíntesisC2 , pero es probable que haya más de lo que indican los registros actuales25. Altos niveles de diversidad fotosintética intraespecífica y plasticidad están presentes dentro de los linajes C2 . Esto implica que la confirmación de la ocurrencia de la fotosíntesis deC2 requiere múltiples líneas de evidencia, como el punto de compensación deCO2 , análisis ultraestructurales e inmunohistoquímica30.

Las secciones a mano alzada y semidelgadas se han utilizado para identificar y medir tejidos vegetales específicos durante muchos años, pero este artículo tiene como objetivo discutir el caso de uso particular de las estructuras anatómicas de las hojas que afectan la diferenciación fotosintética entre las plantas de cultivo C3 y C4 . Hay advertencias tanto para el corte a mano alzada como para el semifino que deben tenerse en cuenta. Las secciones a mano alzada, aunque rápidas de obtener, probablemente den lugar a secciones de hojas con espesores inconsistentes, lo que dificulta los análisis cuantitativos. Esto puede evitarse mediante el uso de equipos especializados para el corte de material vegetal fresco (por ejemplo, vibratomo o criostato). Las secciones más gruesas del corte manual pueden dar lugar a múltiples capas de células una encima de la otra, difuminando las células y, por lo tanto, la anatomía. Si el propósito del corte es puramente cualitativo, las secciones a mano alzada ofrecen la ventaja del procesamiento químico de los tejidos vegetales (es decir, histoquímica)31. Esto permite la indicación cualitativa de la presencia de compuestos particulares en las células vegetales. Por el contrario, las secciones semidelgadas casi siempre dan como resultado secciones consistentemente gruesas. Sin embargo, los procesos son más largos, delicados y, por lo tanto, propensos a errores. Los problemas que pueden surgir, así como las formas de evitarlos, se analizan más a fondo.

Fijación
Se debe utilizar material fresco tanto para las secciones a mano alzada como para las semifinas, es decir, hojas de plantas que estén suficientemente hidratadas. Las secciones de las hojas marchitas no tienen integridad estructural ya que las células tienen una presión de turgencia disminuida. Al obtener secciones semidelgadas a partir de material incrustado en resina, es fundamental asegurarse de que las secciones de la hoja se fijen al vacío para reemplazar el aire dentro de la hoja. Esto permite la integridad estructural y la ósmosis durante el proceso de infiltración. Si este paso no se realiza correctamente, es probable que las células colapsen, lo que dará lugar a secciones transversales que no representan con precisión la estructura real de la hoja y, posteriormente, a mediciones anatómicas incorrectas32.

Por el contrario, la alta presión de vacío puede dañar las hojas con tejidos blandos (como los cotiledones), lo que resulta en células encogidas o la destrucción de las muestras. Esto se puede evitar utilizando un ajuste de bomba de vacío adecuado o omitiéndolo por completo y simplemente remojando las muestras en la solución fijadora. Si se prefiere este último, las muestras se pueden cortar por todos los lados, para facilitar la infiltración del fijador en el tejido.

Pre-infiltración
El grosor de la pared celular y el tejido esclereido son los rasgos anatómicos más influyentes en la permeación de las soluciones que permiten una fijación e infiltración óptimas de la muestra. El propósito de las esclereidas en el tejido vegetal es el soporte mecánico y la protección, lo que puede afectar el proceso de infiltración33. Como estos tejidos tienen paredes celulares lignificadas muy engrosadas, la permeabilidad de las soluciones puede verse obstaculizada. Las muestras que tienen problemas de infiltración dan como resultado secciones semidelgadas con células rotas y desgarros en la resina (Figura 5C, D). El corte longitudinal da como resultado células distorsionadas, lo que causa sesgos en los análisis anatómicos y la medición de las características de las hojas, como el tamaño y la densidad celular (Figura 5F-H).

Infiltración de resina
El corte de calidad es vital para la observación de los tejidos anatómicos, que se ven directamente afectados por el medio en el que se incrusta la muestra. Los medios de inclusión más comunes utilizados en histología vegetal son la cera de parafina, el epoxi y las resinas acrílicas34,35. La inclusión en cera requiere la preparación de muestras mediante fijador químico e infiltración con cera líquida, que se endurecen a temperatura ambiente. Estos cortes suelen dar lugar a secciones de 5 a 10 μm de grosor, que, como se demuestra aquí, se pueden lograr igual de bien a mano (Figura 2) y solo requieren tejido fresco sin fijar. En este caso, la disposición de las células alrededor de la vaina del haz es vital para distinguir entre las plantas C3 y C4, lo que requiere el uso de un medio de inclusión más robusto y rígido. En este estudio, se probaron la resina epoxi (Spurr's resin36) y la resina acrílica (LR White) para determinar la dureza, la longevidad, la infiltración de la muestra y la durabilidad del corte. La resina epoxi se ha utilizado en la incrustación de material biológico durante décadas37. Las resinas acrílicas son relativamente nuevas y se consideraron inicialmente para incrustar especímenes de plantas debido a su resistencia al paso del tiempo, ya que, a diferencia de las resinas epoxi, no se decoloran como resultado de la exposición a los rayos UV y son menos propensas a la contracción38. La resina acrílica LR White (grado duro) fue seleccionada por su fórmula no tóxica y estable a los rayos UV. Las resinas acrílicas tienden a ser considerablemente menos viscosas que las resinas epoxi, lo que permite una infiltración más rápida de la muestra, y la dureza del material permite un corte más limpio con un micrótomo39. La Figura 5C,D muestra los resultados de la resina epoxi en especímenes de hojas con una gran cantidad de tejido estructural, donde los desgarros son inevitables debido a la suavidad de la resina epoxi, en comparación con la resina acrílica (Figura 3).

Ultramicrotomía
Recortar el exceso de resina puede crear grietas en la resina que penetran en la muestra. Para evitarlo, es vital tener en cuenta la densidad y fragilidad de la resina elegida para la incrustación. Al cortar más profundamente en la sección, se debe evitar cualquier artefacto causado por el corte manual o brusco con un cuchillo. La muestra debe alinearse perpendicularmente al portamuestras y validarse aumentando el aumento a través del ocular, así como visualizando una sección fija y manchada. Las células vegetales que no están cortadas en un ángulo perfectamente recto aparecen como células cónicas en las que un extremo es más grande que los otros40.

Después de la tinción
Se utilizó azul de toluidina (1% en solución acuosa) para teñir secciones semifinas cortadas en el ultramicrótomo. Si la mancha se deja secar en la sección durante demasiado tiempo, se produce una mancha excesiva, lo que provoca una sobresaturación de la sección cuando se obtienen imágenes (Figura 5A). Cuando la mancha no se filtra bien, se producen partículas no disueltas que se secan en la sección, lo que dificulta la visualización de las estructuras anatómicas (Figura 5B). Este problema se puede evitar utilizando un filtro fino al hacer la solución de azul de toluidina, así como limitando la exposición de la sección a la mancha. Las muestras se secan en una placa caliente a 60 °C antes de la tinción para asegurar que la sección se adhiere al portaobjetos de vidrio del microscopio, pero no deben exponerse durante más de 10 s al azul de toluidina antes de ser enjuagadas y secadas de nuevo41.

Consideraciones sobre las medidas anatómicas
Las mediciones mostradas en este artículo son solo un ejemplo de los muchos rasgos anatómicos que se pueden evaluar cuantitativamente utilizando secciones semidelgadas, que incluyen una fracción del espacio aéreo intercelular, el grosor promedio del mesófilo (sin tejido vascular) y el área de superficie del mesófilo expuesta a los espacios aéreos intercelulares por unidad de área foliar42. Sin embargo, mientras que el tamaño de la célula de la vaina del haz es un indicador importante para diferenciar entre el metabolismo deC3 yC4, el grosor de la pared celular de la vaina del haz es otro rasgo importante que no se puede ver solo con la microscopía óptica, ya que determina el grado de fuga de las células de la vaina del haz, es decir, la cantidad de CO2 que se difunde hacia las células del mesófilo42, Artículo 43. La alta fuga reduce la eficiencia fotosintética, ya que se pierde una gran fracción de la energía utilizada para la fijación de CO2 por la carboxilasa PEP 44,45,46. Para estos análisis ultraestructurales, se requieren microscopía electrónica de transmisión y análisis de imágenes. Aunque solo se consideró la microscopía óptica para el presente estudio, el protocolo incluye el tratamiento con tetróxido de osmio, un agente de contraste y fijación que es una piedra angular de la microscopía TEM. Por lo tanto, las muestras polimerizadas pueden seguir utilizándose para el análisis TEM siempre que sea necesario, incluso si no se han considerado en el momento de la preparación.

Aunque el diagnóstico anatómico puede detectar fácilmente estructuras similares a Kranz, la presencia deC4 puede diagnosticarse además mediante mediciones de intercambio de gases que pueden mostrar la fisiología típica deC4, es decir, un punto de compensación deCO2 bajo, inhibición limitada deO2 de la fotosíntesis y diferente composición de isótopos de carbono 2,4,47.

También debe tenerse en cuenta que la anatomía de Kranz no es necesaria para que se desarrolle la fotosíntesis deC4, como lo demuestra el descubrimiento de plantas unicelulares deC4 48,49,50. Por lo tanto, el análisis anatómico por sí solo puede no ser suficiente para detectar la fisiología deC4 en taxones menos estudiados. El acoplamiento de la caracterización anatómica con el análisis fisiológico ofrece herramientas poderosas para investigar los rasgos de las hojas y su relación estructura-función tanto en cultivos como en plantas silvestres.

Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Los autores reconocen el Programa H2020 de la Unión Europea (proyecto GAIN4CROPS, GA nº 862087). El Centro de Excelencia AgroCropCropFuturo Agroecología y nuevos cultivos en climas futuros está financiado por el Ministerio de Educación e Investigación de Estonia. Deseamos agradecer a la profesora Evelin Loit-Harro por proporcionar semillas de T. aestivum y Z. mays, a Paula Palmet y Vaiko Vainola por su asistencia en la preparación de las secciones transversales de las hojas, y a João Paulo de Silva Souza por su asistencia con el análisis. Todas las imágenes se obtuvieron de la unidad de microscopía de la Universidad de Ciencias de la Vida de Estonia en el marco de varios proyectos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Hidrogenofosfato disódico dihidratado (Na2HPO42H2O) puroPENTA, CZ10028-24-7
Película de incrustación, 7,8 milésimas de pulgada de espesor, 8 x 12,5, (203 x 318 mm)ACLAR, US10501-10
Etanol, abs. 100% a.r.Chem-Lab NV, BECL00.0505.1000Peligro: Líquidos y vapores altamente inflamables.
Sistema de imagen EVOS Invitrogen FL Auto 2Thermo Fisher Scientific, EE. UU
Molde de PTFE de incrustación plana con marco metálico, 16 cavidadesPELCO, EE. UU10501
Frasco de vidrio de 2 mlVWR Life Science, EE. UU548-0045
Solución de glutaraldehído al 50 %VWR Life Science, EE. UU23H2856331Peligro: Mortal si se inhala. Tóxico si se ingiere. Causa quemaduras graves en la piel y daño ocular. Puede causar irritación respiratoria. Use guantes protectores, ropa protectora, protección para los ojos y la cara.
Cuchillo de diamante HistoDiatome, US
LEICA EM UC7Leica Vienna, AT
LR Resina blanca de grado duroCiencias de la Microscopía Electrónica, US14383Peligro: Causa irritación de la piel. Causa irritación ocular severa Puede causar irritación respiratoria. Puede causar somnolencia o mareos Use guantes protectores, ropa protectora, protección para los ojos y la cara.
Portaobjetos de microscopioNormax, PT5470308A
Nikon Eclipse E600 y Nikon DS0Fi1 5 MPNikon Corporation, JP
Tetróxido de osmio (OsO4)Agar Scientific Ltd, GBR1019Peligro: Fatal si se ingiere, en contacto con la piel o si se inhala. Causa quemaduras graves en la piel y daños en los ojos Use guantes de protección dobles, ropa protectora, protección para los ojos y la cara.
Pipetas y puntas de pipetaThermo Scientific, FIKJ16047
Dihidrógeno fosfato de sodio dihidratado (NaH2PO4 . 2H2O) puroPENTA, CZ13472-35-0
Jeringa 10 mlEcoject, DE20010
Azul de toluidina, grado de uso generalFisher Scientific, GB2045836
. . . .

Referencias

  1. Erb, T. J., Zarzycki, J. A short history of RubisCO: the rise and fall (?) of Nature's predominant CO2 fixing enzyme. Curr Opinion Biotechnol. 49, 100-107 (2018).
  2. Smith, E. N., et al. Improving photosynthetic efficiency toward food security: Strategies, advances, and perspectives. Mol Plant. 16 (10), 1547-1563 (2023).
  3. Nisbet, E. G., et al. The age of Rubisco: the evolution of oxygenic photosynthesis. Geobiology. 5 (4), 311-335 (2007).
  4. Boretti, A., Florentine, S. Atmospheric CO2 concentration and other limiting factors in the growth of C3 and C4 plants. Plants. 8 (4), 92(2019).
  5. Elferjani, R., et al. A meta-analysis of mesophyll conductance to CO2 in relation to major abiotic stresses in poplar species. J Exp Botany. 72 (12), 4384-4400 (2021).
  6. Knauer, J., et al. Contrasting anatomical and biochemical controls on mesophyll conductance across plant functional types. New Phytol. 236 (2), 357-368 (2022).
  7. Tosens, T., Niinemets, Ü, Westoby, M., Wright, I. J. Anatomical basis of variation in mesophyll resistance in eastern Australian sclerophylls: news of a long and winding path. J Exp Botany. 63 (14), 5105-5119 (2012).
  8. Ehleringer, J. R., Monson, R. K. Evolutionary and ecological aspects of photosynthetic pathway variation. Ann Rev Ecol Syst. 24 (1), 411-439 (1993).
  9. Niinemets, Ü, Díaz-Espejo, A., Flexas, J., Galmés, J., Warren, C. R. Role of mesophyll diffusion conductance in constraining potential photosynthetic productivity in the field. J Exp Botany. 60 (8), 2249-2270 (2009).
  10. Flexas, J., et al. Mesophyll diffusion conductance to CO2: An unappreciated central player in photosynthesis. Plant Sci. 193 - 194, 70-84 (2012).
  11. Walker, B. J., VanLoocke, A., Bernacchi, C. J., Ort, D. R. The costs of photorespiration to food production now and in the future. Ann Rev Plant Biol. 67 (1), 107-129 (2016).
  12. Kanai, R., Edwards, G. E. The biochemistry of C 4 photosynthesis. C4 Plant Biol. , 49-87 (1999).
  13. Sage, R. F., Sage, T. L., Kocacinar, F. Photorespiration and the evolution of C4 photosynthesis. Ann Rev Plant Biol. 63 (1), 19-47 (2012).
  14. Lundgren, M. R., Osborne, C. P., Christin, P. A. Deconstructing Kranz anatomy to understand C4 evolution. J Exp Botany. 65 (13), 3357-3369 (2014).
  15. Furbank, R., Kelly, S., Von Caemmerer, S. Photosynthesis and food security: the evolving story of C4 rice. Photosyn Res. 158 (2), 121-130 (2023).
  16. Dengler, N. G., Nelson, T. Leaf structure and development in C4 plants. C4 Plant Biol. , 133-172 (1999).
  17. Leegood, R. C. Roles of the bundle sheath cells in leaves of C3 plants. J Exp Botany. 59 (7), 1663-1673 (2007).
  18. Mallmann, J., et al. The role of photorespiration during the evolution of C4 photosynthesis in the genus Flaveria. eLife. 3, e02478(2014).
  19. Edwards, E. J., et al. The origins of C4 grasslands: Integrating evolutionary and ecosystem science. Science. 328 (5978), 587-591 (2010).
  20. Sage, R. F. The evolution of C 4 photosynthesis. New Phytol. 161 (2), 341-370 (2004).
  21. Ludwig, M., Busch, F. A., Khoshravesh, R., Covshoff, S. Editorial: Understanding C4 evolution and function. Fron Plant Sci. 12, 774818(2021).
  22. Stata, M., Sage, T. L., Sage, R. F. Mind the gap: the evolutionary engagement of the C4 metabolic cycle in support of net carbon assimilation. Curr Opinion Plant Biol. 49, 27-34 (2019).
  23. Sage, R. F., Khoshravesh, R., Sage, T. L. From proto-Kranz to C4 Kranz: building the bridge to C4 photosynthesis. J Exp Botany. 65 (13), 3341-3356 (2014).
  24. Lyu, M. J. A., et al. The coordination of major events in C4 photosynthesis evolution in the genus Flaveria. Sci Rep. 11 (1), 15618(2021).
  25. Lundgren, M. R. C2 photosynthesis: a promising route towards crop improvement. New Phytol. 228 (6), 1734-1740 (2020).
  26. Ermakova, M., Danila, F. R., Furbank, R. T., Von Caemmerer, S. On the road to C4 rice: advances and perspectives. Plant J. 101 (4), 940-950 (2020).
  27. Yadav, S., Mishra, A. Ectopic expression of C4 photosynthetic pathway genes improves carbon assimilation and alleviate stress tolerance for future climate change. Physiol Mol Biol Plants. 26 (2), 195-209 (2020).
  28. Schuler, M. L., Mantegazza, O., Weber, A. P. M. Engineering C4 photosynthesis into C3 chassis in the synthetic biology age. Plant J. 87 (1), 51-65 (2016).
  29. Simpson, C. J. C., Singh, P., Sogbohossou, D. E. O., Eric Schranz, M., Hibberd, J. M. A rapid method to quantify vein density in C4 plants using starch staining. Plant, Cell Environ. 46 (9), 2928-2938 (2023).
  30. Upadhyay, P., Agrawal, N., Yadav, P. K., Patel, R. The evolutionary path from C3 to C4 photosynthesis: A review. Int J Curr Microbiol Appl Sci. 9 (1), 748-762 (2020).
  31. Hewitson, T. D., Wigg, B., Becker, G. J. Tissue preparation for histochemistry: Fixation, embedding, and antigen retrieval for light microscopy. Histol Prot. 611, 3-18 (2010).
  32. Kalve, S., Saini, K., Vissenberg, K., Beeckman, T., Beemster, G. Transverse sectioning of Arabidopsis thaliana leaves using resin embedding. Bio Prot. 5 (18), 1592(2015).
  33. Whitehill, J. G. A., et al. Histology and cell wall biochemistry of stone cells in the physical defence of conifers against insects. Plant, Cell Environ. 39 (8), 1646-1661 (2016).
  34. Yeung, E. C. The use of histology in the study of plant tissue culture systems-Some practical comments. In Vitro Cell Dev Biol- Plant. 35 (2), 137-143 (1999).
  35. Lee, K. J. D., Knox, J. P. Resin embedding, sectioning, and immunocytochemical analyses of plant cell walls in hard tissues. Plant Cell Morpho. 1080, 41-52 (2014).
  36. Spurr, A. R. A low-viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. J Ultrastr Res. 26 (1-2), 31-43 (1969).
  37. Coste, R., et al. Unveiling the impact of embedding resins on the physicochemical traits of wood cell walls with subcellular functional probing. Compos Sci Technol. 201, 108485(2021).
  38. De Smet, I., et al. An easy and versatile embedding method for transverse sections. J Microsc. 213 (1), 76-80 (2004).
  39. Khoshravesh, R., Lundsgaard-Nielsen, V., Sultmanis, S., Sage, T. L. Light microscopy, transmission electron microscopy, and immunohistochemistry protocols for studying photorespiration. Photorespiration. 1653, 243-270 (2017).
  40. Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. A comparative study of sample preparation for staining and immunodetection of plant cell walls by light microscopy. Front Plant Sci. 8, 1505(2017).
  41. Rodríguez, J. R., Turégano-López, M., DeFelipe, J., Merchán-Pérez, A. Neuroanatomy from mesoscopic to nanoscopic scales: An improved method for the observation of semithin sections by high-resolution scanning electron microscopy. Front in Neuroanat. 12, 14(2018).
  42. Veromann-Jürgenson, L. L., Brodribb, T. J., Niinemets, Ü, Tosens, T. Variability in the chloroplast area lining the intercellular airspace and cell walls drives mesophyll conductance in gymnosperms. J Exp Botany. 71 (16), 4958-4971 (2020).
  43. Sonawane, B. V., Koteyeva, N. K., Johnson, D. M., Cousins, A. B. Differences in leaf anatomy determines temperature response of leaf hydraulic and mesophyll CO2 conductance in phylogenetically related C4 and C3 grass species. New Phytol. 230 (5), 1802-1814 (2021).
  44. Hatch, M. D., Agostino, A., Jenkins, C. Measurement of the leakage of CO2 from bundle-sheath cells of leaves during C4 photosynthesis. Plant Physiol. 108 (1), 173-181 (1995).
  45. Kromdijk, J., Ubierna, N., Cousins, A. B., Griffiths, H. Bundle-sheath leakiness in C4 photosynthesis: a careful balancing act between CO2 concentration and assimilation. J Exp Botany. 65 (13), 3443-3457 (2014).
  46. Wang, Y., et al. Increased bundle-sheath leakiness of CO2 during photosynthetic induction shows a lack of coordination between the C4 and C3 cycles. New Phytol. 236 (5), 1661-1675 (2022).
  47. Johnson, J. E., Field, C. B., Berry, J. A. The limiting factors and regulatory processes that control the environmental responses of C3, C3-C4 intermediate, and C4 photosynthesis. Oecologia. 197 (4), 841-866 (2021).
  48. Sage, R. F. C4 photosynthesis in terrestrial plants does not require Kranz anatomy. Trend Plant Sci. 7 (7), 283-285 (2002).
  49. Voznesenskaya, E. V., et al. Proof of C4 photosynthesis without Kranz anatomy in Bienertia cycloptera (Chenopodiaceae). Plant J. 31 (5), 649-662 (2002).
  50. Koteyeva, N. K., Voznesenskaya, E. V., Berry, J. O., Cousins, A. B., Edwards, G. E. The unique structural and biochemical development of single cell C4 photosynthesis along longitudinal leaf gradients in Bienertia sinuspersici and Suaeda aralocaspica (Chenopodiaceae). J Exp Botany. 67 (9), 2587-2601 (2016).

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