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Artículo de método

Evaluación de rasgos estructurales en Triticum aestivum y Zea mays para la diferenciación fotosintética de C3 y C4 utilizando secciones a mano alzada y semidelgadas

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DOI:

10.3791/66843

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12 de julio de 2024

 ,  ,  , 
1Institute of Agricultural and Environmental Sciences, Estonian University of Life Sciences, 2Estonian Academy of Sciences

En este artículo

Resumen

La evaluación de las diferencias anatómicas entre las secciones transversales de las hojas C3 y C4 ayuda a comprender la eficiencia de la fotosíntesis. Este artículo describe la preparación y el examen de las secciones transversales de hojas semifinas y a mano alzada, junto con las advertencias en la preparación de las especies de cultivo Triticum aestivum y Zea mays.

Resumen

La mayor eficiencia de la fotosíntesis deC4 , en comparación con el mecanismo deC3 , surge de su capacidad para concentrar CO2 en las células de la vaina del haz. La eficacia de la fotosíntesisC4 y la eficiencia intrínseca del uso del agua están directamente relacionadas con la proporción de células del mesófilo y de las hojas del haz, el tamaño y la densidad de las vainas del haz, y el tamaño, la densidad y el grosor de la pared celular de las células de la vaina del haz. El análisis microscópico rápido de estos rasgos se puede realizar en secciones a mano alzada y semidelgadas utilizando microscopía óptica convencional, proporcionando información valiosa sobre la eficiencia fotosintética en cultivos deC4 mediante la identificación y el examen de tipos celulares específicos. Además, se muestran los errores en la preparación de secciones a mano alzada y semifinas que afectan a las mediciones anatómicas y a los diagnósticos de tipos de células, así como la forma de evitar estos errores. Este enfoque microscópico ofrece un medio eficiente para recopilar información sobre la aclimatación fotosintética a la variación ambiental y ayuda en la detección rápida de cultivos para climas futuros.

Introducción

La fotosíntesis es un proceso fundamental en el que la energía luminosa se convierte en energía química, sirviendo como piedra angular de las redes tróficas terrestres. La mayoría de las plantas siguen la vía C3 de la fotosíntesis, donde el principal producto fotosintético es el compuesto de tres carbonos glicerato 3-fosfato. La fotosíntesis deC3 evolucionó hace más de 2.000 millones de años en una atmósfera abundante enCO2 y baja enO21. La enzima fotosintética clave, la ribulosa 1,5 bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (Rubisco), que evolucionó en estas condiciones, no es óptima para las condiciones actuales de bajo contenido deCO2 y alto contenido deO2, ya que reacciona competitivamente con elO2, iniciando la fotorrespiración2. La fotorrespiración es una vía de despilfarro que consume energía en lugar de producirla y liberarCO2 como subproducto. En consecuencia, es crucial mantener una alta concentración deCO2 alrededor de Rubisco en los cloroplastos para prevenir la oxigenación 3,4. Debido a la incapacidad de las plantasC3 para concentrar el CO2, se produce una importante reducción de CO2 del aire ambiente a los cloroplastos, lo que frena la fotosíntesis y afecta al crecimiento de las plantas y a la producción de biomasa 2,5,6.

En las plantasC3, la fotosíntesis está limitada por la entrada de CO2 a través de los estomas, su difusión a través del mesófilo y la actividad bioquímica de las enzimas fotosintéticas. La entrada de CO2 está limitada primero por la conductancia estomática, que está controlada por condiciones ambientales como la temperatura y la humedad del aire. Luego, el CO2 se difunde a través de la fase gaseosa y líquida interna de la hoja a Rubisco7. En las plantasC3, todas las etapas de la fotosíntesis ocurren en los cloroplastos de las células mesófilas, y las plantas necesitan mantener una afluencia constante de CO2 de la atmósfera a los cloroplastos. La dependencia de la disponibilidad deCO2 en los cloroplastos de la apertura estomática, la arquitectura mesófila y las características individuales de las células y los cloroplastos hace que las plantas sean susceptibles a las limitaciones ambientales que eventualmente afectan la fotosíntesis, como la baja disponibilidad de agua y las altas temperaturas 7,8,9,10, destacando particularmente su vulnerabilidad a las condiciones del cambio climático11.

Dados los desafíos planteados por las ineficiencias de la víaC3, así como las limitaciones para mantener niveles óptimos de CO2 y susceptibilidad a factores ambientales, en ciertas plantas, ha evolucionado otra vía, la vía de fotosíntesisC4. Característicamente, las plantasC4 tienen dos vías bioquímicas separadas espacialmente; la fijación inicial de CO2 se produce en las células del mesófilo por la fosfoenolpiruvato carboxilasa, que tiene una mayor afinidad por el CO2 que Rubisco y también carece de actividad de oxigenación. El productoC4 formado se transporta posteriormente a las células de la vaina del haz, donde se descarboxila, y el CO2 es nuevamente liberado y fijado por Rubisco (fotosíntesis de C3)12,13,14. La mayor afinidad de la PEP carboxilasa al CO2 y a las paredes celulares gruesas de las células de la vaina del haz permite la concentración de CO2 en las células de la vaina del haz y, por lo tanto, las plantas deC4 minimizan la fotorrespiración al segregar espacialmente la fijación de CO2 y el ciclo de Calvin. La adopción de la vía C4 muestra la respuesta adaptativa de la naturaleza a las limitaciones ambientales, ofreciendo información sobre posibles estrategias para mejorar la productividad y la resiliencia de los cultivos en condiciones climáticas cambiantes15.

La anatomía especializada de la estructura de la hoja en las plantasC4 se caracteriza por venas rodeadas de células de la vaina del haz vascular agrandadas que contienen cloroplastos y con una disposición radial de las células del mesófilo en un patrón de anillo exterior alrededor de las células de la vaina del haz. Las células mesófilas están muy cerca de las células de la vaina del haz, lo que permite un transporte rápido y continuo de metabolitos entre los dos tipos de células. La disposición de esta célula es típica de las plantas C4 y se conoce como anatomía de Kranz16. En las especiesC3, la especialización y disposición de las células mesófilas pueden variar, pero las células de la vaina del haz son claramente más pequeñas y tienen unos pocos cloroplastos o ningún cloroplasto. La anatomía específica de Kranz permite concentrar el CO2 en los cloroplastos de las células de la vaina donde se encuentra la enzima carboxilanteC3 Rubisco, dificultando eficazmente la fotorrespiración 4,17,18. A pesar de su disposición aparentemente compleja, estos cambios han ocurrido de forma independiente múltiples veces en la evolución de las angiospermas, lo que indica que es una vía evolutiva relativamente factible 19,20,21, y se ha demostrado que varios taxones se encuentran en una etapa intermedia entre el metabolismo del carbono C3 y C 4, denominados C3-C 4 o C2, tener habilidades para concentrarse y reasimilar CO2 22,23,24,25.

Muchas plantasC4 son cultivos de gran importancia económica, y la ingeniería genética de cultivosC3, como el arroz, para mejorar su resiliencia climática y asegurar el rendimiento ha sido un tema de interés en las últimas décadas26,27. Sin embargo, los esfuerzos de ingeniería requieren una comprensión detallada de la anatomía especializada deC4 y cómo controla la fotosíntesis 2,28.

El establecimiento de la anatomía de C4 Kranz es un requisito previo para lograr el ambicioso objetivo de diseñar la fotosíntesis de C4 en cultivos de C3 25. Sin embargo, la comprensión actual de la regulación de la anatomía del Kranz y los métodos para detectar rápidamente sus rasgos anatómicos clave es limitada, lo que dificulta la identificación de especies híbridas. Estudios previos han demostrado que los rasgos clave que regulan la eficiencia fotosintética en las plantas C3 y C4 incluyen la distancia intervenal, el diámetro del complejo de la vaina del haz y el tamaño de las células de la vainadel haz 14,29. Estos rasgos pueden filtrarse fácilmente utilizando secciones a mano alzada y analizarse cuantitativamente utilizando secciones semifinas. Aquí, describimos el método de evaluación de los rasgos que permiten el diagnóstico de la diferenciación anatómica de C3 y C4 a través de microscopía cruzada y óptica a mano alzada, a saber, el área de la vaina del haz, la distancia intervenal y la frecuencia de las venas.

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Protocolo

1. Condiciones de crecimiento de las plantas

  1. Seleccione el trigo (Triticum aestivum L. Var. Winter Wheat, "Fredis") y el maíz (Zea mays L. Var. Saccharata, "Golden Bantam") como plantas representativas C3 y C4 , respectivamente. Cultive ambas especies de plantas en una cámara de crecimiento de semillas controlada en un ambiente.
  2. Mantenga la humedad relativa al 55% con la temperatura del aire a 25 °C/18 °C (día/noche) con un período de luz de 12 h. Mantener la densidad de flujo de fotones fotosintéticos (Q) en la superficie de la planta a 1200 μmol/m2/s para representar sus condiciones naturales de crecimiento. Cultive todas las plantas a una concentración ambiente de CO2 de 400 μmol/mol.
  3. Riegue las plantas cada2 días con agua destilada y fertilice con la solución de Hoagland 10 días después de la emergencia de las plántulas. Cultive las plantas en las condiciones dadas durante 60 días y use hojas completamente expandidas para análisis microscópicos.

2. Preparación y visualización de las secciones a mano alzada

  1. Seleccione 3 hojas maduras no senescentes de cada planta y manténgalas en agua destilada. Con una nueva hoja de afeitar de un solo lado, haga un corte de nivelación para formar un ángulo recto con la superficie de la hoja para asegurarse de que las secciones sean secciones transversales perpendiculares a la superficie de la hoja.
  2. Coloque el espécimen de hoja en una placa de vidrio sobre un trozo de cera dental para estabilizar la muestra y evitar que se deslice. Corte moviendo la cuchilla hacia abajo sobre el espécimen de hoja para cortar limpiamente a través de las celdas. Mantenga las secciones transversales en agua destilada.
  3. Monte las muestras en un portaobjetos de vidrio colocándolas sobre una gota de agua y cubriéndolas con un cubreobjetos de vidrio para su visualización microscópica y obtención de imágenes. Evite atrapar burbujas de aire.
  4. Vea el portaobjetos bajo un microscopio de luz compuesta con aumentos de 10x y 20x. Guarde las imágenes según la guía del software, junto con la escala correspondiente.

3. Preparación de secciones semifinas

  1. Corte secciones de aproximadamente 3 mm x 5 mm de tamaño de las áreas intercostales a lo largo de la nervadura central de las hojas de Z. mays y T. aestivum en una placa de vidrio como en el paso 2.2. Asegúrese de que la longitud de la sección cortada corra a lo largo de la veta de la hoja.
  2. Colocar el material vegetal en una jeringa con 1 mL de tampón de fijación (aldehído glutárico al 4% en tampón fosfato 0,1 M, pH = 6,9, Tabla 1).
  3. Sostenga la jeringa verticalmente, retire el aire y, sosteniendo un dedo en la punta, bombee la jeringa para crear un vacío. Repita hasta que las muestras queden en el fondo de la jeringa, lo que indica una infiltración exitosa.
  4. Transfiera el contenido de la jeringa a un vial de vidrio etiquetado y almacene a 4 °C durante 48 h antes del siguiente paso (Tabla 2).
  5. Para cada vial, retire suavemente el fijador con una pipeta y agregue el tampón de fosfato hasta cubrir la muestra. Dejar actuar durante 30 min. Repita este paso 3 veces.
  6. Retire el tampón de fosfato con una pipeta y añada el tetróxido de osmio (PRECAUCIÓN) hasta cubrir la muestra. Las muestras y otras materias orgánicas se volverán negras. Use guantes dobles. Dejar actuar durante 1 h.
  7. Retire la solución anterior con una pipeta y cubra las muestras con agua destilada. Dejar actuar durante 30 minutos Repite este paso 3 veces y utiliza guantes dobles.
  8. Retire la solución anterior con una pipeta y cubra las muestras con la solución de agua-etanol destilado 50/50. Dejar actuar durante 30 min. Repita este paso con soluciones de agua-etanol destilado en las siguientes series: 30/70, 20/80, 10/90 y 2x al 100 % de etanol. Las muestras en cualquiera de estas soluciones se pueden dejar toda la noche a 4 °C.
  9. Retirar la solución anterior con una pipeta y cubrir las muestras con 1/3 de solución de resina-etanol. Poner las muestras en una placa batidora y dejar actuar durante 2 h. Repita este paso con soluciones de resina-etanol de las siguientes series: 1/2, 1/1, 2/1, 3/1 y 2x al 100% de resina. Las muestras en cualquiera de estas soluciones se pueden dejar toda la noche a 4 °C.
  10. Cubra las cavidades de un molde de incrustación plano (16 cavidades, dimensiones de la cavidad: 14 L x 4,8 W x 3 D (mm)) con resina 100% y coloque las muestras en un extremo de la cavidad. Prepare etiquetas de papel escritas a lápiz para cada muestra y colóquelas en el otro extremo de la cavidad.
  11. Rellena completamente todas las cavidades con resina 100% y endereza las muestras y etiquetas si se han movido. Cubra el molde con una película de incrustación y polimerice en un horno según las pautas del producto de resina acrílica.
  12. Coloque el bloque polimerizado con la muestra en el portamuestras del ultramicrótomo. Recorte el bloque con un cuchillo de vidrio rugoso hasta que el tejido se haga visible y se elimine el exceso de resina.
  13. Corte secciones semifinas transversalmente (1 μm) con un cuchillo de vidrio o diamante. Recoja las secciones usando un asa de inoculación de metal de la superficie del agua y colóquelas en un portaobjetos de vidrio. Seque el portaobjetos en una placa calefactora (60 °C) para fijar las secciones en el vidrio.
  14. Teñir las secciones fijas con azul de toluidina (solución acuosa al 1%) durante 5 s antes de enjuagar con agua destilada y secar de nuevo en la placa calefactora.
    NOTA: Asegúrese de que el proceso de fijación química se realice bajo una campana extractora. Las cuchillas de vidrio deben reemplazarse periódicamente para garantizar cortes afilados que permitan secciones sin desgarros ni distorsiones.

4. Obtención de imágenes de las muestras

  1. Imágenes de secciones de hojas frescas
    1. Configure el microscopio de luz compuesta con el software adjunto según el manual.
    2. Coloque la diapositiva de vidrio en el escenario. Ajuste el ocular y visualice la sección a 10x para obtener una visión general, luego a 20x y 40x objetivos.
    3. En cada objetivo, navegue por el canal Live, concéntrese en el área de interés y ubique las células de la vaina del haz alrededor de la vena.
    4. Una vez enfocado, haga clic en el botón Congelar y agregue la escala presionando el botón Barra de escala en la pestaña Herramientas. Guarde la imagen en formato . Formato TIF para el análisis de imágenes.
  2. Obtención de imágenes de secciones infiltradas con resina
    1. Configure el microscopio óptico automatizado en combinación con el software adjunto en la computadora.
    2. Cargue el canal transparente y coloque el portaobjetos en la platina del microscopio. Concéntrese en la sección con un aumento del objetivo de 40x y ajuste el brillo para asegurarse de que todas las estructuras celulares sean visibles.
    3. Establezca el área de ubicación de la sección usando la función de navegador para asegurarse de que se muestre toda la sección y haga clic en el botón Puntada .
    4. Haga clic en Listo y, a continuación, en Iniciar para permitir que el microscopio obtenga una imagen de toda la sección. Abra el software de análisis de imágenes y abra las baldosas tomadas por el microscopio.
    5. Con la función Alinear, asegúrese de que las teselas no se superpongan. Después de generar la imagen, ajuste la posición, el brillo y la rotación con la pestaña Ajustar.
    6. Imprima la escala en la imagen antes de guardarla en . Formato TIF.
  3. Mediciones anatómicas con el software ImageJ
    1. Abra el software ImageJ y cargue la imagen arrastrándola a la ventana.
    2. Con la herramienta Línea, calibre la escala de la siguiente manera: Dibuje una línea sobre la barra de escala, elija Analizar > Establecer escala, cambie la distancia conocida a la longitud de la barra de escala y cambie la unidad de longitud a la unidad correcta.
    3. Mide el rasgo prospectivo seleccionando la Herramienta Línea, dibujando una línea a través del área de interés y presionando la tecla M .
    4. Para las mediciones de área, seleccione la herramienta Selección de polígono y dibuje alrededor del tejido de interés. Concluya pulsando la tecla M . Las mediciones se muestran como una ventana emergente, que se puede copiar en una hoja de cálculo para un análisis posterior de los datos.

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Resultados

La Figura 1A muestra la orientación correcta para seccionar la hoja tanto para el corte fresco como para la microscopía óptica. El método para cortar secciones frescas usando una navaja de afeitar de un solo lado y una hoja de cera dental se puede ver en la Figura 1B. Las secciones resultantes se muestran en la Figura 1C.

La Figura 2 muestra secciones a mano alzada de hojas r...

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Discusión

En este artículo, discutimos los métodos cuantitativos y cualitativos para medir la anatomía de las hojas y las formas en que se pueden optimizar. Además, la metodología se aplica a especies representativas de cultivos con el fin de determinar qué rasgos anatómicos son más útiles para distinguir entre las secciones transversales C3 y C4 . La comprensión de estos rasgos es esencial, ya que las especies híbridas, denominadas fotosíntesisC2 , se están convirtiendo en una vía de investigación...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Los autores reconocen el Programa H2020 de la Unión Europea (proyecto GAIN4CROPS, GA nº 862087). El Centro de Excelencia AgroCropCropFuturo Agroecología y nuevos cultivos en climas futuros está financiado por el Ministerio de Educación e Investigación de Estonia. Deseamos agradecer a la profesora Evelin Loit-Harro por proporcionar semillas de T. aestivum y Z. mays, a Paula Palmet y Vaiko Vainola por su asistencia en la preparación de las secciones transversales de las hojas, y a João Paulo de Silva Souza por su asistencia con el análisis. Todas las imágenes se obtuvieron de la unidad de microscopía de la Universidad de Ciencias de la Vida de Estonia en el marco de varios proyectos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Hidrogenofosfato disódico dihidratado (Na2HPO42H2O) puroPENTA, CZ10028-24-7
Película de incrustación, 7,8 milésimas de pulgada de espesor, 8 x 12,5, (203 x 318 mm)ACLAR, US10501-10
Etanol, abs. 100% a.r.Chem-Lab NV, BECL00.0505.1000Peligro: Líquidos y vapores altamente inflamables.
Sistema de imagen EVOS Invitrogen FL Auto 2Thermo Fisher Scientific, EE. UU
Molde de PTFE de incrustación plana con marco metálico, 16 cavidadesPELCO, EE. UU10501
Frasco de vidrio de 2 mlVWR Life Science, EE. UU548-0045
Solución de glutaraldehído al 50 %VWR Life Science, EE. UU23H2856331Peligro: Mortal si se inhala. Tóxico si se ingiere. Causa quemaduras graves en la piel y daño ocular. Puede causar irritación respiratoria. Use guantes protectores, ropa protectora, protección para los ojos y la cara.
Cuchillo de diamante HistoDiatome, US
LEICA EM UC7Leica Vienna, AT
LR Resina blanca de grado duroCiencias de la Microscopía Electrónica, US14383Peligro: Causa irritación de la piel. Causa irritación ocular severa Puede causar irritación respiratoria. Puede causar somnolencia o mareos Use guantes protectores, ropa protectora, protección para los ojos y la cara.
Portaobjetos de microscopioNormax, PT5470308A
Nikon Eclipse E600 y Nikon DS0Fi1 5 MPNikon Corporation, JP
Tetróxido de osmio (OsO4)Agar Scientific Ltd, GBR1019Peligro: Fatal si se ingiere, en contacto con la piel o si se inhala. Causa quemaduras graves en la piel y daños en los ojos Use guantes de protección dobles, ropa protectora, protección para los ojos y la cara.
Pipetas y puntas de pipetaThermo Scientific, FIKJ16047
Dihidrógeno fosfato de sodio dihidratado (NaH2PO4 . 2H2O) puroPENTA, CZ13472-35-0
Jeringa 10 mlEcoject, DE20010
Azul de toluidina, grado de uso generalFisher Scientific, GB2045836
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Referencias

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